專利名稱：神經(jīng)胚活素多肽的治療作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)病性疼痛(neuropathic pain)，包括觸覺(jué)異常性疼痛的治療，以及降低與神經(jīng)病有關(guān)的疼痛敏感性喪失的治療。
背景技術(shù)：
神經(jīng)病性疼痛是這樣一類痛疼，它包括數(shù)種形式的慢性疼痛，且由神經(jīng)組織而不是軀體組織的功能紊亂引起。由中樞神經(jīng)系統(tǒng)或外周神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂所引起的神經(jīng)病性疼痛還可能是外周神經(jīng)損傷或中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域的損傷所致，也可以由疾病所致，或者還可以是自發(fā)性的。神經(jīng)病性疼痛的癥狀包括末梢的灼熱感，刺痛感，電感，針感，僵硬，麻木，身體變形感，異常性疼痛(由通常是無(wú)害的皮膚刺激所誘發(fā)的疼痛)，痛覺(jué)過(guò)敏(hyperalgesia)(對(duì)疼痛異常敏感)以及痛覺(jué)增敏(hyperpathia)(疼痛刺激停止后持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)大的疼痛應(yīng)答)。
神經(jīng)病性疼痛的幾個(gè)常見(jiàn)原因是糖尿病，癌癥化療，帶狀皰疹感染，由于退化性脊椎病而導(dǎo)致的頸部或腰部神經(jīng)根的壓迫，神經(jīng)叢或神經(jīng)根的惡性病變，神經(jīng)退化，如由于截肢，HIV感染，中樞疼痛通路，包括脊髓丘腦管，丘腦的病變或丘腦的放射治療。神經(jīng)病性疼痛的其他原因包括藥物誘導(dǎo)的，或毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)病。例如，抗病毒藥物如ddI，ddC和d4T通常引起外周神經(jīng)病，如苯妥英(phenytoin)(治療癲癇發(fā)作的藥物)，異煙肼(isoniazid)(抗結(jié)核藥)，長(zhǎng)春新堿(vincristine)，長(zhǎng)春花堿(vinblastine)，紫杉醇(taxol)，脫乙?；仙即?taxotere)以及順鉑(cisplatin)(癌癥化療劑)，高劑量的維生素以及葉酸拮抗劑。
處理神經(jīng)病性疼痛的目前的治療方法對(duì)許多患者而言益處是有限的，且還產(chǎn)生人們不期望有的副作用或劑量限制性的毒性。另外，目前的治療是對(duì)癥治療，不是調(diào)控(modifying)疾病。所以極需對(duì)神經(jīng)病性疼痛的改進(jìn)的處理和治療方法，尤其是針對(duì)潛在的病理的那些處理或治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供治療神經(jīng)病性疼痛、治療觸覺(jué)異常性疼痛以及降低與神經(jīng)病有關(guān)的疼痛敏感性喪失的改進(jìn)的方法。該方法應(yīng)用神經(jīng)胚活素(neublastin)(“NBN”)多肽，包括全長(zhǎng)神經(jīng)胚活素多肽或有生物活性的截短的神經(jīng)胚活素多肽(例如至少包括SEQ ID NOS2，4，5和11-27)。另外，本發(fā)明還提供了藥物組合物，該組合物包含全長(zhǎng)神經(jīng)胚活素多肽，或懸浮在，溶解在或分散在藥學(xué)上可接受的載體中的截短的神經(jīng)胚活素多肽。
在具體的實(shí)施方案中，神經(jīng)胚活素多肽可以是如下任一種多肽SEQ IDNO2的AA-80-AA140，SEQ ID NO2的AA-41-AA140，SEQ ID NO2的AA1-AA140，SEQ ID NO2的AA25-AA140，SEQ ID NO2的AA28-AA140，SEQID NO4的AA-80-AA144，SEQ ID NO4的AA1-AA144，SEQ ID NO5的AA1-AA224或SEQ ID NO5的AA81-AA224；可以是包含SEQ ID NO2的AA107-AA140或SEQ ID NO2的AA76-AA140中所示的C末端序列，且保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7個(gè)半胱氨酸殘基的至少一種多肽；可以是包含SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26或SEQ ID NO27的至少一種多肽；或者可以是與上述所列任一序列具有70％以上的氨基酸同一性的至少一種多肽序列。
神經(jīng)胚活素多肽可以用衍生的半分子(moiety)進(jìn)行修飾以使其存留時(shí)間延長(zhǎng)和/或在體內(nèi)的濃度增加。所述神經(jīng)胚活素多肽可以是N-糖基化的神經(jīng)胚活素多肽。另外，神經(jīng)胚活素多肽可以用一種或多種半分子來(lái)衍生，所述半分子包括，但不限于聚乙二醇半分子，脂肪族酯，酰胺，N-?；?衍生物或O-酰基衍生物。
在實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于一種治療受試者神經(jīng)病性疼痛的方法，該方法包括給藥受試者有效量的神經(jīng)胚活素多肽，包括例如，SEQ IDNOS2，4，5和11-27中的任何一種，它們可以單獨(dú)給藥，或者還給藥受試者有效量的選自如下的誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物類鴉片(opioids)，抗心律失常藥，局部的(topical)止痛藥，局限的(local)止痛藥，抗驚厥藥，抗抑郁藥，皮質(zhì)類固醇或非類固醇抗炎藥(NSAIDS)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物是抗驚厥藥。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物是加巴噴丁(gabapentin)(1-(氨甲基)環(huán)己烷乙酸)或pregabalin(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于一種治療受試者觸覺(jué)異常性疼痛的方法，該方法或者給藥受試者有效量的神經(jīng)胚活素多肽，包括例如，SEQ ID NOS2，4，5和11-27中的任何一種，或者單獨(dú)給藥，或者和有效量的選自如下的誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物來(lái)給藥受試者有效量的神經(jīng)胚活素多肽類鴉片，抗心律失常藥，局部的止痛藥，局限的止痛藥，抗驚厥藥，抗抑郁藥或NSAIDS。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物是加巴噴丁(1-(氨甲基)環(huán)己烷乙酸)或pregabalin(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
神經(jīng)胚活素多肽可以與治療劑聯(lián)合給藥，所述治療劑包括但不限于抗癌藥或抗病毒藥。抗癌藥包括但不限于，紫杉醇，脫乙酰基紫杉醇，順鉑，噻氨酯噠唑(nocodazole)，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春地辛(vindesine)和長(zhǎng)春花堿?？共《舅幇ǖ幌抻赿dI，DDC，d4T，磷卡萘替(foscamet)，氨苯砜(dapsone)，甲硝唑(metronidazole)或異煙肼。
本發(fā)明包括治療受試者神經(jīng)病性疼痛的方法。在具體實(shí)施方案中，所述神經(jīng)病性疼痛與糖尿病性神經(jīng)病有關(guān)。在另一實(shí)施方案中，所述神經(jīng)病性疼痛與受試者被病毒感染有關(guān)，所述病毒包括但不限于皰疹病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)以及乳頭瘤病毒。神經(jīng)病性疼痛可以與被單純皰疹病毒感染有關(guān)，或尤其與帶狀皰疹后神經(jīng)痛(post-herpes neuralgia)有關(guān)。在另一實(shí)施方案中，所述神經(jīng)病性疼痛與坐骨神經(jīng)痛有關(guān)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于一種調(diào)節(jié)患神經(jīng)病的受試者痛覺(jué)敏感性喪失的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述神經(jīng)病是糖尿病性神經(jīng)病。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述痛覺(jué)敏感性喪失是熱痛覺(jué)敏感性喪失。
在另一實(shí)施方案中，神經(jīng)病性疼痛是痛覺(jué)過(guò)敏性疼痛，幻覺(jué)痛(phantompain)，熱痛覺(jué)過(guò)敏或由于與外傷有關(guān)的損傷。另外，神經(jīng)病性疼痛也可以與以下疾病有關(guān)先天性神經(jīng)病(包括但不限于弗里德里希氏共濟(jì)失調(diào)(Friedreich ataxia)，家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病(familial amyloidpolyneuropathy)，唐吉爾病(Tangier disease)，法布里氏病(Fabry disease))，代謝性疾病(包括但不限于腎功能不全和甲狀腺功能低下)，維生素缺乏(包括但不限于維生素B12缺乏，維生素B6缺乏以及維生素E缺乏)，中毒性神經(jīng)病和醫(yī)源性神經(jīng)病(包括但不限于酒精中毒，維生素B6中毒，六碳化合物中毒(hexacarbon intoxication)，乙胺碘呋酮(amiodarone)，氯霉素(chloramphenicol)，雙硫醒(disulfiram)，異煙肼(isoniazide)，金，鋰，甲硝唑，米索硝唑(misonidazole)，呋喃妥因(nitrofurantoin))，傳染性神經(jīng)病(包括但不限于麻風(fēng)病，萊姆病(Lyme disease))，自身免疫性神經(jīng)病(包括但不限于格-巴綜合征(Guillain-Barre syndrome)，慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病，不明意義的單克隆γ球蛋白病(monoclonal gammopathy ofundetermined significance)以及多發(fā)性神經(jīng)病)，三叉神經(jīng)痛，捕獲綜合征(entrapment syndromes)(包括但不限于Carpel通道)，外傷后神經(jīng)痛，假性肢痛(phantom limb pain)，多發(fā)性硬化性疼痛，復(fù)合型區(qū)域性疼痛綜合征(complex regional pain syndrome)(包括但不限于交感反射性營(yíng)養(yǎng)不良，灼痛)，腫瘤，脈管病性/血管病性神經(jīng)病以及自發(fā)性(idiopathic)神經(jīng)病)。
上述方法涉及以每劑每公斤受試者體重1μg-30,000μg的劑量給藥受試者包含神經(jīng)胚活素多肽的制劑給藥，優(yōu)選全身給藥受試者。在選擇性的實(shí)施方案中，所述劑量是每劑每公斤受試者體重10μg-30,000μg；所述劑量是每劑每公斤受試者體重25μg-10,000μg；所述劑量是每劑每公斤受試者體重25μg-3,000μg；所述劑量是每劑每公斤受試者體重50μg-3,000μg。
前述方法中所用的神經(jīng)胚活素多肽可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)膫鬏斚到y(tǒng)給藥，且優(yōu)選通過(guò)以下傳輸途徑傳輸靜脈內(nèi)傳輸，肌肉內(nèi)傳輸，肺內(nèi)傳輸，皮下傳輸或腹膜內(nèi)傳輸，最優(yōu)選通過(guò)肌肉內(nèi)傳輸或皮下傳輸給藥。前述方法中所用的神經(jīng)胚活素多肽也可以通過(guò)鞘內(nèi)傳輸給藥。
本發(fā)明包含NBN多肽的制劑也可以以定時(shí)釋放的組合物給藥。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與該發(fā)明所屬于的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的含義相同。盡管與本發(fā)明所述等同的步法和材料可在實(shí)踐或檢驗(yàn)本發(fā)明時(shí)應(yīng)用，但本發(fā)明以下仍然對(duì)適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧线M(jìn)行了描述。本文中所提及的所有出版物，專利申請(qǐng)，專利和其他參考文獻(xiàn)在此以其全文引入本文作為參考。在發(fā)生沖突時(shí)，依據(jù)包括定義的本說(shuō)明書(shū)。另外，本發(fā)明的材料，方法以及實(shí)施例僅用于作例證性說(shuō)明，不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)在以下詳細(xì)的說(shuō)明和權(quán)利要求中是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1的虛線圖表示，通過(guò)向L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)大鼠皮下給藥神經(jīng)胚活素(NBN)，可使觸覺(jué)異常性疼痛得到幾乎完全的預(yù)防；圖2的虛線圖表示，通過(guò)向L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)大鼠皮下給藥神經(jīng)胚活素(NBN)，可使熱痛覺(jué)過(guò)敏得到幾乎完全的預(yù)防；圖3的虛線圖表示，通過(guò)向L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)大鼠皮下給藥神經(jīng)胚活素(NBN)，可使完全確定的觸覺(jué)異常性疼痛得到幾乎完全的逆轉(zhuǎn)；圖4的虛線圖表示，通過(guò)向L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)大鼠皮下給藥神經(jīng)胚活素(NBN)，可使完全確定的熱痛覺(jué)過(guò)敏得到幾乎完全的逆轉(zhuǎn)；圖5的條線圖表示，通過(guò)向STZ(鏈脲霉素)誘導(dǎo)的神經(jīng)病大鼠皮下給藥神經(jīng)胚活素(NBN)，可使熱痛覺(jué)減退得到幾乎完全的校正；圖6A和圖6B表示，在STZ處理后4周(圖6A)和8周(圖6B)，向STZ(鏈脲霉素)誘導(dǎo)的神經(jīng)病大鼠皮下給藥神經(jīng)胚活素，可預(yù)防熱痛覺(jué)過(guò)敏(圖6A)，預(yù)防熱痛覺(jué)減退(圖6B)，逆轉(zhuǎn)熱痛覺(jué)過(guò)敏(圖6B)。
圖7的虛線圖表示，通過(guò)向L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)大鼠皮下給藥神經(jīng)胚活素，可使完全確定的觸覺(jué)異常性疼痛得到神經(jīng)胚活素劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)。
圖8的虛線圖表示，通過(guò)向L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)大鼠皮下給藥神經(jīng)胚活素，可使完全確定的熱痛覺(jué)過(guò)敏得到神經(jīng)胚活素劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過(guò)給藥有患神經(jīng)病性疼痛危險(xiǎn)，或已患神經(jīng)病性疼痛的受試者神經(jīng)胚活素多肽，治療神經(jīng)病性疼痛，治療觸覺(jué)異常性疼痛并降低痛覺(jué)敏感性喪失的方法和組合物。
神經(jīng)胚活素多肽是可提高存活，維持表型分化，防止退化，促進(jìn)再生并恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)組織活性的蛋白。神經(jīng)胚活素(最初例如在WO00/01815中描述)還可稱作“artemin”(參見(jiàn)，例如WO 00/18799)和“enovin”(參見(jiàn)，例如WO 00/04050)。神經(jīng)胚活素已經(jīng)被分類作為TGF-β超家族的關(guān)系較遠(yuǎn)的成員(Massague，等，.1994，Trends in Cell Biology，4172-178)，且是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子配體家族的一個(gè)成員(“GDNF”；WO93/06116，已引入本為作為參考)，在該家族中包括GDNF，persephin(“PSP”；Milbrandt等.，1998，Neuron 20245-253，已引入本為作為參考)和neurturin(“NTN”；WO 97/08196，已引入本為作為參考)。GDNF亞家族的配體都有通過(guò)RET受體酪氨酸激酶誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的能力。GDNF亞家族的這三個(gè)配體在其對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性受體家族，GFRα受體的相對(duì)親和性方面不同。神經(jīng)胚活素優(yōu)選通過(guò)α3-RET復(fù)合物起作用。Baudet等.，Development，127，pp.4335-44(2000)；Baloh等.，Neuron，21，pp.1291-1302(1998)；Airaksinen等.，Mol.Cell.Neuroscience，13，pp.3 13-325(1999)。
神經(jīng)胚活素(SEQ ID NO2)與GDNF亞家族成員Neurturin(SEQ IDNO6)，Persephin(SEQ ID NO7)和GDNF(SEQ ID NO8)的氨基酸序列比較如表1所示。在本發(fā)明中應(yīng)用的神經(jīng)胚活素多肽優(yōu)選有GDNF亞家族的指紋結(jié)構(gòu)，即，表1中有下劃線的氨基酸殘基。


從表1所示的氨基酸序列對(duì)比可以看出，神經(jīng)胚活素在TGF-β超家族中的保守位置處有七個(gè)半胱氨酸殘基。根據(jù)序列對(duì)比顯示，神經(jīng)胚活素是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子GDNF亞家族(LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC，表1有下劃線處所示的GDNF亞家族指紋結(jié)構(gòu))的一個(gè)成員。
本發(fā)明所用的神經(jīng)胚活素多肽可以以任何生物活性形式提供，包括原前蛋白(pre-pro-protein)形式，前蛋白(pro-protein)形式，成熟蛋白形式，糖基化的蛋白形式，磷酸化的蛋白形式，截短的形式，或任何其他翻譯后修飾的蛋白形式。推測(cè)有生物活性的神經(jīng)胚活素是每種NBN變體的二聚化形式，因?yàn)槎垠w的形成對(duì)活性而言是必需的。據(jù)觀察單體的NBN多肽活性極低至無(wú)活性。有生物活性的神經(jīng)胚活素多肽包括二聚化的多肽，該多肽在輔助因子(如GFRα3或RET)存在下，與GFRα3或與GFRα和RET的復(fù)合物結(jié)合，誘導(dǎo)RET的二聚化以及RET的自動(dòng)磷酸化。因此，本文所用“神經(jīng)胚活素多肽”是指具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的多肽(例如，如WO 00/01815所述)，這些多肽如下1.野生型神經(jīng)胚活素以下“野生型”神經(jīng)胚活素氨基酸(“aa”或“AA”)序列是可用于本發(fā)明的方法和組合物中的那些氨基酸序列的舉例--SEQ ID NO2的AA-80-AA140(“野生型”人原前蛋白(prepro))，--SEQ ID NO2的AA-41-AA140(人前蛋白(pro))，--SEQ ID NO2的AA1-AA140(成熟蛋白140AA(SEQ ID NO11)；此后稱“140NBN”)，--SEQ ID NO2的AA25-AA140(成熟蛋白116AA(SEQ ID NO12)；此后稱“116NBN”)，--SEQ ID NO2的AA28-AA140(成熟蛋白113AA(SEQ ID NO13)；此后稱“113NBN”)，--SEQ ID NO4的AA80-AA144(小鼠原前蛋白)，--SEQ ID NO4的AA1-AA144(小鼠成熟蛋白--144AA)，--SEQ ID NO5的AA1-AA224(大鼠的原前蛋白)，--SEQ ID NO5的AA81-AA224(大鼠的成熟蛋白--144AA)，
--具有SEQ ID NO2的AA107-AA140所示C末端序列的肽，更優(yōu)選SEQID NO2的AA76-AA140，且它們保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7個(gè)Cys殘基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的神經(jīng)胚活素多肽包含如SEQ ID NO2中位置43，70，74，107，108，136和138處保守的(7個(gè))半胱氨酸。已知這7個(gè)保守的半胱氨酸殘基是在TGF-β超家族內(nèi)，以形成三個(gè)單體內(nèi)二硫鍵(所涉及到的，例如，在SEQ ID NO2中半胱氨酸殘基43-108之間，70-136之間和74-138之間)和一個(gè)單體間二硫鍵(所涉及的，例如在SEQ ID NO2中半胱氨酸殘基107-107之間)，它們與延伸的β鏈區(qū)一起構(gòu)成TGF-β超家族的保守結(jié)構(gòu)基序。參見(jiàn)，例如Daopin等.，Proteins 1993，17176-192。
2.截短的神經(jīng)胚活素(“NBNs”)可用于在本發(fā)明的神經(jīng)胚活素多肽還包括全長(zhǎng)神經(jīng)胚活素分子的截短形式。在這些截短的分子中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸已從N末端或C末端，優(yōu)選N末端缺失。截短的神經(jīng)胚活素多肽可以這樣得到，即通過(guò)提供成熟的神經(jīng)胚活素多肽，并使成熟的神經(jīng)胚活素多肽與至少一種蛋白酶，在足以產(chǎn)生截短的神經(jīng)胚活素多肽的條件下接觸。優(yōu)選，至少一種蛋白酶是外蛋白酶，且與成熟的神經(jīng)胚活素多肽接觸時(shí)形成外肽酶神經(jīng)胚活素多肽消化產(chǎn)物，該產(chǎn)物能被二肽酶進(jìn)一步消化。
本文中所描述的截短的神經(jīng)胚活素多肽優(yōu)選包括這樣的多肽序列，該序列包含在成熟的神經(jīng)胚活素序列中保守的7個(gè)半胱氨酸殘基。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，截短的神經(jīng)胚活素多肽包括成熟113NBN神經(jīng)胚活素多肽的至少85個(gè)羧基末端氨基酸。
神經(jīng)胚活素的其他變體包括截短的NBN形式。這些實(shí)施例包括(i)112AA的多肽序列，在本文中稱為NBN112，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端112個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸29-140(SEQIDNO14)。
(ii)111AA的多肽序列，在本文中稱為NBN111，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端111個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸30-140(SEQID NO15)。
(iii)110AA的多肽序列，在本文中稱為NBN110，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端111個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸31-140(SEQID NO16)。
(iv)109AA的多肽序列，在本文中稱為NBN109，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端109個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸32-140(SEQID NO17)。
(v)108AA的多肽序列，在本文中稱為NBN108，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端108個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸33-140(SEQID NO18)。
(vi)107AA的多肽序列，在本文中稱為NBN107，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端107個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸34-140(SEQID NO19)。
(vii)106AA的多肽序列，在本文中稱為NBN106，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端106個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸35-140(SEQ ID NO20)。
(viii)105AA的多肽序列，在本文中稱為NBN105，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端105個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸36-140(SEQ ID NO21)。
(ix)104AA的多肽序列，在本文中稱為NBN104，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端104個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸37-140(SEQID NO22)。
(x)103AA的多肽序列，在本文中稱為NBN103，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端103個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸38-140(SEQID NO23)。
(xi)102AA的多肽序列，在本文中稱為NBN102，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端102個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸39-140(SEQID NO24)。
(xii)101AA的多肽序列，在本文中稱為NBN101，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端101個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸40-140(SEQ ID NO25)。
(viii)100AA的多肽序列，在本文中稱為NBN100，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端100個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸41-140(SEQ ID NO26)。
(xiv)99AA的多肽序列，在本文中稱為NBN99，其具有成熟神經(jīng)胚活素多肽的羧基末端99個(gè)氨基酸，例如，SEQ ID NO2的氨基酸42-140(SEQID NO27)。
可以理解，本發(fā)明所公開(kāi)的神經(jīng)胚活素多肽的截短形式(例如，112AA到99AA)具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。
在最優(yōu)選實(shí)施方案中，截短的神經(jīng)胚活素多肽是成熟的113AA的羧基末端氨基酸99aa，100aa，101aa，102aa，103aa，104aa，105aa，106aa，107aa，108aa，109aa，110aa，111aa或112aa(即，分別為NBN99，NBN100，NBN101，NBN102，NBN103，NBN104，NBN105，NBN106，NBN107，NBN108，NBN109，NBN110，NBN111或NBN112)。這些序列也可以在小鼠和大鼠神經(jīng)胚活素多肽中找到，分別為SEQ ID NOS4和5中的羧基末端99aa，100aa，101aa，102aa，103aa，104aa，105aa，106aa，107aa，108aa，109aa，110aa，111aa或112aa。這些最優(yōu)選的截短的NBN形式的實(shí)施例是有生物活性的(稱為“具有生物活性的截短的神經(jīng)胚活素多肽”)，因?yàn)樵诒景l(fā)明中已經(jīng)證明它們具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。如上所述，NBN二聚化是生物活性所必需的，因?yàn)橛^察到NBN單體多肽具有極小活性至沒(méi)有活性。
3.具有基本類似性或同一性的神經(jīng)胚活素(“NBNs”)變體可用于本發(fā)明的NBNs也包括與前述各種原前，前，成熟和截短的“神經(jīng)胚活素”多肽有基本類似性或同一性的氨基酸序列。優(yōu)選所用的神經(jīng)胚活素多肽與SEQ ID NO2，4，5或11-27所示的神經(jīng)胚活素多肽有至少70％，更優(yōu)選85％，甚至更優(yōu)選90％，或甚至更優(yōu)選95％的同一性或類似性。最優(yōu)選，所用的神經(jīng)胚活素多肽與SEQ ID NOS2，4，5或11-27所示的神經(jīng)胚活素多肽有至少99％的類似性或同一性。
侯選多肽與本發(fā)明的神經(jīng)胚活素多肽之間的同源性程度被確定為這兩個(gè)氨基酸序列之間的類似性或同一性的程度。
高水平的序列同一性提示第一個(gè)序列是衍生于第二個(gè)序列的可能性。氨基酸序列的同一性要求在兩個(gè)被對(duì)比的序列之間有相同的氨基酸序列。因此，與參考序列有70％氨基酸同一性的侯選序列要求的條件是，進(jìn)行對(duì)比后，侯選序列中70％的氨基酸與參考序列中相應(yīng)的氨基酸相同。由計(jì)算機(jī)分析確定同一性，例如，但不限于，ClustalX計(jì)算機(jī)對(duì)比程序(Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，Jeanmougin F，&Higgins DG″The ClustalX windowsinterfaceflexible strategies for multiple sequence alignment aided by qualityanalysis tools″；Nucleic Acids Res.1997，25(24)4876-82)和其中所建議的缺省參數(shù)。應(yīng)用該程序，由本發(fā)明類似的DNA序列編碼的多肽的成熟部分，與本發(fā)明SEQ ID NO2所示氨基酸序列(人NBN)，SEQ ID NOS4和5(嚙齒類NBN)或SEQ ID NOS11-27(成熟和截短的NBN)顯示至少70％，更優(yōu)選85％，甚至更優(yōu)選90％，或甚至更優(yōu)選95％，最優(yōu)選至少99％的同一性程度。
其他對(duì)比工具是已知的，如Needleman等，J.Mol.Biol.48443(1970)中所描述的動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法，以及Align Program，一種由DNAstar，Inc.生產(chǎn)的商業(yè)軟件包，其說(shuō)明已引入本文作參考。一旦進(jìn)行侯選序列和參考序列之間的對(duì)比和改進(jìn)，便可計(jì)算百分同源性的記分。將每一序列的單個(gè)的氨基酸根據(jù)它們彼此之間的類似性順序?qū)Ρ取?br> 類似性因素包括類似的大小，形狀和電荷。確定氨基酸類似性的一個(gè)尤其優(yōu)選的方法是Dayhoff等，在ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE ANDSTRUCTURE 345-352(1978，如上)中描述的PAM250矩陣，在此引入本文作參考。首先計(jì)算類似性記分為所對(duì)比的成對(duì)的氨基酸類似性記分的總數(shù)。用于百分同源性和同一性目的時(shí)忽略插入或缺失。因此，該計(jì)算中不用缺口罰分。將最初的記分除以侯選化合物和神經(jīng)胚活素多肽的7個(gè)半胱氨酸骨架的記分的幾何平均數(shù)來(lái)校正該記分。所述幾何平均數(shù)是這些記分的乘積的平方根。經(jīng)校正的最初記分是百分同源性。
如上所述，本發(fā)明的神經(jīng)胚活素多肽包括多肽變體。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“多肽變體”包括具有與SEQ ID NO2(人NBN)，或SEQ IDNOS4和5(嚙齒類NBN)，或SEQ ID NOS11-27(成熟和截短的NBN)所示氨基酸序列，在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上不同的氨基酸序列的多肽(或蛋白)。這樣的的多肽變體包括以上所述的修飾的多肽，和保守取代物，剪接變體，同種型(isoform)，來(lái)自其他種屬的同系物，以及多態(tài)物(polymorphisms)。
如本文以上所定義的，術(shù)語(yǔ)“保守取代”是指一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)生物學(xué)類似的殘基取代。通常，生物學(xué)的類似性，如上所述，反映在野生型序列上保守氨基酸的取代。例如，人們可以預(yù)測(cè)，保守的氨基酸取代對(duì)生物活性有極小影響或沒(méi)有影響，尤其是這些取代占多肽或蛋白中殘基總數(shù)的10％以下時(shí)。優(yōu)選，保守的氨基酸取代表示多肽或蛋白的5％以下的變化，最優(yōu)選多肽或蛋白的2％以下的變化。例如，當(dāng)按照例如人113NBN計(jì)算時(shí)，最優(yōu)選的保守取代表示在野生型成熟氨基酸序列中的三個(gè)以下的氨基酸取代。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，在成熟序列中有單個(gè)氨基酸取代，其中被取代的氨基酸和取代的氨基酸都是非環(huán)狀的。
特定的保守取代的其他實(shí)施例包括一個(gè)疏水性殘基被另一個(gè)殘基，如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或蛋氨酸取代，或一個(gè)極性殘基被另一個(gè)殘基取代，如精氨酸被賴氨酸取代，谷氨酸被天冬氨酸取代，或谷氨酰胺被天冬酰胺取代等等。
所述保守取代的術(shù)語(yǔ)也包括用被取代的氨基酸殘基代替非被取代的親代氨基酸殘基，條件是針對(duì)被取代的多肽的抗體也與非被取代的多肽有免疫反應(yīng)。
對(duì)最初的氨基酸序列的修飾可產(chǎn)生與未被修飾的對(duì)應(yīng)多肽相比具有實(shí)質(zhì)上相同活性的蛋白，因此它可以被看作是親代蛋白的功能類似物。這樣的修飾可以是例如通過(guò)點(diǎn)突變預(yù)先計(jì)劃的，或它們也可以是自然發(fā)生的，并包括剪接變體，同種型，來(lái)自其他種屬的同系物。這樣的功能類似物也包括在本發(fā)明中。
另外，對(duì)最初的氨基酸序列的修飾也可以產(chǎn)生不保持親代蛋白生物活性的蛋白，包括顯性失活形式等等。顯性失活蛋白通過(guò)結(jié)合，或隔絕調(diào)節(jié)劑，如上游或下游成分(它們通常與所述多肽功能性地相互作用)來(lái)干擾野生型蛋白。這樣的顯性失活形式也包括在本發(fā)明中。
4.衍生物或修飾的NBNs本發(fā)明的多肽也包括嵌合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一多肽被融合在所述多肽或其片段的N末端或C末端。嵌合多肽可以通過(guò)將編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融合來(lái)生產(chǎn)。生產(chǎn)嵌合多肽的技術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。該技術(shù)通常需要將序列進(jìn)行連接以使它們處于同一讀框中，且在相同啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控下表達(dá)所述融合多肽。
神經(jīng)胚活素多肽可以是N-糖基化的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，SEQ IDNO2的位置122處的Asn殘基被糖基化。
本發(fā)明也包括神經(jīng)胚活素融合蛋白，如Ig-融合物，例如在美國(guó)專利5,434,131；5,565,335；5,541,087和5,726,044中所描述的(它們都引入本文作參考)，或優(yōu)選血清白蛋白融合物。
本發(fā)明可用的神經(jīng)胚活素多肽包括定時(shí)釋放的組合物和用衍生半分子(優(yōu)選聚乙二醇半分子)修飾的神經(jīng)胚活素多肽，以延長(zhǎng)存留時(shí)間和/或增加在體液中的濃度。另外，所述神經(jīng)胚活素多肽也可以用選自如下的半分子衍生脂肪族酯，酰胺，N-?；苌铮騉-?；苌铩?br> 下面表2顯示人(SEQ ID NO2)，小鼠(SEQ ID NO4)和大鼠(SEQ IDNO5)原前神經(jīng)胚活素之間的ClustalW對(duì)比。成熟NBN多肽NBN140，NBN116，NBN113和NBN99用“*”表示。NBN112的N末端到NBN100用連續(xù)的“:”符號(hào)表示。下面表3顯示野生型人，小鼠和大鼠神經(jīng)胚活素多肽(SEQ ID NOS2，4和5)之間距離的對(duì)比。
表2.人，小鼠和大鼠神經(jīng)胚活素的ClustalWd對(duì)比
表3.人，小鼠和大鼠神經(jīng)胚活素的距離對(duì)比 神經(jīng)胚活素多肽的生產(chǎn)方法本發(fā)明中所用的神經(jīng)胚活素多肽可分離自哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選分離自人細(xì)胞或小鼠源的細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述神經(jīng)胚活素多肽可分離自人心臟組織，分離自人骨骼肌，自人胰腺，或自人腦組織，尤其分離自尾狀核或丘腦，或者其可得自哺乳動(dòng)物源的DNA，這在以下將予以詳述。
或者，可以通過(guò)表達(dá)編碼該神經(jīng)胚活素多肽的多核苷酸的表達(dá)來(lái)獲得所述神經(jīng)胚活素多肽。這樣的多核苷酸包括DNA，cDNA和RNA序列，且在本領(lǐng)域中可得到。參見(jiàn)，例如，WO 00/01815，WO 00/04050和WO00/18799，在此引入本文作為參考。尤其有用的多核苷酸有SEQ ID NO1所示的DNA序列(人NBN cDNA)，和SEQ ID NO3所示的DNA序列(小鼠NBN cDNA)。另外，人NBN的基因組序列也可以應(yīng)用(參見(jiàn)GenBank，登錄號(hào)為AC 005038)。
更具體的，本發(fā)明所用的神經(jīng)胚活素多肽可通過(guò)在允許神經(jīng)胚活素多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含編碼神經(jīng)胚活素多肽的核酸序列的細(xì)胞，然后從該培養(yǎng)基中回收所述神經(jīng)胚活素多肽。編碼神經(jīng)胚活素多肽的核酸序列可以是通常情況下內(nèi)源于細(xì)胞的核酸序列，或是被導(dǎo)入到“生產(chǎn)”細(xì)胞中的外源衍生的核酸序列。當(dāng)為了生產(chǎn)神經(jīng)胚活素多肽而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾時(shí)，所述細(xì)胞可以通過(guò)常規(guī)方法或通過(guò)基因活化進(jìn)行修飾。
根據(jù)常規(guī)方法，包含神經(jīng)胚活素cDNA或基因組DNA序列的DNA分子可被包含在表達(dá)構(gòu)建體中，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞中，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括，但不限于，脂質(zhì)體-，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)-，或DEAE葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，磷酸鈣沉淀，微注射，或高速驅(qū)動(dòng)的微粒(“biolistics”)。或者，人們可以用通過(guò)病毒載體傳輸DNA的系統(tǒng)。已知用于基因傳輸?shù)牟《景ㄏ俨《?，腺相關(guān)病毒，慢病毒，皰疹病毒，腮腺病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，新培斯病毒和痘苗病毒，如金絲雀痘病毒，以及昆蟲(chóng)細(xì)胞，尤其是Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞的桿狀病毒感染。
或者，可以用基因活化(“GA”)的方法來(lái)修飾所述細(xì)胞以產(chǎn)生神經(jīng)胚活素多肽，所述方法如美國(guó)專利5,733,761和5,750,376(它們已引入本為作為參考)中所描述的。
因此，在指細(xì)胞時(shí)本文所用的術(shù)語(yǔ)“基因修飾的”包含這樣的細(xì)胞，即在導(dǎo)入編碼基因產(chǎn)物的核酸分子和/或控制基因產(chǎn)物的內(nèi)源性編碼序列表達(dá)的調(diào)控元件后，表達(dá)特定基因產(chǎn)物的細(xì)胞。所述核酸分子可通過(guò)基因打靶，允許所述核酸分子在特定基因組位點(diǎn)摻入而被導(dǎo)入。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)胚活素多肽在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)，優(yōu)選在大腸桿菌細(xì)胞中。在不同的實(shí)施方案中，所述神經(jīng)胚活素多肽在昆蟲(chóng)衍生的細(xì)胞中，尤其是在Sf9中生產(chǎn)。
在另一實(shí)施方案中，所述神經(jīng)胚活素多肽在例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，例如，人細(xì)胞，卵母細(xì)胞或酵母細(xì)胞中生產(chǎn)。本發(fā)明的細(xì)胞可以是，但不限于，人胚胎腎(“HEK”)細(xì)胞，例如，HEK293細(xì)胞，BHK21細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(“CHO”)細(xì)胞，滑爪蟾(Xenopus laevis)卵母細(xì)胞(“XLO”)或巴斯德畢赤(酵母)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞是真菌細(xì)胞，例如，絲狀真菌細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞，最優(yōu)選Sf9細(xì)胞。本發(fā)明其他的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是PCl2，HiB5和RN33b細(xì)胞系，人神經(jīng)先祖細(xì)胞以及來(lái)源于人細(xì)胞的其他細(xì)胞，尤其是神經(jīng)細(xì)胞。
初級(jí)或次生細(xì)胞的實(shí)施例包括成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞包括乳腺的和小腸的上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，形成血液的成份，包括淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，肝細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，肌細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，或這些細(xì)胞類型的前體細(xì)胞。可用于本方法的永生化人細(xì)胞系的實(shí)施例包括但不限于，Bowes黑色素瘤細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CRL9607)，Daudi cells(ATCC登錄號(hào)CCL213)，HeLa細(xì)胞以及其衍生物(ATCC登錄號(hào)CCL2，CCL2.1和CCL2.2)，HL-60細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CCL240)，HT-1080細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CL121)，Jurkat細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)TIB 152)，KB癌細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CCL17)，K-562白血病細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CCL 243)，MCF-7乳腺癌細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)BTH 22)，MOLT-4細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)1582)，Namalwa細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CRL 1432)，Raji細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CCL86)，RPMI 8226細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CCL155)，U-937細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CRL1593)，WI-38VA13亞系2R4細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)CLL 75.1)，以及2780AD卵巢癌細(xì)胞(Van der Blick等.，Cancer Res.485927-5932，1988)，以及由人細(xì)胞和其他種屬的細(xì)胞融合的異種雜交瘤細(xì)胞。次生人成纖維細(xì)胞株如WI-38(ATCC登錄號(hào)CCL75)和MRC-5(ATCC登錄號(hào)CCL 171)也可應(yīng)用。
當(dāng)所述細(xì)胞是真核細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明異源多核苷酸的摻入可特別通過(guò)感染(使用病毒載體)，轉(zhuǎn)染(使用質(zhì)粒載體)，應(yīng)用磷酸鈣沉淀，微注射，電穿孔，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或本領(lǐng)域已知的其他物理化學(xué)方法。
從生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)物中，或從生產(chǎn)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化技術(shù)，包括重折疊(如果可應(yīng)用的話)，來(lái)分離NBN多肽。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)在以下實(shí)施例中描述。
治療的受試者本發(fā)明可用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物受試者神經(jīng)病性疼痛，包括觸覺(jué)異常性疼痛，以及降低與神經(jīng)病有關(guān)的痛覺(jué)敏感性喪失，所述受試者患有上述疾病，或有患這些疾病的危險(xiǎn)。有發(fā)生神經(jīng)病危險(xiǎn)的受試者和有與該神經(jīng)病有關(guān)的痛覺(jué)敏感性喪失危險(xiǎn)的受試者包括，患糖尿病的受試者，接受化療的受試者，經(jīng)歷過(guò)一些創(chuàng)傷的受試者，攝入了各種毒素或藥物的受試者，經(jīng)歷某些維生素缺乏的受試者，感染某些病毒性病原體的受試者，患各種自身免疫性疾病和代謝性疾病的受試者，以及經(jīng)歷某些神經(jīng)損傷或神經(jīng)退化的受試者。哺乳動(dòng)物受試者包括羊，馬，狗，貓，豬，兔，豚鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，殺鼠以及小鼠，但最優(yōu)選是人。
通常，在人受試者中，所述患者或者難以用其他傳統(tǒng)疼痛療法醫(yī)治，或者受試者對(duì)其他這樣的能提供滿意的疼痛控制的疼痛療法應(yīng)答不充分。
一般而言，該方法的特征在于預(yù)防性治療和治療目的性治療的方案。在預(yù)防性治療中，將神經(jīng)胚活素多肽給藥有神經(jīng)病性疼痛危險(xiǎn)的受試者或出現(xiàn)疼痛敏感性喪失的受試者；預(yù)計(jì)這樣的受試者是患有早期階段神經(jīng)病的受試者。在這種情況下用神經(jīng)胚活素進(jìn)行的治療可用來(lái)預(yù)防性治療有危險(xiǎn)的患者。
在治療目的性治療中，將神經(jīng)胚活素多肽給藥已患神經(jīng)病性疼痛或已患由神經(jīng)病所導(dǎo)致的疼痛敏感性喪失的受試者；預(yù)計(jì)這樣的受試者是患晚期神經(jīng)病的受試者。在這種情況下用神經(jīng)胚活素進(jìn)行的治療用來(lái)緩解神經(jīng)病性疼痛和/或恢復(fù)受試者的適當(dāng)?shù)奶弁疵舾行浴＿@樣的晚期患者可能已接受過(guò)從自我醫(yī)治開(kāi)始(如非類固醇抗炎藥物，例如，布洛芬)的多種治療。這樣的治療可以逐步上升到抗抑郁藥(例如，三環(huán)的抗抑郁藥，vanlafaxine，以及選擇性的5-羥色胺再攝取抑制劑-具體藥物包括阿米替林(amitriptyline)，去甲丙咪嗪(desipramine)，丙咪嗪(imipramine)以及去甲替林(nortriptyline)，或抗驚厥藥(例如加巴噴丁，卡馬西平(carbamazepine)，拉莫三嗪(lamotrigine)，托吡酯(topiramate)和苯妥英。其他藥療法包括局部止痛藥(例如，辣椒辣素(capsaicin)和lidoderm)，抗心律失常藥和類鴉片。嚴(yán)重神經(jīng)病的病例可以進(jìn)行外科手術(shù)。研究提示有50％以下的患者對(duì)局部止痛藥，抗心律失常藥，類鴉片或外科手術(shù)有效。
方法以及藥物組合物本發(fā)明提供治療神經(jīng)病性疼痛，治療觸覺(jué)異常性疼痛的方法，以及降低與神經(jīng)病有關(guān)的痛覺(jué)敏感性喪失的方法。本發(fā)明使用神經(jīng)胚活素多肽，包括全長(zhǎng)神經(jīng)胚活素多肽或具有生物活性的截短的神經(jīng)胚活素多肽。另外，本發(fā)明還提供包含懸浮，溶解或分散在可藥用載體中的全長(zhǎng)神經(jīng)胚活素多肽或截短的神經(jīng)胚活素多肽的藥物組合物。
1.神經(jīng)病性疼痛的治療在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于治療受試者神經(jīng)病性疼痛的方法，包括給藥受試者有效量的神經(jīng)胚活素多肽。所述神經(jīng)胚活素多肽可單獨(dú)給藥(單一(mono)-治療)或作為聯(lián)合治療方案的一部分。優(yōu)選的聯(lián)合治療包括給藥受試者有效量的選自以下的誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物類鴉片，抗心律失常藥，局部的止痛藥，局限的止痛藥，抗驚厥藥，抗抑郁藥，皮質(zhì)類固醇或非類固醇抗炎藥(NSAIDS)。
本發(fā)明的神經(jīng)胚活素多肽和核酸(以及包含它們的藥物組合物)用于治療與外周神經(jīng)病有關(guān)的疼痛的治療。依照本發(fā)明可治療的外周神經(jīng)病是創(chuàng)傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病，例如，由物理?yè)p傷或疾病狀態(tài)所導(dǎo)致的那些，對(duì)大腦的物理?yè)p傷，對(duì)脊髓的物理?yè)p傷，與大腦損傷有關(guān)的休克以及與神經(jīng)退化有關(guān)的神經(jīng)性疾病。
本發(fā)明還提供對(duì)以下神經(jīng)病的治療化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病(如由化療制劑，如紫杉醇或順鉑的傳輸誘導(dǎo)的神經(jīng)病)；毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)病，藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病，病原體誘導(dǎo)的(例如病毒誘導(dǎo)的)神經(jīng)病，維生素缺乏誘導(dǎo)的神經(jīng)??；自發(fā)性神經(jīng)病和糖尿病性神經(jīng)病。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5,496,804和5,916,555，它們都引入本文作參考。本發(fā)明還可進(jìn)一步用本發(fā)明的神經(jīng)胚活素核苷酸和多肽治療單(mono)-神經(jīng)病，單-多發(fā)性神經(jīng)病(mono-multiplex neuropathies)，以及多發(fā)性神經(jīng)病(poly-neuropathies)，包括軸突和脫髓鞘性神經(jīng)病。
所述神經(jīng)病性疼痛可以與多種外周神經(jīng)病有關(guān)，包括(a)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病，(b)化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病，(c)毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)病(包括但不限于由酒精中毒，維生素B6中毒，六碳化合物中毒，乙胺碘呋酮，氯霉素，雙硫醒，異煙肼，金，鋰，甲硝唑，米索硝唑，呋喃妥因誘導(dǎo)的神經(jīng)病)，(d)藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病，包括治療性藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病性疼痛(如由抗癌藥尤其是選自如下的抗癌藥所導(dǎo)致的神經(jīng)病疼痛紫杉醇，脫乙酰基紫杉醇，順鉑，噻氨酯噠唑，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春花堿；以及如抗病毒劑，尤其是選自如下的抗病毒劑導(dǎo)致的神經(jīng)病性疼痛ddI，DDC，d4T，磷卡萘替，氨苯砜，甲硝唑和異煙肼，(e)維生素缺乏誘導(dǎo)的神經(jīng)病(包括但不限于維生素B12缺乏，維生素B6缺乏以及維生素E缺乏)，(f)自發(fā)性神經(jīng)病，(g)糖尿病性神經(jīng)病，(h)病原體誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，
(i)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)損害，(j)神經(jīng)退化，(k)先天性神經(jīng)病(包括但不限于弗里德里希氏共濟(jì)失調(diào)，家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病，唐吉爾病，法布里氏病)，(l)代謝性疾病(包括但不限于腎功能不全和甲狀腺功能低下)，(m)傳染性和病毒性神經(jīng)病(包括但不限于與麻風(fēng)病，萊姆病有關(guān)的神經(jīng)病性疼痛，與病毒感染，尤其是與選自如下的病毒感染有關(guān)的神經(jīng)病性疼痛皰疹病毒(例如，可導(dǎo)致帶狀皰疹后神經(jīng)痛的帶狀皰疹病毒)，人免疫缺陷病毒(HIV)，以及乳頭瘤病毒)，(n)自身免疫性神經(jīng)病(包括但不限于格-巴綜合征，慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病，不明意義的單克隆γ球蛋白病以及多發(fā)性神經(jīng)病)，(o)三叉神經(jīng)痛和捕獲綜合征(包括但不限于Carpel通道)，(p)其他神經(jīng)病性疼痛綜合征包括創(chuàng)傷后神經(jīng)痛，假性肢痛，多發(fā)性硬化性疼痛，復(fù)合型區(qū)域性疼痛綜合征(包括但不限于交感反射性營(yíng)養(yǎng)不良，灼痛)，腫瘤相關(guān)的疼痛，脈管病性/血管病性神經(jīng)病以及坐骨神經(jīng)痛。
神經(jīng)病性疼痛可表現(xiàn)為異常性疼痛，痛覺(jué)過(guò)敏性疼痛，熱性痛覺(jué)過(guò)敏或假性肢痛。
2.觸覺(jué)異常性疼痛的治療術(shù)語(yǔ)“觸覺(jué)異常性疼痛”通常是指受試者的一種病癥，其中的疼痛是由通常無(wú)害的皮膚刺激(例如觸覺(jué))所誘導(dǎo)的。本發(fā)明的特征在于治療受試者觸覺(jué)異常性疼痛的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，觸覺(jué)異常性疼痛是通過(guò)單獨(dú)給藥受試者有效量的神經(jīng)胚活素多肽來(lái)治療的。
在另一實(shí)施方案中，觸覺(jué)異常性疼痛是通過(guò)將有效量的神經(jīng)胚活素多肽和有效量的選自如下誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物聯(lián)合給藥受試者來(lái)治療的類鴉片，抗心律失常藥，局部的止痛藥，局限的止痛藥，抗驚厥藥，抗抑郁藥，皮質(zhì)類固醇或NSAIDS。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物是抗驚厥藥。在另一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物是加巴噴丁(1-(氨甲基)環(huán)己烷乙酸)或pregabalin(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
3.降低疼痛敏感性喪失的治療在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于降低患神經(jīng)病的受試者痛覺(jué)敏感性喪失的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述神經(jīng)病是糖尿病性神經(jīng)病。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述痛覺(jué)敏感性喪失是熱的痛覺(jué)敏感性喪失。本發(fā)明既包括預(yù)防性治療又包括治療目的性治療。
在預(yù)防性治療中，將神經(jīng)胚活素多肽給藥有神經(jīng)病性疼痛危險(xiǎn)的受試者或出現(xiàn)疼痛敏感性喪失的受試者；預(yù)計(jì)這樣的受試者是患有早期階段神經(jīng)病的受試者。在這種情況下用神經(jīng)胚活素進(jìn)行的治療可用來(lái)預(yù)防性治療有危險(xiǎn)的患者。
在治療目的性治療中，將神經(jīng)胚活素多肽給藥已患神經(jīng)病性疼痛或已患由神經(jīng)病所導(dǎo)致的疼痛敏感性喪失的受試者；預(yù)計(jì)這樣的受試者是患晚期神經(jīng)病的受試者。在這種情況下用神經(jīng)胚活素進(jìn)行的治療用來(lái)緩解神經(jīng)病性疼痛和/或恢復(fù)受試者的適當(dāng)?shù)奶弁疵舾行浴?br> 4.病毒感染與和病毒有關(guān)的神經(jīng)病的治療對(duì)傳染性和病毒性神經(jīng)病的預(yù)防性治療也包括在本發(fā)明中。預(yù)防性治療是指在確定病毒感染后神經(jīng)病性疼痛發(fā)作前進(jìn)行的治療。在治療期間，給藥NBN多肽以預(yù)防神經(jīng)病性疼痛的出現(xiàn)，所述神經(jīng)病性疼痛包括但不限于與麻風(fēng)病，萊姆病有關(guān)的神經(jīng)病性疼痛，與病毒感染，尤其與選自如下的病毒感染有關(guān)的神經(jīng)病性疼痛皰疹病毒(尤其是帶狀皰疹病毒，其引起帶狀皰疹后神經(jīng)痛)，人免疫缺陷病毒(HIV)，以及乳頭瘤病毒。在另一實(shí)施方案中，給藥NBN多肽以降低神經(jīng)病性疼痛的嚴(yán)重性，如果神經(jīng)病性疼痛出現(xiàn)的話。
急性病毒感染的癥狀通常包括皮疹的出現(xiàn)。其他的癥狀包括，例如，在身體的患病區(qū)域出現(xiàn)持續(xù)的疼痛，而這是帶狀皰疹(單純性的)感染的常見(jiàn)主訴。帶狀皰疹后神經(jīng)痛可持續(xù)一個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，且可在任何皮疹樣癥狀消失以后幾個(gè)月出現(xiàn)。帶狀皰疹后神經(jīng)痛可非常嚴(yán)重且持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，而且可能對(duì)治療是非常抵抗的。
5.糖尿病性神經(jīng)病的治療糖尿病有關(guān)的神經(jīng)病的預(yù)防性治療也包括在本發(fā)明中。糖尿病性神經(jīng)病的預(yù)防性治療可以在確定糖尿病的初步診斷或糖尿病相關(guān)癥狀后，神經(jīng)病性疼痛發(fā)作前開(kāi)始。糖尿病性神經(jīng)病的預(yù)防性治療也可在確定受試者有發(fā)展成糖尿病或糖尿病相關(guān)癥狀的危險(xiǎn)時(shí)開(kāi)始。在治療期間，給藥NBN多肽以預(yù)防神經(jīng)病性疼痛的出現(xiàn)，或降低神經(jīng)病性疼痛的嚴(yán)重性，如果出現(xiàn)神經(jīng)病性疼痛的話。
圖6A和圖6B的結(jié)果與需要此治療的人患者的糖尿病性神經(jīng)病的治療相關(guān)。對(duì)熱痛覺(jué)減退的預(yù)防和對(duì)熱痛覺(jué)過(guò)敏的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)，如實(shí)施例6所述，也包括在本發(fā)明中。
6.劑量前述方法涉及給藥，優(yōu)選全身給藥受試者包含神經(jīng)胚活素多肽的制劑，給藥劑量在每劑每公斤受試者體重1μg-30,000μg；優(yōu)選所述劑量是每劑每公斤受試者體重10μg-10,000μg；最優(yōu)選所述劑量是每劑每公斤受試者體重25μg-3,000μg。
用于治療或預(yù)防觸覺(jué)異常性疼痛的各種劑量方案都包括在本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥受試者包含神經(jīng)胚活素多肽的制劑的方法包括以每劑每公斤受試者體重1μg-30,000μg的劑量給藥NBN。在另一實(shí)施方案中，所述劑量是每劑每公斤受試者體重10μg-30,000μg。在另一實(shí)施方案中，所述劑量是每劑每公斤受試者體重10μg-10,000μg。在不同的實(shí)施方案中，所述劑量是每劑每公斤受試者體重25μg-10,000μg。在另一實(shí)施方案中，所述劑量是每劑每公斤受試者體重25μg-3,000μg。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述劑量是每劑每公斤受試者體重50μg-3,000μg。
同樣，調(diào)節(jié)痛覺(jué)敏感性喪失的治療的各種劑量方案也包括在本發(fā)明中。給藥受試者包含神經(jīng)胚活素多肽的制劑的方法包括，以每劑每公斤受試者體重1μg-30,000μg的劑量給藥NBN；優(yōu)選所述劑量是每劑每公斤受試者體重10μg-10,000μg；最優(yōu)選所述劑量是每劑每公斤受試者體重25μg-3,000μg。
7.傳輸用于前述方法中的神經(jīng)胚活素多肽可由任何合適的傳輸系統(tǒng)給藥，所述傳輸系統(tǒng)優(yōu)選選自靜脈內(nèi)傳輸，肌肉內(nèi)傳輸，肺內(nèi)傳輸，皮下傳輸或腹膜內(nèi)傳輸，最優(yōu)選由肌肉內(nèi)傳輸，靜脈內(nèi)傳輸或皮下傳輸給藥。前述方法中所用的神經(jīng)胚活素多肽也可以通過(guò)鞘內(nèi)傳輸給藥。
8.藥物配制本發(fā)明也提供新的包含治療有效量的神經(jīng)胚活素多肽的藥用組合物，所述神經(jīng)胚活素多肽懸浮，溶解或分散在可藥用載體中。
為在治療中應(yīng)用，本發(fā)明的多肽可以任何方便的形式給藥。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽與一種或多種佐劑，賦形劑，載體和/或溶劑一起摻入到藥物組合物中，且所述藥物組合物用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法為技術(shù)人員所制備。配制和給藥技術(shù)方面的詳細(xì)描述可參見(jiàn)最新版的REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Maack Publishing Co.，Easton，PA)?？山邮艿娜軇d體和賦形劑通常不對(duì)接受者的內(nèi)環(huán)境，尤其是對(duì)電解質(zhì)平衡產(chǎn)生不良的影響?？山邮艿妮d體可包括生物相容性的，惰性的或生物可吸收的鹽，緩沖劑，寡-或多糖，多聚體，粘度改善劑，防腐劑等等。一例證性載體包含標(biāo)準(zhǔn)的生理鹽水(0.15M NaCI，pH7.0至7.4)。另一例證性載體包含50mM磷酸鈉，100mM氯化鈉。
9.藥療方案給藥本發(fā)明神經(jīng)胚活素多肽的頻率屬于醫(yī)生的技術(shù)和臨床判斷范圍內(nèi)。通常給藥方案通過(guò)臨床試驗(yàn)來(lái)確定，所述臨床試驗(yàn)可確定最佳的給藥參數(shù)。然而，從業(yè)者可依照受試者的年齡，健康狀況，體重，性別和醫(yī)療狀況改變這種給藥方案。給藥的頻率也可視神經(jīng)病的急性和慢性治療而不同。另外，給藥的頻率也可根據(jù)該治療是治療目的性還是預(yù)防性而不同。
實(shí)施例實(shí)施例1神經(jīng)胚活素多肽的表達(dá)A.在大腸桿菌中的表達(dá)為在細(xì)菌中表達(dá)和純化，使編碼大鼠神經(jīng)胚活素的質(zhì)粒在大腸桿菌中作為有His標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)，該蛋白在緊鄰成熟的113個(gè)氨基酸的NBN序列起始處有腸激酶切割位點(diǎn)。大腸桿菌細(xì)胞在500L的發(fā)酵罐中生長(zhǎng)，并提供冷凍的細(xì)胞團(tuán)。在Manton GaulinPress中裂解大腸桿菌細(xì)胞，并從不溶性的洗滌后的沉淀部分回收大鼠的NBN。
用鹽酸胍從沉淀中提取NBN，進(jìn)行重折疊，并用腸激酶除去His-標(biāo)簽。為進(jìn)行進(jìn)一步純化，將產(chǎn)物在Ni NTA瓊脂(Qiagen)上層析，再在BakerbondWP CBX陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上層析。
將所得產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步定性，包括以下的分析SDS-PAGE，大小排阻層析(SEC)，反相HPLC，基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化質(zhì)譜(MALD/IMS)，肽圖，在KIRA ELISA中進(jìn)行活性評(píng)估以及內(nèi)毒素含量的確定。用SDS-PAGE和SEC檢測(cè)的NBN產(chǎn)物的純度在95％以上。在非還原條件下遷移的NBN產(chǎn)物是二聚體，這與其所預(yù)計(jì)的結(jié)構(gòu)相一致。該物質(zhì)中的內(nèi)毒素含量常規(guī)少于1EU/mg。在KIRA ELISA中的NBN的比活性大約為10nM。所述產(chǎn)物用PBS pH6.5配制成1mg/ml。該物質(zhì)也可儲(chǔ)存在-70℃，作為冷凍液體提供。
類似的表達(dá)系統(tǒng)也可構(gòu)建用于人NBN。從這些構(gòu)建體，已在大腸桿菌中表達(dá)了人NBN。
B.哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)質(zhì)粒pJC070.14的構(gòu)建為在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)神經(jīng)胚活素cDNA，將編碼人神經(jīng)胚活素原前形式的cDNA片段插入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pEAG347中，來(lái)產(chǎn)生質(zhì)粒pJC070.14。pEAG347包含串聯(lián)的SV40早期啟動(dòng)子和腺病毒的主要晚期啟動(dòng)子(來(lái)源于質(zhì)粒pAD2β；Norton and Coffin，Mol.Cell.Biol.5281(1985))，唯一的NotI克隆位點(diǎn)，其后是SV40晚期轉(zhuǎn)錄終止和PolyA信號(hào)(來(lái)源于質(zhì)粒pCMVβ；MacGregor and Caskey，Nucl.Acids.Res.172365(1989))。另外，pEAG347包含pUC19來(lái)源的質(zhì)粒骨架和pSV2dhfr來(lái)源的dhfr，用于進(jìn)行MTX選擇和在轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞中擴(kuò)增。
質(zhì)粒pJC070.14以二步產(chǎn)生。首先，編碼人神經(jīng)胚活素原前形式的片段，用寡核苷酸KD2-824 5′AAGGAAAAA GCGGCCGCCA TGGAACTTGGACTTGGAGG3′(SEQ ID NO9)，KD2-825 5′TTTTTTCCTT GGCGGCCGCTCAGCCCAGGC AGCCGCAGG3′(SEQ ID NO10)和PFU聚合酶，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)分離自質(zhì)粒pUbilZ-NBN。所述片段克隆到pPCR-Script Amp SK(+)的Srf1位點(diǎn)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pJC069。第二步，在質(zhì)粒pJC069上進(jìn)行部分Not-1消化，以產(chǎn)生685bp的片段(包含神經(jīng)胚活素基因)，將該片段克隆到質(zhì)粒pEAG347的Not-1位點(diǎn)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pJC070.14。在質(zhì)粒pJC070.14中的神經(jīng)胚活素基因的轉(zhuǎn)錄受控于腺病毒主要晚期啟動(dòng)子。
表達(dá)神經(jīng)胚活素的CHO細(xì)胞系的產(chǎn)生200μg的pJC070.14通過(guò)限制性內(nèi)切酶Mlu-1的消化被線性化。用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取DNA，并用乙醇沉淀。將線性化的DNA重懸在20mM Hepes pH7.05，137mMNaCI，5mM KCI，0.7mM Na2HPO4，6mM葡萄糖(HEBS)中，并通過(guò)電穿孔(280V和960μF)導(dǎo)入到～4E7 CHO dukx B1(dhfr-)細(xì)胞(p23)中。電穿孔后，在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS)的α+改良Eagle′s培養(yǎng)基(MEM)中繼續(xù)培養(yǎng)兩天。然后使所述細(xì)胞受胰蛋白酶作用，并重鋪板于100mm的皿(100,000細(xì)胞/板)，在補(bǔ)充了10％經(jīng)透析的FBS的α-MEM(沒(méi)有核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸)中，培養(yǎng)5天。之后將所述細(xì)胞以100,000細(xì)胞/100mm板的密度分開(kāi)，并在200nM氨甲喋呤中進(jìn)行選擇。挑出抗性克隆并擴(kuò)充至6孔的培養(yǎng)板中；來(lái)自各克隆的條件培養(yǎng)基用以下描述的神經(jīng)胚活素的特異性檢測(cè)來(lái)篩選。將表達(dá)最高水平神經(jīng)胚活素的十二個(gè)克隆擴(kuò)充至T162瓶中，然后進(jìn)行再測(cè)定。這些CHO細(xì)胞系在25至50ng/ml/天的范圍內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)胚活素。
神經(jīng)胚活素的三重復(fù)合體檢測(cè)CHO細(xì)胞系培養(yǎng)基的上清液中神經(jīng)胚活素的存在用Sanicola等(Proc Natl Acad Sci USA 946238(1997)描述的三重復(fù)合體檢測(cè)法(ternary complex assay)修改后的形式進(jìn)行評(píng)估。
類似的哺乳動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體已經(jīng)制備，且對(duì)于人NBN和大鼠NBN的類似的研究已經(jīng)進(jìn)行。已經(jīng)在大鼠體內(nèi)檢測(cè)NBN的活性。大鼠的研究幾乎都是用大鼠NBN進(jìn)行的。
實(shí)施例2全長(zhǎng)神經(jīng)胚活素在神經(jīng)病性疼痛的神經(jīng)結(jié)扎動(dòng)物模型中的效力-對(duì)神經(jīng)病性疼痛的預(yù)防神經(jīng)胚活素對(duì)觸覺(jué)異常性疼痛和人痛覺(jué)過(guò)敏的預(yù)防作用在ChungL5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(″SNL″)模型(Kim and Chung(1992)Pain 50355-363)中被研究。將Sprague-Dawley雄性大鼠(250-300g)分成四組。一組大鼠(n＝7)接受模擬(sham)手術(shù)，并皮下注射給藥載體。第二組大鼠(n＝7)接受模擬手術(shù)，并皮下注射給藥大鼠神經(jīng)胚活素(1mg/kg)。第三組大鼠(n＝7)接受脊神經(jīng)結(jié)扎，并皮下注射給藥載體。第四組大鼠(n＝7)接受脊神經(jīng)結(jié)扎，并皮下注射給藥大鼠神經(jīng)胚活素(1mg/kg)。所述載體在pH 6.5由5mM磷酸鹽和150mM氯化鈉組成。在脊神經(jīng)結(jié)扎或模擬手術(shù)前30分鐘，然后在結(jié)扎或手術(shù)后(SNL后)2，4，7，9，11和14天注射神經(jīng)胚活素或載體。Von Frey(Chaplan等.(1994)，J.Neurosci.Meth.5355-63)和Hargreave′s(Hargreaves等.(1988)，Pain 3277-88)行為測(cè)試分別用來(lái)監(jiān)測(cè)觸覺(jué)和熱應(yīng)答。在脊神經(jīng)結(jié)扎或模擬手術(shù)前監(jiān)測(cè)對(duì)疼痛的應(yīng)答以確立基線應(yīng)答，然后手術(shù)后二周每天監(jiān)測(cè)。
所得結(jié)果以均值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差顯示在圖1和2中。皮下給藥神經(jīng)胚活素(由圖1和圖2中向下的箭頭表示)可導(dǎo)致脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠的兩類(觸覺(jué)性的見(jiàn)圖1，熱性的見(jiàn)圖2)神經(jīng)病性疼痛近乎完全的正?；Ｔ谶M(jìn)行模擬手術(shù)的大鼠中，皮下給藥神經(jīng)胚活素沒(méi)有明顯改變觸覺(jué)敏感性(圖1)或熱敏感性(圖2)。在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠中，神經(jīng)胚活素對(duì)熱敏感性的作用在開(kāi)始給藥神經(jīng)胚活素后3天首次(first)變得明顯，但對(duì)觸覺(jué)異常性疼痛的作用首次變得明顯的時(shí)間會(huì)稍稍推后，在開(kāi)始給藥神經(jīng)胚活素后4-5天。在開(kāi)始給藥神經(jīng)胚活素多肽后約7-8天神經(jīng)胚活素對(duì)熱敏感性的作用達(dá)到平臺(tái)期，而在開(kāi)始給藥神經(jīng)胚活素多肽后約10-11天神經(jīng)胚活素對(duì)熱敏感性的作用達(dá)到平臺(tái)期。在給藥之間的2-3天的間隙期間，神經(jīng)胚活素的作用不減弱。實(shí)際上，在第4天和第7天給藥神經(jīng)胚活素之間兩種疼痛行為都有了實(shí)質(zhì)的校正，如在給藥第5天和第6天所檢測(cè)到的那樣。在第11天給藥神經(jīng)胚活素后，對(duì)兩種疼痛行為的尚存的最大校正保持恒定，這提示神經(jīng)胚活素對(duì)神經(jīng)病性疼痛的校正作用可持續(xù)至少3天。
實(shí)施例3用截短的神經(jīng)胚活素多肽治療神經(jīng)病包含成熟大鼠神經(jīng)胚活素羧基末端102個(gè)氨基酸的多肽在治療觸覺(jué)異常性疼痛，熱痛覺(jué)過(guò)敏，兩種外周神經(jīng)病性疾病方面的預(yù)防作用，用ChungL5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(″SNL″)模型來(lái)說(shuō)明。
將Sprague-Daley雄性大鼠(約250-300克)分成四組。一組大鼠(n＝6)接受模擬手術(shù)并皮下注射給藥載體。第二組大鼠(n＝6)接受模擬手術(shù)，并皮下注射給藥截短的神經(jīng)胚活素(1mg/kg)。第三組大鼠(n＝6)接受脊神經(jīng)結(jié)扎，并通過(guò)皮下結(jié)扎給藥載體。第四組大鼠(n＝6)接受脊神經(jīng)結(jié)扎，并皮下注射給藥截短的神經(jīng)胚活素(1mg/kg)。所述載體在pH6.5包括5mM磷酸鹽和150mM氯化鈉。截短的神經(jīng)胚活素或載體在0，2，4，7，9，11和14天給藥。在0天，在脊神經(jīng)結(jié)扎或模擬手術(shù)前30分鐘給藥截短的神經(jīng)胚活素。用Chaplan等(1994)，J.Neurosci.Meth.5355-63 and Hargreaves等.(1988)，Pain 3277-88描述的行為測(cè)試法測(cè)定疼痛應(yīng)答。這些測(cè)試分別監(jiān)測(cè)觸覺(jué)應(yīng)答和熱應(yīng)答。在脊神經(jīng)結(jié)扎或模擬手術(shù)前監(jiān)測(cè)疼痛應(yīng)答以確立基線應(yīng)答。手術(shù)后二個(gè)星期每天監(jiān)測(cè)疼痛應(yīng)答。
預(yù)計(jì)皮下給藥截短的神經(jīng)胚活素會(huì)校正脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠的兩類精神病性疼痛。在模擬手術(shù)大鼠中，預(yù)計(jì)皮下給藥截短的神經(jīng)胚活素不會(huì)明顯改變觸覺(jué)或熱敏感性。預(yù)計(jì)神經(jīng)胚活素對(duì)熱敏感性的作用會(huì)在給藥神經(jīng)胚活素后約3天變得明顯，而預(yù)計(jì)對(duì)觸覺(jué)異常性疼痛的作用首次變得明顯會(huì)稍晚些。
實(shí)施例4神經(jīng)胚活素在神經(jīng)病性疼痛的神經(jīng)結(jié)扎動(dòng)物模型中的效力-神經(jīng)病性疼痛的逆轉(zhuǎn)神經(jīng)胚活素對(duì)觸覺(jué)異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏的逆轉(zhuǎn)效果用ChungL5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(″SNL″)模型研究。將Sprague-Dawley雄性大鼠(270-275g)分成四組。一組大鼠(n＝8)接受模擬手術(shù)，并皮下注射給藥載體。第二組大鼠(n＝8)接受模擬手術(shù)，并皮下注射給藥大鼠神經(jīng)胚活素(1mg/kg)。第三組大鼠(n＝8)接受脊神經(jīng)結(jié)扎，并皮下注射給藥載體。第四組大鼠(n＝8)接受脊神經(jīng)結(jié)扎，并皮下注射給藥大鼠神經(jīng)胚活素(1mg/kg)。所述載體在pH6.5由5mM磷酸鹽和150mM氯化鈉組成。Von Frey(Chaplan等.(1994)，J.Neurosci.Meth.5355-63)和Hargreave′s(Hargreaves等.(1988)，Pain 3277-88)行為測(cè)試分別用來(lái)監(jiān)測(cè)觸覺(jué)和熱應(yīng)答。在脊神經(jīng)結(jié)扎或模擬手術(shù)前監(jiān)測(cè)對(duì)這些疼痛的應(yīng)答以確立基線應(yīng)答，然后手術(shù)后二周每天監(jiān)測(cè)。在行為測(cè)試前60分鐘注射神經(jīng)胚活素或載體，在結(jié)扎或手術(shù)后(SNL后)3，5，7，10，12和14天注射神經(jīng)胚活素或載體。
所得結(jié)果以均值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤顯示在圖3和4中。正如所預(yù)計(jì)的那樣，兩類神經(jīng)病性疼痛行為(觸覺(jué)異常性疼痛示于圖3，熱痛覺(jué)過(guò)敏示于圖4)在第3天完全出現(xiàn)。皮下給藥神經(jīng)胚活素(由圖3和圖4中向下的箭頭表示)可導(dǎo)致脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠兩類神經(jīng)病性疼痛(觸覺(jué)性的見(jiàn)圖3，熱性的見(jiàn)圖4)幾乎完全的逆轉(zhuǎn)，這樣觸覺(jué)和熱應(yīng)答得到了校正。在進(jìn)行模擬手術(shù)的大鼠中，皮下給藥神經(jīng)胚活素沒(méi)有明顯改變觸覺(jué)敏感性(圖3)或熱敏感性(圖4)。在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠中，神經(jīng)胚活素對(duì)熱敏感性和觸覺(jué)異常性疼痛的作用在給藥神經(jīng)胚活素后2-3天首次變得明顯。在開(kāi)始給藥神經(jīng)胚活素多肽后約7-8天神經(jīng)胚活素對(duì)熱敏感性和觸覺(jué)異常性疼痛的作用達(dá)到平臺(tái)期。在給藥之間的2-3天的間隙期間，神經(jīng)胚活素的作用不減弱。實(shí)際上，在第3，第5，第7和第10天給藥神經(jīng)胚活素之間兩種疼痛行為都有了實(shí)質(zhì)的校正。
實(shí)施例5在神經(jīng)病性疼痛的鏈脲霉素動(dòng)物模型中神經(jīng)胚活素的效力-預(yù)防疼痛敏感性的喪失神經(jīng)胚活素對(duì)熱敏感性喪失(熱痛覺(jué)減退)的預(yù)防作用在糖尿病性神經(jīng)病的鏈脲霉素(″STZ″)模型進(jìn)行研究。將Sprague-Dawley雌性大鼠(250-275g)分為四組，每組包括10個(gè)動(dòng)物。一組大鼠不接受STZ；這些大鼠皮下注射載體。三組大鼠接受一次STZ注射(無(wú)菌鹽水中含50mg/kg)，隨后用分光光度檢測(cè)法檢測(cè)血樣品，以確定高血糖。3組高血糖大鼠中，1組皮下注射載體，第二組皮下注射大鼠神經(jīng)胚活素(0.1mg/kg)，第三組大鼠皮下注射大鼠神經(jīng)胚活素(1mg/kg)。所述載體在pH6.5由5mM磷酸鹽和150mM氯化鈉組成。每周給藥神經(jīng)胚活素或載體3次(時(shí)間表星期一，星期三，星期五)，給藥8周，在STZ誘導(dǎo)了高血糖時(shí)開(kāi)始給藥。8周后如Calcutt等(2000)，Anesthesiology 931271-1278中所述，評(píng)估熱應(yīng)答潛伏期。簡(jiǎn)言之，將發(fā)光的熱源作用于爪的底部表面，使溫度在20秒鐘內(nèi)由30℃升高到38.5℃，測(cè)定開(kāi)始加熱到爪回縮之間的潛伏時(shí)間來(lái)評(píng)估熱應(yīng)答潛伏期。爪回縮潛伏期的延長(zhǎng)表示熱敏感性的損失(熱痛覺(jué)減退)。
所得結(jié)果以均值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤顯示在圖5中。正如所預(yù)料的那樣，在給予STZ后8周，在載體處理的STZ大鼠中爪回縮潛伏期與正常大鼠相比延長(zhǎng)，這表示STZ注射已誘導(dǎo)了熱痛覺(jué)減退。給藥神經(jīng)胚活素可預(yù)防高血糖(STZ)大鼠中熱應(yīng)答潛伏期的延長(zhǎng)。每周給藥3次，給藥8周后，神經(jīng)胚活素的兩種劑量(1mg/kg和0.1mg/kg)都幾乎完全校正了熱敏感性。這些結(jié)果表明神經(jīng)胚活素可預(yù)防熱痛覺(jué)減退，糖尿病性神經(jīng)病的STZ大鼠模型中發(fā)生的熱敏感性的喪失。
實(shí)施例6神經(jīng)胚活素在鏈脲霉素大鼠中，對(duì)熱痛覺(jué)減退的預(yù)防，以及對(duì)熱痛覺(jué)過(guò)敏的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)如實(shí)施例1在大腸桿菌中所述的制備大鼠NBN113。神經(jīng)胚活素對(duì)熱敏感性喪失(熱痛覺(jué)減退)的預(yù)防作用，以及神經(jīng)胚活素對(duì)熱敏感性增強(qiáng)(熱痛覺(jué)過(guò)敏)的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)，如實(shí)施例5所述，在糖尿病性神經(jīng)病的鏈脲霉素″STZ″)大鼠模型進(jìn)行研究。實(shí)施例5描述的劑量研究被確認(rèn)并擴(kuò)展。所得結(jié)果示于突6A和6B中。
圖6A和圖6B中的結(jié)果以均值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。正如所預(yù)料的那樣，在給予STZ后4周，在載體處理的STZ大鼠中爪回縮潛伏期與正常大鼠相比縮短，這表示STZ注射已誘導(dǎo)了熱痛覺(jué)過(guò)敏。如圖6A所示，每周給藥3次，給藥4周后，皮下注射所有劑量(0.03mg/kg和0.1mg/kg)的神經(jīng)胚活素都對(duì)STZ大鼠中熱痛覺(jué)過(guò)敏起到了預(yù)防作用。如圖6B所示，每周給藥3次，給藥8周后，皮下注射所有劑量(0.03mg/kg和0.1mg/kg)的神經(jīng)胚活素都對(duì)STZ大鼠中熱痛覺(jué)減退起到了預(yù)防作用。另外，如圖6B所示，在8周處理(veh；0.1mg/kgNBN)研究的第二個(gè)4周期間，皮下給藥神經(jīng)胚活素(0.1mg/kg)不僅逆轉(zhuǎn)了STZ處理后4周出現(xiàn)的熱痛覺(jué)過(guò)敏，而且還預(yù)防了在8周在STZ大鼠中熱痛覺(jué)減退的發(fā)生。這些結(jié)果表明神經(jīng)胚活素可預(yù)防和逆轉(zhuǎn)糖尿病性神經(jīng)病的STZ大鼠模型中的熱痛覺(jué)過(guò)敏，而且還可預(yù)防糖尿病性神經(jīng)病的STZ大鼠模型中發(fā)生的熱敏感性的喪失(熱痛覺(jué)減退)。
實(shí)施例7神經(jīng)胚活素在神經(jīng)病性疼痛的神經(jīng)結(jié)扎動(dòng)物模型中的效力-對(duì)神經(jīng)病性疼痛的逆轉(zhuǎn)是劑量依賴性的。
如實(shí)施例1所述在大腸桿菌中制備大鼠NBN113。NBN113對(duì)觸覺(jué)異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏的劑量依賴性逆轉(zhuǎn)的分析，在用Chung L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎(″SNL″)動(dòng)物模型的大鼠進(jìn)行，如實(shí)施例4所述，NBN的劑量為0.03mg/kg，0.1mg/kg，0.6mg/kg和2mg/kg。顯示在圖3和4中的試驗(yàn)結(jié)果被證實(shí)并擴(kuò)展。結(jié)果顯示在圖7和圖8中。
圖7和圖8中的結(jié)果以均值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。BL表示基線應(yīng)答。兩類神經(jīng)病性疼痛行為(觸覺(jué)異常性疼痛在圖7顯示，熱痛覺(jué)過(guò)敏在圖8顯示)如預(yù)計(jì)的那樣在第2天完全顯現(xiàn)。每周皮下給藥2mg/kg神經(jīng)胚活素(NBN)3次(如箭頭所示)可導(dǎo)致脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠中兩種類型神經(jīng)病性疼痛的幾乎完全的逆轉(zhuǎn)(觸覺(jué)異常性疼痛在圖7顯示，熱痛覺(jué)過(guò)敏在圖8顯示)，觸覺(jué)和熱應(yīng)答得到了校正。如圖7所示，神經(jīng)胚活素對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的觸覺(jué)異常性疼痛的逆轉(zhuǎn)是劑量依賴性的。神經(jīng)胚活素(NBN)的劑量在0.1mg/kg s.c.或0.6mg/kg s.c.時(shí)，每周給藥3次，9天(以及11天)后，觸覺(jué)異常性疼痛被部分逆轉(zhuǎn)，而NBN的劑量在2mg/kg s.c.時(shí)，每周3次給藥，7天(以及9和11天)后，觸覺(jué)異常性疼痛被明顯逆轉(zhuǎn)，每周3次給藥，9和11天后，觸覺(jué)異常性疼痛被幾乎完全逆轉(zhuǎn)。而且，隨著將神經(jīng)胚活素的皮下給藥劑量從0.1mg/kg增加至0.6mg/kg，增加至2mg/kg，對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的觸覺(jué)異常性疼痛的平均逆轉(zhuǎn)在SNL后14天會(huì)更高。神經(jīng)胚活素(NBN)在0.03mg/kg s.c.時(shí)，在每周3次給藥的11天期間，沒(méi)有明顯逆轉(zhuǎn)脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的觸覺(jué)異常性疼痛。
如圖8所示，神經(jīng)胚活素(NBN)對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)誘導(dǎo)的熱痛覺(jué)過(guò)敏的逆轉(zhuǎn)也是劑量依賴性的。神經(jīng)胚活素的劑量在0.1mg/kg時(shí)，每周給藥3次，9天(以及11天)后，熱痛覺(jué)過(guò)敏被明顯逆轉(zhuǎn)，NBN的劑量在0.6mg/kg時(shí)，每周3次給藥，7天(以及9和11天)后，熱痛覺(jué)過(guò)敏被明顯逆轉(zhuǎn)，NBN的劑量在2mg/kg時(shí)，每周3次給藥，4天(以及7，9和11天)后，熱痛覺(jué)過(guò)敏被明顯逆轉(zhuǎn)。而且，隨著將神經(jīng)胚活素的皮下給藥劑量從0.1mg/kg增加至0.6mg/kg，增加至2mg/kg，對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的熱痛覺(jué)過(guò)敏的平均逆轉(zhuǎn)在SNL后14天會(huì)更高。NBN在0.03mg/kg s.c.時(shí)，在每周3次給藥的11天期間，沒(méi)有明顯逆轉(zhuǎn)脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的熱痛覺(jué)過(guò)敏。
等同情況盡管本發(fā)明詳細(xì)地公開(kāi)了具體的實(shí)施方案，但這只是為了描述的目的而進(jìn)行的舉例，不構(gòu)成對(duì)所附權(quán)利要求范圍的限制。具體地，在不背離本發(fā)明的精神和不超出本發(fā)明所定義的權(quán)利要求范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明作各種替代，變更以及修改。
序列表<110>比奧根公司(Biogen，Inc.)Sah，Dinah Wen-Yee<120>神經(jīng)胚活素多肽的治療作用<130>00689-507(A118)utility<140>Filed Herewith<141>2002-02-28<150>USSN 06/287,554<151>2001-03-28<160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>861<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(58)..(717)<220>
<221>5′UTR<222>(1)..(57)<220>
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<222>(517)..(711)<223>DISULFIDGly74-Gly138二硫鍵<220>
<221>misc_structure<222>(616)..(618)<223>DISULFIDGly107-Gly107鏈內(nèi)二硫鍵<400>1aggagggtgg gggaacagct caacaatggc tgatgggcgc tcctggtgtt gatagag 57atg gaa ctt gga ctt gga ggc ctc tcc acg ctg tcc cac tgc ccc tgg105Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-80 -75 -70 -65cct agg cgg cag cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct ctg gct ctg153Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-60 -55 -50ctg agc agc gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc cgc agc cct201Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro-45 -40 -35gcc ccc cgc gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc gcc ggc cac249Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His-30 -25 -20ctg ccg ggg gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga gcc cgg cgg297Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg-15 -10 -5 -1ccg ccg ccg cag cct tct cgg ccc gcg ccc ccg ccg cct gca ccc cca345Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1 5 10 15tct gct ctt ccc cgc ggg ggc cgc gcg gcg cgg gct ggg ggc ccg ggc393Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly20 25 30agc cgc gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag441Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln35 40 45ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg489Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu50 55 60gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg cgc tct cca537Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65 70 75 80cac gac ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg585His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro85 90 95ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc633Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg100 105 110tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg681Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val115 120 125gac cgc ctc tcc gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc tgagggctcg 727Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140ctccagggct ttgcagactg gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg accctcccgc 787
agagtcccac tagccagcgg cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg agaggcccct 847accggtgggt gatg861<210>2<211>220<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-80 -75 -70 -65Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-60 -55 -50Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro-45 -40 -35Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His-30 -25 -20Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg-1S -10 -5 -1Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1 5 10 15Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly20 25 30Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln35 40 45Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu50 55 60Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65 70 75 80His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro85 90 95Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg100 105 110Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val115 120 125Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>3<211>2136<212>DNA<213>小鼠種屬(Murinae gen.sp.)<220>
<221>CDS<222>(975)..(1646)<220>
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<220>
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<221>mat_peptide<222>(1290)..(1646)<220>
<221>mat_peptide<222>(1299)..(1646)<400>3gcggccgcga attcggcacg agggcgtctc gctgcagccc gcgatctcta ctctgcctcc 60tggggtcttc tccaaatgtc tagcccccac ctagagggac ctagcctagc cagcggggac 120cggatccgga gggtggagcg gccaggtgag ccctgaaagg tggggcgggg cgggggcgct 180ctgggcccca ccccgggatc tggtgacgcc ggggctggaa tttgacaccg gacggcggcg 240ggcaggaggc tgctgaggga tggagttggg ctcggccccc agatgcggcc cgcgggctct 300gccagcaaca agtccctcgg gccccagccc tcgctgcgac tggggcttgg agccctgcac 360ccaagggcac agaccggctg ccaaggcccc acttttaact aaaagaggcg ctgccaggtg 420cacaactctg ggcatgatcc acttgagctt cgggggaaag cccagcactg gtcccaggag 480aggcgcctag aaggacacgg accaggaccc ctttggtatg gagtgaacgc tgagcatgga 540gtggaaggaa ctcaagttac tactttctcc aaccaccctg gtaccttcag ccctgaagta 600cagagcagaa gggtcttaga agacaggacc acagctgtgt gagtctcccc cctgaggcct 660tagacgatct ctgagctcag ctgagctttg tttgcccatc tggagaagtg agccattgat 720tgaccttgtg gcatcgcgaa ggaacaggtc ctgccaagca cctaacacag agagcaaggt 780tctccatcgc agctaccgct gctgagttga ctctagctac tccaacctcc tgggtcgctt 840cgagagactg gagtggaagg aggaataccc caaaggataa ctaactcatc tttcagtttg 900caagctgccg caggaagagg gtggggaaac gggtccacga aggcttctga tgggagcttc 960tggagccgaa agct atg gaa ctg gga ctt gca gag cct act gca ttg tcc1010Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser-80 -75 -70cac tgc ctc cgg cct agg tgg cag tca gcc tgg tgg cca acc cta gct1058His Cys Leu Arg Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala-65 -60 -55gtt cta gcc ctg ctg agc tgc gtc aca gaa gct tcc ctg gac cca atg1106Val Leu Ala Leu Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met-50 -45 -40tcc cgc agc ccc gcc gct cgc gac ggt ccc tca ccg gtc ttg gcg ccc1154Ser Arg Ser Pro Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro-35 -30 -25
ccc acg gac cac ctg cct ggg gga cac act gcg cat ttg tgc agc gaa1202Pro Thr Asp His Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu-20 -15 -10 -5aga acc ctg cga ccc ccg cct cag tct cct cag ccc gca ccc ccg ccg1250Arg Thr Leu Arg Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro-1 1 5 10cct ggt ccc gcg ctc cag tct cct ccc gct gcg ctc cgc ggg gca cgc1298Pro Gly Pro Ala Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg15 20 25gcg gcg cgt gca gga acc cgg agc agc cgc gca cgg acc aca gat gcg1346Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala30 35 40cgc ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg agc gcg ctc ggc1394Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly45 50 55 60cta ggc cac agc tcc gac gag ctg ata cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc1442Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly65 70 75tcg tgc cgc cga gca cgc tcc cag cac gat ctc agt ctg gcc agc cta1490Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu80 85 90ctg ggc gct ggg gcc cta cgg tcg cct ccc ggg tcc cgg ccg atc agc1538Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser95 100 105cag ccc tgc tgc cgg ccc act cgc tat gag gcc gtc tcc ttc atg gac1586Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp110 115 120gtg aac agc acc tgg agg acc gtg gac cac ctc tcc gcc act gcc tgc1634Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys125 130 135 140ggc tgt ctg ggc tgaggatgat ctatctccaa gcctttgcac actagaccca1686Gly Cys Leu Glytgtgttgccc tacctggaac agctccaccg ggcctcacta accaggagcc tcaactcagc 1746aggatatgga ggctgcagag ctcaggcccc aggccggtga gtgacagacg tcgtcggcat 1806gacagacaga gtgaaagatg tcggaaccac tgaccaacag tcccaagttg ttcatggatc 1866ccagctctac agacaggaga aacctcagct aaagagaact cctctgggag aatccagaaa 1926tggccctctg tcctggggaa tgaattttga agagatatat atacatatat acattgtagt 1986cgcgttgctg gaccagcctg tgctgaaacc agtcccgtgt tcacttgtgg aagccgaagc 2046cctatttatt atttctaaat tatttattta ctttgaaaaa aaacggccaa gtcggcctcc 2106ctttagtgag ggttaatttg tgatcccggg 2136<210>4<211>224<212>PRT<213>小鼠種屬(Murinae gen.sp.)<400>4Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg-80 -75 -70 -65
Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu-60 -55 -50Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro-45 -40 -35Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp His-30 -25 -20Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg-15 -10 -5 -1Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala1 5 10 15Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala20 25 30Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg35 40 45Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser50 55 60Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg65 70 75 80Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly85 90 95Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys100 105 110Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr115 120 125Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>5<211>224<212>PRT<213>大鼠(Rattus sp.)<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(39)<220>
<221>PROPEP<222>(40)..(80)<220>
<221>PEPTIDE<222>(81)..(224)<220>
<221>PEPTIDE<222>(109)..(224)<220>
<221>PEPTIDE<222>(112)..(224)<220>
<221>CARBOHYD<222>(206)
<220>
<221>DISULFID<222>(127)..(192)<220>
<221>DISULFID<222>(154)..(220)<220>
<221>DISULFID<222>(158)..(222)<220>
<221>DISULFID<222>(191)<223>鏈內(nèi)二硫鍵<400>5Met Glu Leu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg1 5 10 15Pro Arg Trp Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu20 25 30Leu Ser Ser Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro35 40 45Ala Ser Arg Asp Val Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp Tyr50 55 60Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Ala Leu Arg65 70 75 80Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala85 90 95Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala100 105 110Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg115 120 125Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser130 135 140Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg145 150 155 160Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly165 170 175Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys180 185 190Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr195 200 205Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly210 215 220<210>6<211>197<212>PRT<213>人(Homo sapiens)
<400>6Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser1 5 10 15Val Leu Ser Ile Trp Met Cys Arg Glu Gly Leu Leu Leu Ser His Arg20 25 30Leu Gly Pro Ala Leu Val Pro Leu His Arg Leu Pro Arg Thr Leu Asp35 40 45Ala Arg Ile Ala Arg Leu Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Leu Gln Gly Ala50 55 60Pro Asp Ala Met Glu Leu Arg Glu Leu Thr Pro Trp Ala Gly Arg Pro65 70 75 80Pro Gly Pro Arg Arg Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Arg Ala Arg Ala85 90 95Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val100 105 110Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg115 120 125Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly130 135 140Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg145 150 155 160Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe165 170 175Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg180 185 190Glu Cys Ala Cys Val195<210>7<211>156<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Met Ala Val Gly Lys Phe Leu Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Gln Leu Gly Gln Gly Trp Gly Pro Asp Ala Arg Gly Val Pro Val Ala20 25 30Asp Gly Glu Phe Ser Ser Glu Gln Val Ala Lys Ala Gly Gly Thr Trp35 40 45Leu Gly Thr His Arg Pro Leu Ala Arg Leu Arg Arg Ala Leu Ser Gly50 55 60Pro Cys Gln Leu Trp Ser Leu Thr Leu Ser Val Ala Glu Leu Gly Leu65 70 75 80Gly Tyr Ala Ser Glu Glu Lys Val Ile Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ser85 90 95Cys Pro Arg Gly Ala Arg Thr Gln His Gly Leu Ala Leu Ala Arg Leu100 105 110
Gln Gly Gln Gly Arg Ala His Gly Gly Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg115 120 125Tyr Thr Asp Val Ala Phe Leu Asp Asp Arg His Arg Trp Gln Arg Leu130 135 140Pro Gln Leu Ser Ala Ala Ala Cys Gly Cys Gly Gly145 150 155<210>8<211>211<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro20 25 30Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser35 40 45Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val50 55 60Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp65 70 75 80Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala85 90 95Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg100 105 110Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr115 120 125Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr130 135 140Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu145 150 155 160Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln165 170 175Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp180 185 190Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys195 200 205Gly Cys Ile210<210>9<211>39<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>9aaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg 39<210>10
<211>39<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>10ttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg 39<210>11<211>140<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CARBOHYD<222>(122)<223>糖基化天冬氨酰<400>11Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1 5 10 15Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly20 25 30Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln35 40 45Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu50 55 60Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65 70 75 80His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro85 90 95Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg100 105 110Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val115 120 125Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>12<211>116<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CARBOHYD<222>(98)<223>糖基化天冬氨酰<400>12Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala1 5 10 15Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly20 25 30Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly35 40 45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50 55 60
Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser65 70 75 80Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp85 90 95Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys100 105 110Gly Cys Leu Gly115<210>13<211>113<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CARBOHYD<222>(95)<223>糖基化天冬氨酰<400>13Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala50 55 60Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys65 70 75 80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85 90 95Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu100 105 110Gly<210>14<211>112<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>14Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg1 5 10 15Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg20 25 30Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg35 40 45Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly50 55 60Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys
65 70 75 80Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr85 90 95Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105 110<210>15<211>111<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>15Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu1 5 10 15Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser20 25 30Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala35 40 45Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala50 55 60Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg65 70 75 80Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp85 90 95Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105 110<210>16<211>110<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>16Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg1 5 10 15Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp20 25 30Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg35 40 45Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu50 55 60Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro65 70 75 80Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg85 90 95Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105 110<210>17
<211>109<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser1 5 10 15Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu20 25 30Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser35 40 45Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg50 55 60Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr65 70 75 80Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr85 90 95Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105<210>18<211>108<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>18Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln1 5 10 15Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu20 25 30Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro35 40 45His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro50 55 60Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg65 70 75 80Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val85 90 95Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105<210>19<211>107<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu1 5 10 15Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val20 25 30Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His35 40 45
Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro50 55 60Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr65 70 75 80Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp85 90 95Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105<210>20<211>106<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val1 5 10 15Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg20 25 30Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp35 40 45Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro50 55 60Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu65 70 75 80Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg85 90 95Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105<210>21<211>105<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro1 5 10 15Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe20 25 30Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu35 40 45Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly50 55 60Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala65 70 75 80Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu85 90 95Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105
<210>22<211>104<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val1 5 10 15Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg20 25 30Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser35 40 45Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser50 55 60Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val65 70 75 80Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser85 90 95Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100<210>23<211>103<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg1 5 10 15Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe20 25 30Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu35 40 45Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg50 55 60Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser65 70 75 80Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala85 90 95Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100<210>24<211>102<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala1 5 10 15Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys20 25 30
Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala35 40 45Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro50 55 60Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe65 70 75 80Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr85 90 95Ala Cys Gly Cys Leu Gly100<210>25<211>101<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu1 5 10 15Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser20 25 30Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser35 40 45Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val50 55 60Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met65 70 75 80Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala85 90 95Cys Gly Cys Leu Gly100<210>26<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly1 5 10 15Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly20 25 30Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu35 40 45Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser50 55 60Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp65 70 75 80Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys85 90 95Gly Cys Leu Gly
100<210>27<211>99<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu1 5 10 15Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser20 25 30Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu35 40 45Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln50 55 60Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val65 70 75 80Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly85 90 95Cys Leu Gly
權(quán)利要求
1.一種治療受試者神經(jīng)病性疼痛的方法，該方法包括以每劑每公斤受試者體重1μg-30,000μg的劑量給藥受試者包含神經(jīng)胚活素多肽的制劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)病性疼痛與帶狀皰疹后神經(jīng)痛，糖尿病性神經(jīng)病或坐骨神經(jīng)痛有關(guān)。
3.一種治療受試者觸覺(jué)異常性疼痛的方法，該方法包括以每劑每公斤受試者體重10μg-30,000μg的劑量給藥受試者神經(jīng)胚活素多肽。
4.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽使用選自如下的傳輸系統(tǒng)給藥?kù)o脈內(nèi)傳輸，肌肉內(nèi)傳輸，肺內(nèi)傳輸，皮下傳輸或腹膜內(nèi)傳輸。
5.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽經(jīng)肌肉內(nèi)傳輸或皮下傳輸給藥。
6.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述劑量是每劑每公斤受試者體重10μg-10,000μg。
7.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述劑量是每劑每公斤受試者體重25μg-3,000μg。
8.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽的所述氨基酸序列包含選自如下的多肽(a)至少一種多肽，該多肽包括SEQ ID NO2的AA-80-AA140，SEQID NO2的AA-41-AA140，SEQ ID NO2的AA1-AA140，SEQ ID NO2的AA25-AA140，SEQ ID NO2的AA28-AA140，SEQ ID NO4的AA-80-AA144，SEQ ID NO4的AA1-AA144，SEQ ID NO5的AA1-AA224或SEQ ID NO5的AA81-AA224；(b)至少一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO2的AA107-AA140或SEQ ID NO2的AA76-AA140中所示的C末端序列，且其保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7個(gè)半胱氨酸殘基；(c)至少一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ IDNO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26或SEQ ID NO27；和(d)至少一種多肽序列，該序列與上述(a)-(c)中任一序列具有70％以上的氨基酸序列同一性。
9.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽以定時(shí)釋放的組合物給藥。
10.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽用衍生的半分子修飾以在體液中具有延長(zhǎng)的存留時(shí)間和/或有增加的濃度。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述衍生的半分子是聚乙二醇半分子。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述衍生的半分子選自脂肪族酯，酰胺，N-酰基-衍生物或O-?；苌?。
13.一種治療受試者神經(jīng)病性疼痛的方法，該方法包括a)給藥受試者有效量的神經(jīng)胚活素多肽；和b)給藥受試者有效量的選自如下的誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物類鴉片，抗心律失常藥，局部的止痛藥，局限的止痛藥，抗驚厥藥，抗抑郁藥，皮質(zhì)類固醇或NSAIDS。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述神經(jīng)病性疼痛與帶狀皰疹后神經(jīng)痛，糖尿病性神經(jīng)病或坐骨神經(jīng)痛有關(guān)。
15.一種治療受試者觸覺(jué)異常性疼痛的方法，該方法包括a)給藥受試者有效量的神經(jīng)胚活素多肽；和b)給藥受試者有效量的選自如下的誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物類鴉片，抗心律失常藥，局部的止痛藥，局限的止痛藥，抗驚厥藥，抗抑郁藥，皮質(zhì)類固醇或NSAIDS。
16.權(quán)利要求13或15的方法，其中(b)中誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物是抗驚厥藥。
17.權(quán)利要求13或15的方法，其中(b)中誘導(dǎo)痛覺(jué)喪失的化合物是加巴噴丁(1-(氨甲基)環(huán)己烷乙酸)或pregabalin(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
18.權(quán)利要求13或15的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽使用選自如下的傳輸系統(tǒng)給藥?kù)o脈內(nèi)傳輸，肌肉內(nèi)傳輸，肺內(nèi)傳輸，皮下傳輸或腹膜內(nèi)傳輸。
19.權(quán)利要求13或15的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽通過(guò)肌肉內(nèi)傳輸或皮下傳輸給藥。
20.權(quán)利要求13或15的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽的劑量是每劑每公斤受試者體重10μg-10,000μg。
21.權(quán)利要求13或15的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽的劑量是每劑每公斤受試者體重25μg-3,000μg。
22.權(quán)利要求13或15的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽的所述氨基酸序列包含選自如下的多肽(a)至少一種多肽，該多肽包括SEQ ID NO2的AA-80-AA140，SEQID NO2的AA-41-AA140，SEQ ID NO2的AA1-AA140，SEQ ID NO2的AA25-AA140，SEQ ID NO2的AA28-AA140，SEQ ID NO4的AA-80-AA144，SEQ ID NO4的AA1-AA144，SEQ ID NO5的AA1-AA224或SEQ ID NO5的AA81-AA224；(b)至少一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO2的AA107-AA140或SEQ ID NO2的AA76-AA140中所示的C末端序列，且其保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7個(gè)半胱氨酸殘基；(c)至少一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ IDNO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26或SEQ ID NO27；和(d)至少一種多肽序列，該序列與上述(a)-(c)中任一序列具有70％以上的氨基酸序列同一性。
23.權(quán)利要求13或15的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽以定時(shí)釋放的組合物給藥。
24.權(quán)利要求13或15的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽用衍生的半分子修飾以在體液中具有延長(zhǎng)的存留時(shí)間和/或有增加的濃度。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述衍生的半分子是聚乙二醇半分子。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述衍生的半分子選自脂肪族酯，酰胺，N-?；?衍生物或O-酰基衍生物。
27.權(quán)利要求13或15的方法，其中所述神經(jīng)病性疼痛與所述受試者被病毒感染有關(guān)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述病毒選自皰疹病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)或乳頭瘤病毒。
29.權(quán)利要求1或13的方法，其中所述神經(jīng)病性疼痛是與給藥治療劑有關(guān)的神經(jīng)病性疼痛。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述治療劑是抗癌劑。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗癌劑選自紫杉醇，脫乙?；仙即?，順鉑，噻氨酯噠唑，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春地辛或長(zhǎng)春花堿。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述治療劑是抗病毒劑。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述抗病毒劑選自ddI，DDC，d4T，磷卡萘替，氨苯砜，甲硝唑或異煙肼。
34.權(quán)利要求1或13的方法，其中所述神經(jīng)病性疼痛是由于與外傷有關(guān)的損傷所致。
35.權(quán)利要求1或13的方法，其中所述神經(jīng)病性疼痛是異常性疼痛。
36.權(quán)利要求1或13的方法，其中所述神經(jīng)病性疼痛是痛覺(jué)過(guò)敏性疼痛。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述痛覺(jué)過(guò)敏性疼痛是熱性痛覺(jué)過(guò)敏。
38.權(quán)利要求1或13的方法，其中所述神經(jīng)病性疼痛是幻覺(jué)痛。
39.權(quán)利要求1或13的方法，其中所述神經(jīng)病性疼痛與以下疾病有關(guān)先天性神經(jīng)病(包括但不限于弗里德里希氏共濟(jì)失調(diào)，家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病，唐吉爾病，法布里氏病)，代謝性疾病(包括但不限于腎功能不全和甲狀腺功能低下)，維生素缺乏(包括但不限于維生素B12缺乏，維生素B6缺乏以及維生素E缺乏)，中毒性神經(jīng)病和醫(yī)源性神經(jīng)病(包括但不限于酒精中毒，維生素B6中毒，六碳化合物中毒，乙胺碘呋酮，氯霉素，雙硫醒，異煙肼，金，鋰，甲硝唑，米索硝唑，呋喃妥因)，傳染性神經(jīng)病(包括但不限于麻風(fēng)病，萊姆病)，自身免疫性神經(jīng)病(包括但不限于格-巴綜合征，慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病，不明意義的單克隆γ球蛋白病以及多發(fā)性神經(jīng)病)，三叉神經(jīng)痛，捕獲綜合征(包括但不限于Carpel通道)，創(chuàng)傷后神經(jīng)痛，假性肢痛，多發(fā)性硬化性疼痛，復(fù)合型區(qū)域性疼痛綜合征(包括但不限于交感反射性營(yíng)養(yǎng)不良，灼痛)，腫瘤，脈管病性/血管病性神經(jīng)病以及特發(fā)性神經(jīng)病。
40.一種降低患神經(jīng)病的受試者疼痛敏感性喪失的方法，該方法包括以每劑每公斤受試者體重1μg-30,000μg的劑量給藥受試者包含神經(jīng)胚活素多肽的制劑。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)病是糖尿病性神經(jīng)病。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述疼痛敏感性的喪失是熱性疼痛敏感性的喪失。
43.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽使用選自如下的傳輸系統(tǒng)給藥?kù)o脈內(nèi)傳輸，肌肉內(nèi)傳輸，肺內(nèi)傳輸，皮下傳輸或腹膜內(nèi)傳輸。
44.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽經(jīng)肌肉內(nèi)傳輸或皮下傳輸給藥。
45.權(quán)利要求40的方法，其中所述劑量是每劑每公斤受試者體重10μg-10,000μg。
46.權(quán)利要求40的方法，其中所述劑量是每劑每公斤受試者體重25μg-3,000μg。
47.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽的所述氨基酸序列包含選自如下的多肽(a)至少一種多肽，該多肽包括SEQ ID NO2的AA-80-AA140，SEQID NO2的AA-41-AA140，SEQ ID NO2的AA1-AA140，SEQ ID NO2的AA25-AA140，SEQ ID NO2的AA28-AA140，SEQ ID NO4的AA-80-AA144，SEQ ID NO4的AA1-AA144，SEQ ID NO5的AA1-AA224或SEQ ID NO5的AA81-AA224；(b)至少一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO2的AA107-AA140或SEQ ID NO2的AA76-AA140中所示的C末端序列，且其保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7個(gè)半胱氨酸殘基；(c)至少一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ IDNO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26或SEQ ID NO27；和(d)至少一種多肽序列，該序列與上述(a)-(c)中任一序列具有70％以上的氨基酸序列同一性。
48.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽以定時(shí)釋放的組合物給藥。
49.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽用衍生的半分子修飾以在體液中具有延長(zhǎng)的存留時(shí)間和/或有增加的濃度。
50.權(quán)利要求40的方法，其中所述衍生的半分子是聚乙二醇半分子。
51.權(quán)利要求40的方法，其中所述衍生的半分子選自脂肪族酯，酰胺，N-?；?衍生物或O-酰基衍生物。
52.一種治療，預(yù)防或延緩受試者神經(jīng)病性疼痛的方法，該方法包括以每劑每公斤受試者體重1μg-30,000μg的劑量給藥受試者包含神經(jīng)胚活素多肽的制劑，其中給藥神經(jīng)胚活素多肽是預(yù)防性的。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽使用選自如下的傳輸系統(tǒng)給藥?kù)o脈內(nèi)傳輸，肌肉內(nèi)傳輸，肺內(nèi)傳輸，皮下傳輸或腹膜內(nèi)傳輸。
54.一種治療受試者糖尿病性神經(jīng)病的方法，該方法包括以每劑每公斤受試者體重1μg-30,000μg的劑量給藥受試者包含神經(jīng)胚活素多肽的制劑。
55.權(quán)利要求52或54的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽使用選自如下的傳輸系統(tǒng)給藥?kù)o脈內(nèi)傳輸，肌肉內(nèi)傳輸，肺內(nèi)傳輸，皮下傳輸或腹膜內(nèi)傳輸。
56.權(quán)利要求52或54的方法，其中所述神經(jīng)胚活素多肽的所述氨基酸序列包含選自如下的多肽(a)至少一種多肽，該多肽包括SEQ ID NO2的AA-80-AA140，SEQID NO2的AA-41-AA140，SEQ ID NO2的AA1-AA140，SEQ ID NO2的AA25-AA140，SEQ ID NO2的AA28-AA140，SEQ ID NO4的AA-80-AA144，SEQ ID NO4的AA1-AA144，SEQ ID NO5的AA1-AA224或SEQ ID NO5的AA81-AA224；(b)至少一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO2的AA107-AA140或SEQ ID NO2的AA76-AA140中所示的C末端序列，且其保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7個(gè)半胱氨酸殘基；(c)至少一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ IDNO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26或SEQ ID NO27；和(d)至少一種多肽序列，該序列與上述(a)-(c)中任一序列具有70％以上的氨基酸序列同一性。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)病性疼痛，包括觸覺(jué)異常性疼痛的治療，以及用于降低與神經(jīng)病有關(guān)的疼痛敏感性喪失的治療。本發(fā)明的治療涉及神經(jīng)胚活素(NBN)多肽的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1525866SQ02810497
公開(kāi)日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2002年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月28日
發(fā)明者黛娜·W·Y·薩, 黛娜 W Y 薩 申請(qǐng)人:比奧根公司