專利名稱：：用于水生生物培養(yǎng)的神經(jīng)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及農(nóng)牧業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽在水生生物培養(yǎng)中的用途。當(dāng)將該肽通過浸沒、注射或作為食物添加劑應(yīng)用于水生生物時，獲得了這些生物的食欲的增加，更大的生長和存活率，優(yōu)良的免疫活性和促乳素釋放的增加?，F(xiàn)有技術(shù)垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)在1989年首次從牛下丘腦中分離，并且證實其刺激生長激素分泌的能力是通過腺苷酸環(huán)化酶激活來實現(xiàn)的(Miyata等人(1989)Isolationofanovel38residuehypothalamicpolypeptidewhichstimulatesadenylatecyclaseinpituitaryeelIs.5/oc力e邁.Aes.CoiH邁u/.164:567—574)。PACAP屬于包括腸促胰液素、胰高血糖素和血管活性腸肽的肽家族(Arimura和Shioda(1995)Pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide(PACAP)anditsreceptors:Neuroendocrineandendocrineinteraction.尸ro/LWei/r0e/3docT//207.16:53—88)。在哺乳動物中，PACAP的前體和生長激素釋放激素(GHRH)由2種不同基因編碼(Hosoya等人(1992)Structureofthehumanpituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide(PACAP)gen.Woc力/瓜"/op力^.Jc".1129:199-206)。在迄今為止研究的所有亞哺乳動物(submammalian)物種(鳥類、爬行動物和魚類)中，GHRH和PACAP肽由相同基因編碼并且包含在相同前體中(Montero等人(2000)Molecularevolutionofthegrowthhormone-releasinghormone/pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptidegenefamily.Functionalimplicationintheregulationofgrowthhormonesecretion,/our/7a7o/*#o_/ec.A/7docr//20/.25:157—168)。PACAP基因基本上在下述部位中表達中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、支配眼的神經(jīng)纖維、呼吸道、唾液腺、胃腸道、生殖系統(tǒng)器官、胰腺和泌尿道。它也在腎上腺、生殖腺和免疫細胞中合成(Sherwood等人(2000)TheoriginandfunctionofthePituitaryAdenylateCyclase-ActivatingPolypeptide(PACAP)/GlucagonSuperfamily.f油c"."eie"e"l:619-670)。PACAP顯示出不同的生物功能，這與其在不同組織中的各種分布以及其促垂體、神經(jīng)傳遞、神經(jīng)調(diào)節(jié)和血管調(diào)節(jié)活性相一致(Chatterjee等人(1997)Genomicorganizationoftheratpituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptidereceptorgene.Alternativesplicingwithinthe59-untranslatedregion./.Wo/.C力e邁.272:12122-12131)。它參與細胞分裂、分化和死亡的調(diào)節(jié)(Sherwood等人(2000)TheoriginyfunctionofthePituitaryAdenylateCyclase—ActivatingPolypeptide(PACAP)/GlucagonSuperfamily.^Wocr//7eWeF/e^21:619-670)。PACAP刺激生長激素(GH)釋放。該肽在GH釋放中的效應(yīng)已在體外在幾種哺乳動物物種、鳥類、兩棲類(Hu等人(2000)Characterizationandmessengerribonucleicaciddistributionofaclonedpituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptidetypeIreceptorinthefrogJe/70;^7ae".sbrain.141:657-665)和魚類(AndersonL.L.等人(2004)GrowthHormoneSecretion:MolecularandCellularMechanismsandInVivoApproaches.Soc/ef//"ori"jr/7er2.邁.S/o人a/2d#ed.229:291-302)中得到證實。關(guān)于PACAP在體內(nèi)GH分泌和釋放中的作用的研究很少。迄今為止，已知這種肽在體內(nèi)增加大鼠血漿(Jarr等人(1992)Contrastingeffectsofpituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptide(PACAP)on//7y細and//7prolactinandgrowthhormonereleaseinmalerats.Z7尸e5W.51:823-830)和牛血漿(Radcliff等人(2001)Pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptideinducessecretionofgrowthhormoneincattle,腸e"/c細'邁a人Endocrinol.21:187-196)中的GH水平。然而，在母綿羊(Sawangjaroen和Curlewis(1994)Effectsofpituitaryadenylateeyelaseactivatingpolypeptide(PACAP)andvasoactiveintestinalpolypeptide(VIP)onprolactin,luteinizinghormoneandgrowthhormonesecretionintheewe./.#ewc>e/7cfo<7r//7o/.6:549-555)和人(Chiodera等人(1996)Effectsofintravenouslyinfusedpituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptideonadenohypophysealhormonesecretioninnormalmen.#ewroe/^ocr/"o/.64:242-246)中，它不產(chǎn)生這種效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)暗示，在哺乳動物中，該肽對于GH分泌的影響從一個物種到另一個物種不同(Anderson等人(2004)GrowthHormoneSecretion:MolecularandCellularMechanismsandInVivoApproaches.Soc/eO^or^rpeW/a.5!'o/.a/2^/#e^/.229:291-302)。迄今為止，在魚類中沒有顯示出PACAP在GH調(diào)節(jié)中的功能的體內(nèi)研究，另外不存在在水生生物的食欲刺激中使用這種肽的先例。到目前為止，在甲殼類中，沒有這種肽存在的證據(jù)，并且不知道在這些生物中調(diào)節(jié)生長的信號級聯(lián)。PACAP在哺乳動物中通過垂體細胞來刺激促乳素釋》文(Ortmann等人(1999)Interactionsofovariansteroidswithpituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptideandGnRHinanteriorpituitarycells.5ur./.五/^ocr/730L140:207—214)。它通過垂體的促黑素激素細胞來促進促黑素(促黑素細胞激素，MSH)釋放(Vaudry等人(2000)Pituitaryadenylateeyelase-activatingpolypeptideanditsreceptors:fromstructuretofunctions,泡擺co人紐.s52:269-364)。在魚類中沒有顯示出這種肽在促乳素釋放中的活性的體內(nèi)研究。同樣也沒有關(guān)于其在魚類顏色形成中的影響的發(fā)現(xiàn)。在哺乳動物中，PACAP對于免疫系統(tǒng)的功能得到非常充分的表征，并且存在描述了其在人中作為免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的用途的幾個專利。迄今為止，在解釋PACAP在水生生物中對于免疫系統(tǒng)的作用的文獻方面沒有先例。已從幾種脊推動物物種和1種原索動物(被嚢動物)中克隆了PACAP基因。在魚類中，已分離出鮭魚和鲇魚(Sherwood等人(2000)TheOriginandFunctionofthePituitaryAdenylateCyclase-Activatingolypeptide(PACAP)/GlucagonSuperfamilyi"油cr/力e齡/,21(6):619-670)、金魚(Leung等人(1999)Molecularcloningandtissuedistributionofinpituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide(PACAP)thegoldfish.Wee.尸rogr.#0人C卿.腐oc"./70厶338-388)、斑馬魚(Fradinger和Sherwood(2000)Characterizationofthegeneencodingbothgrowthhormone-releasinghormone(GRF)andpituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptide.Ce".S/docr//70/.165:211-219)、鱒魚(Krueckl和Sherwood.(2001)Developmentalexpression,alternativesplicingandgenecopynumberforthepituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide(PACAP)andgrowthhormone-releasinghormone(GRF)geneinraibowtrout.A油c,//7。7.182:99-108)的一些物種的PACAP基因。專利US5695954保護編碼魚類GHRH-PACAP多肽的基因核苷酸序列的分離和純化，以及表達這些序列的載體和宿主，目的在于用于通過將所述遺傳構(gòu)建體引入受精的魚卵中經(jīng)由轉(zhuǎn)基因來增加魚類的生長。它還保護用于檢測包含這些序列的轉(zhuǎn)基因魚類的方法。在這個專利中特別地報道了編碼紅大麻哈魚(tocorA//2c/MyVeria)、大頭胡鲇(67ar/as忠acroce/力a/〃s)和美國白鱘(爿ch/e刀se,"3/^/z/Oi3"/3us)物種的GHRH-PACAP多肽的基因序列。在本發(fā)明中使用在我們實驗室對于尖齒胡鲇(Chr/asgar/e/n./2i/s)和尼羅羅非魚(0reoc/ro邁h物種而獲得的PACAP氨基酸序列的不同變體，其具有N-末端修飾。這些變體經(jīng)由非轉(zhuǎn)基因方式在水生生物中用作生長刺激劑，其中它們的施用通過其表達在大腸桿菌(Aco//)和巴斯德畢赤酵母(尸./^Wor")培養(yǎng)物上清液中并經(jīng)由浸浴來進行，無需事先純化它們。出乎意料地，我們發(fā)現(xiàn)這些變體在這些條件下能夠促進這些生物中的免疫活性的顯著增加和升高血清沖的促乳素濃度。對于水生生物還沒有描述過所述肽的這些性質(zhì)。某些作者已報道了在魚類中通過經(jīng)由浸浴施用重組生長激素而造成的生長刺激效應(yīng)。然而，生長激素的直接使用受許多規(guī)章要求的影響，相同的情況也發(fā)生于表達生長激素或生長激素釋放因子的轉(zhuǎn)基因魚類的使用。在本發(fā)明中描述了用于增加水生生物的生長和改善水生生物的免疫系統(tǒng)的非轉(zhuǎn)基因方法，所述水生生物包括無脊推動物。當(dāng)今，水生生物是蛋白質(zhì)的重要來源，但在其天然環(huán)境中的捕獲已被充分開發(fā)。由于這個原因，為了增加生產(chǎn)，必需培養(yǎng)這些水生物種(Pullin等人；ConferenceProceeding7，432p.InternationalCenterforlivingAquaticResourcesMonagement.Manila,Philippines.1982,ISSN0115-4389)。通過刺激生長、增加存活和改善幼體的品質(zhì)來增加水生生物培養(yǎng)的效益仍是水產(chǎn)業(yè)中待解決的重要問題。發(fā)明概述本發(fā)明給出了上述問題的解決方法，提供了具有鑒定為SEQIDNo12、13和14的氨基酸序列的垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽的變體，它們在短時間段內(nèi)增加水生生物(包括無脊推生物)的生長速率，這對于水產(chǎn)業(yè)是非常重要的，此外，當(dāng)通過浸浴或作為飼料添加劑來應(yīng)用時，這些肽增加具有商業(yè)利益的魚類和曱殼類幼體的存活。它們刺激這些生物中的免疫活性，以及食欲、魚類顏色形成和促乳素釋放。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，PACAP變體通過下述方式應(yīng)用于魚類或甲殼類以3天的間隔和以0.ljag/g動物體重的濃度進行定期注射，以1-4天的間隔和以100-200ug/L水的肽濃度在淡水或海水中進行浸浴，和以5mg/Kg配合飼料的濃度作為飼料添加劑進行使用。獲得了生長的顯著增加和優(yōu)良的免疫活性。由于其小的尺寸(5KDa)，本申請的PACAP變體提供了下述優(yōu)點當(dāng)它通過浸浴(一種呈現(xiàn)出對于水產(chǎn)業(yè)來說的成本和操作優(yōu)點并具有低污染指數(shù)的施用途徑)進行應(yīng)用時，使得能夠通過這種生物的皮膚和粘膜被良好吸收，此外，PACAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制由腺苷酸環(huán)化酶的激活來誘導(dǎo)而不通過激素的激活，并且其在哺乳動物(包括人)中的生長激素釋放活性很弱，這是為什么其的使用顯示出更好的公眾理解和更少的規(guī)章要求的原因。PACAP的其他優(yōu)點是其刺激魚類中的先天性和適應(yīng)性免疫活性和增加對致病體感染的抵抗力的能力。在本發(fā)明的一個實施方案中，給水生生物，例如Orec/ro邁"屬物物種(。rec力ro邁"m.)羅非魚、胡鮎屬物種(^o.)鲇魚、鮭屬物種(^/邁o/)鮭魚和對蝦屬物種(尸e/a^m.)蝦提供pacap變體。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，給魚類或甲殼類提供PACAP變體以預(yù)防或治療由致病體引起的感染。本發(fā)明的一個實施方案描述了組合物的制備，所述組合物用于處理培養(yǎng)中的魚類或曱殼類以刺激其生長和增強其抗病力，以及用于預(yù)防或治療性地治療由致病體引起的感染，所有這些的目的是改善生產(chǎn)率。附圖簡述圖1.在細菌表達載體(圖1A)和酵母表達載體(圖1B)中的PACAP克隆策略。圖2.通過以0.1lag/g動物體重的劑量腹膜內(nèi)注射重組PACAP來進行的在年幼尖齒胡鲇中的生長刺激實驗，所述重組PACAP經(jīng)由親和層析進行純化。該圖顯示了與對照組相比較的PACAP處理組的體重的平均值。圖3.通過以0.1pg/g動物體重的劑量腹膜內(nèi)注射重組PACAP來進行的在年幼尖齒胡鮎中的生長刺激實驗，所述重組PACAP經(jīng)由親和層析進行純化。該圖顯示了與對照組相比較的PACAP處理組的肝體細胞指數(shù)(hepatosomaticindex)和肌肉千重的平均值。圖4.通過浸沒在以100yg/L水的劑量包含重組PACAP的大腸桿菌破裂上清液中來進行的在羅非魚幼體中的生長刺激實驗。圖4A和4B顯示了與陰性對照相比較的處理組的平均體重和長度。圖5.通過浸沒在以100pg/L水的劑量包含重組PACAP的大腸桿菌破裂上清液中來進行的在羅非魚幼體中的生長刺激實驗。該圖顯示了在處理開始后22天與陰性對照相比較的處理組的平均體重。圖6.通過浸沒在以100ng/L水的劑量包含重組PACAP的大腸桿菌破裂上清液中來進行的在羅非魚幼體中的生長刺激實驗。該圖顯示了在最后一次浸浴后30天，相對于對照組(B)，經(jīng)PACAP處理的魚(A和C)在長度方面的差異。圖7.通過浸沒在以100Mg/L水的劑量包含重組PACAP的大腸桿菌破裂上清液中來進行的在羅非魚幼體中的生長刺激實驗。該圖顯示了相對于對照組(C),經(jīng)PACAP處理的魚(A和B)中魚類顏色的較早形成。圖8.在尼羅羅非魚這一物種的年幼羅非魚中，用于估經(jīng)由親和層析純化的重組PACAP對于食欲的影響的實驗，以0.5mg/g動物體重的劑量。該圖顯示了在處理開始的6小時和22小時內(nèi)由魚攝取的食物量的平均值。具體實施方案/實施例的詳述實施例l:構(gòu)建包含PACAP的編碼序列的表達載體，以用于其在大腸桿菌中的細胞內(nèi)表達以及其在巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液中的細胞外生產(chǎn)。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來分離尖齒胡鲇的PACAP基因，其中使用先前克隆到T載體內(nèi)的GHRH-PACAPcDNA作為模板。使用相應(yīng)于序列SEQIDNo1和SEQIDNo2的特異性寡核苷酸，以獲得包括信號肽序列的GHRH-PACAP全序列，和使用特異性寡核苷酸SEQIDNo3和SEQIDNo4,以僅擴增出具有對于其克隆到大腸桿菌表達栽體中來說所必需的限制位點的PACAP基因。使用特異性寡核苷酸SEQIDNo3和SEQIDNo4，如上文所述類似地來分離羅非魚的PACAP基因。本發(fā)明是在羅非魚中分離這種基因的笫一個報道。使用限制位點Ndel和BamHI將PACAP編碼序列克隆到大腸桿菌表達載體pAR3040中(圖1A)。選擇一個重組質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21D3細菌，并誘導(dǎo)在T7啟動子的調(diào)控下的PACAP表達，其中使用0.5mMIPTG作為誘導(dǎo)物?；虮磉_于28。C進行5小時。重組PACAP的表達及其完整性通過質(zhì)譜法進行確認(rèn)。對于在巴斯德畢赤酵母中的PACAP表達，使用酵母表達載體pPS9和pPS10。對于在pPS9中的克隆使用特異性寡核苷酸SEQIDNo7和SEQIDNo6,和對于在pPSlO中的克隆使用寡核苷酸SEQIDNo5和SEQIDNo6。對于在載體pPS7中的克隆使用限制位點Ncol和Spel，這種克隆方法在N-末端給目的蛋白添加甲硫氨酸和甘氨酸。對于在載體pPS10中的克隆，使用限制位點Nael和Spel，這種克隆策略不給目的蛋白添加氨基酸(圖IB)。在轉(zhuǎn)化前，用酶I對質(zhì)粒進行線性化。通過電穿孔用重組表達載體轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母MP36菌林。該菌抹是在轉(zhuǎn)化后獲得His+表型的his3營養(yǎng)缺陷型突變體。通過斑點印跡法鑒定的轉(zhuǎn)化體還通過Southern印跡法進行分析，以確定哪一些通過用重組質(zhì)粒的表達盒替換巴斯德畢赤酵母的基因」011而發(fā)生了整合。該整合事件產(chǎn)生Muts(低水平的甲醇利用)和1113+表型。JOn的基因替換通過載體和基因組之間J0JI啟動子和3'」0J1的區(qū)域的重組而發(fā)生。作為重組的結(jié)果，在的編碼區(qū)中發(fā)生缺失。具有Muts表型的重組菌抹支持J0i2基因中的醇氧化酶(alcoholoxidase,A0X)產(chǎn)生，且它們在甲醇中具有低生長率。編碼目的多肽和羅非魚生長激素的基因在可由甲醇誘導(dǎo)的』017啟動子的調(diào)控之下，并且它們具有信號肽。巴斯德畢赤酵母分泌低水平的自身蛋白質(zhì)，并且其培養(yǎng)基不需要蛋白質(zhì)作為補充物。因此，可以預(yù)期，分泌的異源蛋白質(zhì)將占培養(yǎng)基中總蛋白質(zhì)的高百分比(超過80%)(Tschopp等人；Bio/Technology1987,5:1305-1308;Barr等人；Pharm.Eng.1992，12:48-51)。在向培養(yǎng)基中添加了甲醇的5L生物反應(yīng)器之中完成本發(fā)明中說明的重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。實施例2:在年幼尖齒胡鲇中進行的生長刺激實驗，測定魚的肝體細胞指數(shù)和肌肉千重。使用大約相同年齡和具有30-40克平均體重的尖齒胡鲇物種的18條鲇魚，不進行性別區(qū)分。限定2個實驗組，每組9個個體。將所述組在具有穩(wěn)定的水再循環(huán)的分開的箱中進行適應(yīng)，在28。C的溫度下以及采用14小時光和10小時暗的光周期。動物每天喂養(yǎng)2次，采用相當(dāng)于每個箱中總體重的5%的定量。動物在實驗前進行鑒定。一組用半純化的PACAP(70%的純度)SEQIDNo.13進行處理，而用作對照組的另一組用包含在1XPBS中的大腸桿菌蛋白質(zhì)(通過與目的肽相同的純化操作程序而獲得的大腸桿菌蛋白質(zhì)，其量相當(dāng)于純化的PACAP樣品中存在的污染物的量)進行處理。用PACAP進行處理的魚以0.ljag肽/克動物體重的劑量進行腹膜內(nèi)注射，每周2次。對照組如上所述類似地進行注射。實驗開始后22天，在腹腔中注射了PACAP的動物與陰性對照相比較而言顯示出體重的顯著增加(p<0.05)(圖2)。測定肝體細胞指數(shù)和肌肉千重，以證實魚體重的增加不是由于器官尺寸的增加，或肌肉含水量的增加。沒有觀察到實驗組的肝體細胞指數(shù)值和肌肉千重值之間的顯著差異(圖3)。當(dāng)應(yīng)用序列SEQIDNo.12的重組PACAP時，獲得類似的結(jié)果。實施例3:通過用包含重組PACAP的大腸桿菌破裂上清液浸浴而在羅非魚幼體中進行的生長刺激、對致病體的抵抗力和促乳素釋放的實驗。進行實驗以評估存在于大腸桿菌破裂上清液中的尖齒胡鲇重組PACAP對于羅非魚幼體生長的作用。限定2個實驗組，每組60個個體，一組用PACAP神經(jīng)肽(SEQIDNo.13)進行處理，和另一組用作對照組。將這些幼體組在具有穩(wěn)定的水再循環(huán)的分開的箱中進行適應(yīng)，這在WC的溫度下以及采用14小時光和10小時暗的光周期來進行，并且動物用根據(jù)下式獲得的量進行喂養(yǎng)食物的量=動物的#X平均體重(g)X40%/100。處理由下列組成在2L水中浸浴，在20天期間每周3次，持續(xù)60分鐘，劑量為200jag靶蛋白/L水。由此獲得，在實驗開始10天，PACAP處理組顯示出與對照組相比而言顯著的體重和長度增加(P<0.01)，在實驗開始15天，組間差異是高度顯著的(P<0.001)(表1以及圖4A和化)。在浸浴開始20天，PACAP處理組和對照組之間的差異在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的(P<0.001)(圖5)。表l.在實驗開始10天和15天，羅非魚幼體的體重和長度的平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>體重和長度顯示為平均值±S.D.觀察到，PACAP對于生長的影響隨著時間過去而繼續(xù)保持，因為在最后一次浸浴后30天，實驗組動物的體重和長度的差異是非常顯著的(p<0.01)(圖6)。此外，觀察到，與陰性對照相比較，經(jīng)PACAP處理的魚在早期發(fā)育階段顯示出皮膚著色(圖7)。在這個實驗中，還研究了皮膚原生動物車輪蟲屬物種(7V2'C/0CT2'/L3M)的存在，為此從每個實驗組中隨機選擇10個動物，并測定由這種致病體引起的侵入的強度。侵入強度的值根據(jù)下式進行測定(I:寄生蟲總#/魚)I=SN/n-F。和E=n-F。x100/n,其中I:(平均侵入強度)E:(總數(shù)中受寄生蟲侵襲的魚的#)SN:(發(fā)現(xiàn)的寄生蟲總數(shù))F。(未受寄生蟲侵襲的魚的數(shù)目)n:(經(jīng)分析的魚的數(shù)目)。經(jīng)PACAP處理的魚顯示出相對于對照組(I的平均值=5.56)而言明顯更低的由原生動物車輪蟲屬物種造成的侵入強度(I的平均值=2.20)(p<0.01)。在實驗開始45天，在與先前描述相同的條件下通過浸浴對魚進行處理，并且在處理后24小時對每組10個動物進4亍抽血，以通過Western印跡法和ELISA來測量血清中的促乳素。對于這些測定法使用抗羅非魚促乳素多克隆抗體。觀察到，PACAP治療組和對照組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異P<Q.01(表2)。這些在商業(yè)水生生物中是非常有吸引力的結(jié)果，如在鮭魚中的情況，所述鮭魚具有在淡水和海水中的生命周期，并且其中促乳素在滲透調(diào)節(jié)中起重要作用。表2.在實驗開始45天，在羅非魚血清中的促乳素濃度(ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>濃度顯示為平均值士S.D.*表明顯著的差異P<0.01實施例4:用于評估重組PACAP對于尼羅羅非魚的年幼羅非魚食欲的影響的實驗。迄今為止，仍未研究在魚類中PACAP對于食欲的生物學(xué)效應(yīng)。在亞哺乳動物的脊推生物中，這種肽對于食欲的活性已得到少許表征(Jensen,2001，Regulatorypeptidesandcontroloffoodintakeinnon—mammalianvertebrates.Co/n;."/0c力e/z7.And戶力/s/o人尸arfj128:471-479)。為了分析PACAP對于魚類食欲的影響，使用尼羅羅非魚物種的羅非魚，它們隨機進行選擇，不區(qū)分性別以及具有大約相同的平均體重。限定3個實驗組，每組3個個體，并且每組3次重復(fù)。將所述組在具有穩(wěn)定的水再循環(huán)的分開的箱中進行適應(yīng)，在28。C的溫度下以及采用14小時光和10小時暗的光周期。一個組通過以0.5jag/g動物體重進行腹膜內(nèi)注射而用半純化的PACAP(87%的純度)SEQIDNo.13進行處理。第二個組以0.1ng肽/克動物體重的劑量通過相同施用途徑用GHRP-6(Lipotec，S.A，Spain)進行處理。對照組用包含在1XPBS中的大腸桿菌蛋白質(zhì)(通過與目的肽相同的純化操作程序而獲得的大腸桿菌蛋白質(zhì)，其量相當(dāng)于純化的PACAP樣品中存在的污染物的量)進行處理。在處理后，給3個實驗組添加相同量的食物，在6小時的時候收集未攝取的食物并再次添加食物。實驗開始22小時，再次測量食欲。將每個箱中未攝取的食物在爐中進行干燥(100'C,24小時)，并在分析天平中進行稱重。通過確定向箱中添加的食物(IO克，具有20%的濕度)和未由魚攝取的食物之間的差異，計算出被攝取的食物。與對照組相比較，經(jīng)PACAP和GHRP-6處理的羅非魚顯示出顯著的食欲增加(p<0.05)(圖8)。實施例5:重組PACAP在鲇魚尖齒胡鲇免疫系統(tǒng)中的評估。使用年幼的尖齒胡鲇。限定2個組，其中每組10個個體。將所述組在具有穩(wěn)定的水再循環(huán)的分開的箱中進行適應(yīng)，在28。C的溫度下以及采用14小時光和IO小時暗的光周期。動物每天喂養(yǎng)2次，采用相當(dāng)于每個箱中總體重的5°/。的定量。動物在實驗前進行鑒定。用PACAP(SEQIDNo.13)進行處理的魚以0.1Mg肽/克動物體重的劑量進行腹膜內(nèi)注射，每周2次。在實驗開始20天，抽取魚血以測量血清中的溶菌酶和凝集素水平。使用基于溶菌酶裂解溶壁微球菌(#icrococcws77sodeiir〃cus)的能力的方法來測量血清中的溶菌酶活性。在96孔微托盤中，將在磷酸鹽緩沖液(0.05M,pH6.2)中進行4次2倍系列稀釋的100jaL樣品與100pL3mg/ml溶壁微球菌(Sigma)的懸浮液相混合。使微托盤于22。C進行溫育，并在0、2、3、5、10、15、25、35和45分鐘時于450nm處讀取0.D.。對于陽性對照，用雞卵清溶菌酶(從8ng/mL開始的系列稀釋)代替魚血清，和對于陰性對照,用緩沖液代替魚血清。1個單位的溶菌酶活性被定義為引起0.001分鐘—i的O.D.讀數(shù)減少的幼體勻漿物的量。觀察到在PACAP處理組和對照組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.01)(表3)。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>為了確定血清中凝集素的存在，進行血細胞凝集測定法。使用PBSpH7.2在U形底微量滴定板(96孑L，Greiner，Microlon)孔中進行血清的2倍系列稀釋，向所述孔中加入等體積的新鮮制備的2%紅細胞懸液(在PBS中的兔紅細胞)。將微量滴定板在室溫下溫育1小時，并且目測讀取滴度，其等于在最后l個顯示出凝集(如通過在整個孔底部上平均分布的細胞層所證明的)的孔中的稀釋度。檢查樣品的血細胞凝集活性并獲得每個樣品的滴度值?；钚员硎緸榈味?，即顯示出完全凝集的最高稀釋度的倒數(shù)。與對照組相比較，經(jīng)PACAP處理的魚顯示出血清中的凝集素水平的顯著增加(P<0.05)(表4)。表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>學(xué)生檢驗。*表明顯著的差異P<0.05實施例6:通過用包含重組PACAP的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液浸沒而在羅非魚幼體中進行的生長刺激實驗。進行實驗以評估包含在巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液中的尖齒胡鲇PACAP(SEQIDNo14)對于羅非魚幼體生長的影響。限定3個實驗組，每組50個幼體。一個組用包含在巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液中的重組PACAP(SEQIDNo.14)進行處理。第二個組用包含在巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液中的重組羅非魚生長激素(GH)進行處理。對照組用未轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液進行處理。幼體每天喂養(yǎng)2次，采用根據(jù)下式獲得的量食物的量-動物的并X平均體重(g)X40%/100。處理通過如下方式來進行浸沒在30L體積中，每周3次，持續(xù)90分鐘。劑量為100lig靶蛋白/L水。由此獲得，在實驗開始5周(35天)，PACAP處理組顯示出與對照組相比而言顯著的體重增加(p<0.01)。生長激素處理組顯示出與對照組相比而言顯著的體重增加(p〈(K05)(表5)。表5.以克表示的羅非魚幼體重量。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>數(shù)據(jù)顯示為體重平均值士S.D.實施例7:在南方濱對奸(Z27o/e/seiAy中進行的生長刺激和幼體品質(zhì)改善實驗，所述南方濱對蝦用包含重組PACAP的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液進行處理。使用南方濱對蝦物種的蝦的幼體。限定2個實驗組，每組100個幼體。一個組用包含在巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液中的重組PACAP(SEQIDNo.14)進行處理，和用作對照組的另一個組用未轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液進行處理。幼體在容量為100L的玻璃纖維箱中進行培養(yǎng)。給料基于硅藻(纖細角毛藻(C力ae"cerosgra"7"))、有鞭毛藻類(司西四爿藻(7Wrase7歷/sswec/ca))和卣蟲的無節(jié)幼體(AquaticEco-SystemsInc.)。非生物生長因素如下照明(24:00L/D)穩(wěn)、定的通風(fēng)34ppm的鹽度溶解氧5.2±0.5(在幼體循環(huán)時)。在PZm之后的再循環(huán)80%。對實驗組應(yīng)用4次浸浴，每3天1次，持續(xù)時間為1小時。由此獲得，PACAP處理組顯示出與對照組相比而言顯著的體重增加(p<0.01)(表6)。表6.以毫克表示的蝦幼體重量。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>數(shù)據(jù)顯示為體重平均值士S.D.在PACAP處理組中觀察到壞長度的更高的均一性(這在蝦養(yǎng)殖中是非常重要的)和幼體的更好的品質(zhì)(更多的腮分枝和額部修飾(rostralmodifications)。在PACAP處理組中，在PL9階段存活中的差異大于40%。實施例8:通過在魚飲食配方中包括重組PACAP而實施的對于年幼尖齒胡鲇的生長刺激。將包含在巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液中的重組PACAP(SEQIDNo.14)進行濃縮，并配制入營養(yǎng)魚飲食中至約5fflg/Kg飼料的濃度。限定2個實驗組，每組100個幼體，具有O.1g的平均體重。一個組用包含在巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液中的重組PACAP(SEQIDNo.14)進行處理，和用作對照組的另一個組用未轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液進行處理。該實驗進行30天。與對照組相比較，以5mg/Kg祠料的劑量包括在飲食中的重組PACAP(SEQIDNo.14)使生長增加30%,具有高度顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。權(quán)利要求1.用于增加魚類或甲殼類培養(yǎng)物的生產(chǎn)率的方法，其包括以對于刺激其生長或增加其抗病力或兩者來說有效的量給培養(yǎng)中的魚類或甲殼類飼喂或施用根據(jù)序列SEQIDNo12、SEQIDNo13和SEQIDNo14的神經(jīng)肽PACAP。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述PACAP神經(jīng)肽用于在魚類中增加促乳素分泌和改善滲透調(diào)節(jié)。3.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所迷PACAP神經(jīng)肽用于在水生生物中調(diào)節(jié)食欲。4.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述PACAP神經(jīng)肽用于在觀賞魚類和曱殼類中促進顏色的形成。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述PACAP神經(jīng)肽通過化學(xué)合成獲得。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述PACAP神經(jīng)肽通過重組技術(shù)獲得。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述PACAP神經(jīng)肽無需純化而以包含在大腸桿菌破裂上清液中的形式進行使用。8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述PACAP神經(jīng)肽無需純化而以包含在巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液中的形式進行使用。9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述PACAP神經(jīng)肽以從重組生產(chǎn)系統(tǒng)中純化的形式進行使用。10.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中通過間隔為3天的定期注射，以0.1pg/g動物體重的濃度，將所述PACAP神經(jīng)肽應(yīng)用于魚類或曱殼類。11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過以1-4天的間隔在淡水或海水中進行浸浴，以100-200jngPACAP/L水的濃度，將所述PACAP神經(jīng)肽提供給魚類或甲殼類。12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中作為配合飼料，以5mgPACAP/Kg飼料的濃度，將所述PACAP神經(jīng)肽提供給魚類或甲殼類。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12的方法，其中將所述PACAP神經(jīng)肽提供給ftrec力iY邁/i1屬物種羅非魚。14.根據(jù)權(quán)利要求1-12的方法，其中將所述PACAP神經(jīng)肽提供給胡鲇屬物種鲇魚。15.根據(jù)權(quán)利要求1-12的方法，其中將所述PACAP神經(jīng)肽提供給鮭屬物種鮭魚。16.根據(jù)權(quán)利要求1-12的方法，其中將所述PACAP神經(jīng)肽提供給對奸屬物種奸。17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將所述PACAP神經(jīng)肽提供給魚類或甲殼類，以預(yù)防或處理由致病體引起的感染。18.根據(jù)序列SEQIDNo12、SEQIDNo13和SEQIDNo14的PACAP神經(jīng)肽在制備組合物中的用途，所述組合物用于處理培養(yǎng)中的魚類或甲殼類以刺激其生長。19.才艮據(jù)序列SEQIDNo12、SEQIDNo13和SEQIDNo14的PACAP神經(jīng)肽在制備組合物中的用途，所述組合物用于處理培養(yǎng)中的魚類或甲殼類以增加其抗病力。20.才艮據(jù)序列SEQIDNo12、SEQIDNo13和SEQIDNo14的PACAP神經(jīng)肽在制備組合物中的用途，所述組合物用于在培養(yǎng)中的魚類或甲殼類之中預(yù)防或治療性地治療由致病體引起的感染。21.才艮據(jù)序列SEQIDNo12、SEQIDNo13和SEQIDNo14的PACAP神經(jīng)肽的用途，用于刺激培養(yǎng)中的魚類和甲殼類生長以改善生產(chǎn)率。22.根據(jù)序列SEQIDNo12、SEQIDNo13和SEQIDNo14的PACAP神經(jīng)肽的用途，用于增加培養(yǎng)中的魚類和甲殼類的抗病力以改善生產(chǎn)率。23.根據(jù)序列SEQIDNo12、SEQIDNol沐SEQIDNo14的PACAP神經(jīng)肽的用途，用于預(yù)防或治療培養(yǎng)中的魚類和甲殼類的由致病體引起的感染以改善生產(chǎn)率。全文摘要本發(fā)明涉及垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽的變體用于刺激水生生物的生長和改善水生生物的免疫系統(tǒng)的用途。所述肽的變體通過浸沒、注射或作為食物添加劑來提供。文檔編號C07K14/575GK101356191SQ200680050714公開日2009年1月28日申請日期2006年11月20日優(yōu)先權(quán)日2005年11月22日發(fā)明者A·羅德里格斯馬龍,A·莫拉萊斯羅哈斯,F·F·埃雷拉米亞萊斯,J·M·盧戈岡薩雷斯,M·P·埃斯特拉達加西亞,O·羅德里格岡薩雷斯德索沙,R·莫拉萊斯費爾南德斯,Y·卡普里奧岡薩雷斯申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心