專(zhuān)利名稱(chēng)：：使用mntf肽及其類(lèi)似物治療神經(jīng)紊亂的方法使用MNTF肽及其類(lèi)似物治療神經(jīng)紊亂的方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明公開(kāi)總體上涉及使用MNTF肽及其類(lèi)似物治療神經(jīng)紊亂的組合物和方法。下文包括了可以用于理解本發(fā)明公開(kāi)的信息。并非承認(rèn)，本文所提供的任何信息對(duì)于本發(fā)明公開(kāi)而言是現(xiàn)有技術(shù)或相關(guān)技術(shù)，或者并非承認(rèn)，以明確的或隱含的方式引用的任何出版公開(kāi)或文件是現(xiàn)有技術(shù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活取決于由相關(guān)的、發(fā)育中的骨骼肌衍生而來(lái)的特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。已經(jīng)報(bào)道，某些骨骼肌產(chǎn)生能夠通過(guò)防止胚胎神經(jīng)元發(fā)生退化以及隨后的自然細(xì)胞死亡來(lái)增強(qiáng)神經(jīng)元的存活和發(fā)育的物質(zhì)。這些物質(zhì)已經(jīng)被廣泛地描述為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTF)，其為這樣一類(lèi)專(zhuān)門(mén)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)發(fā)揮作用以促進(jìn)所選的多群神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、維持和功能的能力(例如Chau，R.M.W.，etal.，6Chin.JNeuroanatomy129，1990)。影響中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)的多種神經(jīng)退行性、神經(jīng)肌肉和神經(jīng)元的疾病、紊亂或病況可以完全地或部分地表征為功能神經(jīng)組織的急性或進(jìn)行性喪失。其包括諸如脊髓損傷(SCI)、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或缺血(例如腦缺血)、亨廷頓氏疾病(HD)、帕金森氏疾病(PD)、多發(fā)性硬化(MS)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、阿茲海默氏疾病(AD)和糖尿病神經(jīng)病變之類(lèi)的病況。US6309877、US7183373、US6841531、US6759389和US20060052299報(bào)道了被稱(chēng)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)的特定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTF)，所述的因子具有對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以營(yíng)養(yǎng)作用的能力。所述文獻(xiàn)的內(nèi)容在此以引用方式全文并入本文。發(fā)明概述本文描述了具有許多特征和實(shí)施方案的技術(shù)，這些特征和實(shí)施方案包括，但不限于在本發(fā)明概述中列出、描述或引用的那些。無(wú)意于將所有的特征和實(shí)施方案都包括在內(nèi)，并且權(quán)利要求也不限于本發(fā)明概述中所表明的特征或?qū)嵤┓桨?，這些特征和實(shí)施方案僅是為了說(shuō)明的而并非為了限制的目的被包括在本說(shuō)明中的。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明公開(kāi)涉及包含MNTF分子的部分的新型肽和組合物，其中所述的MNTF分子可用于調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和增殖，從而提供了可以容易地合成的并且在治療中樞和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)中的多種神經(jīng)退行性、神經(jīng)肌肉的疾病、紊亂或病況中具有治療有效性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽。在一個(gè)方面中，提供了治療受試者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)缺陷和/或神經(jīng)元紊亂的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，其中所述的神經(jīng)元紊亂選自脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變，其中所述的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)以足以治療所迷的神經(jīng)元紊亂的量來(lái)施用。在一個(gè)方面中，本發(fā)明公開(kāi)涉及合成的和/或純化的MNTF肽類(lèi)似物，其中所述的MNTF肽類(lèi)似物包含WMLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的部分(包括WMLSAFS,FSRYAR，以及SEQIDNO:1-142的其他結(jié)構(gòu)域)，并且本發(fā)明公開(kāi)還涉及模擬了上述類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)和/或功能的、用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和生長(zhǎng)的分子，包括截短的序列同源物和類(lèi)似物。在某些實(shí)施方案中，MNTF肽類(lèi)似物可以包括含有SEQIDNO:I-7以及SEQIDNO:8-142的序列類(lèi)似物(參見(jiàn)圖25)。LGTFWGDTLN，LSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQIDNO:1)FSRYAR(SEQIDNO:2)■SAFS(SEQIDNO:3)MLSAFSRYAR(SEQIDNO:4)8FSRYARCLAEG(SEQIDNO:5)CWMLSAFSRYARC(SEQIDNO:6)MLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQIDNO:7)本文中所描述的MNTF肽類(lèi)似物為衍生自MNTF的多肽(即，得自SEQIDNO:1)以及此類(lèi)衍生多肽的類(lèi)似物。這些化合物包括具有SEQIDNO:1-142中的一條序列(例如SEQIDNO:2-7中的任一條)的氨基酸序列的多肽。此外，所述的化合物還包括SEQIDNO:1-7中所述的MNTF肽類(lèi)似物的功能衍生物。上文所述多肽的鹽、酯和其他普通劑型也可用于本文所述的技術(shù)中，如其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被非天然(例如D-異構(gòu)體)的氨基酸殘基替代的多肽一樣。如本文所述，其他類(lèi)似物(包括保守性地替代SEQIDNO:1中所公開(kāi)的那些氨基酸殘基的氨基酸殘基)可以用于替代一個(gè)或多個(gè)這些殘基。在另一方面中，提供了這樣的組合物和方法，其通過(guò)體外向細(xì)胞培養(yǎng)物施用MNTF肽類(lèi)似物或者體內(nèi)向患有神經(jīng)損傷或神經(jīng)退行性紊亂的個(gè)體施用MNTF肽類(lèi)似物以促進(jìn)細(xì)胞增殖或穩(wěn)定不適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡、和/或在上述任一種情況下以恢復(fù)正常細(xì)胞的行為，來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和/或生長(zhǎng)。在一個(gè)方面中，提供了一種修復(fù)受試者中損害的神經(jīng)通路的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，其中所述損害的神經(jīng)通路與脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變有關(guān)，其中所述的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物以足以治療所述的神經(jīng)元紊亂的量來(lái)進(jìn)行施用，從而在所述的受試者中損害的神經(jīng)通路得以修復(fù)。在一個(gè)方面中，提供了一種改善患有神經(jīng)通路損害癥狀的受試者的運(yùn)動(dòng)功能的方法，該方法包括向有此需要的患者施用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，其中所述的損傷的神經(jīng)通路與脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變有關(guān)，其中所述的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物以足以治療所述受試者中所述損害的神經(jīng)通路的量來(lái)進(jìn)行施用，從而運(yùn)動(dòng)功能得以改善。圖1。示出了野生型小鼠的腦中示例性MNTF-6聚體肽類(lèi)似物(GM6;FSRYAR，SEQIDNO:2)的水平。野生型小鼠載體對(duì)照(鹽水)，0.2mg的MNTF或者2mg/kg的MNTF。在時(shí)間0時(shí)，施用所示的測(cè)試制品，并在4小時(shí)后收集腦以便通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。圖2A。示出了在發(fā)生暫時(shí)性缺血的小鼠中，示例性MNTF-6聚體肽(FSRYAR，GM602或SEQIDNO:2)對(duì)梗塞體積的作用。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后的24小時(shí)的再灌注。在缺血結(jié)束時(shí)，以lmg/kg或5mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或者GM602。在第2天處死動(dòng)物，并進(jìn)行處理以測(cè)定梗塞體積。圖2B。其為經(jīng)歷缺血/再灌注損傷、然后經(jīng)歷IV注射一個(gè)劑量的GM602或栽體的兩個(gè)腦的圖像，其中GM602(左側(cè)，經(jīng)治療的腦的4個(gè)部分)顯示出極小的損傷(白色區(qū)域)，而載體(右側(cè)，對(duì)照腦的4個(gè)部分)顯示出腦中過(guò)度的損傷。其為得自經(jīng)歷1小時(shí)缺血及24小時(shí)再灌注的小鼠腦的代表性照片。在缺血結(jié)束時(shí)，對(duì)動(dòng)物注射GM602(5mg/kg)或載體。圖3。示出了得自腦血流量的估測(cè)的數(shù)據(jù)，其中所述的腦血流量得自經(jīng)歷缺血/再關(guān)注損傷的動(dòng)物。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后的24小時(shí)的再灌注。在缺血結(jié)束時(shí)，以lmg/kg或5mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或者GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過(guò)程中(第二根柱)以及在注入測(cè)試制品之后(第三根柱)，測(cè)定血流量。圖4。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的血壓測(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后的24小時(shí)的再灌注。在缺血結(jié)束時(shí)，以lmg/kg或5mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或者GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過(guò)程中(第二根柱)以及在注入測(cè)試制品之后(第三根柱)，測(cè)定血流圖5。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的心率測(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后的24小時(shí)的再灌注。在缺血結(jié)束時(shí)，以lmg/kg或5mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或者GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過(guò)程中(第二根柱)以及在注入測(cè)試制品之后(第三根柱)，測(cè)定心率。圖6。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的血?dú)鉁y(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后的24小時(shí)的再灌注。在缺血結(jié)束時(shí)，以lmg/kg或5mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或者GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過(guò)程中(第二根柱)以及在注入測(cè)試制品之后(第三根柱)，測(cè)定血液氣體(p02和pC02)。圖7。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的pH測(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后的24小時(shí)的再灌注。在缺血結(jié)束時(shí)，以lmg/kg或5mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或者GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過(guò)程中(第二根柱)以及在注入測(cè)試制品之后(第三根柱)，測(cè)定pH。圖8。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的神經(jīng)缺損測(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后的24小時(shí)的再灌注。在缺血結(jié)束時(shí)，以lmg/kg或5mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或者GM602。在再灌注的末期測(cè)定神經(jīng)缺損情況。圖9。示出了在發(fā)生脊髓損傷后的小鼠中，示例性MNTF肽類(lèi)似物GM603(FSRYAR，SEQIDNO:2)對(duì)病變體積的作用。所有的小鼠都經(jīng)歷了脊髓損傷、及其后的14天的恢復(fù)。在損傷后，并在在每天都對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射栽體(對(duì)照)和GM603,直至處死。在第14天將動(dòng)物處死，然后進(jìn)行處理以測(cè)定病變體積。圖10。其為在經(jīng)歷脊髓損傷(SCI)之后脊髓的損害區(qū)域。所有的小鼠都經(jīng)歷了脊髓損傷、及其后的14天的恢復(fù)。切除組織切片，并進(jìn)行處理以用于評(píng)價(jià)損害區(qū)域。A:經(jīng)載體治療的患有SCI的小鼠。B:使用5mg/kgGM603治療的小鼠。損害的區(qū)域染成了紅色，而未受損害的區(qū)域被染成了藍(lán)色。如圖所示，在GM603治療的動(dòng)物中，圖B所示的損害區(qū)域明顯較小。圖11。示出了經(jīng)歷脊髓損傷的動(dòng)物的轉(zhuǎn)棒踏車(chē)(Rota-RodTreadmill)測(cè)試的結(jié)果。所有的小鼠都經(jīng)歷了脊髓損傷、及其后的圖中指示的天數(shù)。在損傷之后測(cè)定行為分析情況。圖12。其為在經(jīng)歷脊髓損傷的小鼠中的曠場(chǎng)(open-field)行為測(cè)定情況。所有的小鼠都經(jīng)歷了脊髓損傷、及其后的圖中指示的天數(shù)。在損傷之后測(cè)定行為分析情況。圖13。其為在ALS小鼠中，示例性MNTF肽類(lèi)似物GM604(FSRYAR，SEQIDNO:2)對(duì)疾病發(fā)作年齡的作用。在第80天，并且在直至處死前每天都對(duì)所有的小鼠靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或GM6(M。針對(duì)疾病發(fā)作的時(shí)間對(duì)動(dòng)物進(jìn)行記錄。圖14。其為在ALS小鼠中，示例性MNTF肽類(lèi)似物GM604對(duì)死亡年齡的作用。在第80天，并且在直至處死前每天都對(duì)所有的小鼠靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或GM604?；诤笾c瘓的情況，針對(duì)疾病發(fā)作的時(shí)間對(duì)動(dòng)物進(jìn)4亍記錄。圖15。其為對(duì)ALS動(dòng)物的轉(zhuǎn)棒踏車(chē)測(cè)試情況。所有的小鼠都是轉(zhuǎn)基因的，發(fā)生了G93ASOD突變，并如指示的使用鹽水或者示例性MNTF肽類(lèi)似物GM604進(jìn)行治療。在指示的時(shí)間測(cè)定行為分析情況。圖16。其為對(duì)ALS動(dòng)物的抓力測(cè)試。所有的小鼠都是轉(zhuǎn)基因的，發(fā)生了G93ASOD突變，并如指示的使用鹽水或者GM604進(jìn)行治療。對(duì)ALS動(dòng)物進(jìn)行臨床評(píng)分。所有的小鼠都是轉(zhuǎn)基因的，發(fā)生了G93AS0D突變，并如指示的使用鹽水或者GM604進(jìn)行治療。按照在方法部分中概括的那樣，在指示的時(shí)間測(cè)定臨床評(píng)分。未見(jiàn)虛弱跡象(0);顫抖和喪失張開(kāi)反射(l);一只后肢輕癱(2);兩只后肢輕癱(3);—只或兩只后肢癱瘓(4)(參見(jiàn)圖16B)。圖17。其為在經(jīng)歷豬毛菜酚(salsolinol)治療后的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞中，示例性MNTF肽類(lèi)似物(GB測(cè)試制品)對(duì)細(xì)胞生存能力的作用。按照在方法部分中所概況的那樣，所有的培養(yǎng)物都生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物與載體(對(duì)照)、各種濃度的MNTF肽類(lèi)似物GM6、+/-豬毛菜酚(Sal)溫育。此外，將多個(gè)培養(yǎng)物與渥曼青霉素(W)溫育，從而測(cè)定作用的機(jī)制。將培養(yǎng)物與多種化合物溫育24小時(shí)，并分析細(xì)胞的生存能力。圖18。通過(guò)CSF，在原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在培養(yǎng)12天后，將得自對(duì)照和各種神經(jīng)紊亂的CSF應(yīng)用到原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中，為期2天。在時(shí)間0時(shí)施用所示的測(cè)試制品，并通過(guò)MTT分析測(cè)定培養(yǎng)物的細(xì)胞生存能力。圖19。其為在CSF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中，示例性MNTF肽對(duì)抗神經(jīng)元細(xì)胞損失的保護(hù)性作用。在培養(yǎng)1,2天后，將得自對(duì)照和各種神經(jīng)紊亂的CSF應(yīng)用到原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中，為期2天。加入MNTF(+M)，2小時(shí)后加入CSF。在時(shí)間0時(shí)施用所示的測(cè)試制品，并通過(guò)MTT分析測(cè)定培養(yǎng)物的細(xì)胞生存能力。圖20A和20B。其為在PD誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠中的行為測(cè)定情況。對(duì)雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，然后以所示的劑量注射GM6,為期5天。評(píng)價(jià)動(dòng)物的行為變化情況。圖21A、21B和21C。示出了在經(jīng)歷MPTP治療后一元胺和代謝物的水平。對(duì)雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，然后以所示的劑量注射GM6，為期5天。在所述研究結(jié)束時(shí)評(píng)價(jià)動(dòng)物中一元胺和代謝物的水平。圖22。其為在PD誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠的黑質(zhì)致密部(Substantianigraparscompacta)中細(xì)胞的數(shù)量。對(duì)雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，然后以所述的劑量注射GM6,為期5天。在所述研究結(jié)束時(shí)，評(píng)價(jià)動(dòng)物中的細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖23。其為在MS誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠中的平均臨床分?jǐn)?shù)。對(duì)雌性JJL/J小鼠注射PLP，然后以所示的劑量注射GM6,為期7天。每隔一天評(píng)價(jià)動(dòng)物的臨床分?jǐn)?shù)。圖24A和24B。24A:其為在MS誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠的腦中13的病變的數(shù)量。對(duì)雌性JJL/J小鼠注射PLP，然后以指示的劑量注射GM6，為期7天。在所述研究結(jié)束時(shí)，評(píng)價(jià)動(dòng)物中的腦病變情況。24B:其為在MS誘導(dǎo)和GM6處理后，小鼠脊髓中的病變的數(shù)量。對(duì)雌性JJL/J小鼠注射PLP，然后以指示的劑量注射GM6，為期7天。在所述研究結(jié)束時(shí)，評(píng)價(jià)動(dòng)物中的脊髓病變情況。圖25,其由圖25A、25B、25C、25D、25E、25F和25G構(gòu)成，為示例性MNTF肽類(lèi)似物的部分列表。與各個(gè)SEQIDNO相應(yīng)的序列被突出表示。圖26。示出了在經(jīng)歷瞬時(shí)缺血的小鼠中GM602對(duì)梗塞體積的作用的研究中得到的數(shù)據(jù)。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血后，在指示的時(shí)間(3、6、12、24小時(shí))，以5mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射栽體(對(duì)照)或者GM602。此外，在損傷后的3天中每天都對(duì)動(dòng)物進(jìn)行注射。在第14天處死動(dòng)物，并對(duì)其進(jìn)行處理以測(cè)定梗塞體積。圖27。示出了在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的動(dòng)物中腦血流量研究中得到的數(shù)據(jù)。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時(shí)施用測(cè)試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血后以及再灌注后測(cè)定血流量。圖28。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的血壓測(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時(shí)施用測(cè)試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血過(guò)程中以及在缺血結(jié)束時(shí)之后測(cè)定血壓。圖29。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的心率測(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時(shí)施用測(cè)試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血過(guò)程中以及在缺血結(jié)束時(shí)之后測(cè)定心率。圖30A和30B。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的血液氣體測(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時(shí)施用測(cè)試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血過(guò)程中以及在缺血結(jié)束時(shí)之后測(cè)定血液氣體pO2(30A)和pC02(30B)。圖31。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中的pH測(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時(shí)施用測(cè)試制品。在發(fā)生缺血前、在缺血過(guò)程中以及在缺血結(jié)束時(shí)之后測(cè)定pH。圖32。其為在經(jīng)歷缺血/再灌注損傷的小鼠中神經(jīng)缺損的測(cè)定值。所有的小鼠都經(jīng)歷了1小時(shí)的腦缺血、及其后14天的再灌注。在缺血發(fā)作后的第3、6、12和24小時(shí)施用測(cè)試制品。在再灌注結(jié)束時(shí)，測(cè)定神經(jīng)缺損情況。圖33。其為在經(jīng)歷缺血之后的大鼠中，GM602對(duì)梗塞體積的作用。所有的大鼠都經(jīng)歷的為期28天的持續(xù)的腦缺血。在缺血開(kāi)始之后的3小時(shí)，以0，2.5，10或20mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或GM602。在第28天處死動(dòng)物，并對(duì)其進(jìn)行處理以測(cè)定梗塞體積。圖34。其為得自經(jīng)歷缺血的動(dòng)物的腦血液。所有的大鼠都經(jīng)歷了腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)，以2.5、10或20mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血前(第一根柱，缺血前基線(xiàn)下的CBF)，在缺血過(guò)程中(第二根柱，在持續(xù)缺血之后、但在施用測(cè)試制品之前3小時(shí)的CBF),以及在注射了測(cè)試制品之后(第三根柱，在施用測(cè)試制品之后1小時(shí)的CBF)測(cè)定血液流量。圖35。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的血液測(cè)定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)，以2.5、10或20mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過(guò)程中(第二根柱)以及在注入測(cè)試制品之后(第三根柱)，測(cè)定血壓。圖36。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的心率測(cè)定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)，以2.5、10或20mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過(guò)程中(第二根柱)以及在注入測(cè)試制品之后(第三根柱)，測(cè)定心率。圖37A和37B。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的血液氣體測(cè)定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)，以2.5、10或20mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一才艮柱)、在缺血過(guò)程中(第二根柱)以及在注入測(cè)試制品之后(第三才艮柱)，測(cè)定血液氣體p02(參見(jiàn)圖37A)和pC02(參見(jiàn)圖37B)。圖38。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的pH測(cè)定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)，以2.5、IO或20mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射載體(對(duì)照)或GM602。對(duì)于各研究組而言，在發(fā)生缺血之前(第一根柱)、在缺血過(guò)程中(第二才艮柱)以及在注入測(cè)試制品之后(第三才艮柱)，測(cè)定pH。圖39。其為在經(jīng)歷缺血的大鼠中的神經(jīng)缺損測(cè)定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)，以2.5、10或20mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射栽體(對(duì)照)或GM602。圖39A:其為前肢放置情況。圖39B:其為后肢放置情況。圖39C:其為平衡木情況。圖39D:其為在所述研究結(jié)束時(shí)，測(cè)定的神經(jīng)缺損情況(自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)性)。在圖39D中，第一根條柱是在施用測(cè)試制品之前的評(píng)分，而第二根條柱是在給要測(cè)試制品之后的第28天時(shí)的評(píng)分。圖40。其為在經(jīng)歷缺血損傷的大鼠中的生物標(biāo)志物測(cè)定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)，以2.5、10或20mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射栽體(對(duì)照)或GM602。在第28天處死動(dòng)物，并對(duì)腦切片進(jìn)行處理以用于TNF免疫組織化學(xué)分析。圖41。其為在經(jīng)歷缺血損傷的大鼠中的生物標(biāo)志物測(cè)定值。所有的大鼠都經(jīng)歷了持續(xù)的腦缺血，及其后28天的恢復(fù)。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)，以2.5、10或20mg/kg的量對(duì)動(dòng)物靜脈內(nèi)注射栽體(對(duì)照)或GM602。在第28天處死動(dòng)物，并對(duì)腦部分進(jìn)行處理以用于Fluoro-jade免疫組織化學(xué)分析。發(fā)明詳述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活取決于由相關(guān)的、發(fā)育中的骨骼肌衍生而來(lái)的特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。已經(jīng)報(bào)道，骨骼肌產(chǎn)生能夠通過(guò)抑制胚胎神經(jīng)元發(fā)生退化以及隨后的自然細(xì)胞死亡來(lái)增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活和發(fā)育的物質(zhì)(0'Brian，R.J.andFischbach，G.D.，6J.Neurosci.3265(1986);Hollyday，M.andHamburger,V.，170J.Comp.Neurol.311(1976).McMa麵an,J.L.，etal.,263J.Biol.Chem.5890(1988);Oppenheim，R.W.,etal.，240Science,919(1988);和Smith,R.G.，etal.，6J.Neurosci.439(1986))。人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)是一種得自骨骼肌組織的特殊的NTF，已經(jīng)顯示其能夠減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷位置處的炎癥，增強(qiáng)神經(jīng)再生，以及促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活。已經(jīng)在大鼠的多種神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)MNTF進(jìn)行了測(cè)試，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)包括外周坐骨神經(jīng)(控制下肢肌肉)，外周肌皮神經(jīng)(控制上肢肌肉)，頭部和面部神經(jīng)(控制面部和頭部肌肉)，頭部舌下神經(jīng)(控制舌頭)，以及控制頸部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓。在脊髓模型中，將MNTF施加在大鼠的半橫切脊髓中的神經(jīng)移植物上；MNTF減少了炎癥、限制了惡化并增強(qiáng)了嫁接神經(jīng)的再生。許多研究已經(jīng)證實(shí)了當(dāng)將MNTF或其肽類(lèi)似物直接施加到所述的神經(jīng)上時(shí)，這些合成的MNTF或其肽類(lèi)似物在大鼠外周神經(jīng)模型中在營(yíng)養(yǎng)和熱效應(yīng)方面的效力。此外，MNTF已經(jīng)顯示出能夠促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的再生和存活。在生長(zhǎng)和形成的某些時(shí)期，在脊推動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生神經(jīng)元細(xì)胞死亡。因此，加入得自相關(guān)目標(biāo)組織的可溶性神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子可以起到減輕神經(jīng)元死亡的這種現(xiàn)象。因此，本發(fā)明公開(kāi)的多個(gè)方面和實(shí)施方案提供了用于治療神經(jīng)元紊亂的、包含MNTF肽類(lèi)似物及其衍生物的方法和組合物。本發(fā)明公開(kāi)的多個(gè)方面和實(shí)施方案涉及與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子的17作用有關(guān)的功能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被識(shí)別并且在MNTF1分子中被繪制成短的重疊序列。這些這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(包括"WMLSAFSRYAR"，"WMLSAFS"，"FSRYAR"以及得自SEQIDNO:1-142的其他結(jié)構(gòu)域)足以調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和增殖。此外，包含這些結(jié)構(gòu)域的多種截短的MNTF1種類(lèi)或類(lèi)似物(序列片段類(lèi)似物或其功能類(lèi)似物)他們本身足以證明運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元/成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞雜交體的刺激生物活性。定義以下列出在描述本發(fā)明公開(kāi)所屬技術(shù)的內(nèi)容中使用的某些術(shù)語(yǔ)。除非另作說(shuō)明，否則以下術(shù)語(yǔ)當(dāng)在本文中以及在所附的^=又利要求書(shū)中使用時(shí)具有以下含義。在以下說(shuō)明書(shū)或者在本說(shuō)明書(shū)中的其他處沒(méi)有定義的那些術(shù)語(yǔ)具有他們本領(lǐng)域所公認(rèn)的含義。如本文所使用的，"運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子"包括涉及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)或維持的那些因子。術(shù)語(yǔ)"運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子"、"MNTF"、"MNTF肽，，、"運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子類(lèi)似物"和"MNTF類(lèi)似物，，可以互換使用，只要它們具有本文限定的功能特性。他們可以包括參照NMTF序列的序列以及功能同源物。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子可以促進(jìn)定型的神經(jīng)祖細(xì)胞的發(fā)育和分化，或者它們可以誘導(dǎo)或增強(qiáng)分化的神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)(例如神經(jīng)突長(zhǎng)出)和存活。本發(fā)明的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子一般以有效產(chǎn)生CNS或PNS的完全分化的神經(jīng)細(xì)胞(例如，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)的量提供。關(guān)于量的指導(dǎo)在本文中提供，并且可以由技術(shù)人員基于已知操作和本文公開(kāi)的方法容易地確定。示例性的MNTF肽及其肽類(lèi)似物可以包括在Chau，R.M.W.，etal.，MuscleNeuronotrophicFactorsSpecificforAnteriorHornMotoneuronsofRatSpinalCord.In:RecentAdvancesinCellularandMolecularBiology,Vol.5，PeetersPress,Leuven，Belgium,pp.89-94(1992)中所報(bào)道的那些，以及在(例如)US6309877、US7183373、US6841531、US6759389和US20060052299中發(fā)現(xiàn)的那些。這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文并入本文。在某些實(shí)施方案中，實(shí)例可以包括可用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存能力和生長(zhǎng)的、經(jīng)合成和/或純化18的、包含有部分WMLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域(包括WMLSAFS、FSRYAR以及得自SEQIDNO:1-142的其他結(jié)構(gòu)域)的MNTF肽類(lèi)似物，以及模擬了其類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)和/或功能的分子(包括截短的序列同源物和類(lèi)似物)。此外，示例性的MNTF肽及其肽類(lèi)似物還可以包括在Chau，R.M.W.，etal.，TheEffectofa30kDProteinfromTectalExtractofRatonCulturedRetinalNeurons,34ScienceinChina,SeriesB，908(1991);Chau，R.M.W.，etal.，MuscleNeuronotrophicFactorsSpecificforAnteriorHornMotoneuronsofRatSpinalCord.In:RecentAdvancesinCellularandMolecularBiology,Vol.5，PeetersPress,Le講n，Belgium,pp.89-94(1992);Chau，R.M.W.，etal.，TheEffectofa30kDProteinfromTectalExtractofRatonCulturedRetinalNeurons,34ScienceinChina,SeriesB，908(1991);Chau,R.M.W.，etal.，CloningofGenesforMuscle-DerivedMotoneuronotrophicFactor1(MNTF1)andItsReceptorbyMonoclonalAntibodyProbes,(abstract)19Soc.forNeurosci.part1，252(1993)，Chau，R.M.W.，etal.，CloningofGenesforMuscle-DerivedMotoneuronotrophicFactor1(MNTFOandItsReceptorbyMonoclonalAntibodyProbes,(abstract)19Soc.forNeurosci.part1，252(1993)中所描述的那些，這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容均以參考方式并入本文。在某些實(shí)施方案中，所述的MNTF或其類(lèi)似物是合成的或純化的。在某些實(shí)施方案中，MNTF肽類(lèi)似物可以包括得自MNTF結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)之一的序列(例如6個(gè)氨基酸的MNTF類(lèi)似物，例如SEQIDNO:2)。在某些實(shí)施方案中，MNTF肽類(lèi)似物可以包括含有SEQIDNO:1-142的序列類(lèi)似物。在某些實(shí)施方案中，MNTF肽乘似物可以包括如在SEQIDNO:1-142中所迷的肽類(lèi)似物的功能衍生物。在某些實(shí)施方案中，所述的MNTF肽類(lèi)似物及其衍生物可以由在19SEQIDNO:1-142中所述的序列構(gòu)成。如本申請(qǐng)所用，"類(lèi)似物"是指這樣的肽，其中在參照序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被改變，而基本上沒(méi)有影響MNTF的活性。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的類(lèi)似物包括"保守性"的取代。保守性的氨基酸取代包括使用具有相同基團(tuán)的同義氨基酸進(jìn)行的氨基酸替代，其中所述的同義氨基酸具有足夠相同相似的物理化學(xué)性質(zhì)，從而使得同類(lèi)成員之間的取代將保留所述分子的生物學(xué)功能，Grantham,Science,Vol.185，pp.862-864(1974)。同義氨基酸基團(tuán)包括在表I、II和III中定義的那些。表I寬泛種類(lèi)的同義氨基酸氨基酸一同義種類(lèi)Ser—Ser，Thr，Gly，AsnArg—Arg，Gln，Lys，Glu，HisLeu—lie,Phe，Tyr，Met,Val，LeuPro—Gly，Ala,Thr,ProThr—Pro,Ser，Ala，Gly，His,Gln，Ala—Gly，Thr，Pro,AlaVal—Met,Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGly—Ala,Thr，Pro,Ser，Glylie—Met,Tyr,Phe，Val，Lou,IlePhe一Trp,Met,Tyr，Ile，Val，Leu,Tyr—Trp，Met,Phe，lie,Val，Leu，Cys一Ser，Thr，CysHis—Glu，Lys，Gln，Thr，Arg,HisGinGlu，Lys，Asn，His,Thr,Arg，Asn—Gln，Asp,Ser，AsnLys—Glu，Gln，His,Arg，LysAsp—Glu，Asn，Asp20Glu—Asp，Lys，Asn，Gln，His,Arg,GluMet—Phe，lie,Val，Leu，MetTrp—Trp表II中等程度種類(lèi)的同氨基酸一同義種類(lèi)Ser—SerArg—His,Lys，Leu—Ile，Phe，Pro—Aia，ProThr—ThrAla—Pro,AlaVal—Met,lie,Gly—Gly"lieIle,Met,Phe—Met,Tyr，Tyr—Phe，TyrCys—Ser，CysHis—Arg，Gln，Gin—Glu，His,Asn—Asp,AsnLys—Arg，LysAsp—Asn,AspGlu—Gln，GluMet—Phe，Ile,Trp—Trpt氨基酸ArgMet,LeuValPhe,Val,Leulie,Leu，PheHisGlnVal，Uu，Met表III狹窄范圍種類(lèi)的同義氨基酸氨基酸一同義種類(lèi)Ser—SerArg—ArgLeu—lie,Met,LeuPro—ProThr—ThrAla—AlaVal—ValGly—Glylie—lie,Met,LeuPhe—PheTyr—TyrCys—Ser，CysHis—HisGin—GinAsn—AsnLys—LysAsp—AspGlu—GluMet—lie,Leu，MetTrp—Trp在本文所提供的化合物(例如肽和蛋白質(zhì))中所使用的氨基酸可以是遺傳編碼的氨基酸，天然形成的非遺傳編碼的氨基酸，或者合成的氨基酸。上述任何氨基酸的L-和D-對(duì)映體都可以用于所述的化合物中。本文中，以下縮寫(xiě)可以用于以下遺傳編碼的氨基酸(及其殘基)中丙氨酸(Ala，A);精氨酸(Arg，R);天冬酰胺(Asn，N);天冬氨酸(Asp,D);半胱氨酸(Cys，C);甘氨酸(Gly，G);谷氨酸(Glu，E);谷氨酰胺(Gln，Q);組氨酸(His,H);異亮氨酸(Ile，I);亮氨酸(Leu，L);賴(lài)氨酸(Lys，K);甲疏氨酸(Met，M);苯丙氨酸(Phe，F(xiàn));脯氨酸(Pro，P);絲氨酸(Ser，S);蘇氨酸(Thr，T);色氨酸(Trp，W);酪氨酸(Tyr，Y);以及纈氨酸(Val，V)。的氨基酸包括(但不限于)P-丙氨酸(b-Ala)以及其他cc-氨基酸，例如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr，Z)，4-氨基丁酸等；ot-氨基異丁酸(Aib);s-氨基已酸(Aha);5-氨基戊酸(Ava);曱基甘氨酸(MeGly);鳥(niǎo)氨酸(0rn);瓜氨酸(Cit);叔丁基丙氨酸(t-BuA);叔丁基甘氨酸(t-BuG);N-甲基異亮氨酸(Melle);苯基甘氨酸(Phg);環(huán)己基丙氨酸(Cha);正亮氨酸(Nle，J);2-萘基丙氨酸(2-Nal);4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl));2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F));3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F));4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F));青霉胺(Pen);1,2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic);P-2-噻吩丙氨酸(Thi);甲疏氨酸亞砜(MS0);高精氨酸(hArg);N-乙酰基賴(lài)氨酸(AcLys);2，3-二氨基丁酸(Dab);2，3-二氨基丁酸(Dbu);對(duì)氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2));N-曱基纈氨酸(MeVal);高半胱氨酸(hCys);3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸(BztAla，B);以及高絲氨酸(hSer)。所考慮的其他氨基酸類(lèi)似物包括磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸酯、馬尿酸、八氫吲味-2-羧酸、施德丁(Statine)、a-曱基-丙氨酸、對(duì)苯酰-苯基丙氨酸、炔丙基甘氨酸以及肌氨酸。無(wú)論是目前或是在將來(lái)，本文所述的肽在L-或D-構(gòu)型中可以具有任何之前所述的氨基酸，或者可以具有本文所述的或本領(lǐng)域已知的任何其他氨基酸?？梢员舜巳〈渌陌被嵬ǔＴ谙嗨频念?lèi)別或亞類(lèi)中。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的那樣，主要根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)和物理性質(zhì)，許多氨基酸可以被放置到不同的類(lèi)別中。例如，一些氨基酸通常被認(rèn)為是親水性的或者是極性的氨基酸，而其他的氨基酸被認(rèn)為是疏水性的或者是非極性的氨基酸。極性氨基酸包括具有酸性、堿性或親水性側(cè)鏈的氨基酸，而非極性氨基酸包括具有芳香或疏水性側(cè)鏈的氨基酸。非極性氨基酸可以被進(jìn)一步再細(xì)分，其中包括脂肪族氨基酸等。本文所用的氨基酸類(lèi)別的定義如下所示"非極性氨基酸"指具有在生理pH下不帶電，非極性和一般被水溶液排斥的側(cè)鏈的氨基酸。遺傳編碼的疏水性氨基酸的例子包括Ala、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。非遺傳編碼的非極性氨基酸的例子包括t-BuA、Cha和Nle。"芳香族氨基酸"指具有這樣的側(cè)鏈的非極性氨基酸，所述側(cè)鏈包含至少一個(gè)具有綴合的7T-電子系統(tǒng)(芳香族基團(tuán))的環(huán)。芳香族基團(tuán)可以進(jìn)一步替換為取代基例如烷基、烯基、炔基、羥基、磺?；?、硝基和氨基以及其他。遺傳編碼的芳香族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常見(jiàn)的非遺傳編碼的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、|3-2-噻吩丙氨酸、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸、1，2，3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。"脂肪族氨基酸"指具有飽和或未飽和的直鏈、分支或環(huán)狀烴側(cè)鏈的非極性氨基酸。遺傳編碼的芳香族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非編碼的芳香族氨基酸的例子包括Nle。"極性氨基酸"指具有這樣的側(cè)鏈的親水性氨基酸，所述側(cè)鏈在生理pH下是帶電的或不帶電的，并且具有其中由2個(gè)原子共同分享的電子對(duì)通過(guò)原子之一保持更緊密的鍵。極性氨基酸一般是親水性的，意指它們具有由水溶液吸引的側(cè)鏈的氨基酸。遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、賴(lài)氨酸和絲氨酸。非遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括瓜氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰賴(lài)氨酸和曱石危氨酸亞砜。"酸性氨基酸"指具有小于7的側(cè)鏈pK值的親水性氨基酸。由于氫離子的喪失，酸性氨基酸在生理pH下一般具有帶負(fù)電的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸鹽)和谷氨酸(谷氨酸鹽)。"堿性氨基酸"指具有大于7的側(cè)鏈pK值的親水性氨基酸。由于水合氬離子的喪失，堿性氨基酸在生理pH下一般具有帶正電的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸。非遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括鳥(niǎo)氨酸、2,3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。"可電離的氨基酸，，指在生理pH下可以帶電的氨基酸。此類(lèi)可電離的氨基酸包括酸性和堿性氨基酸，例如D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-組氨酸、D-精氨酸、D-賴(lài)氨酸、D-羥賴(lài)氨酸、D-鳥(niǎo)氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-羥賴(lài)氨酸或L-鳥(niǎo)氨酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，上文分類(lèi)法不是絕對(duì)的。幾種氨基酸顯示出超過(guò)一種的特征性質(zhì)，并且因此可以包括在超過(guò)一種的類(lèi)別中。例如，酪氨酸具有非極性芳香族環(huán)和極性羥基。因此，酪氨酸具有可以被描述為非極性、芳香族和極性的幾個(gè)特征。然而，非極性環(huán)是占優(yōu)勢(shì)的并且因此酪氨酸一般被視為非極性的。類(lèi)似地，除了能夠形成二硫鍵外，半胱氨酸也具有非極性特性。因此，盡管沒(méi)有嚴(yán)格分類(lèi)為疏水性或非極性氨基酸，但在許多情況下半胱氨酸可以用于給肽賦予疏水性或非極性。在某些實(shí)施方案中，由本發(fā)明考慮的極性氨基酸包括，例如，精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、高半胱氨酸、賴(lài)氨酸、羥賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，極性氨基酸是可電離的氨基酸，例如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、羥賴(lài)氨酸、賴(lài)氨酸或鳥(niǎo)氨酸?？梢岳玫臉O性或非極性氨基酸殘基的例子包括例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。本文中的術(shù)語(yǔ)"鹽"是指羧基鹽以及本文所述的的肽或其類(lèi)似物的氨基形成的酸加成鹽。羧基鹽可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)形成，并且包括無(wú)機(jī)鹽(例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽、鋅鹽等)以及與有機(jī)堿(如與胺(例如三乙醇胺、精氨酸、賴(lài)氨酸、哌啶、魯普卡因等)形成的那些堿)形成的鹽。酸性鹽包括例如與礦物酸(例如鹽酸或硫25酸)形成的鹽，以及與有機(jī)酸(例如乙酸或草酸)形成的鹽。當(dāng)然，任何所述的鹽都必需與本發(fā)明所公開(kāi)的肽具有基本相似的活性。如本文所使用的，定義"功能衍生物"是指這樣的衍生物，該衍生物可以根據(jù)已知的方法由存在于所述氨基酸部分的側(cè)鏈上或者存在于N-基團(tuán)或C-基團(tuán)上的官能團(tuán)來(lái)制備得到，并且當(dāng)該衍生物是藥學(xué)上可接受的時(shí)，即，當(dāng)他們不會(huì)破壞所述蛋白質(zhì)的活性或者不會(huì)使包含他們的藥物組合物具有毒性時(shí)，這些衍生物將被包含在本發(fā)明公開(kāi)的范圍內(nèi)。這些衍生物可以包括例如游離氨基的羧基和N-?；苌锏孽セ蛑咀艴０坊蛘哂坞x羥基的O-?；?，并且這些衍生物可以是與?；?例如alcanoyl或者芳?；?形成的。"前體"是在人或動(dòng)物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為本文所公開(kāi)的肽的化合物。本發(fā)明公開(kāi)的肽可以通過(guò)任何已知的方法來(lái)制備，例如固相合成或者液相合成方法。例如，就固相合成而言，將待合成的肽的C末端相應(yīng)的氨基酸與栽體結(jié)合，該載體不溶于有機(jī)溶劑，并通過(guò)交替反復(fù)的反應(yīng)，其中所述的反應(yīng)為使其中其oc-氨基和側(cè)鏈官能團(tuán)是由合適的保護(hù)基團(tuán)所保護(hù)的氨基酸以由C末端至N末端的順序依次濃縮的反應(yīng)；以及使與樹(shù)脂或者所述肽的ct-氨基的保護(hù)基團(tuán)結(jié)合的氨基酸被釋放出來(lái)的反應(yīng)，由此，按照這種方式所述的肽鏈被延長(zhǎng)。根據(jù)所用的包含基團(tuán)的種類(lèi)，固相合成方法在很大程度上被分為tBoc方法和Fmoc方法。常用的保護(hù)基團(tuán)包括用于氨基的tBoc(叔丁氧基羰基)，Cl-Z(2-氯千氧基羰基)，Br-Z(2-溴千氧基羰基)，Bzl(芐基)，F(xiàn)moc(9-芴甲氧基羰基)，Mbh(4，4'-dimethoxydibenzhydryl)，Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三曱基苯磺?；?，Trt(三苯曱基)，Tos(甲苯磺酰基)，Z(芐氧羰基)以及C12-Bzl(2，6-二氯千基)，用于胍基的N02(硝基)和Pmc(2，2，5，7，8-五曱基色原烷-6-磺?；?；以及用于羥基的tBu(叔丁基)。在合成所需的肽之后，應(yīng)該對(duì)該肽進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，并從固相載體上切下來(lái)。對(duì)于Boc方法而言，這種肽的切除反應(yīng)可以使用氟化氬或者三氟曱磺酸來(lái)進(jìn)行，而對(duì)于Fmoc方法而言，上述肽的切除反應(yīng)可以使用TFA來(lái)進(jìn)行。然后，對(duì)如此得到的肽粗品進(jìn)行純化。通過(guò)可以達(dá)到上述目的的任何一種方法來(lái)進(jìn)行純化，即，涉及提取、沉淀、色譜、電泳等的任何傳統(tǒng)方法。例如，可以使用HPLC(高效液相色譜)?？梢允褂玫鞍踪|(zhì)純化常用的水-乙腈基的溶劑來(lái)進(jìn)行洗脫。本文所述的肽可以以基本純化的形式來(lái)提供，由此使其在需要MNTF活性和/或調(diào)節(jié)的病理學(xué)中作為活性組分而適用于藥物組合物中。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"生物活性肽"和"生物活性片段"指依照上文描述的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子(MNDF)或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)的肽或多肽，其中MNDF使千細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，和MNTF顯示出神經(jīng)保護(hù)、修復(fù)和治療功能。術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)的"一般指例如在允許的鹽和溫度條件下，經(jīng)由堿基配對(duì)的多核苷酸的天然結(jié)合。例如，序列"A-G-T"與互補(bǔ)序列"T-C-A"結(jié)合。2個(gè)單鏈分子之間的互補(bǔ)性可以是"部分的"，從而使得只有某些核酸結(jié)合，或其可以是"完全的"，從而使得總體互補(bǔ)性存在于單鏈分子之間。核酸分子之間的互補(bǔ)性程度對(duì)它們之間的雜交效率和強(qiáng)度具有顯著影響。"可雜交的，，和"互補(bǔ)的"是這樣的術(shù)語(yǔ)，其用于指出互補(bǔ)性的足夠程度，從而使得足以執(zhí)行預(yù)期作用的結(jié)合優(yōu)選地穩(wěn)定的結(jié)合例如在核酸之間發(fā)生。應(yīng)當(dāng)理解寡核苷酸無(wú)需與其可雜交的靶核酸序列100%互補(bǔ)。術(shù)語(yǔ)"組合物"旨在包括含有一種或多種成分的產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)"分化的"是相對(duì)術(shù)語(yǔ)，其中"分化細(xì)胞，，是比待比較的細(xì)胞已沿著發(fā)育途徑進(jìn)一步進(jìn)展的細(xì)胞。如本文進(jìn)一步所使用的，"分化的神經(jīng)細(xì)胞"一般指中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的部分分化或完全分化的細(xì)胞。祖細(xì)胞是在發(fā)育和分化期間通過(guò)一系列細(xì)胞分裂產(chǎn)生不同的細(xì)胞譜系的母細(xì)胞。例如，神經(jīng)祖細(xì)胞被定型為最終將發(fā)育成CNS或PNS的完全分化的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞諮系；然而，此類(lèi)神經(jīng)祖細(xì)胞可能尚未獻(xiàn)身于特定類(lèi)型，或亞類(lèi)的神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)27這樣的細(xì)胞系，其將分化成特定類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞，并且其后產(chǎn)生完全分化的神經(jīng)細(xì)胞。因此，本發(fā)明的部分分化的神經(jīng)細(xì)胞可以是具有神經(jīng)標(biāo)識(shí)的細(xì)胞，其已獲得定向或定位特性，或已定型為發(fā)育成特定種類(lèi)的神經(jīng)細(xì)胞，但并非完全分化的神經(jīng)細(xì)胞。例如，依照本發(fā)明用單獨(dú)或與成形素(例如RA)組合的MNTF肽處理ES細(xì)胞可以產(chǎn)生部分分化的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞。"紊亂，，是將從使用本發(fā)明的分子或組合物的治療中獲益的任何病況。這包括慢性和急性紊亂或疾病，包括使哺乳動(dòng)物易患所述病癥的那些病理學(xué)條件。"飼養(yǎng)細(xì)胞"或"祠養(yǎng)物"包括一種類(lèi)型的細(xì)胞，其與另一種類(lèi)型的細(xì)胞共培養(yǎng)，一般用于提供其中第二種類(lèi)型的細(xì)胞可以生長(zhǎng)的環(huán)境。例如，某些類(lèi)型的pPS細(xì)胞可以由原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、永生化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、或由hES細(xì)胞分化的人成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞得到支持。"功能等價(jià)物"意指具有基本上類(lèi)似于例如MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的生物活性的肽，及其保守的、同源6-聚體(例如SEQIDN0:2)、7-聚體、8-聚體、9-聚體或10-聚體衍生物。其包括具有此活性或特征的"片段"、"變體"、"類(lèi)似物"、"同系物"或"化學(xué)衍生物"。MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的功能等價(jià)物和上述其他隨后可以共享或不共享相同的氨基酸序列，并且常規(guī)或非常規(guī)氨基酸的保守或非保守的氨基酸置換是可能的。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"MLSAFSRYAR,WMLSAFS和FSRYAR結(jié)構(gòu)域"域，以及能夠模仿所述結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和/或功能的肽和/或分子。其他的結(jié)構(gòu)域示于SEQIDN0:1-142中。在某些方面中，提供了包含任何序列IDNO:1-142中的氨基酸的肽，及其功能等價(jià)物。術(shù)語(yǔ)"基因產(chǎn)物"是指由基因轉(zhuǎn)錄的RNA分子，或者由基因編碼或由所述RNA翻譯的多肽。"生長(zhǎng)環(huán)境"是其中目的細(xì)胞在合適的條件下可以在體外增殖、分化或成熟的環(huán)境。此類(lèi)條件可以包括例如，其中細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以存在的任何生長(zhǎng)因子或分化誘導(dǎo)因子，和固體表面或支持結(jié)構(gòu)。如本文所使用的，各種形式的術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)劑，，和"調(diào)節(jié)"預(yù)期包含特定靶的表達(dá)或作用或活性的全部或部分抑制。為了本公開(kāi)內(nèi)容的目的，術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)祖細(xì)胞"或"神經(jīng)前體細(xì)胞"包括可以產(chǎn)生這樣的后代的細(xì)胞，所述后代是神經(jīng)元細(xì)胞(例如，神經(jīng)元前體或成熟神經(jīng)元)或膠質(zhì)細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)前體、成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞或成熟少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。細(xì)胞一般表達(dá)具有神經(jīng)讒系特征的某些表型標(biāo)記，并且當(dāng)在體外單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，它們一般不產(chǎn)生其他胚胎胚層的后代。"神經(jīng)元祖細(xì)胞，，或"神經(jīng)元前體細(xì)胞"包括可以產(chǎn)生這樣的后代的細(xì)胞，所述后代是成熟神經(jīng)元并且有時(shí)還具有產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞的能力。"多潛能神經(jīng)祖細(xì)胞群"包括具有產(chǎn)生這樣的后代的能力的細(xì)胞群，所述后代是神經(jīng)元細(xì)胞，是膠質(zhì)細(xì)胞，并且有時(shí)是其他類(lèi)型的細(xì)胞。這個(gè)術(shù)語(yǔ)不要求群體內(nèi)的個(gè)別細(xì)胞具有形成2種類(lèi)型的后代的能力，盡管可以存在是多潛能神經(jīng)前體的個(gè)別細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"擬肽"和"模擬物"包括可以基本上具有它們模擬的蛋白質(zhì)區(qū)域相同的結(jié)構(gòu)和功能特征的天然的和合成的化學(xué)化合物。具有類(lèi)似于模板肽的那些的性質(zhì)的肽類(lèi)似物可以是非肽藥物。"肽模擬物"或"擬肽"包括基于肽的化合物，還包括此類(lèi)基于非肽的化合物(Fauchere，J.Adv.DrugRes.15:29(1986);Veber和Freidinger;TINS;392(1985);和Evans等人，J.Med.Chem.30:1229(1987);BeeleyN.，TrendsBiotechnol.Jim;12(6):213-6(1994);Kieber-EmmonsT，等人；CurrOpinBiotechnol.Aug;8(4):"5-41(1997)。在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于治療上有用的肽的肽模擬物可以用于產(chǎn)生等價(jià)的或增強(qiáng)的治療或預(yù)后效果。一般而言，擬肽在結(jié)構(gòu)上等同或類(lèi)似于示例多肽(即，具有生物或藥理學(xué)功能或活性的多肽)，但還可以具有任選地被選自下述的鍵替換的一個(gè)或多個(gè)肽鍵例如，-C歸H-、-CH2S-、-CH「CH2-、-CH-CH-(順式和反式)、-C0CH廣、-CH(OH)CH2-和-CH2S0-。模擬物可以完全由天然氨基酸或氨基酸的非天然類(lèi)似物組成，或者是部分天然的肽氨基酸和部分氨基酸的非天然類(lèi)似物的嵌合分子。模擬物還可以包含任何量的天然氨基酸的保守置換，只要此類(lèi)置換同樣基本上不改變模擬物活性。如本文所使用的，"預(yù)防"是指完全或部分預(yù)防，或者改善或控制。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"治療，，是指治療性處理以及預(yù)防的或預(yù)防性措施。需要治療的那些對(duì)象包括已經(jīng)患有所述的紊亂的那些，以及傾向于患有所述的紊亂或者被診斷出所述的紊亂的那些，或者所述的紊亂有待預(yù)防的那些。如本文所使用的，關(guān)于本文中所述的化合物或組合物的"有效量"是指足以誘導(dǎo)出所需的生物學(xué)結(jié)果、藥物學(xué)結(jié)果或治療結(jié)果的量。所述的結(jié)果可以為疾病、紊亂或病況的跡象、癥狀或原因的減輕，或者生物系統(tǒng)的任何其他所需的改變。如本文所使用的，"同時(shí)地"用于指將MNTF組合物與一種或多種其他治療劑同時(shí)施用，而術(shù)語(yǔ)"組合"用于指如果所述的MNTF組合物與一種或多種其他治療劑如果不同時(shí)施用或者以物理組合的方式施用，則為在一定的時(shí)間框(他們均可利用，從而起治療作用)內(nèi)，"依次"施用。因此，"依次"施用可以允許一種試劑在其他試劑之后的若干分鐘(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30)、大約若干小時(shí)、天、星期、月的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行施用，前體條件是MNTF與一種或多種其他治療劑同時(shí)以有效量存在。在多種成分施用之間的時(shí)間延遲期間會(huì)發(fā)生變化，這取決于所述成分的精確的性質(zhì)，成分之間的相互作用，以及這些成分的各自的半衰期。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"肽類(lèi)似物"是指具有與模板肽相類(lèi)似的性質(zhì)的化合物，并且可以為非肽類(lèi)藥物。"肽的模擬物"或者"肽模30擬物"包括肽基化合物，還包括所述的非肽基化合物，例如肽類(lèi)似物。與具有治療用途的肽結(jié)構(gòu)類(lèi)似的肽模擬物可用于產(chǎn)生等效的或增強(qiáng)的治療或預(yù)后效果。通常，肽類(lèi)似物與示范多肽(即，具有生物學(xué)或藥理學(xué)功能或活性的多肽)為結(jié)構(gòu)或功能的模擬物(即，同一性或相似性)，而且還可以具有一個(gè)或多個(gè)可任選地被其他鍵替代的肽鍵，其中所述的其他鍵選自(例如)-CH2NH-，-CH2S-,-CH2-CH2-，-CH-CH-(順式和反式)，-COCH廣，-CH(OH)CH廣，以及-CH2S0-。所述的模擬物可以完全由天然氨基酸、合成的化學(xué)化合物或氨基酸的非天然類(lèi)似物組成，分子。所述的模擬物還可以包含任意量的天然氨基酸的保守性置換，只要這種置換同樣基本上不改變模擬物活性。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"指經(jīng)由肽鍵連接的2個(gè)或更多單個(gè)氨基酸(無(wú)論是不是天然存在的)的任何聚合物，如在下述情況下發(fā)生的一樣，當(dāng)與l個(gè)氨基酸(或氨基酸殘基)的oc-碳鍵合的羧酸基團(tuán)的羧基碳原子變得和與鄰近氨基酸的oc-碳鍵合的氨基的氨基氮原子共價(jià)結(jié)合時(shí)。這些肽鍵連接，和包含其的原子(即，a-碳原子、羧基碳原子(及其取代氧原子)，和氨基氮原子(及其取代氫原子)形成蛋白質(zhì)的"多肽主鏈"。此外，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)，，應(yīng)當(dāng)理解為包括術(shù)語(yǔ)"多肽"和"肽，，(它們有時(shí)可以在本文中互換使用)。類(lèi)似地，蛋白質(zhì)片段、類(lèi)似物、衍生物和變體在本文中可以被稱(chēng)為"蛋白質(zhì)"，并且除非另有說(shuō)明應(yīng)被視為"蛋白質(zhì)"。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)的"片段"指包含少于蛋白質(zhì)的所有氨基酸殘基的多肽。蛋白質(zhì)的"結(jié)構(gòu)域"也是片段，并且包含通常是賦予活性或功能所需的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基。短語(yǔ)"百分比00同一性"是指在對(duì)比兩條或多條序列中所發(fā)現(xiàn)的序列相似性的百分比。例如，可以采用任何合適的軟件來(lái)以電子方式測(cè)定百分比同一性。同樣地，兩條序列(或者任一條序列或者這兩條序列的一個(gè)或多個(gè)部分)之間的"相似性"可以通過(guò)將一條序列與第二條序列進(jìn)行序列比對(duì)來(lái)測(cè)定。組合物或制劑的"藥學(xué)上可接受的"化合物和其他成分，例如栽體、稀釋劑或賦形劑是適合于給其受體施用的那些。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"指允許編碼目的MNTF肽的多核苷酸之間雜交的條件。嚴(yán)格條件可以由鹽濃度、有機(jī)溶劑(例如，甲酰胺)的濃度、溫度和本領(lǐng)域眾所周知的其他條件進(jìn)行限定。通過(guò)減少鹽的濃度、增加有機(jī)溶劑(例如，曱酰胺)的濃度、或提高雜交溫度可以增加嚴(yán)格性。例如，嚴(yán)格鹽濃度通常將小于約750mMNaCl和75mM檸檬酸三鈉，例如小于約500mMNaCl和50mM檸檬酸三鈉，和小于約250mMNaCl和25mM檸檬酸三鈉。低嚴(yán)格性雜交可以在不存在有機(jī)溶劑例如甲酰胺的情況下獲得，而高嚴(yán)格性雜交可以在有機(jī)溶劑(例如，至少約35%甲酰胺，最優(yōu)選地至少約50%甲酰胺)的存在下獲得。嚴(yán)格溫度條件通常將包括至少約3(TC，至少約37。C，和至少約42'C的溫度。各種附加參數(shù)，例如，雜交時(shí)間，去污劑例如十二烷基硫酸鈉(SDS)的濃度，以及載體DNA的包括或排除，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。且在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)。嚴(yán)格雜交條件還可以由低于靶序列的解鏈溫度(Tm)約5'C-約2(TC或25。C中的條件，以及與耙具有精確或接近精確的互補(bǔ)性的探針來(lái)限定。如本文所使用的，解鏈溫度是在其下雙鏈核酸分子群體變得半解離成單鏈的溫度。用于計(jì)算核酸的Tm的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)，例如，Berger和Ki隱l，MethodsInEnzymology，笫152巻GuideToMolecularCloningTechniques,SanDiego(1987):AcademicPress,Inc.和Sambrook等人,MolecularCloning(1989):ALaboratoryMa畫(huà)l，第2版，第l-3巻，ColdSpringHarborLaboratory)。如由標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)指出的，Tm值的簡(jiǎn)單估計(jì)可以通過(guò)下式進(jìn)行計(jì)算Tm=81.5+0.41(%G+C)，當(dāng)核酸在1MNaCl的tK溶液中時(shí)(參見(jiàn)例如，Anderson和Young,"QuantitativeFi1terHybridization"inNucleicAcidHybridization(1985))。雜合體的解離溫度(和因此關(guān)于嚴(yán)格雜交的條件)受到各種因素的影響，例如探針的長(zhǎng)度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和耙的性質(zhì)(DNA、32RNA、堿基組成、存在于溶液中或固定的等)，以及鹽和其他組分(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)的濃度。這些因素的效應(yīng)是眾所周知的并且在本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)中得到討論，參見(jiàn)，例如，Sambrook，同上，和Ausubel，同上。一般地，嚴(yán)格雜交條件是在pH7.0-8.3下小于約1.0M鈉離子、一般約0.01-1.0M鈉離子的鹽濃度，和對(duì)于短探針(例如，10-50個(gè)核苷酸)至少約30。C和對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)至少約6(TC的溫度。如指出的，嚴(yán)格條件還可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來(lái)達(dá)到，在這種情況下可以使用較低的溫度。在本文所述，多核苷酸可以是在中至高嚴(yán)格性的條件下與耙mRM雜交的多核苷酸，所述條件例如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉在約50-約60攝氏度下。如本文所使用的，"受試者"指分類(lèi)為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、馴養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、和動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，例如，犬、馬、貓、綿羊、豬、牛等。優(yōu)選受試者是人。術(shù)語(yǔ)"治療有效量"意指將引發(fā)所需應(yīng)答的受試化合物的量，所述所需應(yīng)答例如由例如研究者、獸醫(yī)、醫(yī)師或其他臨床醫(yī)生尋求的組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答。"治療"指治療性處理和預(yù)防性或預(yù)防措施。需要治療的那些包括已具有病癥的那些以及其中待預(yù)防病癥的那些。術(shù)語(yǔ)"載體"指用于將核酸遞送給細(xì)胞的質(zhì)粒、噬菌體、病毒或其他系統(tǒng)(它是天然的或合成的)形式的核酸分子擴(kuò)增、復(fù)制和/或表達(dá)媒介物，其中質(zhì)粒、噬菌體或病毒可以與細(xì)菌、酵母、無(wú)脊推動(dòng)物和/或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞一起發(fā)揮作用。載體可以保持獨(dú)立于宿主細(xì)胞基因組DNA或可以與基因組DNA全部或部分整合。栽體一般將包含但不必包含所有必需元件，以便在它與之相容的任何宿主細(xì)胞中起作用。"表達(dá)載體"是在合適的條件下能夠指導(dǎo)外源多核苷酸，例如編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白的多核苷酸表達(dá)的載體。如本文所描述的，術(shù)語(yǔ)"同源性和同系物"包括可以是含有與目的蛋白質(zhì)序列序列同源的氨基酸序列的肽。此類(lèi)肽一般與相關(guān)序列具有至少約70%的同源性，優(yōu)選地至少約80%、90%、95%、97°/?；?9%的同源性，例如在至少約15、20、30、40、50、100或更多鄰接核苷酸(同源序列的)的區(qū)域上。同源性可以基于本領(lǐng)域的任何方法進(jìn)行計(jì)算。例如UWGCGPackage提供了BESTFIT程序，其可以用于計(jì)算同源性(例如以其缺省設(shè)置使用)(Devereux等人，NucleicAcidsResearch12，第387-395頁(yè)(1984))。PILEUP和BLAST算法可以用于計(jì)算同源性或排列序列(一般以其缺省設(shè)置)，例如，如AUschulS.F.;JMolEvol36:290-300(1993);Altschul，S.F.等人;JMolBiol215:403-10(1990)中所述。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件是可通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/L)公開(kāi)獲得的。這種算法包括首先通過(guò)鑒定查詢(xún)序列中長(zhǎng)度W的短字來(lái)鑒定高得分序列對(duì)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)，所述短字匹配或滿(mǎn)足某些正值閾值得分T。T被稱(chēng)為鄰近字得分閾值(AUschul等人，同上)。這些起始鄰近字命中充當(dāng)種子用于起始搜索以找到包含其的HSPs。字命中沿著每個(gè)序列在2個(gè)方向上進(jìn)行延伸直至累積比對(duì)得分可以得到增加。關(guān)于字命中在每個(gè)方向上的延伸在下述情況下停止累積比對(duì)得分與其達(dá)到的最大值減少量X;由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對(duì)的積累，累積得分變成零或以下；或達(dá)到任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的敏感性和速度。BLAST程序使用字長(zhǎng)(W)11、BU)SUM62評(píng)分矩P車(chē)(參見(jiàn)Henikoff和HenikoffProc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919(1992))比對(duì)(B)50、期望值(E)10、M=5、N=4和2條鏈的比較作為缺省值。BLAST算法執(zhí)行2個(gè)序列之間的相似性的統(tǒng)計(jì)分析；參見(jiàn)，例如，Karlin和AltschulPro"Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993)。由BLAST算法提供的一種相似性測(cè)量是最小總和概率(P(N))，其提供了2個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將偶然發(fā)生的概率指示。例如，如果在第一個(gè)序列的比較中最小總和概率小于約1、以及小于約O.1、0.01或0.001，那么序列被視為與另一個(gè)序列類(lèi)似。同源序列一般通過(guò)至少(或通過(guò)不超過(guò))約1個(gè)、2個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)或20個(gè)或更多突變(它可以是置換、刪除或插入)不同于相關(guān)序列。這些突變可以在上文提及的任何區(qū)域上相對(duì)于計(jì)算的同源性進(jìn)行測(cè)量。同源序列一般在顯著超過(guò)背景的水平上與原始序列選擇性雜交。選擇性雜交一般使用中至高嚴(yán)格性(例如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉在約50°C-約6(TC下)的條件達(dá)到。然而，此類(lèi)雜交可以在本領(lǐng)域已知的任何合適的條件下進(jìn)行(參見(jiàn)Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989))。例如，如果需要高嚴(yán)格性，那么合適的條件包括O.2xSSC在60。C下。如果需要低嚴(yán)格性，那么合適的條件包括2xSSC在60。C下。術(shù)語(yǔ)"重組"指在體外合成或以其他方式處理的多核苷酸(例如，"重組多核苷酸")，指使用重組多核普酸在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中生產(chǎn)基因產(chǎn)物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽("重組蛋白質(zhì)")。因此，"重組，，多核普酸由其生產(chǎn)方法或其結(jié)構(gòu)來(lái)限定。關(guān)于其生產(chǎn)方法，該過(guò)程指重組核酸技術(shù)的使用，例如，涉及核苷酸序列中的人為干預(yù)，一般為選擇或生產(chǎn)。備選地，它可以是通過(guò)產(chǎn)生包含2個(gè)或更多片段的融合物的序列制備的多核苷酸，所述片段并非天然地彼此鄰接。因此，包含了例如通過(guò)用任何非天然存在的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞制備的產(chǎn)物，如包含使用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的多核苷酸。類(lèi)似地，"重組"多肽是由重組多核普酸表達(dá)的多肽。"重組宿主細(xì)胞"是包含載體例如克隆載體或表達(dá)栽體的細(xì)胞，或已通過(guò)重組技術(shù)在其他方面進(jìn)行處理以表達(dá)目的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。治療的普通方面提供了治療患有神經(jīng)元紊亂的受試者的方法，該方法包括向所述的受試者施用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)肽類(lèi)似物。如本文所使用的，神經(jīng)元紊亂可以包括完全地或部分地與功能神經(jīng)組織的急性、進(jìn)行性或逐漸性喪失有關(guān)的，或者特征在于完全地或部分地功能神經(jīng)組織的急性、進(jìn)行性或逐漸喪失的疾病、紊亂或病況。示例性的神經(jīng)元紊亂可以包括脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或者35短暫或延長(zhǎng)的缺血狀況(例如腦缺血)、亨廷頓氏疾病(HD)、帕金森氏疾病(PD)、多發(fā)性硬化(MS)、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變、脊髓性肌萎縮(SMA)、以及橫貫性脊髓炎。此外，示例性的神經(jīng)退行性疾病還可以包括亞歷山大疾病、阿耳珀疾病、毛細(xì)管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)、Batten疾病(也稱(chēng)為Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten疾病)、牛海綿狀腦病(BSE)、卡納萬(wàn)疾病、科可因氏綜合征、皮質(zhì)基底退化癥(Corticobasaldegeneration)、克-雅二氏疾病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、HIV相關(guān)性癡呆、Kennedy疾病、克拉伯疾病、Lewy小體癡呆、Machado-Joseph疾病(3型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(Spinocerebellarataxia))、多系統(tǒng)萎縮、發(fā)作性嗜睡病、神經(jīng)疏螺旋體病、Pelizaeus-Merzbacher疾病、皮克疾病、原發(fā)性側(cè)索硬化、朊病毒疾病、Refsum疾病、Sandhoff疾病以及Schilder疾病。"神經(jīng)退行性疾病"是指與中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的病況，其中所述的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的特征在于功能神經(jīng)組織的進(jìn)行性、漸進(jìn)性喪失。"肌萎縮性側(cè)索硬化，，或"ALS，，為本領(lǐng)域所理解的術(shù)語(yǔ)，并且如本文所使用的，其是指可以影響上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(腦中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)和/或下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)、并且可以導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡的進(jìn)行性神經(jīng)退化疾病。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"ALS"包括本領(lǐng)域已知的ALS的所有類(lèi)別，包括，但不限于典型ALS(通常影響上和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)、原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS,通常只影響上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)、進(jìn)行性延髓麻痹(PBP或延髓發(fā)作(BulbarOnset)，一種通常以吞咽、咀嚼和說(shuō)話(huà)困難開(kāi)始的ALS)、進(jìn)行性肌萎縮(PMA，通常僅影響下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)和家族性ALS(遺傳型ALS)。ALS的示例性臨床癥狀包括肌無(wú)力、肌萎縮(musclewasting)、肌肉痙攣(musclecramping)、肌顫搐、模糊或緩慢的口齒、吞咽苦難、吞咽緩慢、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)。ALS的其他示例性臨床癥狀包括可在生物樣品中檢測(cè)的那些，其中所述的生物樣品得自患有或疑似患有ALS(例36如與正常相比，CD4:CD8細(xì)胞的比例增大；與正常相比，CD14+細(xì)胞的數(shù)量減少；與正常CD14+細(xì)胞相比，CD14+細(xì)胞上的HLA-DR的表達(dá)增多；與正常細(xì)胞相比，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的水平增多；發(fā)生巨噬細(xì)胞增殖；以及與正常相比，血清IgG和/或IgM減少，其中本文中所用的"正常"是指未受ALS影響的受試者或來(lái)自這種未受影響的受試者的細(xì)胞)的受試者。因此，"處理"涵蓋了取得一種或多種臨床癥狀的減少，這種減少可能具有理想的伴隨效果，例如減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或延遲疾病的進(jìn)程，延遲和/或甚至預(yù)防疾病的發(fā)作。"多發(fā)性硬化"或"MS"是本領(lǐng)域所理解的術(shù)語(yǔ)，并且如本文所使用的，其是指導(dǎo)致覆蓋神經(jīng)細(xì)胞，特別是腦和脊髓的神經(jīng)細(xì)胞的髓磷脂(myelin)被破壞的進(jìn)行性神經(jīng)退化疾病。如本文所使用的，"MS"包括本領(lǐng)域已知的所有類(lèi)別的MS，包括但不限于復(fù)發(fā)緩解型MS(RRMS)(通常表征為在疾病侵襲(也稱(chēng)為惡化、復(fù)發(fā)或驟發(fā))后的部分或完全恢復(fù))；繼發(fā)性進(jìn)行性MS(SPMS)(通常表征為較少?gòu)?fù)發(fā)，并伴有殘疾情況增加以及多個(gè)癥狀)，以及原發(fā)性進(jìn)行性MS(PPMS)(通常表征為癥狀以及殘疾的發(fā)展，而沒(méi)有減輕)。MS的示例性臨床癥狀包括疲勞(也稱(chēng)為MS疲乏)、肌肉疲勞、感覺(jué)異常、行走和/或平衡問(wèn)題產(chǎn)生困難、感覺(jué)異常(例如麻木、刺痛或"發(fā)麻"、疼痛、膀胱功能障礙、腸功能障礙、認(rèn)知功能改變(包括記憶、注意力、集中、判斷和解決問(wèn)題方面都發(fā)生問(wèn)題)、頭暈和眩暈、情緒問(wèn)題(例如抑郁)、性功能障礙、以及視覺(jué)問(wèn)題)。嚴(yán)重的情況可能涉及部分或完全癱瘓(例如視覺(jué)模糊或復(fù)視覺(jué)、紅-綠色盲、單眼失明)。其他癥狀包括頭疼、聽(tīng)覺(jué)損失、瘙癢、癲癇、痙攣、語(yǔ)言和吞咽紊亂、以及顫抖。MS的其他示例性臨床癥狀包括可在生物樣品中檢測(cè)的那些，其中所述的生物樣品得自患有或疑似患有MS(例如與正常相比，CD4:CD8細(xì)胞的比例增大；與正常相比，CD14+細(xì)胞的數(shù)量減少；與正常CD14+細(xì)胞相比，CD14+細(xì)胞上的HLA-DR的表達(dá)增多；與正常細(xì)胞相比，活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的水平增多；發(fā)生巨噬細(xì)胞增殖；以及與正常相比，血清IgG和/或IgM減少，其中本文中所用的"正常，，是指未受MS影響的受試者或來(lái)自這種未受影響的受試者的細(xì)胞。因此"處理"包括實(shí)現(xiàn)一種或多種臨床癥狀的減少，所述減少可以具有希望的伴隨作用，例如減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或延遲疾病的發(fā)展，延遲和/或甚至阻止疾病的發(fā)作。"阿茲海默氏疾病"或"AD"是本領(lǐng)域所理解的術(shù)語(yǔ)，并且如本文所使用的，其是指進(jìn)行性神經(jīng)退化疾病，其特征在于癡呆，并且由美國(guó)精神病學(xué)會(huì)(AmericanPsychiatricAssociation)(在DSMIV中)根據(jù)多發(fā)性認(rèn)知缺陷(其包括記憶受損)的發(fā)展情況來(lái)定義。AD的示例性臨床癥狀包括輕度的健忘，包括對(duì)近期事件、活動(dòng)或熟悉的人的名字或事情發(fā)生記憶障礙；難以解答簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)問(wèn)題；難以記憶怎樣做簡(jiǎn)單的工作(例如刷牙或梳理頭發(fā))；不能清楚地思考；說(shuō)、理解、閱讀或?qū)懚及l(fā)生困難；以及焦慮或攻擊行為，或者趨向于離家出走。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"受試者"可以為脊推動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，例如人。哺乳動(dòng)物包括但不限于家畜、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)動(dòng)物和寵物。如本文所使用的，帕金森氏疾病(也稱(chēng)為帕金森病或PD)的特征在于全或部分的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病況，這種病況通常會(huì)削弱患者的運(yùn)動(dòng)技巧和語(yǔ)言。帕金森氏疾病屬于一種被稱(chēng)為運(yùn)動(dòng)紊亂的病況。其特征部分在于肌肉僵直、顫抖、物理運(yùn)動(dòng)緩慢(運(yùn)動(dòng)徐緩)，極端情況下為物理運(yùn)動(dòng)喪失(運(yùn)動(dòng)不能)。原發(fā)癥狀是基底核對(duì)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的刺激發(fā)生減少的結(jié)果，這通常是由于多巴胺的形成和作用不足所導(dǎo)致，其中所述的多巴胺由腦中的多巴胺能神經(jīng)元所產(chǎn)生。繼發(fā)癥狀可以包括高水平的認(rèn)知功能障礙和細(xì)微語(yǔ)言問(wèn)題。PD為慢性的，且為進(jìn)行性的。PD為帕金森綜合征(一系列相似的癥狀)的最常見(jiàn)的原因。PD還稱(chēng)為"原發(fā)帕金森綜合征"或"先天PD"(原因未知)。雖然多數(shù)形式的帕金森綜合征是先天性的，但是存在這樣一些情況，其中一些癥狀可以由毒性、藥品、基因突變、頭部損傷或其他醫(yī)學(xué)紊亂所導(dǎo)致。38亨廷頓氏疾病(HD)的特征在于常染色體顯性神經(jīng)退化紊亂，其是由于在Huntington(HU)基因的外顯子1中發(fā)生CAGE三核苷酸延伸所導(dǎo)致的(E.g.Perutzetal.，TrendsBiochem.Sci.1999;24:58-63;andRubinszteinetal.，J.Med.Genet.1999;36:265-270)。HD患者可以表征為存在異常的肌體運(yùn)動(dòng)、癡呆和精神問(wèn)題。綜述來(lái)自大鼠肌肉組織的2種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF1和MNTF2)的分離和表征以及衍生自人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤cDNA文庫(kù)的重組MNTF1-F6基因的隨后克隆在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,309,877、6，759，389和6,841,531(以及共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/858,144、10/858,286、10/858，543和10/858,545)中得到描述;所述所有專(zhuān)利在此整體引入作為參考。MNTF1-F6基因序列編碼在本文中如SEQIDNO:4所示的33個(gè)氨基酸的序列。如國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2004/038651中所述，發(fā)現(xiàn)編碼MNTF1多肽的核苷酸序列位于人染色體16q22內(nèi)，所述專(zhuān)利在此整體引入作為參考?？雌饋?lái)對(duì)于MNTF1的已知生物活性足夠的MNTF1-F6分子內(nèi)的2個(gè)重疊結(jié)構(gòu)域得到鑒定。參見(jiàn)，國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US04/01468或美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/541，343，所述專(zhuān)利在此整體引入作為參考。在本文中命名為"WMLSAFS"和"FSRYAR"結(jié)構(gòu)域的這些結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)足以刺激運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生的細(xì)胞系增殖，其方式類(lèi)似于MNTF1-F633-聚體。類(lèi)似地，"FSRYAR"結(jié)構(gòu)域足以在體內(nèi)指導(dǎo)經(jīng)由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的肌肉靶的選擇性神經(jīng)再支配，其方式類(lèi)似于MNTF1-F633-聚體。此外，"FSRYAR"結(jié)構(gòu)域提供了足以產(chǎn)生抗體的抗原表位，所述抗體識(shí)別包含"FSRYAR"序列的任何MNTF肽，包括MNTF1-F633-聚體。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)在人胎兒妊娠期中第9周時(shí)在表達(dá)中達(dá)到峰值(Di，X.等人，ActaAnatomicaSinica29:86-89，1998)?；贛NTF在發(fā)育中的人中的表達(dá)，我們推斷MNTF可能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化和/或存活。為了檢查這點(diǎn)，我們確定MNTF是否調(diào)節(jié)多能胚胎干細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元并且是否增強(qiáng)ES細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活。如本文公開(kāi)的，本發(fā)明人已確定ES細(xì)胞暴露于RA和MNTF類(lèi)似物指導(dǎo)這些細(xì)胞產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。使用方法包括但不限于包含MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的那些的MNTF和截短的MNTF分子，所述MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域在本文中被稱(chēng)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子(MDNF)，在本文中被證實(shí)誘導(dǎo)干細(xì)胞或部分分化的神經(jīng)元細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。此類(lèi)試劑提供了用于從干細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生和/或分離運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元群體的新方法。本發(fā)明的方法包括使胚胎干細(xì)胞與視黃酸(RA)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子(MNDF)接觸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使胚胎干細(xì)胞與RA連同運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子接觸。備選地，該方法包括使部分分化的神經(jīng)元細(xì)胞與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子接觸。因子以有效產(chǎn)生分化的神經(jīng)細(xì)胞的量提供。這些量可以由技術(shù)人員基于已知操作和本文公開(kāi)的方法容易地確定。MNTF1和/或其肽類(lèi)似物還在體外促進(jìn)哺乳動(dòng)物運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活。因此，本文所述的技術(shù)提供了MNTF肽類(lèi)似物作為關(guān)于神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)因子/補(bǔ)充物的用途，包括通過(guò)在體外用有效量的MNTF肽類(lèi)似物培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞，用于促進(jìn)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)^l包系的存活的方法。本發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的存在下培養(yǎng)的神經(jīng)元存活并產(chǎn)生突起。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使干細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與至少一種MNTF肽類(lèi)似物接觸，例如，在與RA和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化因子例如如本文所描述的MNTF肽類(lèi)似物或備選地音猬(SonicHedgehog,Shh)接觸后，所述音猬包括Shh激動(dòng)劑。分化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可以例如通過(guò)FACS分選進(jìn)行分離或富集。例如經(jīng)元的純?nèi)后w。我們已使用這種方案用于從來(lái)自胚狀體的細(xì)胞混合群體中分離細(xì)胞的純運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元群體。使用膠原酶和分散酶使胚狀體分解成單細(xì)胞。這些單細(xì)胞隨后對(duì)于GFP進(jìn)行FACS分選，因?yàn)橛蒆B9啟動(dòng)子控制表達(dá)GFP的細(xì)胞是群體中真正的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。因此，本文所述技術(shù)的另一個(gè)方面涉及通過(guò)下述用于分離和/或純化分化的神經(jīng)細(xì)胞群的方法(a)獲得或產(chǎn)生在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)G增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)使胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物與有效產(chǎn)生表達(dá)eGFP的分化的神經(jīng)細(xì)胞的量的RA和MNTF接觸；(d)檢測(cè)分化的神經(jīng)細(xì)胞中的eGFP表達(dá)；和(f)分離表達(dá)eGFP的分化的神經(jīng)細(xì)胞。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)由于其促進(jìn)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、增殖和/或維持的能力，MNTF和某些MNTF類(lèi)似物對(duì)于治療神經(jīng)元紊亂是有用的。本發(fā)明人已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)根據(jù)某些實(shí)施方案，MNTF肽或MNTF類(lèi)似物調(diào)節(jié)不依賴(lài)于音猬通路(例如取決于實(shí)施方案，部分或完全不依賴(lài))的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。同樣地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)MNTF肽和MNTF類(lèi)似物調(diào)節(jié)某些蛋白激酶通路，包括某些酪氨酸激酶和生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)或活性。得到調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或蛋白激酶通路包括例如，音猬非依賴(lài)性通路。音猬(Shh)是負(fù)責(zé)尾部化的(caudalized)神經(jīng)元腹部化(ventralization)的關(guān)鍵組分，經(jīng)由其跨膜受體組分i7a/^力ecr-s邁oo^e"ecT發(fā)揮作用。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示，在視黃酸的存在下鼠類(lèi)ES細(xì)胞在體外分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元方面，MNTF肽有效代替音猬(實(shí)施例5)。給這些ES培養(yǎng)物添加MNTF導(dǎo)致成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄因子(HB9和Islet1/2)的表達(dá)、成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)記膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的表達(dá)、和能夠傳導(dǎo)動(dòng)作電位的神經(jīng)元的產(chǎn)生。數(shù)椐還顯示在smoothened受體信號(hào)的特異性抑制劑(環(huán)杷明-KAAD)的存在下，MNTF肽能夠產(chǎn)生有絲分裂后的成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。盡管不希望被束綽于任何具體理論或機(jī)制，但本發(fā)明人認(rèn)為數(shù)據(jù)顯示MNTF通過(guò)與Shh或smoothened的下游不同的途徑發(fā)信號(hào)?；诒疚某尸F(xiàn)的數(shù)椐，本發(fā)明人已進(jìn)一步確定MNTF肽通過(guò)本文描述的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，以促進(jìn)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、增殖和/或維持。因此，在本發(fā)明41的另一個(gè)方面，施用MNTF因子或MNTF類(lèi)似物以調(diào)節(jié)某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分的表達(dá)或活性。我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)ES細(xì)胞的MNTF處理導(dǎo)致胰島素受體(IR)的Tyr972和Tyrl162/1163的自磷酸化(實(shí)施例5)。這些殘基是IR活化的標(biāo)記。此外，免疫共沉淀研究顯示由于對(duì)于ES細(xì)胞的MNTF處理，特異性SH2結(jié)構(gòu)域與IR(關(guān)于PI3激酶的p85亞單位)的結(jié)合。實(shí)施例5還顯示阻斷IGF-1R對(duì)MNTF產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的能力沒(méi)有影響，但阻斷IR消除了這種能力。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，胰島素受體底物蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。胰島素受體底物蛋白質(zhì)(IRS-蛋白質(zhì))是胰島素和IGF起始信號(hào)的效應(yīng)子。它們共享在其N(xiāo)末端附近的PH和PTB結(jié)構(gòu)域，和在其C末端區(qū)域中的多個(gè)Tyr磷酸化基序。與酪氨酸-磷酸化的IRS-蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)包括PI3激酶p85、GRB2、SHP2、Nck、Crk和Fyn。IRS-1看起來(lái)主要涉及IGF信號(hào)和細(xì)胞骨架生長(zhǎng)。IRS-2看起來(lái)是胰島素信號(hào)的重要介質(zhì)，因?yàn)檫z傳去除導(dǎo)致II型糖尿病。IRS-3主要在脂細(xì)胞中表達(dá)，并且是PI3激酶的罕有地有效活化劑。IRS-4缺乏在其他IRS-蛋白質(zhì)中與SHP2結(jié)合的酪氨酸殘基。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給靼器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，IGF-1、IGF-II或任一的受體的蛋白質(zhì)表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。IGF-I和-II通過(guò)與胰島素受體同源的IGF-I受體發(fā)信號(hào)。IGF-II受體的高親和力在信號(hào)傳導(dǎo)中不發(fā)揮直接的作用，但調(diào)控游離IGF-II的濃度。IGFs涉及骨骼生長(zhǎng)，并且對(duì)于預(yù)防凋亡是必需的。游離IGFs的血清水平通過(guò)隔離IGF的IGF結(jié)合蛋白質(zhì)(IGFBPs)的作用保持很低。IGFBPs的過(guò)量表達(dá)可以誘導(dǎo)凋亡，推測(cè)是通過(guò)游離IGF的減少；IGFBP水平在某些癌癥中也是被改變的。IGF-1受體不象某些其他生長(zhǎng)因子受體一樣是促有絲分裂的，但其通過(guò)胰島素受體底物(IRS)蛋白質(zhì)激活PI3激酶途徑的能力對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞存活是非常重要的。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給耙器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，磷脂酰肌醇3-激酶蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)負(fù)責(zé)PI(4，5)P2的肌醇環(huán)的3位的磷酸化，以產(chǎn)生存活信號(hào)所需的有效第二信使PI(3，4，5)P3，和胰島素作用。PI3激酶是由85kDa調(diào)節(jié)亞單位和110kDa催化亞單位組成的異二聚復(fù)合物。生長(zhǎng)因子受體的酪氨酸磷酸化產(chǎn)生停泊位點(diǎn)用于結(jié)合受體上的p85(通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域)；p85給其帶來(lái)pl10,所述pllO隨后接近于其在膜上的磷脂底物。PI3激酶還通過(guò)Ras,和異三聚的G蛋白質(zhì)的P:y亞單位得到激活。PI3激酶可被渥曼青霉素抑制，所述渥曼青霹素是用于研究PI3激酶信號(hào)途徑的有用工具。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給耙器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，Akt激酶蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。Akt是PI3激酶通路的主要已知效應(yīng)子。PIP3的產(chǎn)生導(dǎo)致使Akt上的Thr308磷酸化的PDK1,和使Akt上的Ser473磷酸化的另一種激酶(預(yù)期為PDK2)的活化。這些磷酸化另外激活A(yù)ktSer/Thr激酶活性，和針對(duì)這些位點(diǎn)中任一的磷酸化狀態(tài)特異性抗體的使用能意p未著Akt活化。Akt的活化可以通過(guò)免疫沉淀隨后為用方文射性標(biāo)記的ATP使已知底物磷酸化進(jìn)行直接測(cè)量。Akt使Bad上的Serl36磷酸化，導(dǎo)致保護(hù)不受凋亡。Akt的其他底物包括GLUT4、心臟PFK2和GSK3，其通過(guò)這種磷酸化被滅活。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，Bad激酶蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。Bad或"細(xì)胞死亡的Bcl-2拮抗劑"是Bcl-2家族的成員以及生存對(duì)死亡的重要調(diào)節(jié)物。非磷酸化的Bad與Bel-2和Bcl-XL成為二聚物，中和其抗凋亡活性。PI3激酶途徑的活化導(dǎo)致Akt的活化，這使Bad上的ser-136磷酸化。MAP激酶途徑使BAD上的ser-112磷酸化，并且近來(lái)，已顯示PKA使BAD上的ser-155磷酸化。磷酸化的Bad結(jié)合14-3-3蛋白質(zhì)和可能的其他因子，所述14-3-3蛋白質(zhì)和因子使Bad與其促凋亡作用隔離。使用對(duì)這些位點(diǎn)特異的磷酸化狀態(tài)特異性抗體的測(cè)定法充當(dāng)細(xì)胞存活通路活化的記錄。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，PI(3,4,5)P3依賴(lài)性激酶蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。PI(3，4，5)P3依賴(lài)性激酶l(PDK1)是具有PH結(jié)構(gòu)域并且受PIP3強(qiáng)烈刺激的Ser/Thr激酶。PDK1的最佳表征的底物是Akt，所述Akt通過(guò)PDK1上的Thr308進(jìn)行磷酸化，促成Akt活化。PDK1的2種同種型已得到鑒定。PDK1也被認(rèn)為在p70S6激酶的活化中起作用，并且在T細(xì)胞活化期間對(duì)于從T細(xì)胞受體到NFKB信號(hào)傳導(dǎo)是重要的。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，Bax蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。與Bcl-2共享高度保守的結(jié)構(gòu)域的Bax蛋白質(zhì)，可以在線(xiàn)粒體的脂雙層中形成離子傳導(dǎo)通道，這通過(guò)將凋亡基因蛋白質(zhì)釋放到細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)在許多細(xì)胞的凋亡通路中起必要作用。Bax為許多涉及凋亡的疾病提供了有趣的治療靶，所述疾病例如癌癥或神經(jīng)變性病癥。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給單巴器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，p53基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。p53在所有人癌癥的大約一半中是突變的。它的基因產(chǎn)物涉及針對(duì)細(xì)胞毒性應(yīng)激的細(xì)胞應(yīng)答，并且連同pl9ARF—起i秀導(dǎo)p21Cipl的表達(dá)，以引起細(xì)胞周期停滯。此外，p53能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄機(jī)制誘導(dǎo)凋亡。p53的氨基末端的83個(gè)氨基酸包含反式激活結(jié)構(gòu)域，以及涉及轉(zhuǎn)錄非依賴(lài)性生長(zhǎng)抑制的區(qū)域。羧基末端區(qū)域包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其通過(guò)3種磷酸化事件，以及潛在地通過(guò)乙酰化得到調(diào)節(jié)。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，一氧化氮合酶蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。一氧化氮合酶(NOS)是二聚的，含亞鐵血紅素的酶，其產(chǎn)生一氧化氮，并且包含C末端還原酶和N末端氧合酶結(jié)構(gòu)域。NOS的3個(gè)類(lèi)別包括主要在神經(jīng)元組織中表達(dá)的nNOS/NOS1/N0S1，通過(guò)炎癥刺激在巨噬細(xì)胞和某些其他細(xì)胞中可誘導(dǎo)的iN0S/NOSII/N0S2,和組成性表達(dá)的N0S的上皮形式的eN0S/N0SIII/N0S3。組成性表達(dá)的nNOS和eNOS需要Ca2+用于活性，并且通過(guò)Ca2+內(nèi)流進(jìn)行調(diào)節(jié)。iNOS不依賴(lài)于Ca2+。不同同種型在許多位點(diǎn)上的磷酸化對(duì)蛋白質(zhì)活性具有不同的影響；某些是抑制的和某些是活化的。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給靼器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，糖原合酶激酶3蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。糖原合酶激酶3(GSK)不同于大多數(shù)絲氨酸/蘇氨酸激酶的地方在于它在不存在信號(hào)傳導(dǎo)途徑作用的情況下是活性的。存在2種同種型，GSK3a和GSK3P。GSK3的功能是使糖原合酶磷酸化并且從而使其滅活。胰島素作用刺激PI3激酶通路，導(dǎo)致Akt活化，這使GSK3磷酸化并且使其滅活。糖原合酶隨后迅速地去磷酸化并且被活化。其他GSK3底物包括Jun(在抑制位點(diǎn)上)和elF2B。通過(guò)GSK3使Tau磷酸化可能涉及阿爾茨海默氏疾病的發(fā)展。針對(duì)GSK3上的Akt位點(diǎn)(Ser21)的磷酸化狀態(tài)特異性抗體適合于代替測(cè)定途徑的活化狀態(tài)。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給靶器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，半胱天冬酶蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。涉及線(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans)CED-3死亡蛋白質(zhì)的半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶包含半胱天冬酶家族。所有作為通過(guò)蛋白質(zhì)水解活化的酶原被表達(dá)。就其在凋亡中的作用而言，取決于它們是通過(guò)受體群集(起始)還是通過(guò)線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)變(效應(yīng))得到活化，可以將半胱天冬酶再分成起始(半胱天冬酶8、9、1Q)和效應(yīng)(半胱天冬酶3、6、7)半胱天冬酶。效應(yīng)半胱天冬酶，最顯著地是半胱天冬酶3，切割眾多底物以實(shí)現(xiàn)與凋亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化。在半胱天冬酶3的底物中有DFF45/ICAD，其釋放DFF的DNA酶亞單位以引起染色質(zhì)降解，以及凝溶膠蛋白、PAK2、D4GDI(所有這些都涉及細(xì)胞骨架組織)、核層纖蛋白和PARP。PARP切割的意義仍不明了，但它是關(guān)于半胱天冬酶活化的極佳標(biāo)記和正在進(jìn)行的凋亡的推測(cè)。在某些實(shí)施方案中，響應(yīng)給患者或給靼器官、組織或細(xì)胞施用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物，RAS基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性得到調(diào)節(jié)。Ras蛋白質(zhì)是小GTP結(jié)合蛋白，其與異三聚的G蛋白質(zhì)不同，在單個(gè)多肽內(nèi)包含所有GTPase和效應(yīng)子作用。存在Ras的至少3種同種型，Ki-Ras、Ha-Ras和N-Ras，具有不同的表達(dá)模式但相似的信號(hào)活性。Ras在羧基末端處進(jìn)行棕櫚?；头峄?，使其錨定在膜上。在靜止細(xì)胞中，Ras裝載GDP，并且在受體的生長(zhǎng)受體刺激之后被活化，這將Ras鳥(niǎo)噪呤核苷酸交換因子召募至膜的平面。交換因子與Ras蛋白質(zhì)的接近引起GDP的釋放，以及其被GTP替換。在其GTP結(jié)合形式中，Ras結(jié)合幾種蛋白質(zhì)，包括Raf、RalGDS和PI3激酶。Ras的滅活通過(guò)GTP水解發(fā)生，這極大地受到RasGAP或NF-1這2種已知的RasGTP酶活化蛋白的促進(jìn)。通過(guò)使裂解物與Raf-l的Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域一起溫育可以測(cè)定Ras活化，所述Raf-l與Ras:GTP選擇性結(jié)合。干細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干(ES)細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞，衍生自能夠無(wú)限復(fù)制的胚泡期胚胎的多能內(nèi)細(xì)胞群。一般而言，ES細(xì)胞具有分化成其他細(xì)胞的潛能(即，它們是多能的)；因此，它們可以充當(dāng)新細(xì)胞的持續(xù)來(lái)源。用于在本發(fā)明中使用的胚胎干細(xì)胞可以得自任何動(dòng)物，但優(yōu)選得自哺乳動(dòng)物(例如，人、馴養(yǎng)動(dòng)物或商業(yè)動(dòng)物)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，胚胎干細(xì)胞是鼠類(lèi)胚胎干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胚胎干細(xì)胞得自人。用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的合適方法是本領(lǐng)域已知的，例如，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/362,437、10/789,266、10/789,308、10/928,805和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,833,269中所述，所述專(zhuān)利全部整體引入本文。除非另有明確說(shuō)明，本文所述的技術(shù)可以使用任何脊推動(dòng)物物種的千細(xì)胞(例如，來(lái)自人；以及非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、馴養(yǎng)動(dòng)物、家畜和其他非人哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞)進(jìn)行實(shí)踐。在適合于在本發(fā)明中使用的干細(xì)胞中包括了衍生自在妊娠后形成的組織例如胚泡，或在妊娠期間的任何時(shí)候獲取的胎兒或胚胎組織的靈長(zhǎng)類(lèi)多能干(pPS)細(xì)胞。非限制性例子是胚胎千細(xì)胞或胚胎生殖細(xì)胞的原代培養(yǎng)物或建立的系。在某些實(shí)施方案中，使用原型"靈長(zhǎng)類(lèi)多能干細(xì)胞(pPS細(xì)胞)。pPS細(xì)胞包括衍生自在受精后任何時(shí)候的胚胎前、胚胎或胎兒組織的多能細(xì)胞。在合適的條件下，它們能夠產(chǎn)生三個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)衍生物的幾種不同細(xì)胞類(lèi)型的后代。pPS細(xì)胞包含各種類(lèi)型的胚胎細(xì)胞，包括如由Thomson等人，Science282:1145(1998)描述的人胚胎干(hES)細(xì)胞；來(lái)自其他靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞，例如恒河猴干細(xì)胞(Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,(1995))、絨猴干細(xì)胞(Thomson等人，Biol.Reprod.55:254(1996)和人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad,Sci.USA95:13726(1998)，以及本領(lǐng)域已知的其他類(lèi)型的多能細(xì)胞。包括能夠產(chǎn)生所有三個(gè)胚層衍生物的后代的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物起源的任何細(xì)胞，不管它們是衍生自胚胎組織、胎兒組織還是其他來(lái)源。pPS細(xì)胞一般不衍生自惡性來(lái)源，并且優(yōu)選細(xì)胞是核型正常的。當(dāng)群體中大比例的干細(xì)胞及其衍生物顯示未分化細(xì)胞的形態(tài)特征時(shí)，pPS細(xì)胞培養(yǎng)物被描述為"未分化的"，當(dāng)與胚胎或成人起源的分化細(xì)胞比較時(shí)，所述未分化細(xì)胞是顯而易見(jiàn)的。未分化的pPS細(xì)胞由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地識(shí)別，并且一般在具有高核/質(zhì)比和明顯核仁的細(xì)胞集落的顯微鏡視野的2個(gè)平面中出現(xiàn)。群體內(nèi)未分化細(xì)胞的集落通常由分化的鄰近細(xì)胞圍繞這是常見(jiàn)的。分化的神經(jīng)細(xì)胞用于培養(yǎng)前體、部分分化和完全分化的神經(jīng)細(xì)胞的合適方法是本領(lǐng)域已知的，例如，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/362,437、10/789,266、10/789,308、10/928，805和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，833，269中所述的，所述專(zhuān)利全部整體引入本文。此外，如本文所使用的，"神經(jīng)元細(xì)胞"或"神經(jīng)元，，是神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)或神經(jīng)細(xì)胞，其一般由下述組成包含核和周?chē)?xì)胞質(zhì)的細(xì)胞體(核周體)；幾個(gè)短的、照射狀突起(樹(shù)突)；以及于終止細(xì)枝樣分支(終樹(shù)突)，和可以具有沿著其路線(xiàn)伸出的分支(側(cè)突)的一個(gè)長(zhǎng)突起(軸突)。神經(jīng)元的例子包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。分化的神經(jīng)細(xì)胞的表征測(cè)分化成部分或完全分化的神經(jīng)細(xì)胞的ES細(xì)胞。例如，可以就神經(jīng)元標(biāo)記例如NeuN(神經(jīng)元標(biāo)記)和/或特異性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)記如HB9或ChAT探測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所描述的，分化的神經(jīng)細(xì)胞是遺傳標(biāo)記的，因?yàn)樗磉_(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)。eGFP遺傳標(biāo)記在用于分離和/或純化分化的神經(jīng)細(xì)胞群的方法中，或在用于監(jiān)控脊髓再駐的方法中可以是特別有用的。視黃酸視黃酸(RA)或維生素A是被認(rèn)為是成形素的醛分子。RA是容易獲得的；它可以例如得自SigmaChemicalCo.(St.Louis，Mo.)。用終濃度約0.0.001-1的RA處理導(dǎo)致干細(xì)胞有效分化成神經(jīng)前體。MNTF肽如本領(lǐng)域和本發(fā)明的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，包含MNTF活性結(jié)構(gòu)域和治療性作用。本文所述的MNTF因子可以合成或重組生產(chǎn)，或從天然細(xì)胞中分離。包含本發(fā)明的MNTF肽類(lèi)似物的蛋白質(zhì)或肽中的氨基酸殘基序列在本文中通過(guò)使用其常用的三字母命名法或通過(guò)其單字母命名法進(jìn)行命名。這些三字母和單字母命名法的列表可以在教科書(shū)例如Biochemistry,第2版,Lehninger，A.，WorthPublishers，NewYork,N.Y.(1975)中找到。當(dāng)氨基酸序列橫向列出時(shí)，氨基末端旨在位于左端，而羧基末端旨在位于右端。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解包含各種MNTF肽類(lèi)似物的肽的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)將依許多因素而變。例如，給定多肽可以作為酸性或堿性鹽或以中性形式獲得，因?yàn)樵诜肿又邪l(fā)現(xiàn)可電離的羧基和氨基。因此，為了本發(fā)明的目的，保留MNTF133聚體肽的生物活性，包含WMLSAFS、FSRYAR或MLSAFSRYAR結(jié)構(gòu)域的任何形式的肽，意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。圖25舉例說(shuō)明了依照本發(fā)明的MNTF肽的某些優(yōu)選實(shí)施方案。MNTF1-F633-聚體在美國(guó)專(zhuān)利No.6，309，877中，提供了具有以下氨基酸序列的多肽，所述的序列為L(zhǎng)GTFWGDTLNCWMLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQIDNO:1)。具有該序列的多肽在本文中被稱(chēng)為MNTF133-聚體。包含該序列的重組蛋白質(zhì)與針對(duì)MNTF-1的單克隆抗體反應(yīng)，維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存力，增加神經(jīng)突的長(zhǎng)出，減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞死亡/凋亡，并且支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)和"擴(kuò)展"到具有延伸的含生長(zhǎng)錐軸突的巨大的、活性神經(jīng)元內(nèi)。MNTF133聚體通過(guò)用于在下文實(shí)施例中使用的固相合成進(jìn)行合成。這種MNTF-1分子在下文中將被稱(chēng)為"33聚體"。當(dāng)與低濃度的RA結(jié)合使用時(shí)，線(xiàn)性33-聚體誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。此外，MNTF1誘導(dǎo)的ES細(xì)胞分化不受音猬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑的阻斷。用MNTF133-聚體處理胚狀體與胰島素受體(IR)和/或胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF-R)的自磷酸化相關(guān)，這意味著MNTF通過(guò)IR/IGF-R介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起作用。本發(fā)明公開(kāi)包括MNTF1的肽類(lèi)似物的用途，其中所述的MNTF1的肽類(lèi)似物保持了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、保持和/或修復(fù)；或者在某些情況下，使干細(xì)胞分化形成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。通常，用于本文所述用途的MNTF肽類(lèi)似物的長(zhǎng)度為6至33個(gè)氨基酸，并且包含與SEQIDNO:1的氨基酸殘基12至18相應(yīng)的WMLSAFS結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:3);或者與SEQIDNO:1的氨基酸殘基17至22相應(yīng)的FSRYAR結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2)。此外，某些實(shí)施方案的MNTF肽類(lèi)似物包括含有所述活性結(jié)構(gòu)域的、SEQIDNO:1的6至33個(gè)連續(xù)氨基酸殘基片段(SEQIDNO:2或3)。在備選實(shí)施方案中，通過(guò)BLAST分析測(cè)定，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子肽類(lèi)似物的氨基酸序列與SEQIDNO:4所示的IO個(gè)連續(xù)氨基酸殘基,與SEQIDNO:4所示的IO個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的同一性為至少70%,與SEQIDNO:4所示的10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的同一性為至少80%,以及與SEQIDNO:4所示的10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的同一性為至少90%。為了比較多肽序列與相應(yīng)的SEQIDNO:l片段，可以使用可通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物信息中心(在萬(wàn)維網(wǎng)上ncbi.nlm.nih.gov處)公開(kāi)獲得的BLAST程序進(jìn)行序列的總體比對(duì)。在進(jìn)行總體比對(duì)前，可以將SEQIDNO:l提交給GenBank。對(duì)于總體比對(duì)可以使用由美國(guó)國(guó)立生物信息中心提供的缺省參數(shù)。10-聚體在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種具有以下氨基酸序列的肽MLSAFSRYAR(SEQIDNO:4)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基13-22相對(duì)應(yīng)。示例性的MNTF片段可以包含WMLSAFS結(jié)構(gòu)域的大部分以及完整的FSRYAR結(jié)構(gòu)域。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、保持和/或修復(fù)；或者在某些情況下，使干細(xì)胞分化形成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。MNTF10聚體在低至0.01Mg/ml的濃度時(shí)在體外刺激胚胎干細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元方面至少與全長(zhǎng)MNTF33聚體一樣有效(參見(jiàn)圖2)。此外，MNTF10聚體在增強(qiáng)干細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活方面幾乎與MNTF33聚體一樣有效。MNTF-l分子的這個(gè)部分在下文中將被稱(chēng)為"IO聚體"。6-聚體及類(lèi)似物在另一實(shí)施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽FSRYAR(SEQIDNO:2)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基17-22相對(duì)應(yīng)。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(包括干細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)的存活、保持和/或修復(fù)。這一部分MNTF-l分子在下文中被稱(chēng)為"6聚體"。在某些實(shí)施方案中，MNTF肽類(lèi)似物可以包含6-聚體肽的功能類(lèi)似物的序列。7-聚體在另一實(shí)施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽WMLSAFS(SEQIDNO:3)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基12-18相對(duì)應(yīng)。MNTF1的這種7個(gè)氨基酸片段與FSRYAR結(jié)構(gòu)域的FS殘基交疊。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(包括干細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)的存活、保持和/或修復(fù)。這一部分MNTF-1分子在下文中被稱(chēng)為"7聚體"。ll-聚體在另一實(shí)施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽FSRYARCLAEG(SEQIDNO:5)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基17-27相對(duì)應(yīng)。MNTF1ll-聚體包含F(xiàn)SRYAR結(jié)構(gòu)域。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(包括千細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)的存活、保持和/或修復(fù)。這一部分MNTF-l分子在下文中被稱(chēng)為"ll聚體"。21-聚體在另一實(shí)施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽MLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQIDNO:6)，其與SEQIDNO:1所示的氨基酸殘基13至33相對(duì)應(yīng)。MNTF121-聚體包含"WMLSAFS"結(jié)構(gòu)域的大部分以及完整的FSRYAR結(jié)構(gòu)域。該片段及其變體保留了MNTF1的能力，所述的能力為發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(包括干細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)的存活、保持和/或修復(fù)。這一部分MNTF-1分子在下文中被稱(chēng)為"21聚體"。MNTF肽類(lèi)似物應(yīng)當(dāng)理解本文所述的技術(shù)包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換為其他氨基酸的肽類(lèi)似物的使用。在一個(gè)優(yōu)選的備選方案中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子肽類(lèi)似物包含針對(duì)SEQIDNO:1的6-32個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的片段的一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸置換。MNTF肽類(lèi)似物可以是MNTF1肽的改變形式，條件當(dāng)然一般是該肽的必需活性基本上保持不變。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"改變的形式"指已進(jìn)行處理以改變其天然存在的結(jié)構(gòu)的肽。改變的形式可以通過(guò)下述進(jìn)行制備，例如通過(guò)MNTF1肽片段的共價(jià)修飾，通過(guò)使MNTF1肽片段與不溶性支持基質(zhì)交聯(lián)，或通過(guò)使MNTF1肽片段與載體蛋白交聯(lián)。MNTF1肽類(lèi)似物可以是在抗原上與MNTF1肽片段相關(guān)的肽片段。在抗原上相關(guān)的2種肽顯示免疫交叉反應(yīng)性。例如，針對(duì)第一種肽的抗體同樣識(shí)別第二種肽。MNTF1肽類(lèi)似物可以是包含與異源蛋白附著的MNTF1肽片段的融合蛋白。異源蛋白具有與MNTF1肽片段基本上不相似的氨基酸序列。異源蛋白可以與MNTF1肽片段的N末端或C末端融合。融合蛋白可以包括但不限于，聚-His融合物、MYC-標(biāo)記的融合物、Ig融合物和酶促融合蛋白例如(3-半乳糖苷酶融合物。此類(lèi)融合蛋白，特別是聚-His融合物可以促進(jìn)重組MNTF1肽片段的純化。MNTF肽的擬肽也包括在本文所述技術(shù)的范圍內(nèi)，并且可以充當(dāng)藥物用于調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的生存力和生長(zhǎng)，通過(guò)例如阻斷包含WMLSAFS、FSRYAR或者SEQIDNO:1-142中所述的任何其他序列或功能結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的功能。擬肽在制藥工業(yè)中通常理解為包括具有與模擬的肽的那些類(lèi)似性質(zhì)的非肽藥物。擬肽設(shè)計(jì)的原則和實(shí)踐是本領(lǐng)域已知的，并且在例如FauchereJ.,Adv.DrugRes.15:29(1986)'，和Evans等人，J.Med.Chem.30:1229(1987)中得到描述。具有對(duì)于治療上有用的肽的結(jié)構(gòu)相似性的擬肽可以用于產(chǎn)生等價(jià)的治療或預(yù)防效果。一般地，此類(lèi)擬肽具有任選地被鍵替換的一個(gè)或多個(gè)肽鍵，這可以改變所需性質(zhì)例如對(duì)體內(nèi)化學(xué)破壞的抵抗力。此類(lèi)鍵可以包括一CH2NH—、—CH2S—、—CH2—CH「-、—CH-CH--、—C0CH2—、—CH(OH)CH2—和一CH2S0—。擬肽可以顯示出增強(qiáng)的藥理性質(zhì)(生物半衰期、吸收率等)，不同的特異性，增加的穩(wěn)定性，生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)，減少抗原性等，這使得它們能夠作為特別需要的治療劑使用?；诮?例如在實(shí)驗(yàn)上測(cè)定的)肽結(jié)構(gòu)，使用推理性藥物設(shè)計(jì)的已知方法，可以由技術(shù)人員進(jìn)行WMLSAFS、FSRYAR或其他類(lèi)似結(jié)構(gòu)域模擬物或結(jié)合分子的推理性設(shè)計(jì)。推理性藥物設(shè)計(jì)的目的是生產(chǎn)生物活性多肽或乾化合物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。通過(guò)制備此類(lèi)類(lèi)似物，可以形成藥物，所述藥物比天然分子更有活性或穩(wěn)定，具有針對(duì)改變的不同敏感性，或可以影響各種其他分子的功能。在一種方法中，將產(chǎn)生關(guān)于靶分子或其片段的三維結(jié)構(gòu)。這可以通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)，計(jì)算機(jī)建?；蛲ㄟ^(guò)2種方法的組合來(lái)完成。制備方法應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的MNTF肽組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)制備，包括但不限于，通過(guò)固相合成的化學(xué)合成和通過(guò)HPLC純化使其不含化學(xué)反應(yīng)的其他產(chǎn)物，或通過(guò)在體外翻譯系統(tǒng)或在活細(xì)胞中表達(dá)編碼包含本發(fā)明的MNTF肽的肽或多肽的核酸序列(例如，DNA序列)生產(chǎn)。優(yōu)選地組合物的MNTF肽得到分離并進(jìn)行廣泛透析，以去除一種或多種不希望有的小分子量分子，和/或進(jìn)行凍干以更容易配制到所需媒介物內(nèi)。應(yīng)進(jìn)一步理解在MNTF肽組分中制備的存在的任何另外的氨基酸、突變、化學(xué)修飾等，將優(yōu)選地基本上不干擾MNTF停泊序列的受體識(shí)別。對(duì)應(yīng)MNTF1的一種或多種片段的肽或多肽長(zhǎng)度一般應(yīng)為至少6個(gè)氨基酸殘基，并且可以包含多至約7個(gè)、約8個(gè)、約9個(gè)、約10個(gè)、約11個(gè)、約12個(gè)、約13個(gè)、約15個(gè)、約20個(gè)或約30個(gè)殘基左右。肽序列可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行合成，例如，使用自動(dòng)化肽合成才幾器的肽合成，例如可從AppliedBiosystems(FosterCity,CA)獲得的那些。本文所述技術(shù)包括衍生自(SEQIDNO:1)和(SEQIDNO:6)的環(huán)狀肽的合成和使用。內(nèi)，所述有機(jī)衍生劑能夠與選擇的側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)。^使用有機(jī)衍生劑的多肽共價(jià)修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，可以使半胱氨酰殘基與cc-卣乙酸鹽(haloacetates)(和相應(yīng)的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)，以產(chǎn)生羧甲基或羧氨基甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。組氨酰殘基可以通過(guò)在pH5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應(yīng)，或在pH6下在1M二甲基胂酸鈉中與對(duì)溴苯酰甲基溴反應(yīng)進(jìn)行衍生。賴(lài)氨酰和氨基末端殘基可以與琥珀酸或其他羧酸酐進(jìn)行反應(yīng)。精氨酰殘基可以通過(guò)與一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)進(jìn)行修飾，在所述常規(guī)試劑中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己胺二酮和茚三酮。通過(guò)與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)可以將光譜標(biāo)記引入酪氨酰殘基內(nèi)；最常見(jiàn)地，使用N-乙酰咪唑(acetylimidizol)和四硝基甲烷以分別形成0-乙酰酪氨酰種類(lèi)和3-硝基衍生物。羧基側(cè)基(天冬氨?；蚬劝滨?可以通過(guò)與碳化二亞胺(R，-N-C-N-R，)反應(yīng)進(jìn)行選擇性修飾，例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳化二亞胺或l-乙基-3(4氮鑰4，4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，通過(guò)與銨離子反應(yīng)將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)變成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基可以脫去酰胺基為相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。其他修飾包括脯氨酸和賴(lài)氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的ot-氨基的曱基化(T.E.Creighton，1983，Proteins:Structure和MoleculeProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,笫79-86頁(yè))，N末端胺的乙?；?，和在某些情況下C末端羧基的酰胺化。本文所述的MNTF肽類(lèi)似物可以以游離形式或與載體分子(例如蛋白質(zhì)或固體顆粒，以及與標(biāo)記物或示蹤物(例如生物素或異石克氰酸熒光素)連接的經(jīng)修飾的肽)連接的形式而用于檢測(cè)及檢測(cè)試劑盒中。使MNTF1肽片段與水不溶性支持基質(zhì)交聯(lián)可以用本領(lǐng)域眾所周知的雙功能劑來(lái)進(jìn)行，包括l，l二(重氮乙?；?2苯乙烷，戊二酪，N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如，與4-疊氮水楊酸的酯，同雙功能酰亞胺酯，包括二琥珀酰亞胺酯例如3，3，-二巰基二(琥珀酰亞胺基丙酸酯)，和雙功能馬來(lái)酰亞胺例如二-N-馬來(lái)酰亞胺-1，8-辛烷。雙功能劑例如甲基-3-[(對(duì)疊氮苯基)二疏代]亞胺丙酯產(chǎn)生在光的存在下能夠形成交聯(lián)的光可激活的中間產(chǎn)物。備選地，可以使用反應(yīng)性水不溶性基質(zhì)例如溴化氰活化的碳水化合物用于蛋白質(zhì)固定化?？梢允褂帽疚乃龅碾p功能試劑來(lái)進(jìn)行MNTF1肽片段與第二種蛋白質(zhì)(包括第二種MNTF1肽片段)的交聯(lián)。在另一種備選的情況中，存在有插入的間隔物，例如二巰基或二氨基，或者多個(gè)氨基酸殘基(例如甘氨酸)。所述的間隔物還可以為同源的或異源的雙功能交聯(lián)劑，例如異源雙功能交聯(lián)劑N-(4-羧基-環(huán)己基-甲基)-馬來(lái)酰亞胺?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)制備較長(zhǎng)的肽或多肽，例如融合蛋白。例如，編碼MNTF1肽片段的DNA片段可以克隆在已包含異源蛋白的商購(gòu)可得的表達(dá)栽體中，而結(jié)果是在框內(nèi)與異源蛋白融合的MNTF1肽片段。在某些實(shí)施方案中，編碼MNTF1肽的核酸和/或本文所述的成分可如，在某些實(shí)施方案中，編碼MNTF1肽的核酸是例如重組細(xì)胞中的栽體的組分?？梢员磉_(dá)核酸以生產(chǎn)包含MNTF1肽序列的肽或多肽。肽或多肽可以從細(xì)胞中分泌出來(lái)，或作為細(xì)胞的部分，或在細(xì)胞內(nèi)?；衔锏暮Y選在另一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定了改變MNTF肽或涉及MNTF肽細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的化合物。在某些實(shí)施方案中，這些化合物被靼向用于治療本文描述的各種神經(jīng)病癥。通過(guò)本文描述和本領(lǐng)域已知的使用神經(jīng)元細(xì)胞的后續(xù)測(cè)試，可以區(qū)別神經(jīng)保護(hù)的激動(dòng)劑和拮抗劑，并且可以評(píng)估化合物的功效?；谄湓陬I(lǐng)域公認(rèn)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)疾病和紊亂模型系統(tǒng)中治療神經(jīng)元紊亂的能力，可以進(jìn)一步區(qū)別通過(guò)本文描述的篩選搮作鑒定的化合物，并且可以評(píng)估化合物的功效。在測(cè)試化合物和天然提取物文庫(kù)的許多藥物篩選測(cè)定法中，需要高通量測(cè)定法以便使給定時(shí)間段內(nèi)檢查的化合物數(shù)目最大。在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行，例如可以用純化或部分純化的蛋白質(zhì)獲得的測(cè)定法，作為"初步"篩選通常是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛梢员划a(chǎn)生以允許快速發(fā)展和相對(duì)容易的檢測(cè)由測(cè)試化合物介導(dǎo)的分子靶中的改變。此外，測(cè)試化合物的細(xì)胞毒性和/或生物利用度的效應(yīng)在體外系統(tǒng)中一般是可以被忽略的，相反該測(cè)定法主要集中于藥物對(duì)分子靶的影響，如可以在與受體蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力的改變中表現(xiàn)的。因此在另一個(gè)方面，提供了鑒定用于促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)或存活的化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括下述步驟i)制備包含候選化合物的樣品，ii)使細(xì)胞與所述樣品接觸，iii)測(cè)定涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的化合物的表達(dá)或活性是否得到調(diào)節(jié)，和iv)測(cè)定樣品是否能夠促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)或存活。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)定包含候選化合物的樣品是否在體外或體內(nèi)刺激胰島素受體的Tyr972和Tyrl162/1163的自磷酸化。在其他實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)定包含候選化合物的樣品是否調(diào)控MNTF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在其他實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)定包含候選化合物的樣品是否調(diào)節(jié)選自下述的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性胰島素受體、IGF-1受體、IGF-2受體、Shh、Akt、Bad(bcl-2的細(xì)胞死亡拮抗劑)、PI(3,4，5)P3依賴(lài)性激酶1(PDK1)、Bax、p53基因產(chǎn)物、pp60-Src、JAK2、一氧化氮合酶(NOS)、糖原合酶激酶3(GSK)、半胱天冬酶、PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。在其他實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)定包含候選化合物的樣品是否受MNTF類(lèi)似物的調(diào)控，或備選地調(diào)控MNTF類(lèi)似物(例如活性、表達(dá)等)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)施用由本文描述的篩選操作鑒定的化合物促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)或存活或用于治療神經(jīng)元病癥的方法。在示例性篩選測(cè)定法中，目的化合物在其中一般能夠結(jié)合MNTF肽的條件下與包括MNTF結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，表達(dá)MNTF肽受體的細(xì)胞)和MNTF肽的混合物接觸。隨后向混合物中加入包含測(cè)試化合物的組合物。受體/MNTF肽復(fù)合物的檢測(cè)和量化提供了用于測(cè)定測(cè)試化合物在抑制(或加強(qiáng))受體蛋白質(zhì)和MNTF肽之間的復(fù)合物形成方面的功效的方法。還可以執(zhí)行對(duì)照測(cè)定法以提供用于比較的基線(xiàn)，其中向受體蛋白質(zhì)中添加分離的和純化的MNTF肽，并且在不存在測(cè)試化合物的情況下定量受體/MNTF肽復(fù)合物的形成。例如，復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)可以使用例如可檢測(cè)標(biāo)記的蛋白質(zhì)例如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶促標(biāo)記的MNTF肽，通過(guò)免疫測(cè)定法或通過(guò)色譜檢測(cè)進(jìn)行定量。對(duì)于無(wú)細(xì)胞測(cè)定法，一般將希望使MNTF肽或MNTF肽結(jié)合蛋白固定，以促進(jìn)受體/MNTF肽復(fù)合物與未復(fù)合形式的蛋白質(zhì)之一的分離，以及調(diào)節(jié)測(cè)定法的自動(dòng)化。例如可以提供添加允許蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。例如，谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶/受體(GST/受體)融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽瓊脂糖珠(SigmaChemical,St.Louis,Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，其隨后與MNTF肽例如35S標(biāo)記的MNTF肽和測(cè)試化合物組合，并且在有助于復(fù)合物形成的條件下進(jìn)行溫育，例如在對(duì)于鹽和pH的生理?xiàng)l件下，盡管略微更嚴(yán)格的條件可以是希望的。溫育后，洗滌珠以去除任何未結(jié)合的MNTF肽，并且直接地或在受體/猬復(fù)合物解離后的上清液中測(cè)定基質(zhì)珠結(jié)合的放射性標(biāo)記(例如，置于閃爍體中的珠)。備選地，復(fù)合物可以與珠解離，通過(guò)SDS-PAGE凝膠分開(kāi)，并且使用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)定量來(lái)自凝膠的在珠中發(fā)現(xiàn)的MNTF肽水平。用于使蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上的其他技術(shù)也可用于在受試測(cè)定法中使用。例如，MNTF肽的可溶性部分可以使用生物素和鏈霉親和素的綴合進(jìn)行固定。例如，使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(例如，生物素化試劑盒，PierceChemicals,Rockford，111.)生物素化的受體可以從生物素-NHS(N-幾基-琥珀酰亞胺)進(jìn)行制備，并且固定在鏈霉親和素包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。備選地，與MNTF肽反應(yīng)但不干擾猬結(jié)合的抗體可以衍生至平板的孔，并且受體通過(guò)抗體綴合捕獲在孔中。如上所述，MNTF肽和測(cè)試化合物的制劑在平板的受體呈遞孔中進(jìn)行溫育，并且可以定量孔中捕獲的受體/猬復(fù)合物的量。用于檢測(cè)此類(lèi)復(fù)合物的示例性方法，除了上文描述的關(guān)于GST-固定復(fù)合物的那些外，包括使用與MNTF肽反應(yīng)，或與受體蛋白質(zhì)反應(yīng)并且竟?fàn)幗Y(jié)合MNTF肽的抗體的復(fù)合物的免疫檢測(cè)；以及依賴(lài)于與MNTF肽相關(guān)的酶促活性檢測(cè)的酶聯(lián)測(cè)定法。在后者的情況下，酶可以與MNTF肽進(jìn)行化學(xué)綴合或作為含MNTF肽的融合蛋白提供。為了舉例說(shuō)明，MNTF肽可以與堿性磷酸酶進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)或遺傳融合，并且復(fù)合物中捕獲的MNTF肽的量可以使用酶的生色底物例如對(duì)硝基磷酸苯酯進(jìn)行評(píng)估。同樣地，可以提供包含MNTF肽和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白，并且通過(guò)使用l-氯-2，4二硝基苯檢測(cè)GST活性定量復(fù)合物形成(Habig等人，JBiolChem，249:7130(1974))。對(duì)于用于定量復(fù)合物中捕獲的抗體之一的免疫檢測(cè)，可以使用針對(duì)蛋白質(zhì)的抗體，例如抗MNTF肽抗體。備選地，復(fù)合物中待檢測(cè)的蛋白質(zhì)可以以融合蛋白的形式"附加表位，，，除了MNTF肽或MNTF肽序列外，所述融合蛋白還包括對(duì)于其可容易獲得抗體的笫二種多肽(例如，來(lái)自商業(yè)來(lái)源)。例如，使用針對(duì)GST部分的抗體，上文描述的GST融合蛋白也可以用于結(jié)合的定量。其他有用的附加表位包括myc-表位(例如，參見(jiàn)Ellison等人，JBiolChem266:21150-21157(1991))，其包括來(lái)自c-myc的10殘基序歹'J，以及pFLAG系統(tǒng)(InternationalBiotechnologies,Inc.)或pEZZ-蛋白A系統(tǒng)(Pharamacia，N.J.)。組合物藥物組合物可以包含本發(fā)明公開(kāi)的一種或多種MNTF肽類(lèi)似物以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑和/或栽體。合適的載體/稀釋劑是本領(lǐng)域公知的，其包括鹽水或其他無(wú)菌水性介質(zhì)，任選地包含其他成分，例如緩沖鹽和防腐劑，或者糖、淀粉、鹽或它們的混合物。包含MNTF肽的組合物可以以適于施用方案和/或患者需要的任何合適的形式提供于應(yīng)用中。本文所述的技術(shù)包括培養(yǎng)基，其可用于建立和繁殖干細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、分化的神經(jīng)細(xì)胞以及干細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。所述的培養(yǎng)I、，、一、本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基理想地補(bǔ)充有成形素和/或生長(zhǎng)因子，并且根據(jù)需要培養(yǎng)的個(gè)別細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行優(yōu)化。此類(lèi)補(bǔ)充和優(yōu)化在本領(lǐng)域的普通技術(shù)內(nèi)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以補(bǔ)充下述近似水平(或在1個(gè)有效數(shù)字內(nèi))的任何或所有下述成形素和/或生長(zhǎng)因子的0.001-1RA，0.001-1Shh或Shh激動(dòng)劑，和/或0.01一250pg/ml的一種或多種MNTF肽類(lèi)似物。作為任選成分，本發(fā)明的藥物制劑可以包括藥學(xué)上可接受的栽體、稀釋劑、穩(wěn)定或乳化劑、和本領(lǐng)域可獲得的類(lèi)型的鹽。此類(lèi)物質(zhì)的例子包括標(biāo)準(zhǔn)鹽水溶液例如生理學(xué)緩沖鹽水溶液和水。在本發(fā)明的藥物可接受的緩沖鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液pH7.0-8.0。合適的藥學(xué)載體包括但不限于，無(wú)菌水，鹽溶液(例如林格氏溶液)，醇，聚乙烯二醇，明膠，碳水化合物例如乳糖、直鏈淀粉或淀粉，硬脂酸鎂，滑石，硅酸，粘性石蠟，脂肪酸酯，幾甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等。藥物制劑可以進(jìn)行滅菌并且需要時(shí)和不與活性化合物有害地反應(yīng)的助劑混合，所述助劑例如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑和/或芳香族物質(zhì)等。需要時(shí)它們還可以與其他活性物質(zhì)例如酶抑制劑組合，以減少代謝性降解。本文提供的化合物可以在藥物組合物中進(jìn)行配制，除了肽外所述藥物組合物還可以包括藥學(xué)上可接受的栽體、增稠劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、中性或陽(yáng)離子脂質(zhì)、脂質(zhì)復(fù)合物、脂質(zhì)體、滲透增強(qiáng)劑、載體化合物和其他藥學(xué)上可接受的栽體或賦形劑等。藥物組合物一般配制用于治療用途施用。藥物組合物還可以包括一種或多種活性成分例如干擾素、抗微生物劑、抗炎劑、麻醉劑等。用于腸胃外施用的制劑可以包括無(wú)菌水溶液，所述無(wú)菌水溶液還可以包含緩沖劑、脂質(zhì)體、稀釋劑和其他合適的添加劑。包含本文提供的肽的藥物組合物可以包括滲透增強(qiáng)劑，以便增強(qiáng)肽的消化遞送。穿透增強(qiáng)劑可以分類(lèi)為屬于5個(gè)廣泛類(lèi)別之一，即，脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、表面活性劑和非表面活性劑(Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems8,91-192(1991);Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems7,1-33(1990))?？梢园▉?lái)自這些廣泛類(lèi)別中的一個(gè)或多個(gè)的一種或多種滲透增強(qiáng)劑。充當(dāng)滲透增強(qiáng)劑的各種脂肪酸及其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、荒麻油酸酯(recinleate)、甘油單油酸酯(ak.a.l-單油?；?rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油基l-單癸酸酯、1-十二烷基環(huán)庚烷-2-酮、?；舛緣A、?；憠A、單和雙甘油酯及其生理學(xué)可接受的鹽(即油酸鹽、月桂酸鹽、癸酸鹽、肉豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、亞油酸鹽等)。Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems笫92頁(yè)(1991)'，Muranishi，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems7,l(1990);El-Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.44,651-654(1992))。膽汁的生理學(xué)作用包括促進(jìn)脂質(zhì)和脂溶性維生素的分散和吸收(Brunton，Chapter38In:Goodman&Gilman，sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第9版，Hardman等人McGraw-Hill,NewYork,N.Y.,第934-935頁(yè)(1996))。各種天然膽汁鹽及其合成衍生物充當(dāng)滲透增強(qiáng)劑。因此，術(shù)語(yǔ)"膽汁鹽"包括膽汁的任何天然組分及其任何合成衍生物?？梢允褂冒环N或多種滲透增強(qiáng)劑的復(fù)合制劑。例如，膽汁鹽可以與脂肪酸組合使用以制備復(fù)合制劑。螯合劑包括但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽和同香蘭草鹽)、膠原的N-?；苌?、月桂醇聚醚和p-二酮的N氨基?；苌?烯胺)[Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems第92頁(yè)(1991);Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems7，1-33(1990);Buur等人，J.ControlRel.14，43-51(1990))。螯合劑還具有充當(dāng)DNA酶抑制劑的另外優(yōu)點(diǎn)。表面活性劑包括例如月桂硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂醚和聚氧乙烯-20-鯨蠟醚(Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems第92頁(yè)(1991));和全氟化合物乳狀液，例如60FC-43(Takahashi等人，J.Pharm.Ph纖col.40,252-257(1988))。非表面活性劑包括例如，未飽和的環(huán)狀脲、1-烷基-和1-烯基氮雜環(huán)-坑酉同4汙生物(Lee等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems第92頁(yè)(1991));和非甾體抗炎劑例如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和保泰松(Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.39,621-626(1987))。一般的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于，結(jié)合劑(例如，預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基曱基纖維素等)；填充劑(例如，乳糖和其他糖、微晶纖維素、膠質(zhì)、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、硅石、二氧化硅膠體、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、氫化植物油、玉米淀粉、聚乙烯二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(例如，淀粉、淀粉羥乙酸拿等)；或濕潤(rùn)劑(例如，月桂磷酸鈉等)。本文提供的組合物可以另外包含以其領(lǐng)域確定的使用水平的，在藥物組合物中通常發(fā)現(xiàn)的其他附屬組分。因此，例如，組合物可以包含另外的相容性藥學(xué)活性材料，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或的^外材^:例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，當(dāng)添加時(shí)此類(lèi)材料不應(yīng)不適當(dāng)?shù)馗蓴_本文提供的組合物組分的生物活性。不管化合物通過(guò)其引入患者內(nèi)的方法，膠態(tài)分散系統(tǒng)可以用作遞送媒介物，以增強(qiáng)肽的體內(nèi)穩(wěn)定性和/或使肽耙向特定器官、組織或細(xì)胞類(lèi)型。膠態(tài)分散系統(tǒng)包括但不限于，大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球體、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)包括水包油乳狀液、微膠粒、混合微膠粒、脂質(zhì)體和未表征結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)肽復(fù)合物。優(yōu)選的膠態(tài)分散系統(tǒng)是多個(gè)脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是由脂質(zhì)構(gòu)成以雙層構(gòu)型排列的，具有由一個(gè)或多個(gè)外層圍繞的水核心的孩吏觀球體(一般參見(jiàn)，Chonn等人，CurrentOp.Biotech.6，698-708(1995))。在某些實(shí)施方案中，MNTF肽和MNTF類(lèi)似物可以摻入生物分布導(dǎo)向部分內(nèi)，或與生物分布導(dǎo)向部分結(jié)合使用，所述生物分布導(dǎo)向部分包括一種或多種聚合物，以指導(dǎo)MNTF肽或MNTF類(lèi)似物或本文提供的其他化合物的生物分布至所需耙的附近，或允許其持續(xù)釋放。活性劑包括例如，用于增加治療功效、用于優(yōu)化生物分布和生物利用度、用于減少組織損傷、用于促進(jìn)愈合、或用于增加患者舒適的化合物；示例性活性劑包括血管活性劑、麻醉劑、用于缺血的治療劑、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。備選地，微顆粒或納米顆粒聚合珠劑型可以在本文提供的組合物中使用。本文提供的化合物可以與活性劑組合使用，或連同與其附著的許多配體或抗配體分子一起包裹在顆粒劑型中。以這種方式，單獨(dú)地或與其他活性劑組合的MNTF肽和MNTF類(lèi)似物以及本文提供的其他化合物隨著時(shí)間在那個(gè)位點(diǎn)處釋放，以提供持續(xù)的治療益處。相對(duì)于本發(fā)明實(shí)踐中有用的其他活性劑，例如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞西子等，持續(xù)釋放劑型也是有用的?；钚詣谋景l(fā)明的顆粒劑型中的釋放可以由于擴(kuò)散和顆粒基質(zhì)腐蝕而發(fā)生。生物降解率直接影響活性劑釋放動(dòng)力學(xué)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的MNTF肽、MNTF類(lèi)似物和化合物的控制釋放腸胃外制劑可以制備為植入劑、油性注射劑或作為顆粒系統(tǒng)。顆粒系統(tǒng)包括微球體、微粒、微膠囊、納米膠嚢、納米球和納米微粒。微膠嚢包含治療蛋白質(zhì)作為中央核心。在微球體中，治療劑分散在整個(gè)顆粒中。脂質(zhì)體可以用于控制釋放以及誘陷藥物的藥物靶向。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物，包括MNTF肽和MNTF類(lèi)似物可以地方性地、局部地、經(jīng)鼻、經(jīng)口、胃腸道、支氣管內(nèi)、膀胱內(nèi)、陰道內(nèi)施用到子宮內(nèi)，皮下、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)周、關(guān)節(jié)內(nèi)施用到腦脊髓液(ICSF)內(nèi)、腦組織內(nèi)(例如顱內(nèi)施用)、脊髓內(nèi)、創(chuàng)傷內(nèi)、腹膜內(nèi)或胸膜內(nèi)，或全身地，例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肝門(mén)內(nèi)或直接施用到器官內(nèi)。如本領(lǐng)域已知的，各種導(dǎo)管和遞送途徑可以用于達(dá)到冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送。例如，適合于在本發(fā)明中使用的各種通用導(dǎo)管以及改良導(dǎo)管可從商業(yè)供應(yīng)商例如AdvancedCardiovascularSystems(ACS)、TargetTherapeutics和Cordis獲得。同樣地，當(dāng)通過(guò)直接注射到冠狀動(dòng)脈內(nèi)(這是目前最優(yōu)選的)來(lái)完成給心肌的遞送時(shí)，如本領(lǐng)域已知的，許多方法可用于將導(dǎo)管引入冠狀動(dòng)脈內(nèi)。作為舉例說(shuō)明，導(dǎo)管可以方便地引入股動(dòng)脈內(nèi)并且向后穿過(guò)髂動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈并且進(jìn)入冠狀動(dòng)脈內(nèi)。備選地，導(dǎo)管可以首先引入臂或頸動(dòng)脈內(nèi)并且向后穿過(guò)至冠狀動(dòng)脈。這些和其他技術(shù)的詳細(xì)描述可以在本領(lǐng)域中找到(參見(jiàn)，例如，Topol，EJ(編輯)，TheTextbookofInterventionalCardiology,第2版(W.B.SaundersCo.1994);Rutherford,RB,VascularSurgery,第3版(W.B.SaundersCo.1989);WyngaardenJB等人(編輯)，TheCecilTextbookofMedicine,第19版(W,B.Saunders,1992);和Sabiston，D,TheTextbookofSurgery,第14版(W.B.SaundersCo.1991))。本文提供的化合物可以腸胃外(parentally)施用。有時(shí)優(yōu)選某些化合物與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合，以產(chǎn)生藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。組合物可以配制用于腸胃外、肌內(nèi)、大腦內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或經(jīng)皮施用。施用的制劑可以包含此類(lèi)試劑。這些試劑的例子包括陽(yáng)離子試劑(例如磷酸《丐和DEAE-葡聚糖)和lipofectants(例如lipofectamTM和transfectamTM)。用于局部施用的制劑可以包括經(jīng)皮貼劑、軟骨、洗劑、乳青、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥學(xué)載體，水、粉末或油基，增稠劑等可能是必需或希望的。包被手套、避孕套等也可能是有用的。用于口部施用的組合物包括粉劑或顆粒劑、在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠嚢、嚢劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是希望的。用于腸胃外施用的組合物可以包括無(wú)菌水溶液，其還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其他合適的添加劑。在某些情況下，用肽與其他常規(guī)治療形式結(jié)合治療患者可能是更有效的，以便增加治療方案的功效。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"治療方案"意欲包含治療、姑息和預(yù)防形式。給藥劑量可以取決于許多因素，包括待治療疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度和應(yīng)答性，并且療程從數(shù)天持續(xù)至數(shù)月，或直至實(shí)現(xiàn)治愈或達(dá)到疾病狀態(tài)減少。本文提供的化合物的毒性和治療功效可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)操作在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中進(jìn)行確定。例如，為了確定LD5。(對(duì)50%群體致死的劑量)和ED5。(在50%群體中治療上有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，并且它可以表示為比LD5。/ED5。。顯示出大治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。盡管可以使用顯示出有毒副作用的化合物，但應(yīng)慎重設(shè)計(jì)使此類(lèi)化合物乾向受累組織位點(diǎn)的遞送系統(tǒng)，以便使對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損害降到最低，并且從而減少副作用。劑量范圍配制;使用。此類(lèi)化合物的劑量?jī)?yōu):地位于循環(huán)濃度范圍內(nèi):所述循環(huán)濃度范圍包括具有很少毒性或沒(méi)有毒性的ED5。。取決于使用的劑型和利用的施用途徑，劑量可以在這個(gè)范圍內(nèi)變化。對(duì)于在本發(fā)明的方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可以最初由細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估。劑量可以在動(dòng)物模型中進(jìn)行配制，以達(dá)到包括如在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC5。(即，達(dá)到癥狀的半最大抑制的測(cè)試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。此類(lèi)信息可以用于更精確地確定在人中的有用劑量。在血漿中的水平可以例如通過(guò)高效液相層析進(jìn)行測(cè)量。給藥方案可以由患者體內(nèi)的藥物蓄積測(cè)量進(jìn)行計(jì)算。劑量可以依單個(gè)化合物包括MNTF肽和MNTF類(lèi)似物的相對(duì)功效而變，并且一般可以基于發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中有效的EC50進(jìn)行評(píng)估。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，優(yōu)選劑量將以MNTF肽如何和何處施用(例如體外、體內(nèi)、局部地、全身地等)而變。例如，在一個(gè)方面，可以施用MNTF肽和MNTF類(lèi)似物，以在靶位點(diǎn)處(例如在ES千細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)中)達(dá)到終濃度約0.01微克/毫升(jag/ml)-約lmg/ml、約0.1pg/mL-約50mg/mL、約0.1mg/mL一約150Mg/mL、約liag/mL—約200jag/mL、和約O.lMg/mL-約500lag/mL，包括在這些范圍內(nèi)的任何范圍。取決于施用途徑，備選的合適劑量可以例如從約0.lug到多至約1克的總劑量不同。關(guān)于具體劑量和遞送方法的指導(dǎo)在文獻(xiàn)中提供并且對(duì)于本領(lǐng)域從業(yè)者一般是可得到的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將利用對(duì)于核苷酸與對(duì)于蛋白質(zhì)或其抑制劑不同的制劑。類(lèi)似地，本文提供的多核苷酸、多肽和化合物的遞送將對(duì)具體細(xì)胞、條件和位置特異。一般而言，劑量一般為O.Olmg/kg-1000mg/kg體重，和更一般地，例如，約0.1mg/kg-300mg/kg體重，并且可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次，或甚至在2-20年的時(shí)間間隔期間給予一次或多次。在某些實(shí)施方案中，劑量可以從手術(shù)后緊接著到24小時(shí)給予，在另一個(gè)實(shí)施方案中；劑量從2小時(shí)到高達(dá)24小時(shí)給予。取決于具體制劑的半衰期和清除率，長(zhǎng)效組合物可以每3-4天、每周或每2周進(jìn)行施用。基于在體液或組織中測(cè)量的藥物停留時(shí)間和濃度，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地估計(jì)用于給藥的重復(fù)率。成功治療后，可能希望使患者經(jīng)歷維持療法以預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中所選化合物以0.01mg/kg-IOOmg/kg體重的維持劑量施用，每天一次或多次至每20年一次。在某些病狀的治療或預(yù)防中，合適的劑量水平一般為約0.001-100mg/kg患者體重/天，其可以以單次或多次劑量施用。合適的劑量水平可以為約1-約40mg/kg/天。在某些實(shí)施方案中，本文提供的化合物，包括MNTF肽和MNTF肽類(lèi)似物以這樣的量施用以達(dá)到下述體內(nèi)濃度在損害位點(diǎn)上約l微摩爾-約1毫摩爾、約IO微摩爾-約500微摩爾、或約30微摩爾-約300微摩爾、和約25微摩爾-約300微摩爾終濃度，并且包括在損害位點(diǎn)上約25微摩爾、或約160微摩爾、或約300微摩爾終濃度，并且更一般地約1微摩爾-約IOO微摩爾。在某些實(shí)施方案中，可以施用1、5、10、20、50、100、150或者200mg/kg的劑量。本文描述的化合物可以在診斷、治療、預(yù)防中、以及作為研究試劑和在試劑盒中使用。用于檢測(cè)目的化合物(例如MNTF肽和MNTF類(lèi)似物)的方法供應(yīng)可以常規(guī)地完成。此類(lèi)供應(yīng)可以包括酶綴合物、放射性標(biāo)記或任何其他合適的檢測(cè)系統(tǒng)。還可以制備用于檢測(cè)目的化合物存在或不存在的試劑盒。如本文所使用的，脊髓損傷可以包括由胂瘤、機(jī)械外傷和化學(xué)外傷所導(dǎo)致的損傷。相同或相似的方法被考慮用于恢復(fù)患有肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化或脊髓損傷的受試者的運(yùn)動(dòng)功能。在某些實(shí)施方案中，施用一種MNTF類(lèi)似物還提供了預(yù)防功能。這種施用情況具有保護(hù)受試者或者處于患有肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化或脊髓損傷風(fēng)險(xiǎn)的受試者的運(yùn)動(dòng)功能的作用。在某些實(shí)施方案中，施用MNTF類(lèi)似物保護(hù)了MNTF通路的完整性。具體而言，用于治療(在發(fā)現(xiàn)癥狀前或發(fā)現(xiàn)癥狀后)脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)或腦缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變的方法包括施用選自SEQIDNO:1-142中的MNTF肽類(lèi)似物。在某些方面中，提供了多種組合物以及治療性處理方法，該方法包括在神經(jīng)通路受到損傷或者是在預(yù)計(jì)到發(fā)生這種損傷時(shí)，以足以維持神經(jīng)通路(包括修復(fù)損害的通路或抑制神經(jīng)通路發(fā)生額外的損傷)的濃度向受試者施用治療有效量的本文所述的MNTF類(lèi)似物蛋白質(zhì)，并持續(xù)一段時(shí)間。在另一方面中，本文所述的技術(shù)包括用于保持神經(jīng)通路的組合物和治療性處理方法。這種處理方法包括在神經(jīng)通路受到損傷或者是在預(yù)計(jì)到發(fā)生這種損傷時(shí)，向所述的受試者施用刺激治療有效濃度的內(nèi)源MNTF的化合物。本文所述的多個(gè)方面和多種實(shí)施方案提供了用于保護(hù)神經(jīng)元免于法。在某些實(shí)施方案中，提供了用于刺激對(duì)損害的神經(jīng)元和神經(jīng)通路進(jìn)行細(xì)胞修復(fù)(包括損害的樹(shù)突或軸突的再生)的方法、組合物和裝置。在一個(gè)方面中，本文所述的MNTF類(lèi)似物可用于修復(fù)外周神經(jīng)系統(tǒng)中損害的神經(jīng)通路。特別是，MNTF可用于修復(fù)損傷的神經(jīng)通路，包括橫切的神經(jīng)纖維或者是損傷的神經(jīng)纖維。具體而言，本文所述的MNTF能夠刺激完全軸突神經(jīng)的再生，包括髓鞘的血管化和再形成。MNTF可以在處于具有生物相容性和生物吸收性的載體(其能夠保持MNTF處于損傷位點(diǎn)處)中的情況下而被提供于所述的位點(diǎn)處，并且在必要的情況下，MNTF提供了用于指導(dǎo)軸突由鄰近的位點(diǎn)處生長(zhǎng)至嚴(yán)重神經(jīng)元的遠(yuǎn)端的手段。例如，在神經(jīng)再生有待于被誘導(dǎo)越過(guò)延長(zhǎng)的距離(例如大于lOinni)的情況下，可能需要用于指導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的手段。能夠提供上述功能的許多栽體是可預(yù)見(jiàn)的。例如，有用的載體包括基本上不溶的材料，或者按照本文所公開(kāi)的方法制備的粘性溶液，包括層粘蛋白，透明質(zhì)酸或膠原，或者其他合適的、合成的、具有生物相容性的聚合物材料(例如聚乳酸、聚羥基乙酸、聚丁酸和/或它們的共聚物)。在某些實(shí)施方案中，將MNTF類(lèi)似物置于其距離跨越了損害通路的神經(jīng)導(dǎo)管中。所述的導(dǎo)管起到了保護(hù)性覆蓋物和用于定向神經(jīng)突生長(zhǎng)的物理手段的作用?？捎玫膶?dǎo)管包括結(jié)構(gòu)可以為管狀生物相容性膜，該膜具有足以跨越有待修復(fù)的神經(jīng)間隙的維度，并且具有適于容納嚴(yán)重神經(jīng)末梢的開(kāi)口。所述的膜可以由任何具有生物相容性的無(wú)刺激性材料(例如有機(jī)硅或生物相容性聚合物，如聚乙烯或聚乙烯-醋酸乙烯)構(gòu)成，其中所述的聚合物包括例如膠原、透明質(zhì)酸、聚乳酸、聚丁酸和聚羥基乙酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述導(dǎo)管的外表面基本上是不可滲透的。在另一方面中，本文所述的MNTF可用于保護(hù)對(duì)抗損害，該損害與針對(duì)神經(jīng)組織最初的損傷而產(chǎn)生的肌體免疫和炎性應(yīng)答有關(guān)。所述的應(yīng)答可以發(fā)生在神經(jīng)組織發(fā)生外傷(例如通過(guò)自體免疫功能紊亂、腫瘤病變、感染、化學(xué)或4幾械外傷、疾病、通過(guò)中斷血液流入到神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，或者通過(guò)對(duì)神經(jīng)或周?chē)镔|(zhì)造成的其他外傷所引起)之后。例如，認(rèn)為在神經(jīng)血液供應(yīng)被閉塞之后，由組織缺氧或缺血-再灌注導(dǎo)致的原發(fā)性損害(如同在栓塞性中風(fēng)中)具有免疫相關(guān)性。此外，與大量原發(fā)性腦腫瘤有關(guān)的至少部分損傷還表現(xiàn)出具有免疫相關(guān)性。MNTF類(lèi)似物的應(yīng)用直接或系統(tǒng)性的減輕和/或抑制了針對(duì)神經(jīng)損傷所產(chǎn)生的免疫相關(guān)性應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，本文所述的技術(shù)涵蓋了本文所述的任何MNTF蛋白質(zhì)的生物活性種類(lèi)(系統(tǒng)發(fā)生的)變體的用途，其中所述的變體包括但不限于保守的氨基酸序列變體，由兼并核苷酸序列變體編碼的蛋白質(zhì)，以及共享保守的MNTF結(jié)構(gòu)域的、并且由在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格條件MNTF蛋白質(zhì)。本發(fā)明的化合物還可以用于研究目的。因此，由肽顯示出的特異性雜交可以用于測(cè)定法、純化、細(xì)胞產(chǎn)物制備和通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解的其他方法中。除非另有說(shuō)明，本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。本文參考本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法?？梢詤⒖嫉年U述此類(lèi)已知方法的出版物和其他材料整體引入本文作為參考，如詳細(xì)闡述一樣。闡述重組DNA技術(shù)的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考著作包括Sambrook,J.，等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Planview,N.Y.(1989)和MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版(Sambrook和Russel，2001)，在本文中共同和單獨(dú)地稱(chēng)為"Sambrook";McPherson,M.J.，Ed.，DirectedMutagenesis:APracticalApproach,IRLPress,0xford(1991);Jones,J.,AminoAcidandPeptideSynthesis,OxfordSciencePublications,Oxford(1992);Austen,B.M.和Westwood，0.M.R.,ProteinTargetingandSecretion,IRLPress,Oxford(1991);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,編輯，1984);AnimalCel1Culture(R.I.Freshney，編輯，1987);HandbookofExperimentalImmunology(D.M.Weir&C.C.Blackwell，編輯)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.Miller&M.P.Calos，編輯，1987);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人，編輯，1987包括直到2001年的補(bǔ)充)；PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullis等人，編輯，1994);CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coligan等人，編輯，1991);TheImmunoassayHandbook(D.Wild,編輯，StocktonPressNY，1994);Bio函jugateTechniques(GregT.Hermanson,編輯，AcademicPress,1996);MethodsofImmunologicalAnalysis(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines,編輯，Weinheim:VCHVerlagsgesellschaftmbH，1993)，Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications,NewYork和Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(在本文中共同和單獨(dú)地稱(chēng)為Harlow和Lane)，Beaucage等人編輯，CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistryJohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,2000);和Agrawal，編輯,ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,SynthesisandPropertiesHumanaPressInc.,NewJersey，1993);Teratocarcinomasandembryonicstemcells:Apracticalapproach(E.J.Robertson,編輯，IRLPressUd.(1987);GuidetoTechniquesinMouseDevelopment(P.M.Wasserman等人編輯，AcademicPress(1993);EmbryonicStemCellDifferentiationinvitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225:900(1993);PropertiesandusesofEmbryonicStemCells:ProspectsforApplicationtoHumanBiologyandGeneTherapy(P.D.Rathjen等人，Reprod.Fertil.Dev.，10:31(1998));CNSRegeneration:BasicScienceandClinicalAdvances,M.H.Tuszynski&J.H.Kordower，編輯，AcademicPress,(1999)。在本發(fā)明實(shí)踐中可能有用的某些技術(shù)在各種專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)中得到描述，包括報(bào)道了從腦組織獲得多潛能神經(jīng)千細(xì)胞的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，851，832，報(bào)道了由新生大腦半球生產(chǎn)成神經(jīng)細(xì)胞的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,766,948，報(bào)道了哺乳動(dòng)物神經(jīng)嵴干細(xì)胞的使用的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，654，183和5，849，553,報(bào)道了從哺乳動(dòng)物多潛能CNS干細(xì)胞在體外產(chǎn)生分化的神經(jīng)元的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，040，180,報(bào)道了神經(jīng)上皮干細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞前體、和語(yǔ)系受限的神經(jīng)元前體的產(chǎn)生和分離的WO98/50526和WO99/01159，和報(bào)道了從胚胎前腦獲得并用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，968，829，所述培養(yǎng)基包含葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、硒、孕酮和幾種其他的生長(zhǎng)因子。盡管在本發(fā)明的執(zhí)行中可以利用技術(shù)人員已知的任何合適的材料和/或方法；然而，本文還是描述了非限制性?xún)?yōu)選的材料和/或方法。本發(fā)明在某些方面可以參考下述實(shí)施例進(jìn)行理解，所迷實(shí)施例為了舉例說(shuō)明而不是為了限制而提供。除非另有說(shuō)明，下述實(shí)施例中參考的材料、試劑等可從商業(yè)來(lái)源獲得。以下描述的某些實(shí)施例包含了下文提供的引用文獻(xiàn)ChauRMW,RenF，HuangW，JenLS.Muscleneurotrophicfactorsspecificforanteriorhornmotoneuronsofratspinalcord.RecentAdvancesinCell.AndMol.Biol.1992，5:89-94.CopelandJr，LeggettYA，Ka廳nYM，TaylorRE,TizabiY.Neuroprotectiveeffectsofnicotineagainstsalsolino卜inducedcytotoxicity:implicationsforParkinson'sdisease.NeurotoxRes.2005Nov;8(3-4):289-93.KMBiotech.PublishedPCTPatentApplication:W098/13492，1998.MaruyamaW，YiH，TakahashiT，ShimazuS,0hdeH，YonedaF，IwasaK，NaoiM.NeuroprotectivefunctionofR-(-)-l-(benzofuran-2-yl)-2-propylaminopentane，[R-(_)-BPAP]，againstapoptosisinducedbyN-methyl(R)salsolinol，anendogenousdopaminergicneurotoxin,inhumandopaminergicneuroblastomaSH-SY5Ycells.LifeSci.2004May21;75(1):107-17.NussbaumD，AshD，JabsE，BrushartT.Mononeurontrophicfactor(MNTF)FromGenetoFunction.Soc.ForNeuroscience,NewOrleans,LA，2003.ShavaliS，RenJ，EbadiM.Insulin-likegrowthfactor-lprotectshumandopaminergicSH-SY5Ycellsfromsalsolinol-inducedtoxicity.NeurosciLett.2003Apr10;340(2):79-82.WangAM,ChauRMW，ChowSP，ZhangZY，LiZM.Effectsofmyogenic22and35kDneurotrophicfactorsonaxonalregenerationinfreeperipheralautograftsintoratspinalcord.1995,5(6):248-252.DubaiDB，ZhuH，YuJ，RauSW，ShughruePJ，MerchenthalerI，KindyMS，WisePM.Estrogenreceptoralpha,notbeta,isacriticallinkinestradiol-mediatedprotectionagainstbraininjury.ProcNatlAcadSciUSA.2001，98:1952-1957.EllsworthJL，GarciaR，YuJ，KindyMS.Timewindowoffibroblastgrowthfactor-18-mediatedneuroprotectionafterocclusionofthemiddlecerebralarteryinrats.JCerebBloodFlowMetab.2004，24:114—123.EllsworthJL，GarciaR，YuJ，KindyMS.Fibroblastgrowthfactor—18reducedinfarctvolumesandbehavioraldeficitsaftertransientocclusionofthemiddlecerebralarteryinrats.Stroke.2003，34:1507-1512.GaryDS，Bruce-KellerAJ，KindyMS,MattsonMP.Ischemicandexcitotoxicbraininjuryisenhancedinmicelackingthep55tumornecrosisfactorreceptor.JCerebBloodFlowMetab.1998，18:1283-1287.KMBiotech.InternationalPatentWO98/13492，1998.MattsonMP,ZhuH，YuJ，KindyMS.Presenilin-lmutationincreasesneuronalvulnerabilitytofocalischemiainvivoandtohypoxiaandglucosedeprivationincellculture:involvementofperturbedcalciumhomeostasis.JNeurosci.2000，20:1358-1364.DiX，HuangW.Localizationandmorphometricstudyonmotoneuronotrophicfactor1anditsreceptorindevelopingchorionicvi11iofhumanplacenta.ActaAnatomicaSinica，1998，29:86-89.XinyuD，WeiquanH.Localizationandmorphometricstudyonmotoneuronotrophicfactor1anditsreceptorindevelopingchorionicvi11iofhumanplacenta.ActaAnatomicaSinica，1998，29:86-89.如本文所使用的，應(yīng)該預(yù)計(jì)到MNTF肽、及其序列和/或功能類(lèi)似物的效力可以通過(guò)與以下實(shí)施例中所述的基本相似和/或一致的方案來(lái)測(cè)定。此外，應(yīng)該預(yù)計(jì)到SEQIDNO:1-142中列出的任<可MNTF肽類(lèi)似物、及其變體的效力可以根據(jù)本文所述的實(shí)驗(yàn)條件來(lái)測(cè)定。如本文所使用的，示例性的MNTF肽類(lèi)似物GM6、GM602、GM603、GM604、MNTF6聚體都稱(chēng)為含有序列FSRYAR(SEQIDNO:2)的MNTF6-聚體。實(shí)施例1MNTF血腦屏障滲透的測(cè)試用于本實(shí)施例的縮寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)。"MNTF"是指運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子；或其肽類(lèi)似物。"GM6"和"6聚體"是指MNTF的示例性6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物，即，F(xiàn)SRYAR(SEQIDNO:2)。"BBB"是指血腦屏障。"Genervon，，和"GB"是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"I.V."是指靜脈內(nèi)。"抗-6聚體的抗體"是指抗-GM6的抗體。"NTS"是指NeurologicalTestingService,其為合同研究組織。對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)的合成的6氨基酸類(lèi)似物(GM^FSRYAR)穿過(guò)血腦屏障并進(jìn)入腦的能力進(jìn)行測(cè)試。GM6為合成的6個(gè)氨基酸肽MNTF的類(lèi)似物。GM6以固體的形式提供，并且制劑(儲(chǔ)存在4。C下的溶液)由NTS來(lái)制備。已經(jīng)在大鼠的多種神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)匪TF進(jìn)行了測(cè)試，其中所迷的神經(jīng)系統(tǒng)包括外周坐骨神經(jīng)、外周肌皮神經(jīng)，頭部和面部神經(jīng)、頭部舌下神經(jīng)以及控制頸部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓。在所述的脊髓模型中，將MNTF應(yīng)用在大鼠的半橫切脊髓中的神經(jīng)移植物上。MNTF減少了炎癥、限制了惡化并增強(qiáng)了嫁接神經(jīng)的再生。許多研究已經(jīng)證實(shí)了當(dāng)將MNTF或GM6直接應(yīng)用到神經(jīng)上時(shí)，合成的MNTF或GM6在良好建立的大鼠外周神經(jīng)模型中對(duì)營(yíng)養(yǎng)和熱作用的效力。此外，MNTF已經(jīng)顯示出能夠促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的再生和存活。此外，選擇具有雙隱性基因的Wobbler小鼠模型(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病小鼠模型)作為代用品，來(lái)在上述小鼠品系中研究MNTF挽救運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元免于發(fā)生基因缺陷(該缺陷會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性疾病)的能力。在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，在六周齡時(shí)肌肉內(nèi)給予一劑量的MNTF減緩了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的發(fā)展。在經(jīng)處理的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病小鼠中，未經(jīng)治療的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病小鼠的存活由9至12周明顯增加至28至63周。對(duì)MNTF和GM6在多種動(dòng)物系統(tǒng)中的作用進(jìn)行評(píng)估。在對(duì)超過(guò)1000只SpragueDawley大鼠和15組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病小鼠及其正常的同窩出生的幼鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，未鑒定出安全問(wèn)題。由于具有潛在作用的MNTF起到了神經(jīng)保護(hù)、發(fā)炎和神經(jīng)元再生的作用，所以包含MNTF及其肽類(lèi)似物的藥物組合物被評(píng)價(jià)為用于治療神經(jīng)疾病。治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和紊亂的一個(gè)主要障礙是難以將藥物傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。測(cè)定藥物的生物利用度和對(duì)多種神經(jīng)紊亂的作用，從而評(píng)估藥物的治療潛力。評(píng)估通過(guò)靜脈內(nèi)注射的gm6對(duì)腦的有效性。方法和材料研究設(shè)計(jì)對(duì)C57BL6小鼠注射所示劑量的GM6,并對(duì)腦中的GM6進(jìn)行檢測(cè)。取出一半腦用于針對(duì)GM6的免疫細(xì)胞化學(xué)分析，并將另一半(腦)冷凍用于ELISA分析。體內(nèi)方法在實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使重量大約為25克的雄性C57BL/6小鼠(JacksonLaboratory)自由進(jìn)食和進(jìn)水。在實(shí)驗(yàn)前，使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境，為期1周。將載體或GM6以0.2或2mg/kg的濃度經(jīng)尾靜脈對(duì)動(dòng)物給予靜脈內(nèi)推注給藥。通過(guò)使用儲(chǔ)存在4。C下的100%的鹽水溶液重構(gòu)GM6來(lái)配制GM6作為原液。栽體對(duì)照也包含鹽水溶液。免疫組織化學(xué)分析將組織切片脫蠟，并在pH7.4的Tris緩沖鹽水(TBS)中洗滌，再在合適的血清(山羊)中封閉。將切片在4。C下封閉過(guò)夜，然后在4。C下經(jīng)歷一級(jí)抗體(抗6-聚體的抗體)過(guò)夜。將切片在TBS中洗滌，然后加入二級(jí)抗體，再在室溫下溫育l小時(shí)。在洗涂后，將切片#4居VectorABCElite試劑盒的指導(dǎo)進(jìn)行溫育，并用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。在水中終止反應(yīng)，并在用二甲苯處理后蓋上蓋玻片。使用計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各切片中的免疫細(xì)胞化學(xué)染色面積，其中所述的計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)由裝配有QuickCapture圖像采集卡的PowerMacintosh計(jì)算機(jī)、安裝在Olympus顯微鏡上的HitachiCCD照相機(jī)、以及照相才幾支架構(gòu)成。使用NIHImageAnalysisSoftware,v.1.55。獲取圖像，并在10個(gè)切片上測(cè)定GM6肽的總面積。由對(duì)治療狀態(tài)為盲的單個(gè)操作者進(jìn)行所有的測(cè)量。ELISA分析使用竟?fàn)幮訣LISA試劑盒測(cè)定樣品中GM6的水平。將處于涂敷緩沖劑中的濃度為1Oug/ml的親和力純化兔抗-6聚體涂敷在ELISA板上。在所述的檢測(cè)中，使用1uM(最終稀釋度)的6聚體-生物素。將濃度已知的GM6(竟?fàn)幵噭?用作參照標(biāo)準(zhǔn)品，在所述的測(cè)試中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度為80uM，并對(duì)采用2倍稀釋法稀釋至0.625uM的該標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行滴定，以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，由OD450的觀察結(jié)果估測(cè)測(cè)試樣品的濃度。在包含100mMTrisHC1，pH7.0，包含2%BSA，1MNaCl，4mMEDTA，2%TritonX-100,0.1°/。疊氮化鈉、以及蛋白酶抑制劑(CompleteTM，Mini,BoehringerMannheim)的細(xì)胞裂解緩沖劑中制備腦組織。在相對(duì)組織濕重10個(gè)體積的緩沖劑中制備勻漿。將所述的勻漿在14，OOOxg下離心30分鐘。將調(diào)整的合適體積的所得上清液用于ELISA。對(duì)于所述的檢測(cè)，將抗6聚體pAb在ELISA涂敷緩沖劑中稀釋至10ug/ml。使用經(jīng)稀釋的pAb以100ul/孔的量涂敷96孔微孔板。蓋上所述的微孔板，并保持冷凍過(guò)夜。第二天，用3%的BSA以200u1/孔TBS封閉所述的板，然后在RT下保持60分鐘。將板用18510183+0.05%TVeen20)洗滌3X。對(duì)各板，制備10mlluM6聚體-生物素和lml的標(biāo)準(zhǔn)混合物luM6聚體-生物素與80uM的6聚體。對(duì)于各板，通道1和2用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。除了Al和A2以外，將1uM6聚體-生物素(IOOjul)加入到所有的孔中，而將標(biāo)準(zhǔn)混合物以200ul/孔的量加入到A1和A2中。通過(guò)由各孔中取出100ul的樣品、并將其與下一個(gè)孔混合一吸管上下抽吸至少8次，從而由孔Al和A2直至孔Hl和H2進(jìn)行2倍系列稀釋。將最后孔(H1和H2)中的額外的100ul丟棄。將測(cè)試樣品(腦勻漿)在Ab稀釋緩沖劑中稀釋?zhuān)⒁詌:50與luM的6聚體-生物素混合。在RT下，將所得的板在混合器上以400rpm混合2小時(shí)。將得到的樣品用TBST洗滌6X。通過(guò)在Ab稀釋緩沖劑中將鏈霉親和素-HRP稀釋至l:2000來(lái)制備鏈霉親和素-HRP溶液(每板10ml)。在RT下，將板在混合器上再混合1小時(shí)。將樣品用TBST洗滌8X。以50u1/孔的量加入底物(TMBS，Genetel)，并顯色5分鐘。使用50ul1M的HC1終止反應(yīng)，并立刻讀取OD450。統(tǒng)計(jì)分析將結(jié)果表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。釆用t檢驗(yàn)分析ELISA和免疫組織數(shù)據(jù)的差異顯著性。所述研究中動(dòng)物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動(dòng)物在研究結(jié)束前(在任何時(shí)間點(diǎn)上)死亡的動(dòng)物；在施用測(cè)試制品后形成嚴(yán)重并發(fā)癥的動(dòng)物。處理組所有的組都經(jīng)歷GM6或者作為對(duì)照。將栽體或MNTF以指示的劑量經(jīng)尾靜脈對(duì)動(dòng)物(30只動(dòng)物)給予靜脈內(nèi)推注給藥。表-小鼠BBB模型<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>將所有的測(cè)試組都提供給NTS;將GM6以固體材料的形式提供給NTS。測(cè)試組中所有的動(dòng)物都給予上文指示的劑量。在所述研究結(jié)束時(shí)，取出1/2的腦以用于針對(duì)GM6的免疫細(xì)胞化學(xué)分析。取出另1/2腦以用于針對(duì)GM6的ELISA分析。結(jié)果小鼠中的MNTF。血腦屏障研究對(duì)GM6在腦中的相對(duì)有效性進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)得自靜脈內(nèi)施用載體或GM6的小鼠(野生型)。免疫細(xì)胞化學(xué)分析GM6:在施用MNTF后，取出腦，并^f吏用抗-6聚體的抗體對(duì)取出的腦進(jìn)行針對(duì)GM6的免疫細(xì)胞化學(xué)分析。與對(duì)照動(dòng)物相比，在任何動(dòng)物的組織中都沒(méi)有檢測(cè)到免疫反應(yīng)性。ELISA分析為了使用竟?fàn)幮訣LISA試劑盒測(cè)定腦樣品中GM6的水平，按照上文所述制備樣品，并對(duì)其進(jìn)行ELISA。如圖l和表4所示，釆用ELISA測(cè)試，檢測(cè)腦中的MNTFGM6。ELISA檢測(cè)到了腦中內(nèi)源GM6的基礎(chǔ)水平(O.4iaM)。在注射有0.2mg/kgGM6的動(dòng)物中，檢測(cè)到GM6增長(zhǎng)至400%(1.760iaM)，而在注射2mg/kgGM6的4小時(shí)之后，腦中的GM6增長(zhǎng)至3000%(12.92juM)。這些數(shù)據(jù)表明靜脈內(nèi)注射GM6可以使所述的肽在腦中進(jìn)行分布。表4.腦中的MNTF(I.V注射)。(示于圖l中)<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>死亡率在該研究中沒(méi)發(fā)生死亡。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，MNTF為這樣的營(yíng)養(yǎng)因子，其能夠提供保護(hù)從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在受損或移植后再生。在此所進(jìn)行的研究證明了MNTF(GM6)的6氨基酸類(lèi)似物以有效且高效的方式穿過(guò)血腦屏障的能力。靜脈內(nèi)施用0.2和2mg/kg的單推注劑量的GM6證明腦中的GM6的水平呈劑量依賴(lài)方式的增加。這表明，GM6通過(guò)靜脈內(nèi)施用能夠進(jìn)入腦，并且可以用于各種疾病模型中，從而確定了其有益效果。當(dāng)通過(guò)靜脈內(nèi)進(jìn)行施用時(shí)，發(fā)現(xiàn)GM6在4小時(shí)之后存在于腦中。GM6在腦中的水平是劑量依賴(lài)方式的，并且表明GM6能夠通過(guò)靜脈內(nèi)施用的方式進(jìn)入腦中。實(shí)施例2中風(fēng)在MCAO模型中用MNTF治療中風(fēng)在中腦動(dòng)脈阻塞(MCAO)的小鼠模型中測(cè)試MNTF肽類(lèi)似物GM602(SEQIDNO:2，F(xiàn)SRYAR)的效力。為了測(cè)定GM602在MCAO小鼠模型中的效力，使小鼠經(jīng)歷1小時(shí)的缺血和24小時(shí)的再灌注。在開(kāi)始再灌注之后即刻通過(guò)尾靜脈以靜脈內(nèi)推注方式對(duì)小鼠注射幾種劑量的GM602,并檢測(cè)在腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)方面的變化。對(duì)靜脈(IV)內(nèi)施用的單劑量(l或5mg/kg)GM602檢測(cè)。施用GM602證明在HR、BP、p02、pC02或pH方面無(wú)變化。觀察到，在再灌注后，施用GM602會(huì)使CBF明顯高于對(duì)照組，表明GM602會(huì)幫助減輕由血流阻斷所導(dǎo)致的缺血作用。在注射GM602之后，檢測(cè)在ND和IFV中發(fā)生的劑量依賴(lài)方式的變化。lmg/kg和5mg/kg的GM602都表現(xiàn)出了明顯的免于受到梗塞損傷的保護(hù)，這解釋了對(duì)神經(jīng)缺損的保護(hù)作用。所得的這些數(shù)據(jù)表明，在MCAO小鼠模型中，GM602在經(jīng)歷IV注射之后對(duì)腦具有神經(jīng)保護(hù)作用。用于本實(shí)施例的縮寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)。"MNTF"是指運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子。"MNTF6聚體"是指MNTF的6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物，例如FSRYAR。"GM602"是指用于中風(fēng)的MNTF的6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物。"GM602(1)"是指劑量為lmg/kg的GM602。"GM602(5)"是指劑量為5mg/kg的GM602。"MCAO"是指中腦動(dòng)脈阻塞。"GB，，是指GenervonBiopharmaceuticalsUC。"IV"是指靜脈內(nèi)。"CBF"是指腦血流量。"HR，，是指心率。"BP"是指血壓。"ND"是指神經(jīng)缺損。"IFV"是指梗塞體積。MNTF為通過(guò)其功能而發(fā)現(xiàn)的、在人染色體上具有特定位置的內(nèi)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。MNTF對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)具有高度的特異性，并且在人類(lèi)胎兒的完整神經(jīng)系統(tǒng)的形成過(guò)程中的妊娠期的三個(gè)月中被快速表達(dá)，并在笫九周時(shí)達(dá)到峰值(DiandHuang，1998)。MNTF為完全結(jié)合非常特異性的受體的神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)分子。如在動(dòng)物和體外研究中所證明的功能為使胚胎干細(xì)胞分化形成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元得以維持和存活；在其指導(dǎo)下運(yùn)動(dòng)軸突的再生；以及目標(biāo)肌肉和器官的再神經(jīng)無(wú)力(re-enervation)(Chauetal.，1992;Nussbaumetal.，2003)。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)處于由疾病、紊亂或損傷所導(dǎo)致的攻擊之下時(shí)，MNTF針對(duì)神經(jīng)再生和修復(fù)形成了保護(hù)性和許可的環(huán)境，該環(huán)境為神經(jīng)保護(hù)性的、抗細(xì)胞凋亡的、抗氧化的、抗炎的以及抗創(chuàng)傷的。大量的研究已經(jīng)證明了MNTF在大鼠的各種神經(jīng)系統(tǒng)中的效力，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)包括外周坐骨神經(jīng)、外周肌皮神經(jīng)、頭部和面部神經(jīng)、頭部舌下神經(jīng)以及控制頸部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓(Wangetal.，1995)。在半橫切的大鼠脊髓模型中，MNTF減少了炎癥、限制了惡化并增強(qiáng)了嫁接神經(jīng)的再生(KMBiotechPCT，1998)。許多研究已經(jīng)證實(shí)了合成的MNTF或MNTF6聚體(FSRYAR;SEQIDNO:2)在良好建立的大鼠外周神經(jīng)模型中在營(yíng)養(yǎng)和熱作用的效力(Nussbaumetal，2003)。此外，MNTF已經(jīng)顯示出促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的再生和存活(KMBiotechPCT，1998)。此外，在具有雙隱性基因的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病小鼠(NIH)達(dá)到6周齡時(shí)給予其一劑量的35ng的MNTF，減慢上述品系小鼠的神經(jīng)退行性基因疾病(KMBiotechPCT，1998)。將MNTF的一個(gè)活性位點(diǎn)的6個(gè)氨基酸(FSRYAR)的類(lèi)似序列作為具有MNTF活性的藥物候選物進(jìn)行研究。由使用了自己建立的檢測(cè)方法和方案的獨(dú)立的研究組進(jìn)行以下的CNS和PNS實(shí)驗(yàn)1.已經(jīng)顯示出MNTF6聚體類(lèi)似物能夠通過(guò)IV注射而滲透過(guò)血腦屏障并進(jìn)入到腦中。2.L-2-輕基戊二酸(LGA)誘導(dǎo)了神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激和細(xì)^^凋亡。在斑馬魚(yú)生物分析中，MNTF6聚體保護(hù)了CNS中的由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將中腦中的細(xì)胞凋亡減少了85%。3.在大鼠的坐骨神經(jīng)斷層(具有8mm間隙)的研究中，經(jīng)MNTF處理的動(dòng)物中具有呈劑量應(yīng)答方式的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元再生明顯的改善(在最佳劑量下，p<0.0002)，并促進(jìn)了DRG神經(jīng)元的再生。4.在橫切的股神經(jīng)大鼠模型中，在經(jīng)MNTF6聚體處理的動(dòng)物中，大量的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以劑量應(yīng)答的方式正確投射到肌肉中。在最佳劑量下，正確投射到肌肉中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量為不正確地投射到皮膚中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量的3倍(p〈0.0001)。5.在斑馬魚(yú)生物分析中，MNTF6聚體保護(hù)了PNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將外周肌神經(jīng)接合點(diǎn)的細(xì)胞凋亡減小49%。評(píng)估示例性的MNTF肽GM602(FSRYAR;SEQIDNO:2)，其為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子的6個(gè)氨基酸肽類(lèi)似物(MNTF6聚體)在保護(hù)腦免受急性缺血和再灌注損傷的能力。GM602是在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成的(CSBioCo.，MenloPark,CA，GMP013,lotC811)。在NeurologicalTestingService,Inc(NTS,Charleston,SC)的合同下進(jìn)行上述研究。將GM602以固體形式提供給NTS,并且制劑(儲(chǔ)存在4。C下的溶液)由NTS來(lái)制備。方法和材料在實(shí)驗(yàn)前，重量大約為22-25克的動(dòng)物C57BL/6小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)均給予自由進(jìn)食和進(jìn)水。使用氟烷來(lái)麻醉動(dòng)物(70V30。/。NO2/02中1%的氟烷，通過(guò)面罩麻醉)。通過(guò)尾筒裝置(tailcuffapparatus)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(MABP),并收集血液樣品，從而測(cè)定動(dòng)J^pH7jc平、以及PaC02和Pa02。<吏用VisitechSystem血壓監(jiān)測(cè)儀記錄MABP和心率。使用插入到顳肌肌肉中的直腸溫度計(jì)和熱敏探針來(lái)監(jiān)測(cè)腦的溫度。通過(guò)使用帶有水套的加熱墊，將動(dòng)物的體溫保持在37°C。在缺血前的1小時(shí)至缺血后的6小時(shí)監(jiān)測(cè)腦的溫度，并每隔30分鐘記錄一次。實(shí)驗(yàn)組所有的動(dòng)物都經(jīng)歷了1.Oh的缺血、及其后的24h的再灌注。將動(dòng)物隨機(jī)分成栽體組(n-lO)，或靜脈內(nèi)注射劑量為1或5mg/kg的GM602的處理組(11=10)。NTS通過(guò)使用儲(chǔ)存在4。C下的標(biāo)準(zhǔn)鹽水溶液重構(gòu)GM602來(lái)配制GM6(CSBioCo.,MenloPark,CA，GMP013,lotC811)作為原液。栽體對(duì)照接受鹽水溶液。在再灌注發(fā)生后即刻通過(guò)尾靜脈進(jìn)行IV推注。研究人員對(duì)于處理組是盲的。缺血的誘導(dǎo)本研究涉及缺血的瞬時(shí)模型。對(duì)每只小鼠都進(jìn)行麻醉，并分離出頸外動(dòng)脈(ECA)和頸總動(dòng)脈(CCA)。將熱敏探針插入到直腸和顳肌肌肉中，從而監(jiān)測(cè)肌體和腦的溫度，其中通過(guò)外部加熱，將所述的溫度保持在36-37。C。通過(guò)頸部正中切口使左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)暴露出來(lái)。對(duì)甲狀腺上動(dòng)脈和枕動(dòng)脈進(jìn)行電凝集并分開(kāi)。將顯微手術(shù)夾;^文置在頸外動(dòng)脈(ECA)源頭的周?chē)CA的遠(yuǎn)端用6-0絲綁結(jié)，并橫切。將6-0絲松散地系在ECA殘端的周?chē)?。移開(kāi)所述的手術(shù)夾，并將5-0尼龍縫合線(xiàn)(涂有有機(jī)硅)的經(jīng)燒邊的尖端溫和地插入到ECA殘端中。將環(huán)狀的6-0絲系緊在所述殘端的周?chē)?，并且使尼龍縫合線(xiàn)進(jìn)入并通過(guò)頸外動(dòng)脈(ICA)中大約13mm(根據(jù)體重進(jìn)行調(diào)節(jié))，直至所述的縫合線(xiàn)停留在前大腦動(dòng)脈(ACA)中，由此阻塞了前交通動(dòng)脈和中腦動(dòng)脈。在將尼龍縫合線(xiàn)放置l小時(shí)后，其被拉回到ECA中，并封閉切口。組織學(xué)檢測(cè)關(guān)于組織學(xué)檢測(cè)，在誘導(dǎo)缺血之后的24小時(shí)，采用腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)來(lái)麻醉動(dòng)物。采用穿心灌注(transcardially)的方式，使用4'C的10。/。的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對(duì)腦進(jìn)行灌注。取出所述的腦，并將其在-2(TC下冷凍15分鐘，然后再放置到嚙齒動(dòng)物腦矩陣中。制備冠狀切片(lmm厚)，并將其在37。C下用2%的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色。由各腦獲得由梗塞的前緣直至尾部范圍的7個(gè)連續(xù)的lmm厚冠狀切片，其中所述的梗塞距額極2mm開(kāi)始。將經(jīng)TTC染色的切片放置在10%中性的緩沖福爾馬林中，并在黑暗狀態(tài)下，在4。C下保持至少24小時(shí)。使用計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各切片中的梗塞的面積，其中所述的計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)由裝配有QuickCapture圖像采集卡的PowerMacintosh計(jì)算機(jī)、安裝在Olympus顯微鏡上的HitachiCCD照相機(jī)、以及照相機(jī)支架構(gòu)成。使用NIHImageAnalysisSoftware,v.1.55。獲取圖像，并在7個(gè)切片上測(cè)定損害的總面積。由對(duì)治療狀態(tài)為盲的單個(gè)操作者進(jìn)行所有的測(cè)量。通過(guò)對(duì)切片中梗塞體積求和來(lái)計(jì)算梗塞體積。通過(guò)采用以下公式來(lái)計(jì)算梗塞的尺寸(W以消除水腫影響(對(duì)側(cè)體積-同側(cè)未損傷的體積)X100/對(duì)側(cè)體積。腦血流量的測(cè)量通過(guò)使用激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)腦血流量(CBF)。CBF值以百分比的形式測(cè)定，這是因?yàn)橛杉す舛嗥绽昭鲀x顯示的值并非為絕對(duì)值。如上文所述，使用氟烷來(lái)麻醉動(dòng)物(70%/30%N02/02中1%的氟烷，通過(guò)面罩麻醉)。在與MCA阻塞同側(cè)的腦半球中，坐標(biāo)如下點(diǎn)A，前囪點(diǎn)后0.5mm、中線(xiàn)側(cè)部2mm;點(diǎn)B，前囪點(diǎn)后lmm、中線(xiàn)側(cè)部1.2mm;點(diǎn)D,前囪點(diǎn)后lmm、中線(xiàn)側(cè)部1.7mm;點(diǎn)C，在對(duì)側(cè)半J求中，前囪點(diǎn)后lmm、距中線(xiàn)2mm。在缺血發(fā)作前15分鐘，在注射測(cè)試制品前的缺血過(guò)程中(缺血開(kāi)始之后的15分鐘)，以及在注射制品之后的30分鐘時(shí)(在缺血之前的15分鐘至注射所述的化合物結(jié)束之后的30分鐘進(jìn)行連續(xù)地測(cè)定，并且每30分鐘記錄一次)，對(duì)比CBF。將MCA阻塞前的平均值作為基線(xiàn)，此后的數(shù)據(jù)以基線(xiàn)值的百分比表示。行為評(píng)估在缺血損傷之前和之后的小鼠中測(cè)定行為分析(神經(jīng)缺損)。神經(jīng)學(xué)評(píng)分如下0，正常的運(yùn)動(dòng)功能；1,當(dāng)通過(guò)尾巴將動(dòng)物提起來(lái)時(shí)，軀干和對(duì)側(cè)前肢彎曲；2,當(dāng)通過(guò)尾巴將動(dòng)物按在平面上時(shí)，會(huì)發(fā)生對(duì)側(cè)偏轉(zhuǎn)，但在休息時(shí)保持正常的姿態(tài)；3，在休息時(shí)發(fā)生對(duì)側(cè)傾斜；4，沒(méi)有自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性。所述研究中動(dòng)物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動(dòng)物在研究結(jié)束前(在任何時(shí)間點(diǎn)上)死亡的動(dòng)物。將至死亡時(shí)收集的數(shù)椐提供給GB;在阻塞后腦血流量沒(méi)有降低至基線(xiàn)值的20±5%(即，被認(rèn)為為非缺血情況)，或者在再灌注時(shí)血流量沒(méi)有恢復(fù)至基線(xiàn)值的90±15%;在缺血損傷后產(chǎn)生癲癇狀行為的動(dòng)物；在缺血過(guò)程中或缺血后片刻，檢測(cè)到過(guò)量出血的動(dòng)物。統(tǒng)計(jì)分析將結(jié)果表示成平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。采用單因素協(xié)方差分析(AN0VA)、再通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)(Fisher'sposthoctest)來(lái)分析生理學(xué)和組織學(xué)數(shù)據(jù)中的差異顯著性。在監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上計(jì)算重復(fù)測(cè)量的AN0VA，再通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)評(píng)價(jià)多組中的差異顯著性。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM602或者作為對(duì)照。以IV劑量方式給予動(dòng)物(30只動(dòng)物)以指示劑量的載體或GM602。小鼠中風(fēng)模型<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>結(jié)束GM602在由缺血和再灌注損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)保護(hù)方面的作用。針對(duì)腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物。將所有的測(cè)試組都提供給NTS;將GM602以固體材料的形式提供給NTS。測(cè)試組中所有的動(dòng)物都以上文指示給藥。結(jié)果小鼠中的缺血(缺血研究)。對(duì)上述研究中的缺血的相對(duì)嚴(yán)重性進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)得自患有缺血損傷的小鼠，其中所述的小鼠靜脈內(nèi)注射有載體或GM602。梗塞體積與載體注射組相比，在GM602處理組(在lmg/kg和5mg/kg下)中，腦中梗塞體積明顯減小。GM602顯示出使梗塞體積呈劑量依賴(lài)性地減小(參見(jiàn)表5)。梗塞體積對(duì)GM6的劑量繪制于圖2A中。在腦中梗塞體積減小的百分比示于表5中。如表5所示，缺血后，IV施用0、1或5mg/kg的GM602分別顯示出57%、39%和12%的梗塞尺寸。對(duì)于栽體組而言，梗塞體積為73.37mm3;對(duì)于1或5mg/kg的GM602處理組而言，梗塞體積分別為45.93mm3和20.29mm3。由此，與載體相比，缺血后IV施用1或5mg/kg的GM602使得梗塞體積分別減小38%和73%。表5.腦中梗塞減小的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>減小的百分比與各種載體對(duì)照動(dòng)物相比。所有組與對(duì)照組相比，p值均〈0.0001。死亡率在本研究中未發(fā)生死亡。生理學(xué)參數(shù)在使用5mg/kg的GM602(其有助于減輕由阻斷血流量所導(dǎo)致的缺血效果)治療的組中，觀察到在再灌注之后腦血流量明顯高于載體組，除此以外，在缺血過(guò)程中或者是在再灌注之后，在栽體小鼠和治療小鼠之間，生理學(xué)參數(shù)(平均動(dòng)脈血壓、血液p02、pC02和pH)不具有顯著性差異，均為基線(xiàn)水平(參見(jiàn)圖3-7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>行為測(cè)定基于G至4的分值，針對(duì)神經(jīng)缺損對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估。使用GM602治療的動(dòng)物顯示出神經(jīng)缺損呈劑量依賴(lài)方式的減小(數(shù)據(jù)同樣示于圖8)?；衔锷窠?jīng)缺損與載體相比的p值載體2.7±0.30GM602(1)1.8±0.249P<0.04GM602(5)1.3±0.153P<0.0006在美國(guó)，中風(fēng)是死亡的第三大原因，并且是造成殘疾的主要原因。局灶性腦缺血造成的結(jié)果和所形成的梗塞的尺寸可以通過(guò)"壞死性"(細(xì)胞凋亡)細(xì)胞死亡情況以及通過(guò)在缺血邊緣帶中延遲的神經(jīng)元細(xì)胞損失(程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡)情況來(lái)測(cè)定。近期出現(xiàn)的療法用于治療缺血性中風(fēng)。但是，這些治療方法通常涉及溶解血液凝塊，但一旦神經(jīng)元細(xì)胞死亡循環(huán)被引發(fā)不會(huì)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、或者減小行為缺陷或腦梗塞體積的作用。理解影響細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)機(jī)理將有助于能夠減小與缺血性損傷有關(guān)的細(xì)胞死亡的藥物的設(shè)計(jì)和應(yīng)用。MNTF為這樣的營(yíng)養(yǎng)因子，其能夠提供保護(hù)從而免于神經(jīng)疾病，并可以在發(fā)生損傷或缺血性中風(fēng)后使神經(jīng)元組織再生。本發(fā)明所進(jìn)行的研究證明了GM602(MNTF的6個(gè)氨基酸(FSRYAR)的類(lèi)似物)以有效且高效的方式保護(hù)腦免于受到由腦缺血和再灌注損傷而造成的有害作用的能力。靜脈內(nèi)施用1和5mg/kg單次推注劑量的GM602證明了通過(guò)減小梗塞體積、改善行為性質(zhì)以及增大腦血流量而在腦中產(chǎn)生對(duì)抗缺血/再灌注損傷的、呈劑量依賴(lài)方式的保護(hù)作用。這些研究表明，GM602在中風(fēng)中具有有利的作用。當(dāng)將GM602進(jìn)行靜脈內(nèi)施用時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在小鼠中具有對(duì)抗缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。這些研究奠定了進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)，以測(cè)定GM602在中風(fēng)和其他神經(jīng)退行性紊亂中的有利作用。實(shí)施例3脊髓損傷GM603(示例性MNTF6聚體FSRYAR)在脊髓損傷的小鼠模型中的測(cè)試。針對(duì)在脊髓損傷(SCI)小鼠模型中的效力對(duì)MNTF類(lèi)似物GM603(SEQIDNO:2;FSRYAR)進(jìn)行測(cè)試。為了測(cè)定GM603在SCI小鼠模型中的效力，使小鼠經(jīng)歷脊髓受損，和14天的恢復(fù)。在損傷后即刻向小鼠靜脈內(nèi)注射若干劑量的GM603,并且在14天中的每一天均如此。(i.v.)施用多劑量的GM603(1或5mg/kg)的情況進(jìn)行測(cè)試。施用GM603證實(shí)了LV和BR方面的變化，其顯示出劑量依賴(lài)方式的效果。1和5mg/kg的GM603顯示出病變體積明顯減小，這解釋了對(duì)神經(jīng)缺損的保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)證明，在對(duì)SCI小鼠模型i.v.注射GM603之后，其在脊髓中具有神經(jīng)保護(hù)作用。用于本實(shí)施例的縮寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)。"MNTF"是指運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子。"MNTF6聚體"是指MNTF的6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物。"GM603"是指用于SCI的MNTF的6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物(FSRYAR)。"GM603-1"是指劑量為lmg/kg的GM603;SEQIDNO:2，F(xiàn)SRYAR。"GM603-5"是指劑量為5mg/kg的GM603。"scr是指脊髓損傷。"GB，，是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"I.V."是指靜脈內(nèi)。"BR"是指行為恢復(fù)。MNTF6聚體是相對(duì)小型的，其不具有大型肽在穩(wěn)定性、溶解性、誘變性、免疫原性、或者轉(zhuǎn)基因或重組方法的高制造成本方面的缺點(diǎn)。固相合成6aa的成本是相對(duì)低的。在中腦動(dòng)脈阻塞(MOAC)的小鼠中風(fēng)模型中，通過(guò)IV注射MNTF6聚體的后期治療減小了腦中梗塞體積并以劑量應(yīng)答的方式減輕了神經(jīng)缺損。與載體相比，高劑量的MNTF6聚體將腦中梗塞體積減小了74%，并且顯著地減輕了神經(jīng)缺損(p<0.0001)，表明MNTF6聚體在中風(fēng)方面具有有利的作用。L-2-羥基戊二酸(LGA)誘導(dǎo)了神經(jīng)系統(tǒng)中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。在斑馬魚(yú)生物分析中，MNTF6聚體保護(hù)了CNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將中腦中的細(xì)胞凋亡減少85%(Parngetal，2004)。在具有8mm間隙的大鼠坐骨神經(jīng)橫切研究中，經(jīng)MNTF6聚體治療的動(dòng)物以劑量應(yīng)答的方式明顯地改善了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的再生(p<0.0002，在最佳劑量下)，并促進(jìn)了DRG神經(jīng)元的再生(Nussbaumetal，2003)。在經(jīng)橫切的股神經(jīng)大鼠模型中，在經(jīng)MNTF6聚體治療的動(dòng)物中，正確透射到肌肉中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量呈現(xiàn)劑量應(yīng)答的方式。在最佳劑量下，正確透射到肌肉中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量是非正確地透射到皮膚中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量的3倍(p〈0.0001)(Nussbaumetal，2003)。在斑馬魚(yú)生物分析中，MNTF6聚體保護(hù)了PNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并使外周肌神經(jīng)接合點(diǎn)的細(xì)胞凋亡減少49%(Parngetal,2004)。測(cè)定了GBGM603(其為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF6聚體)的6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物(FSRYAR;SEQIDNO:2))通過(guò)靜脈內(nèi)推注來(lái)保護(hù)脊髓免于受到損害或損傷的能力(Tyoretal.，2002;Engesser-Cesaretal.，2005)。GM603是在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成的(CSBioCo.，MenloPark,CA,GMP013,lotC811)。在NeurologicalTestingService,Inc(NTS,Charleston,SC)的合同下進(jìn)行上述研究。將GM603以固體形式提供給NTS，并且制劑(儲(chǔ)存在4。C下的溶液)由NTS來(lái)制備。方法和材料動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前，每只重量大約為22-25克的C57BL/6小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)均自由進(jìn)食和進(jìn)水。使用良好表征的氣動(dòng)沖擊裝置，使剛成熟的雌性小鼠(25gm)接受脊髓挫傷。實(shí)驗(yàn)組在實(shí)施外科手術(shù)前，根據(jù)隨機(jī)分組設(shè)計(jì)方案，將小鼠分配到不同的處理組中，使得在任何給定的手術(shù)當(dāng)天，所有的治療都被包括在內(nèi)。研究者對(duì)于處理組是盲的。NTS通過(guò)使用儲(chǔ)存在4。c下的y。鹽水溶液重構(gòu)GM603來(lái)配制GM603(CSBioCo.，MenloPark,CA，GMP013,lotC811)作為原液。栽體對(duì)照含有鹽水溶液。在再灌注發(fā)生后即刻通過(guò)尾靜脈進(jìn)行IV推注。脊髓損傷的誘導(dǎo)在對(duì)第10個(gè)胸推關(guān)節(jié)(T10)進(jìn)行推板切除術(shù)之前，使用克他命(80mg/kg)和曱苯噻溱(10mg/kg)來(lái)麻醉小鼠。使用直角夾具在上胸推(T8)和腰胸推(T11)處將脊柱夾穩(wěn)，并將直徑為2mm的銅針通過(guò)空氣作用推進(jìn)到疊置在背部脊髓上方的、暴露且完整的硬腦脊膜上。立刻除去氣動(dòng)沖擊裝置，并用鹽水沖洗傷口，再將肌肉和皮膚開(kāi)口縫合在一起。處理就化合物的應(yīng)用而言，每天i.v.注射GM603，并持續(xù)2周。在損傷后即刻施用2種不同劑量(1mg/kg和5mg/kg)的GM603。由于雌性動(dòng)物發(fā)生了與損傷有關(guān)的癱瘓并且易于排空膀胱，所以使用這種動(dòng)物。行為分析旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試和曠場(chǎng)測(cè)試就行為分析而言，在實(shí)施手術(shù)前，以及在手術(shù)后的第1、3、5、7和14天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試。將動(dòng)物在曠場(chǎng)室(直徑為120cm,壁高為25cm)中放置4分鐘，以確保所有的受試者都獲得了Basso，Beattie和Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)分表中的最大分值21。將小鼠在曠場(chǎng)中放置4分鐘，并錄像以用于評(píng)分。此外，測(cè)試小鼠保持在旋轉(zhuǎn)棒上的能力。就旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試而言，使小鼠經(jīng)歷l周的學(xué)習(xí)時(shí)間，其后，它們能夠在加速的旋轉(zhuǎn)棒上表演。在第1、3、5、7和14天進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試小鼠，直到它們?cè)谌芜B續(xù)的嘗試中不能在旋轉(zhuǎn)棒上保持10秒鐘以上為止，將這種情況確定為旋轉(zhuǎn)棒失敗。將最長(zhǎng)的時(shí)間設(shè)定為90秒。記錄處理組的分值，并將平均分繪制為損傷后時(shí)間的函數(shù)。組織學(xué)在上述研究結(jié)束時(shí)，處死動(dòng)物，并將脊髓固定于4%的多聚甲醛中。就分析而言，將20jam的冷凍切片用鉻花青(EC)染色，以區(qū)分白質(zhì)和細(xì)胞體，從而計(jì)算出穿過(guò)病變位點(diǎn)處的剩余組織的量。對(duì)所述的組織進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。由穿過(guò)損傷T10節(jié)段的IO個(gè)均勻間隔的部分，通過(guò)計(jì)算圖像分析來(lái)測(cè)定組織受量(tissuesparing)。壞死組織的體積除以橫穿部分的總體積，由此被轉(zhuǎn)換為百分比，然后再?gòu)?00%中減去該百分比。所述研究中動(dòng)物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動(dòng)物在研究結(jié)束前(在任何時(shí)間點(diǎn)上)死亡的動(dòng)物。將至死亡時(shí)收集的數(shù)據(jù)提供給GB;在缺血損傷后發(fā)生癲癇狀行為的動(dòng)物；在損傷過(guò)程中或損傷后片刻，檢測(cè)到過(guò)量出血的動(dòng)物。統(tǒng)計(jì)分析將所得的結(jié)果表示為平均值土該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。采用t檢驗(yàn)來(lái)分析病變體積和行為恢復(fù)中的差異顯著性。脊髓損傷的小鼠模型<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>結(jié)束行為缺陷組織學(xué)分析GM603保護(hù)免于受到脊髓損傷的作用。針對(duì)脊髓損傷來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物。已經(jīng)將所有的測(cè)試組都提供給NTS;將GM603以固體材料的形式提供給NTS。測(cè)試組中所有的動(dòng)物都如上文指示給藥。結(jié)果小鼠中的脊髓損傷。SCI研究。對(duì)上述研究中SCI的相對(duì)嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)得自靜脈內(nèi)注射載體或GM603的SCI小鼠。病變體積與載體注射組相比，在GM603組(1和5mg/kg)中，脊髓中的病變體積明顯減小。1至5mg/kg的GM603顯示出劑量依賴(lài)性地減小病變體積(參見(jiàn)表6)。病變體積繪制于圖9中。脊髓中所存在的病變體積的減小百分比列于表6中。如表6所示，與栽體相比，1或5mg/kg的GM603使病變體積分別減小28%或53%。圖IO示出了得自損傷動(dòng)物的脊髓的代表性照片。圖io顯示，在載體處理的動(dòng)物中，病變體積(染成紅色)非常大，而在GM603(5mg/kg)處理的動(dòng)物中，損傷體積(染成紅色)相對(duì)較小。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>減小的百分比與各載體對(duì)照動(dòng)物相比*與組1(載體)相比死亡率在本研究中未發(fā)生死亡。行為測(cè)定使小鼠經(jīng)歷旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試。對(duì)動(dòng)物保持在旋轉(zhuǎn)棒上的能力進(jìn)行測(cè)試，最長(zhǎng)時(shí)間為90秒。在旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試，這可以用于測(cè)定運(yùn)動(dòng)功能。裝置(DS37型)由直徑為2.5cm的棒構(gòu)成，該棒被直徑為25cm的圓盤(pán)分成6個(gè)分隔間。使棒以22rpm的恒定速度旋轉(zhuǎn)。在第1、3、5、7和14天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試。記錄它們?cè)谛D(zhuǎn)棒上保持的時(shí)間(最長(zhǎng)為90秒)。如圖ll所示，所有的動(dòng)物證實(shí)，開(kāi)始時(shí)都不能保持在旋轉(zhuǎn)棒上。但是，3天后，各組間形成了清楚的描繪。在第3天和第5天，差異是顯著的(P^.05)，到第7天顯著性甚至更大(P〈0.01)。將動(dòng)物在曠場(chǎng)室(直徑為120cm，壁高為25cm)中放置4分鐘，以確保所有的受試者都獲得了Basso，Beattie和Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)分表中的最大分值21，從而對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估。將小鼠在曠場(chǎng)中放置4分鐘，并錄像以用于評(píng)分。如圖12所示，在第l天，由于損傷，所有的動(dòng)物在運(yùn)動(dòng)中都顯示出相同的缺陷。但是，到第3天，與載體處理的動(dòng)物相比，GM603處理的動(dòng)物都顯示出明顯的改善。到第5天，顯著性P<0.01。討論MNTF為這樣的營(yíng)養(yǎng)因子，其能夠提供保護(hù)從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在損傷或移植后再生。在此所進(jìn)行的研究證明了MNTF6聚體類(lèi)似物GM603以有效且高效的方式保護(hù)了得自經(jīng)歷SCI有害作用的脊髓的能力。每日靜脈內(nèi)注射施用1和5mg/kg的GM603持續(xù)14天證明通過(guò)減小病變體積和行為性質(zhì)而在脊髓中對(duì)抗SCI的劑量依賴(lài)性保護(hù)作用。這些研究表明，GM603在SCI中具有有利的作用。當(dāng)通過(guò)靜脈內(nèi)進(jìn)行施用時(shí)，發(fā)現(xiàn)GM603在小鼠中對(duì)抗脊髓損傷的保護(hù)作用。實(shí)施例4ALS:測(cè)試Gm604在肌萎縮性側(cè)索硬化中如何對(duì)MNTF肽類(lèi)似物GM604(FSRYAR;SEQIDNO:2)在肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)小鼠模型中的效力進(jìn)行測(cè)試。為了測(cè)定GM604在ALS小鼠模型中的效力，向80天的小鼠靜脈內(nèi)注射兩種劑量的GM604，并持續(xù)直到小鼠死亡。針對(duì)在疾病發(fā)作的年齡、死亡年齡、以及疾病的行為表現(xiàn)方面的變化，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試多劑量靜脈內(nèi)(i.v.)施用的GM604(1或5mg/kg)。施用GM604證明，在疾病發(fā)作的年齡、死亡年齡和疾病的行為表現(xiàn)方面發(fā)生了變化，這些變化顯示為劑量依賴(lài)方式的作用。1和5mg/kg的GM604都顯示出，動(dòng)物的壽命預(yù)期的明顯延長(zhǎng)，這解釋了對(duì)神經(jīng)缺損的保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)表明，在ALS小鼠模型中GM604可以具有神經(jīng)保護(hù)性作用。用于本實(shí)施例的縮寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)。"MNTF"是指運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子。"MNTF6聚體"是指MNTF的6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物。"GM604"是指用于ALS的MNTF的6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物(FSRYAR)。"GM604-1"是指劑量為lmg/kg的GM604。"GM604-5"是指劑量為5mg/kg的GM604。"ALS"是指肌萎縮性側(cè)索硬化。"GB，，是指GenervonBiopharmaceuticals，L1X。"I.V."是指靜脈內(nèi)。評(píng)估運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF6聚體)的GB測(cè)試制品GM6(M(6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物(FSRYAR;SEQIDNO:2))在延遲或調(diào)節(jié)ALS小鼠模型中ALS疾病的臨床跡象的發(fā)作、臨床跡象的改善以及疾病末期方面的能力。使動(dòng)物經(jīng)歷靜脈內(nèi)注射GM604,其為在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成的(CSBioCo.,MenloPark,CA，GMP013,lotC811)。GM604以固體配制物(儲(chǔ)存在4。C下的溶液)的形式提供。方法和材料動(dòng)物將ALS小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)在無(wú)特定病原體(SPF)的條件下喂養(yǎng)和維持。在實(shí)驗(yàn)前，使重量為22-25克的動(dòng)物均自由進(jìn)食和進(jìn)水。使年輕的成熟小鼠(25gm)經(jīng)歷靜脈內(nèi)注射GM604。實(shí)驗(yàn)組在實(shí)施外科手術(shù)前，根據(jù)隨機(jī)分組設(shè)計(jì)方案，將小鼠分配到不同的處理組中，使得在任何給定的手術(shù)當(dāng)天，所有的處理都被包括在內(nèi)。通過(guò)使用儲(chǔ)存在4X:下—的鹽水溶液重構(gòu)GM604來(lái)配制GM604作為原液。栽體對(duì)照含有鹽水溶液。通過(guò)尾靜脈進(jìn)行IV推注。處理就化合物的應(yīng)用而言，每天i.v.注射GM604,直到動(dòng)物死亡。應(yīng)用2種不同劑量的GM604(1mg/kg和5mg/kg)。由于需要大量的動(dòng)物進(jìn)行研究，所以使用了雄性和雌性小鼠。行為分析旋轉(zhuǎn)棒就行為分析而言，在疾病發(fā)作前(80天)并且每隔三天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次測(cè)試，直到動(dòng)物死亡。針對(duì)小鼠保持在旋轉(zhuǎn)棒上的能力對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。就旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試而言，使小鼠經(jīng)歷l周的學(xué)習(xí)時(shí)間，其后，它們能夠在加速的旋轉(zhuǎn)棒上表演。每隔三天進(jìn)行一次測(cè)試，測(cè)試小鼠，直到它們?cè)谌芜B續(xù)的嘗試中不能在旋轉(zhuǎn)棒上保持10秒鐘以上為止，將這種情況確定為旋轉(zhuǎn)棒失敗。將最長(zhǎng)的時(shí)間設(shè)定為180秒。記錄處理組的分值，并將中值繪制為年齡的函數(shù)。抓力檢驗(yàn)使用抓力計(jì)(SanDiegoInstruments)，一周兩次測(cè)定小鼠前肢的力量(單位為牛頓)。上述測(cè)定測(cè)出了當(dāng)拉住小鼠的尾巴將其直線(xiàn)拉離傳感器時(shí)，小鼠前肢施加到桿上的力量峰值。在經(jīng)歷4次嘗試后，采用最高的結(jié)果來(lái)進(jìn)行分析。鼠尾測(cè)試?yán)∈笪矊⑿∈筇嶂量罩校z測(cè)后肢的伸展情況。將后肢缺少伸展確定為鼠尾檢驗(yàn)失敗。臨床評(píng)價(jià)基于以下標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)小鼠進(jìn)行分值為Q至4的臨床評(píng)分。未見(jiàn)虛弱跡象(G);顫抖和喪失張開(kāi)反射(l);一只后肢輕癱(2);兩只后肢輕癱(3);—只或兩只后肢癱瘓(4)。在水平4的情況下處死小鼠，以用于人為目的。組織學(xué)在上述研究結(jié)束時(shí)，處死動(dòng)物，并將脊髓固定于4%的多聚甲醛中，以用于分析。所述研究中動(dòng)物的排除基于若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動(dòng)物在本研究中沒(méi)有動(dòng)物被排除統(tǒng)計(jì)分析將所得的結(jié)果表示為平均值士該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。采用t檢驗(yàn)來(lái)分析在發(fā)作年齡、死亡年齡和行為表現(xiàn)方面的差異顯著性。ALS小鼠模型<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>結(jié)束疾病發(fā)作的年齡死亡的年齡行為缺陷組織學(xué)分析已經(jīng)將所有的測(cè)試組都提供給NTS;將GM604以固體材料的形式提供給NTS。測(cè)試組中所有的動(dòng)物均以上文指示給藥。結(jié)果ALS研究。對(duì)上述研究中ALS的相對(duì)嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)得自靜脈內(nèi)注射栽體或GM604的ALS小鼠。疾病發(fā)作的年齡與栽體注射組相比，在使用GM604(1和5mg/kg)治療的ALS小鼠中，疾病發(fā)作的年齡明顯延長(zhǎng)。1至5mg/kg的GM604顯示出疾病發(fā)作年齡的劑量依賴(lài)式延遲(參見(jiàn)表7)。疾病發(fā)作的概況示于表13中。疾病發(fā)作年齡增大的百分比列于表7中。如表7所示，與栽體相比，1或5mg/kg的GM604使疾病發(fā)作的年齡分別增大12%或27%。表7.ALS小鼠中疾病發(fā)作的年齡<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>增大的百分比與各載體對(duì)照動(dòng)物相比*與組1(栽體)相比死亡的年齡與載體注射組相比，在使用GM604(1和5mg/kg)治療的ALS小鼠中，死亡的年齡明顯延長(zhǎng)。1至5mg/kg的GM604顯示出死亡年齡的劑量依賴(lài)式延遲(參見(jiàn)表8)。死亡的年齡繪制于圖14中。死亡年齡延長(zhǎng)的百分比列于表8中。如表8所示，與栽體相比，l或5mg/kg的GM604使死亡的年齡分別增大16°/?；?0°/。。表8ALS小鼠中死亡時(shí)的年齡<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>增大的百分比與各載體對(duì)照動(dòng)物相比*與組1(載體)相比死亡率在本研究中未發(fā)生涉及疾病的死亡。行為測(cè)試旋轉(zhuǎn)才奉使小鼠經(jīng)歷旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試。對(duì)動(dòng)物保持在旋轉(zhuǎn)棒上的能力進(jìn)行測(cè)試，最長(zhǎng)時(shí)間為180秒。在旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試，這可以用于測(cè)定運(yùn)動(dòng)功能。裝置(DS37型)由直徑為2.5cra的棒構(gòu)成，該棒被直徑為25cm的圓盤(pán)分成6個(gè)分隔間。使所述的棒以22rpm的恒定速度旋轉(zhuǎn)。在第80天開(kāi)始對(duì)動(dòng)物每周進(jìn)行2次測(cè)試。記錄它們?cè)谛D(zhuǎn)棒上保持的時(shí)間(最長(zhǎng)為180秒)。如圖15所示，所有的動(dòng)物都能高效地通過(guò)旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試，直到疾病發(fā)作為止(參見(jiàn)圖15)。表9.在ALS小鼠中的旋轉(zhuǎn)棒分析<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>增大的百分比與各載體對(duì)照動(dòng)物相比*與組1(載體)相比抓力在疾病進(jìn)行過(guò)程中并在GM604存在下，檢查小鼠的抓力。與對(duì)照小鼠相比，使用GM604處理的ALS小鼠顯示出在抓力減小方面明顯延遲(參見(jiàn)圖16A和表10)?？傊?，與對(duì)照動(dòng)物相比，使用1或5mg/kg的GM604處理的小鼠表現(xiàn)更好。表10.ALS小鼠的抓力<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>增大的百分比與各載體對(duì)照動(dòng)物相比*與組1(載體)相比臨床評(píng)價(jià)在疾病進(jìn)行過(guò)程中并在GM604存在下，檢查小鼠的臨床評(píng)分。與對(duì)照動(dòng)物相比，使用GM604處理的ALS小鼠顯示出在臨床評(píng)分減小方面明顯延遲(參見(jiàn)圖16B和表11)?？傊c對(duì)照動(dòng)物相比，使用1或5mg/kg的GM604治療的小鼠表現(xiàn)更好。表11.ALS小鼠的臨床評(píng)分<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>增大的百分比與各載體對(duì)照動(dòng)物相比*與組1(載體)相比MNTF為這樣的營(yíng)養(yǎng)因子，其能夠提供保護(hù)從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在損傷或移植后能夠再生。在此所進(jìn)行的研究證明了MNTF6聚體類(lèi)似物GM604以有效且高效的方式保護(hù)脊髓免于受到ALS的有害作用和的能力。每天靜脈內(nèi)注射施用1和5mg/kg的GM6(M證明了通過(guò)增大疾病發(fā)作的年齡、死亡年齡和行為參數(shù)而在ALS小鼠模型中產(chǎn)生呈劑量依賴(lài)方式的保護(hù)作用。這些研究證明，GM604在ALS方面具有有利的作用。當(dāng)通過(guò)靜脈內(nèi)進(jìn)行施用時(shí)，發(fā)現(xiàn)GM604在小鼠中具有對(duì)抗ALS的保護(hù)作用。實(shí)施例5A小鼠帕金森氏疾病模型在帕金森氏疾病(PD)模型中測(cè)試GM6(FSRYAR，SEQIDNO:2)(CSBioCo.，MenloPark,CA)的效力。為了測(cè)定GM6在PD中的效力，向小鼠注射1-曱基-4-苯基-1，2，3，6-四氬吡咬(MPTP)以誘導(dǎo)PD,然后靜脈內(nèi)注射幾種不同劑量的GM6，從而測(cè)定其在減輕PD方面的作用。對(duì)5天(每天2次)進(jìn)行靜脈內(nèi)(i.v.)施用GM6(1'5，10或20mg/kg)的情況進(jìn)行測(cè)試。施用GM6證明了其以劑量依賴(lài)方式減輕小鼠的PD,其中20mg/kg顯示出最大的效力。行為、生物化學(xué)和組織學(xué)分析證明了減輕作用，說(shuō)明了GM6在PD中的獨(dú)特作用。這些數(shù)據(jù)表明，在i.v.注射之后GM6在PD小鼠模型中的有效性，并且可以成為用于PD患者的有效治療。用于本實(shí)施例的縮寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)。"MNTF，，是指運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子。"GM6"和"6聚體"分別是指MNTF的6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物。"PD"是帕金森氏疾病。"MPTP"是指1-甲基-4-苯基-l，2，3，6-四氫吡啶。"D0PAC"是指二氫基苯乙酸。"HVA"是指多巴胺。"DA"是指高香草酸。"Genervon，，和"GB，，分另寸是指GenervonBiopharmaceutica1s，LLC。"I.V."是指靜脈內(nèi)。測(cè)定運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)的6氨基酸類(lèi)似物(GM6)的能力，從而測(cè)定GM6在帕金森氏疾病(PD)的小鼠模型中的效力。帕金森氏疾病(PD)GM6為合成的6個(gè)氨基酸的肽(MNTF)。將GM6以固體形式提供給NTS,并且制劑(儲(chǔ)存在4。C下的溶液)由NTS制備。治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和紊亂的主要障礙是難以將藥物傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。測(cè)定藥物的生物利用度和其對(duì)各種神經(jīng)紊亂的作用對(duì)于潛在的治療發(fā)明而言是重要的。對(duì)通過(guò)靜脈內(nèi)注射的GM6在PD小鼠模型中的效力進(jìn)行評(píng)估。方法和材料研究設(shè)計(jì)。按照下文所述向雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，并檢測(cè)指示劑量的GM6對(duì)PD的保護(hù)作用。針對(duì)行為表現(xiàn)、生物化學(xué)和組織學(xué)方面的變化來(lái)檢測(cè)這些動(dòng)物。MPTP治療。對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行注射(i.p.，以20mg/kg的量溶于0.lml的水中，以2小時(shí)的時(shí)間間隔注射4劑量的卜甲基-4-苯基-l，2,3，6-四氫吡啶，MPTP，SigmaM-0896)，并在注射后對(duì)這些小鼠進(jìn)行每周一次的檢測(cè)。各組中的對(duì)照小鼠接受4次i.p.注射鹽水。在注射后，將小鼠置于加熱毯上24小時(shí)。施用MNTF。對(duì)于MNTF(GM6)處理，使小鼠每天接受兩次(12hr間隔)靜脈內(nèi)注射溶于鹽水中的各種劑量(1、5、10或20mg/kg)的MNTF,這種注射是在第一次MPTP注射后的30分鐘開(kāi)始，并在最后一次注射MPTP后再持續(xù)額外的4天；對(duì)照小鼠僅接受鹽水。N-10/組。行為測(cè)試。將雄性小鼠用于行為測(cè)試中。將所有的動(dòng)物都保持在12小時(shí)的光-暗循環(huán)(在7點(diǎn)至19點(diǎn)為光照)中，并允許它們自由進(jìn)食和進(jìn)水。為了評(píng)價(jià)自發(fā)的運(yùn)動(dòng)活性，我們使用了由4個(gè)Plexiglas氣缸(23cmx30cm，直徑x高)構(gòu)成的活性監(jiān)測(cè)器，其中每個(gè)氣缸都裝配有三個(gè)紅外線(xiàn)光束和自動(dòng)計(jì)數(shù)系統(tǒng)。通過(guò)將小鼠放置到氣缸中來(lái)開(kāi)始自發(fā)活性測(cè)試。在3min的環(huán)境適應(yīng)之后，通過(guò)計(jì)數(shù)在每5min內(nèi)穿過(guò)光電池裝置中的紅外線(xiàn)光束的次數(shù)來(lái)對(duì)活性進(jìn)行評(píng)估。為了評(píng)98估感覺(jué)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性，在旋轉(zhuǎn)棒任務(wù)中評(píng)價(jià)小鼠。使用由旋轉(zhuǎn)軸(直徑為7.3cm)和5個(gè)單獨(dú)的分隔間構(gòu)成的旋轉(zhuǎn)棒單元，一次對(duì)5只小鼠進(jìn)行測(cè)試。在每天訓(xùn)練兩次，并持續(xù)兩天(第一天速度為12rpm,第二天速度為18rpm)之后，在第三天測(cè)試期間，將測(cè)試的旋轉(zhuǎn)速度增大至25rpm。對(duì)每只小鼠都進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，每次間隔5分鐘，每次最長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)度為60秒，并記錄每只小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上保持的時(shí)間。數(shù)據(jù)以三次測(cè)試實(shí)驗(yàn)后在旋轉(zhuǎn)棒上的平均時(shí)間示出。腦一元胺的定量將切開(kāi)的腦區(qū)域在0.1M的高氯酸和0.lmM的EDTA中(10mg/100Ml)超聲。然后將提取物離心15分鐘，并收集上清液，然后將其儲(chǔ)存在-20。C下。采用電化學(xué)檢測(cè)方法，使用高壓液相色i普(HPLC)測(cè)定一元胺(多巴胺，[DA])和代謝物(二氬苯乙酸[DOPAC]，高香草酸[HVA])。免疫組織化學(xué)法。將所有小鼠(1/2腦)滴落固定于4%的PFA中。將所述的腦在4。C的4%的PFA中固定12h,然后儲(chǔ)存在溶解于PBS中的30°/。的蔗糖中。切下50微米切片，并使用1:IOOO稀釋的TH抗體(SigmaT-1299)進(jìn)行處理用于免疫組織化學(xué)。使用單克隆抗TH的抗體來(lái)顯現(xiàn)酪氨酸氫化酶(TH)的免疫反應(yīng)性。采用圖像分析，對(duì)黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)中的TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行初步定量。將切片干燥，并固定于Depex中。使用計(jì)算機(jī)輔助的立體工具盒來(lái)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。所有細(xì)胞的計(jì)數(shù)都是在對(duì)藥物處理為盲的條件下進(jìn)行的，并且是在100倍放大下進(jìn)行的。統(tǒng)計(jì)分析。將所得的結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)的形式表示。采用t檢驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)中的差異顯著性。所述研究中動(dòng)物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動(dòng)物在研究結(jié)束前(在任何時(shí)間點(diǎn)上)死亡的動(dòng)物；在施用測(cè)試制品后產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥的動(dòng)物。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM6或者作為對(duì)照。將栽體或MNTF以所述的劑量經(jīng)尾靜脈對(duì)動(dòng)物(60只動(dòng)物)給予靜脈內(nèi)推注給藥。對(duì)動(dòng)物每天注射2次，并持續(xù)5天。使用GM6(其為示例性的MNTF6-聚體FSRYARSEQIDNO:2)的小鼠PD模型組別化合物劑量(mg/kg)途徑C57BL/6小鼠1(n=10只小鼠)栽體0IV2(n=10只小鼠)示例性MNTFGM6FSRYAR1mg/kg/天IV3(n=10只小鼠)示例性MNTFGM6FSRYAR5mg/kg/天IV4(n=10只小鼠)示例性MNTFGM6FSRYAR10mg/kg/天IV5(n=10只小鼠)示例性MNTFGM6FSRYAR20mg/kg/天IV6(n=10只小鼠)對(duì)照對(duì)照NA結(jié)束小鼠中PD的調(diào)節(jié)將所有的測(cè)試組都提供給NTS;將GM6以固體材料的形式提供給NTS。測(cè)試組中所有的動(dòng)物都如上文指示給藥。行為測(cè)試。對(duì)GM6在MS小鼠模型中的效力進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)得自i.v.施用載體或GM6(以指示的劑量)的小鼠。行為分析在使用MPTP誘導(dǎo)PD之后，向小鼠施用上文指示劑量的GM6。從第2天開(kāi)始并且每天都對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，以測(cè)定在給予MPTP和GM6之后動(dòng)物的行為。在MPTP施用的當(dāng)天開(kāi)始，向小鼠注射GM6，并持續(xù)5天。在最后一次MPTP注射后的30min開(kāi)始施用GM6,并再持續(xù)另外的4天。如表12和13所示，與對(duì)照動(dòng)物或經(jīng)處理的動(dòng)物相比，使用栽體治療的小鼠在行為評(píng)分(參見(jiàn)自發(fā)活性和旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試圖)方面顯示出明顯的增加。使用GM6的處理顯示出在行為方面明顯的改善(減輕)。5、10和20mg/kg的GM6顯示出是明顯有利的，而lmg/kg則沒(méi)有顯示出任何改善。自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性100<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>脈內(nèi)施用推注劑量為1、5、10和20mg/kg的GM6證明PD行為、生物化學(xué)和組織學(xué)以劑量依賴(lài)方式降低。這表明，GM6通過(guò)靜脈內(nèi)施用能夠有效地限定PD在小鼠中的程度，并且有利于治療這些疾病。當(dāng)通過(guò)靜脈內(nèi)進(jìn)行施用時(shí)，發(fā)現(xiàn)GM6在PD小鼠模型中是有效的。GM6的效力是劑量依賴(lài)方式的，并且表明GM6有利于PD。實(shí)施例5B在帕金森氏疾病的細(xì)胞培養(yǎng)物模型中測(cè)試MNTF行對(duì)MNTF在帕金森氏疾病(PD)的細(xì)胞培養(yǎng)物模型中的效力進(jìn)行測(cè)試。為了測(cè)定MNTF在PD細(xì)胞培養(yǎng)物模型中的效力，使SH-SY5Y細(xì)胞在豬毛菜酚(IOO]LiM)中暴露24小時(shí)。將細(xì)胞用不同濃度的MNTF處理，以及未經(jīng)MNTF處理，然后針對(duì)細(xì)胞的生存能力進(jìn)行測(cè)試。在暴露24小時(shí)之后，豬毛菜酚誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞死亡。將MNTF加入到所述的培養(yǎng)物中顯示了以劑量依賴(lài)方式保護(hù)對(duì)豬毛菜酚的暴露。此外，使用渥曼青霉素(PI3K)進(jìn)行處理破壞了MNTF的作用。這些數(shù)椐表明，MNTF在施用豬毛菜酚之后的PD細(xì)胞培養(yǎng)物模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且可以通過(guò)PI3K途徑起作用。用于本實(shí)施例的縮寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)。"MNTF"是指運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子。"PD"是帕金森氏疾病。"GB，，分另寸是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"CV"是指細(xì)胞生存能力。"GM，，是指MNTF。"WRT"是指渥曼青霉素。"Sal"是指豬毛菜酚。大量的研究證明了MNTF在大鼠的各種神經(jīng)系統(tǒng)中的效力，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)包括外周坐骨神經(jīng)、外周肌皮神經(jīng)、頭部和面部神經(jīng)、頭部舌下神經(jīng)以及控制頸部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓(Wangetal.，1995)。此外，在具有雙隱性基因的wobbler小鼠(NIH)達(dá)到16周齡時(shí)給予其一劑量的35ng的MNTF，會(huì)終止上述品系小鼠的神經(jīng)退行性遺傳疾病。獨(dú)立研究組使用其自己建立的檢測(cè)和方案來(lái)實(shí)施以下CNS和PNS實(shí)驗(yàn)l.在GM6血腦屏障滲透的研究中，靜脈內(nèi)施用單次推注劑量為0.2和2mg/kg的GM6證明了在4小時(shí)后，腦中GM6的水平以劑量依賴(lài)方式增大。2.在中腦動(dòng)脈阻塞(M0AC)小鼠中風(fēng)模型中，在IV注射GM6處理后，會(huì)減小腦中梗塞體積，并以劑量依賴(lài)方式減少神經(jīng)缺損。與栽體相比，高劑量的GM6會(huì)將腦中梗塞體積減小74%,并顯著減小神經(jīng)缺損(p<0.0001)。3.L-2-羥基戊二酸(LGA)誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。在斑馬魚(yú)生物分析中，GM6保護(hù)了CNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將中腦中的細(xì)胞凋亡減少85%。4.在具有8mm間隙的大鼠坐骨神經(jīng)橫切研究中，GM6處理的動(dòng)物會(huì)以劑量依賴(lài)方式顯著地改善運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的再生(在最佳劑量下P<0.0002)，并促進(jìn)DRG神經(jīng)元的再生。5.在橫切的股神經(jīng)大鼠模型中，在GM6處理的動(dòng)物中，正確投射到肌肉中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量呈現(xiàn)劑量應(yīng)答的方式。在最佳劑量下，正確投射到肌肉中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量是不正確地投射到皮膚中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量的3倍(p〈0.0001)。6.在斑馬魚(yú)生物分析中，GM6保護(hù)了PNS中由LGA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并將外周肌神經(jīng)接合點(diǎn)的細(xì)胞凋亡減少49%。7.得自患有CNS紊亂的患者的腦脊液(CSF)含有可溶性因子，這些因子誘導(dǎo)了神經(jīng)突損壞和神經(jīng)元死亡。GM6顯著地增強(qiáng)了患者CSF中細(xì)胞的存活亨廷頓氏疾病(271%)、MS(246%)、中風(fēng)(205°/。)、帕金森氏疾病(198W、阿茲海默氏疾病(191%)和ALS(175%)。這些數(shù)據(jù)表明，MNTF能夠保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)抗由神經(jīng)紊亂患者的CSF所刺激的細(xì)胞死亡，我們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈地證實(shí)了這一點(diǎn)。GMP級(jí)別的GM6(在本報(bào)道中也稱(chēng)為MNTF)在帕金森氏疾病的細(xì)胞培養(yǎng)物模型中的效力(Shavalietal.，2003)。進(jìn)行所述的研究以測(cè)試MNTF保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免受損害的能力。MNTF以固體的形式提供，并制備制劑(儲(chǔ)存在4。C下的溶液)。方法和材料<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>結(jié)束細(xì)胞數(shù)量將所有的測(cè)試組都提供給NTS;將MNTF以固體形式提供給NTS。測(cè)試組中所有的培養(yǎng)物都如上文指示給藥。豬毛菜酚和渥曼青霉素得自Sig歸。GM6-示例性MNTF(FSRYAR,SEQIDNO:2)。結(jié)果PD的細(xì)胞培養(yǎng)物模型。PD研究。當(dāng)將SH-SY5Y細(xì)胞與GM6±豬毛菜酚(Sal)—起培養(yǎng)時(shí)，對(duì)該細(xì)胞生存能力的相對(duì)變化進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)得自使用載體或MNTF(GM6)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞的生存能力。將細(xì)胞培養(yǎng)物在各種濃度的GM6(0.1至10mg/ml)±豬毛菜酚(IOOnM)、以及渥曼青霉素(WRT，10uM)中溫育，并測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，與對(duì)照處理細(xì)胞相比，GM6顯示出使細(xì)胞數(shù)量以劑量依賴(lài)方式增多。與對(duì)照處理細(xì)胞相比，10mg/ml使細(xì)胞數(shù)量增多19.2%。使用1OmM的渥曼青霉素處理細(xì)胞抑制細(xì)胞數(shù)量的增多，表明GM6針對(duì)PI3K的作用。使用lOOiaM的豬毛菜酚處理所述的細(xì)胞，證明多巴胺能SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞生存能力降低。在使用豬毛菜酚處理24小時(shí)后，細(xì)胞的數(shù)量減少63.7%。向所述的細(xì)胞中加入GM6抑制由Sal誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并顯著地增加細(xì)胞的存活，這可由MTT分析來(lái)評(píng)估。濃度為lOOiaM的SAL將細(xì)胞的生存能力降至36.5%,并且將濃度為IOOmM的SAL與濃度為0.1，1.0和10.0mg/ml的GM6進(jìn)行共同處理，分別使細(xì)胞的生存能力增大至66%、85%和95%(參見(jiàn)圖17)。WRT(10yM)阻斷了GM6的神經(jīng)保護(hù)作用(參見(jiàn)圖17)。表16.GM6和豬毛菜酚處理后細(xì)胞生存能力變化的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>*組7-10中細(xì)胞數(shù)量變化的百分比與豬毛菜酚處理的細(xì)胞(組6)相比較。**組2-5中細(xì)胞數(shù)量變化的百分比與載體處理的細(xì)胞(組1)相比較。加入100juM的豬毛菜酚(Sal)，加入IOmM的渥曼青霉素(WRT)。MNTF(GM)為這樣的營(yíng)養(yǎng)因子，其能夠提供保護(hù)從而免于神經(jīng)疾病，并且使神經(jīng)元組織在損傷或移植后再生。在此所進(jìn)行的研究證明了MNTF以有效且高效的方式保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元(SH-SY5Y細(xì)胞)免于受到PD(豬毛菜酚)有害作用的能力。24小時(shí)施用劑量為0.1、l和10mg/ml的MNTF證明了通過(guò)增加細(xì)胞數(shù)量而在SH-SY5Y細(xì)胞中以劑量依賴(lài)方式對(duì)由豬毛菜酚所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的保護(hù)作用。這些研究表明，MNTF在PD中具有有利的作用。當(dāng)進(jìn)行施用時(shí)，發(fā)現(xiàn)MNTF(GM6)具有對(duì)抗細(xì)胞死亡(豬毛菜酚誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡)的PD細(xì)胞培養(yǎng)物模型的保護(hù)作用。實(shí)施例6測(cè)試MNTF對(duì)抗CSF損傷的保護(hù)作用針對(duì)GM6在神經(jīng)元損傷模型中的效力進(jìn)行測(cè)試。在原代神經(jīng)元細(xì)胞中，對(duì)得自對(duì)照組以及8個(gè)神經(jīng)紊亂組的每一個(gè)組中的5個(gè)疾病特異性人患者腦脊液(CSF)樣品進(jìn)行測(cè)試，從而測(cè)定對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的作用。此外，針對(duì)對(duì)抗由CSF誘導(dǎo)的損傷的保護(hù)作用，對(duì)GM6的作用進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)將CSF以10%溶液的形式應(yīng)用時(shí)，得自8個(gè)不同神經(jīng)疾病的疾病特異性人的CSF誘導(dǎo)了神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。GM6提供了保護(hù)從而免于受到該損傷。這些研究表明得自患有神經(jīng)紊亂的人的CSF包含誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的某些因子，并且GM6能夠保護(hù)對(duì)抗這些作用。這些研究進(jìn)一步表明GM6在神經(jīng)疾病模型中的效力。用于本實(shí)施例的縮寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)。"MNTF"是指運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子。"GM6，'和"6聚體"均是指MNTF的示例性6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物FSRYAR(SEQIDNO:2)。"CSF"是指腦脊液。"Genervon，，和"GB，，分另'J是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"NCC"是指神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物。測(cè)試MNTF在對(duì)抗CSF損傷中的保護(hù)作用使用死后CSF樣品(得自9個(gè)研究組的每一個(gè)組中的5個(gè)疾病特異性患者/供體)以及由UCLAH畫(huà)nBrainandSpinalFluidResourceCenter(LosAngeles,CA)提供的鑒定、臨床診斷和神經(jīng)病理學(xué)診斷文件，進(jìn)行研究以評(píng)估MNTF肽在CSF損傷的保護(hù)中的能力。在原代神經(jīng)元細(xì)胞中測(cè)試CSF樣品，從而測(cè)定對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的作用。此外，針對(duì)對(duì)抗由CSF誘導(dǎo)的損傷的保護(hù)作用來(lái)檢測(cè)MNTF6聚體/GM6的作用。GM6在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成(CSBioCo.，MenloPark，CA,GMP013,lotC811)。在NeurologicalTestingService,Inc(NTS,Charleston,SC)的合同下進(jìn)行上述研究。將GM6以固體形式提供給NTS，并且制劑(儲(chǔ)存在4。C下的溶液)由NTS來(lái)制備。方法和材料研究的設(shè)計(jì)SpragueDawley大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞由18天大的胚胎胎兒(embryonicfetuses)中分離得到，并在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)12天。將得自對(duì)照和各種神經(jīng)紊亂供體的死后CSF應(yīng)用到培養(yǎng)物中，并檢測(cè)神經(jīng)元生存能力。此外，將MNTF加入到所述的培養(yǎng)物中，以保護(hù)所述的細(xì)胞免于受到損傷。體外方法由18天大的Sprague-Dawley大鼠胎兒制備神經(jīng)元培養(yǎng)物。將大鼠胎兒中腦切開(kāi)，并在由21!^/1111胰島素溶于不含0&2+-和1^2+-的Hank平衡鹽溶液(HBSS)中形成的溶液中溫育15分鐘，其中所述的Hank平衡鹽溶液(HBSS)使用了lOmM的HEPES(GIBCOLifeTechnologies,Paisley,Scotland)進(jìn)行緩沖。然后，將所述的組織在大豆胰島素抑制劑(lmg/mL，溶于HBSS)中暴露2分鐘，并在HBSS中漂洗3次。通過(guò)研碎使細(xì)胞分離，然后將這些細(xì)胞分配到96孔或24孔聚-L-賴(lài)氨酸涂敷的塑料培養(yǎng)板(Costar，Cambridge,MA)中。最初的涂布密度為大約160-180個(gè)細(xì)胞/mm2。在涂布時(shí)，每個(gè)孔中都包含0.2ml的DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCOLifeTechnologies,NY)，其中所述的培養(yǎng)基補(bǔ)充有100ml/L的胎牛血清(SigmaChemicals,St.Louis,M0)。在24小時(shí)之后，用0.15ml的2%v/vB-27神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基替代DMEM/F12培養(yǎng)基，其中所述的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有2mM的GlutaMAX和0.5%w/vD-(+)葡萄糖(GIBC0LifeTechnologies)。每周2次，使用相同組成的新配制培養(yǎng)基取代其中2/3的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在培養(yǎng)12天之后，將培養(yǎng)物用于神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)。在研究之前、在研究過(guò)程中以及當(dāng)將原始數(shù)據(jù)提供給贊助人時(shí)，NTS的研究人員并不清楚所述的材料。UCLAHumanBrainandSpinalFluidResourceCenter(LosAngeles，CA)提供了死后CSF樣品(其得自9個(gè)研究組的每一個(gè)研究組中5個(gè)供體)，以及鑒定、臨床診斷和神經(jīng)病理學(xué)診斷文件。在運(yùn)輸之前，將樣品儲(chǔ)存在-170°C，并使用干冰來(lái)運(yùn)送。所述的研究組為對(duì)照(無(wú)神經(jīng)紊亂)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、神經(jīng)病(NP)、多發(fā)性硬1<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>化(MS)、阿茲海默氏疾病(AD)、Batten疾病(BD)、亨廷頓氏疾病(HD)、帕金森氏疾病(PD)以及腦缺血(中風(fēng))。為了測(cè)試CSF對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞存活的作用，將CSF加入到處于含有10°/。CSF的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物中。將CSF加入到所述的培養(yǎng)物中，并在48小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。取得培養(yǎng)物的圖像，然后使該培養(yǎng)物經(jīng)歷MTT分析(參見(jiàn)下文)，從而測(cè)定細(xì)胞死亡％。將額外的培養(yǎng)物與MNTF(IOOnM)溫育，其中所述的MNTF是在加入CSF之前2小時(shí)加入到培養(yǎng)物中的。MTT分析。按照上文所述測(cè)定原代神經(jīng)元的生存能力。用使用栽體刺激的細(xì)胞所得到的值作為100%，以一式三份測(cè)定存活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。通過(guò)MTT分析，在處理的第2天對(duì)細(xì)胞的存活進(jìn)行估測(cè)。將MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑)在Hank平衡鹽溶液(Biochrom)中稀釋至200mM，并在37。C下將其在2個(gè)小時(shí)內(nèi)加入到培養(yǎng)物中。通過(guò)加入二甲亞砜由所述的細(xì)胞中釋放出MTT曱臢產(chǎn)物，并在570nm處在introspectIII分光光度計(jì)(Pharmacia)中測(cè)定上述產(chǎn)物。然后測(cè)定與未經(jīng)處理的對(duì)照相對(duì)比的相對(duì)存活情況。統(tǒng)計(jì)分析。所得的結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來(lái)表示。使用t檢驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。處理組。神經(jīng)元損傷模型<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>MTT分析為了測(cè)定在大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中由CSF誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的百分比，釆用MTT分析來(lái)分析培養(yǎng)物。如圖18所示，與對(duì)照樣品相比，得自對(duì)照患者的CSF沒(méi)有誘導(dǎo)出任何合適的細(xì)胞死亡。但是，得自各種神經(jīng)紊亂的CSF則誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞損傷(參見(jiàn)表17和圖18)。如所述的圖和表所示，MS誘導(dǎo)了最多的細(xì)胞損失(70%)，而NP則誘導(dǎo)了最少量的細(xì)胞死亡(32W。這些數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)紊亂刺激或?qū)е铝四軌蛘T導(dǎo)或加劇神經(jīng)元細(xì)胞損失的化合物的釋放。表17.由CSF誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損失CSF劑量細(xì)胞存活的y。(平均值土sD)p值(降低的y。)對(duì)照10%92.00±9.1810(0)ALS10%41.33±13.76<0.0001(55)NP10%62.73±13.42<0.0001(32)MS10%27.40±7.149<0.0001(70)AD10%37.53±12.45<0.0001(59)BD10%57.00±8.443<0.0001(38)HD10%29.40±10.35<0.0001(68)PD10%39.67±11.45<0.0001(57)中風(fēng)10%39.07±11.13<0.0001(57.5)MNTF對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中的CSF的作用。在神經(jīng)元細(xì)胞損傷的體外模型中，評(píng)估MNTF對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡中的CSF的作用。在加入CSF之前2小時(shí)，將MNTF以100nM的量加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中。將CSF以占總體積10。/。加入到原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中。針對(duì)細(xì)胞死亡，通過(guò)顯微鏡分析和MTT分析對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。顯微鏡分析將神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物用100nM的MNTF處理2小時(shí)，然后加入得自對(duì)照或各種神經(jīng)紊亂的10%的CSF,持續(xù)48小時(shí)，再對(duì)細(xì)胞損失進(jìn)行評(píng)估。在細(xì)胞經(jīng)歷CSF前處理的條件下，MNTF對(duì)細(xì)胞存活具有明顯的作用。112MTT分析為了測(cè)定在經(jīng)CSF處理的大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中由MNTF誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)的百分比，采用MTT分析來(lái)分析培養(yǎng)物。如圖2所示，在由得自對(duì)照神經(jīng)紊亂患者的CSF所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中，MNTF對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物提供了一定水平的保護(hù)作用(參見(jiàn)表18和圖19)。如圖19和表18所示，MNTF增強(qiáng)細(xì)胞存活，在HD的CSF中最多(271%),在MS(246W、Stroke(205W、Parkinson(198%)、Alzheimer(191%)和ALS(175。/。)的CSF中顯著，而MNTF在BD的CSF中增強(qiáng)細(xì)胞存活最少(114%)。這些數(shù)據(jù)表明，MNTF能夠保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)抗由神經(jīng)紊亂患者的CSF所刺激的細(xì)胞死亡。表18.由MNTF引起的神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)作用<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>MNTF為這樣的營(yíng)養(yǎng)因子，其能夠提供保護(hù)從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在損傷或移植后再生。在此所進(jìn)行的研究證明了害作用的能力。在多數(shù)情況下，體外應(yīng)用100nM的GM6證明了對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。這表明，GM6具有對(duì)抗多種神經(jīng)紊亂的保護(hù)作用。當(dāng)在體外施用至神經(jīng)元細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)GM6具有對(duì)抗得自神經(jīng)疾病的CSF的保護(hù)作用。實(shí)施例7MS模型在小鼠多發(fā)性硬化(MS)模型中測(cè)試GM6(CSBioCo.，MenloPark,CA)的效力。為了測(cè)定GM6在MS中的效力，向小鼠注射髓鞘蛋白脂蛋白(PLP)以誘導(dǎo)MS,然后靜脈內(nèi)注射若干劑量的GM6以測(cè)定對(duì)減輕MS的影響。對(duì)靜脈內(nèi)(i.v.)施用的7個(gè)劑量(每天一次)的GM6(1，5，10或20mg/kg)進(jìn)行測(cè)試。在這些小鼠中，施用GM6證明了呈劑量依賴(lài)方式的減輕MS，并且其中20mg/kg的劑量顯示出最大的效力。臨床和組織學(xué)分析都證明了減輕，表明了GM6在MS中的獨(dú)特作用。這些數(shù)據(jù)表明，在i.v.注射后的MS小鼠模型中，GM6是有效的，并且可以是MS患者的有效治療方法。用于本實(shí)施例的縮寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)。"MNTF"是指運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子。"GM6"和"6聚體"均是指MNTF的示例性6個(gè)氨基酸的肽類(lèi)似物。"MS"是指多發(fā)性硬化。"EAE"是指實(shí)驗(yàn)性自體免疫腦脊髓炎。"PLP"是指髓鞘蛋白脂蛋白。"Genervon，，和"GB，，分另'J是指GenervonBiopharmaceuticals，LLC。"I.V."是指靜脈內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)將對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)的6氨基酸類(lèi)似物(GM6)的能力進(jìn)行評(píng)估，以測(cè)定GM6在多發(fā)性硬化的小鼠模型中的效力。GB測(cè)試制品為合成的6個(gè)氨基酸肽(MNTF)(CSBioCo.，MenloPark,CA)。評(píng)估通過(guò)靜脈內(nèi)注射的GM6在MS小鼠模型中的效力方法和材料研究設(shè)計(jì)。按照上文所述向雌性'SJL/J小鼠注射PLP，并檢測(cè)指示劑量的GM6對(duì)由EAE誘導(dǎo)的MS所產(chǎn)生的保護(hù)作用。針對(duì)臨床表現(xiàn)和組織學(xué)變化對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)性自體免疫腦脊髓炎(EAE)的誘導(dǎo)。在本實(shí)驗(yàn)中，使用雌性S幾/J小鼠(8-10周齡，theJacksonLaboratory)。使用EAE誘導(dǎo)和處理髓鞘蛋白脂蛋白(PLP)(pl39-151，HSLGKWLGHPDKF，SynPepCorporation)用于免疫。在雌性SJL/J小鼠中，通過(guò)皮下注射溶解于弗氏完全佐劑中的25pg的PLP來(lái)誘導(dǎo)EAE(CFA，DifcoLaboratories)。在免疫的當(dāng)天和48h之后，將溶于磷酸緩沖鹽水(PBS)中的200ng的百日咳毒素(PT，ListBiologicallaboratories,Inc)注射到小鼠的尾靜脈中。MNTF的施用。將小鼠隨機(jī)分成以下幾組MNTF處理組(n=10/組)在臨床癥狀發(fā)作(評(píng)分$1)的當(dāng)天開(kāi)始，在連續(xù)7天內(nèi)靜脈內(nèi)施用MNTF,這使得該處理方案具有臨床相關(guān)性。根據(jù)初步研究，MNTF的劑量為1、5、10或20mg/kg。EAE對(duì)照組(n=10):使用與實(shí)驗(yàn)組相同體積的鹽水來(lái)對(duì)EAE小鼠進(jìn)行處理。臨床觀察。針對(duì)EAE的臨床跡象每天觀察小鼠，并且每2天對(duì)小鼠稱(chēng)重。如下確定臨床評(píng)分0,未發(fā)現(xiàn)EAE跡象；1，受到影響的尾強(qiáng)直；2,尾癱瘓；3，后肢中度癱瘓；4，后肢重度癱瘓；5，一支后肢癱瘓；6，后肢完全癱瘓；7，后肢完全癱瘓和前肢輕癱；以及8，死亡。就臨床EAE評(píng)價(jià)而言，使用以下參數(shù)對(duì)每只動(dòng)物而言，發(fā)作當(dāng)天被定義為首次表現(xiàn)出EAE癥狀的那一天。按照以下方法計(jì)算EAE持續(xù)時(shí)間每只動(dòng)物被評(píng)分為疾病的天數(shù)除以評(píng)分的總天數(shù)，并以百分比的形式表示。累積發(fā)病率定義為在實(shí)驗(yàn)期間產(chǎn)生EAE的動(dòng)物的百分比。就每只動(dòng)物而言，在實(shí)驗(yàn)期間的平局評(píng)分計(jì)算為所有單次評(píng)分的115總和除以測(cè)量的次數(shù)。就每只動(dòng)物而言，在實(shí)驗(yàn)期間，最大評(píng)分被定義為最高的臨床評(píng)分。如果在實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程中，小鼠死于EAE，則在所有以后的時(shí)間點(diǎn)都將這些小鼠指定為8分。如果小鼠在清楚地發(fā)作EAE癥狀之前死亡，則將這些小鼠從實(shí)驗(yàn)中排除。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有的動(dòng)物(包括嚴(yán)重EAE影響的動(dòng)物)都自由進(jìn)食和進(jìn)水。組織學(xué)。20天后取出腦和脊髓，并在10。/。的緩沖的福爾馬林(Sigma)中固定。將石蠟包埋切片(6Mm厚)用H&E染色，從而評(píng)估腦和脊髓中的病變數(shù)量。對(duì)這些進(jìn)行評(píng)分和記錄。統(tǒng)計(jì)分析。將結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來(lái)表示。采用t檢驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。所述研究中動(dòng)物的排除?；谝韵氯舾蓸?biāo)準(zhǔn)從研究中排除動(dòng)物在研究結(jié)束前(在任何時(shí)間點(diǎn)上)死亡的動(dòng)物；在施用測(cè)試制品后產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥的動(dòng)物。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM6或者作為對(duì)照。將栽體或MNTF以指示的劑量經(jīng)尾靜脈對(duì)動(dòng)物(50只動(dòng)物)靜脈內(nèi)推注給藥。小鼠MS模型。<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>結(jié)束對(duì)小鼠中MS的調(diào)節(jié)將所有的測(cè)試組都提供給NTS;將GM6以固體材料的形式提供給NTS。測(cè)試組中所有的動(dòng)物都如上指示給藥。結(jié)果臨床評(píng)分。對(duì)GM6在MS小鼠模型中的效力進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)得自i.v.施用栽體或GM6(以所述的劑量)的小鼠。臨床分析GM6:在PLP誘導(dǎo)MS后，對(duì)小鼠施用指示劑量的GM6(參見(jiàn)圖23)。從第0天開(kāi)始每隔一天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次檢測(cè)，以測(cè)定動(dòng)物的臨床評(píng)分。在注射PLP的當(dāng)天開(kāi)始，在7天中，每天都向小鼠注射GM6。如圖23所示，使用載體處理的小鼠顯示臨床評(píng)分明顯增大。使用GM6進(jìn)行治療顯示所述疾病明顯改善(減輕)(參見(jiàn)圖23)。5、10和20mg/kg的GM6顯示是明顯有利的，而lmg/kg的GM6卻沒(méi)有顯示出任何復(fù)原。表20示出了在使用GM6處理后產(chǎn)生急性疾病的小鼠的數(shù)量。如表20所示，10和20mg/kg顯示急性疾病小鼠的總數(shù)減少，但是慢性疾病小鼠的總數(shù)則沒(méi)有減少。表19.與載體處理動(dòng)物相比，GM6施用的顯著性<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表20.具有臨床跡象的小鼠/小鼠的總數(shù)(W—急性疾病<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表21.具有臨床跡象的小鼠/小鼠的總數(shù)(%)—慢性疾病<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>死亡率本研究中沒(méi)有發(fā)生死亡。病變數(shù)量腦和脊髓中的病變數(shù)量通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定，并示于圖24A和24B中。隨著GM6劑量的增加，腦和脊髓中的病變數(shù)量減少。這表明，GM6保護(hù)腦和脊髓免于受到MS誘導(dǎo)的有害作用。表22.區(qū)域劑量病變#P值差異％(mg/kg)平均值±SD腦069.2010.99NANA162.30±9.2020.1454-10545.00±8.367<0.0001-351024.90±6.871<0.0001-642022.40±6.687<0.0001-68脊髓059.90±9.098NAM155.20±8.8170.2560-8536.90±7.385<0.0001-381024.50±6.671<0.0001-592019.90±8.517<0.0001一67MNTF為這樣的營(yíng)養(yǎng)因子，其能夠提供保護(hù)從而免于神經(jīng)疾病，并且可以使神經(jīng)元組織在損傷或移植后再生。在此所進(jìn)行的研究證明了MNTF(GM6)的6氨基酸類(lèi)似物減輕小鼠模型中MS的效力。經(jīng)7天靜脈內(nèi)施用推注劑量為1、5、10或20mg/kg的GM6證明了在MS臨床評(píng)分和組織學(xué)中呈劑量依賴(lài)方式的減小。這表明，通過(guò)靜脈內(nèi)施用，GM6在限定小鼠MS程度方面的有效性，并且可以有利于治療該疾病。當(dāng)進(jìn)行靜脈內(nèi)施用時(shí)，發(fā)現(xiàn)GM6在MS小鼠模型中是有效的。GM6的效力是劑量依賴(lài)方式的，這表明GM6有利于治療MS。實(shí)施例8在中腦動(dòng)脈阻塞的小鼠模型中測(cè)試GM602(MNTF6聚體)。在中腦動(dòng)脈阻塞(MCAO)的小鼠模型中測(cè)試GenervonBiopharmaceuticals，LLC測(cè)試制品GM602的效力。為了測(cè)定GM602在MCAO小鼠模型中的效力，使小鼠經(jīng)歷1小時(shí)的缺血和14天的再灌注。在再灌注開(kāi)始后的0、3、6、12和24小時(shí)，經(jīng)尾靜脈推注向小鼠靜脈內(nèi)注射GM602,并檢測(cè)在腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02，pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)方面的變化。檢測(cè)在缺血后的指定時(shí)間以及在3天中的每一天都靜脈內(nèi)(i.v.)施用GM602(5mg/kg)的神經(jīng)保護(hù)作用。施用GM602證明在CBF、HR、BP、p02、pC02、或pH方面沒(méi)有發(fā)生變化。在ND和IFV中檢測(cè)變化，其是時(shí)間依賴(lài)性的。在0、3、6和12小時(shí)，5mg/kg的GM602顯示出顯著保護(hù)作用免于梗塞損害，這解釋了對(duì)神經(jīng)缺損的保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)表明，在MCAO小鼠模型中，在i.v.注射后GM602對(duì)腦具有神經(jīng)保護(hù)作用?？s寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)縮寫(xiě)/術(shù)語(yǔ)定義證F運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子MNTF6聚體MNTF的6氨基酸肽類(lèi)似物GM602用于中風(fēng)的MNTF的6氨基酸肽類(lèi)似物MCAO中腦動(dòng)脈阻塞GBGenervonBiopharmaceuticalsLLCI.V.靜脈內(nèi)CBF腦血流量HR心率BP血壓ND神經(jīng)缺損IFV梗塞體積對(duì)GB測(cè)試制品GM602(其為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子的6氨基酸肽類(lèi)似物(MNTF6聚體；FSRYAR))保護(hù)腦免于受到急性缺血和再灌注損傷的能力進(jìn)行測(cè)試。GM602在P認(rèn)證下化學(xué)合成(CSBioCo.，MenloParkCA，GMP013，1otC811)。將GM602以固體的形式提供，并由此制備制劑(其為儲(chǔ)存在4'C下的溶液)。方法和材料動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前，使重量為22-25克的C57BL/6小鼠(Jackson119Laboratory,BarHarbor,ME)均自由進(jìn)食和進(jìn)水。使用氟烷來(lái)麻醉動(dòng)物(70%/30%卯2/02中1%的氟烷，通過(guò)面罩麻醉)。通過(guò)尾套裝置監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(MABP)，并收集血液樣品，從而測(cè)定動(dòng)脈pH水平、以及PaC。2和Pa02。使用VisitechSystem血壓監(jiān)測(cè)儀記錄MABP和心率。使用插入到顳肌肌肉中的直腸溫度計(jì)和熱敏探針來(lái)監(jiān)測(cè)腦的溫度。通過(guò)使用帶有水套的加熱墊，將動(dòng)物的體溫保持在37°C。在缺血前的1小時(shí)至缺血后的6小時(shí)監(jiān)測(cè)腦的溫度，并每隔30分鐘記錄一次。實(shí)驗(yàn)組所有的動(dòng)物都經(jīng)歷了1.0h的缺血及24h的再灌注，并將動(dòng)物隨機(jī)分成栽體組(n-10)，或靜脈內(nèi)注射了劑量為5mg/kg的GM602的處理組(n-lO)。NTS通過(guò)使用儲(chǔ)存在4。C下的(100%)鹽水溶液重構(gòu)GM602來(lái)配制GM6(CSBioCo.，MenloPark,CA，CS1507,GMP013，lotC811)作為原液。載體對(duì)照接受鹽水溶液。在再灌注開(kāi)始后的0、3、6、12和24小時(shí)、以及損失后的三天中的每一天(損傷后)都通過(guò)尾進(jìn)行IV推注GM602。研究者對(duì)處理組是盲的。缺血的誘導(dǎo)本研究涉及缺血的瞬時(shí)模型。對(duì)每只小鼠都進(jìn)行麻醉，并分離出頸外動(dòng)脈(ECA)和頸總動(dòng)脈(CCA)。將熱敏探針插入到直腸和顳肌肌肉中，從而監(jiān)測(cè)肌體和腦的溫度，其中通過(guò)外部加熱，將所述的溫度保持在36-37°C。通過(guò)頸部正中切口使左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)暴露出來(lái)。對(duì)甲狀腺上動(dòng)脈和枕動(dòng)脈進(jìn)行電凝集并分開(kāi)。將顯微手術(shù)夾放置在頸外動(dòng)脈(ECA)起源的周?chē)CA的遠(yuǎn)端用6-0絲綁結(jié)，并橫切。將6-0絲松散地系在ECA殘端的周?chē)Ｒ崎_(kāi)所述的手術(shù)夾，并將5-0尼龍縫合線(xiàn)(涂有有機(jī)硅)的經(jīng)燒邊的尖端溫和地插入到ECA殘端中。將環(huán)狀的6-0絲系緊在所述殘端的周?chē)?，并且使尼龍縫合線(xiàn)進(jìn)入并通過(guò)頸外動(dòng)脈(ICA)中大約13mm(根據(jù)體重進(jìn)行調(diào)節(jié))，直至所述的縫合線(xiàn)停留在前大腦動(dòng)脈(ACA)中，由此阻塞了前交通動(dòng)脈和中腦動(dòng)脈。在將尼龍縫合線(xiàn)放置l小時(shí)后，其被拉回到ECA中，并封閉切口。組織學(xué)檢測(cè)關(guān)于組織學(xué)檢測(cè)，在誘導(dǎo)缺血之后的14天，采用腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)來(lái)麻醉動(dòng)物。釆用穿心灌注的方式，使用4。C的10%的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對(duì)腦進(jìn)行灌注。取出所述的腦，并將其在-20。C下冷凍15分鐘，然后再放置到嚙齒動(dòng)物腦矩陣中。制備冠狀切片(lmm厚)，并將其在37。C下用2%的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色。由各腦獲得由梗塞的前緣直至尾部范圍的7個(gè)連續(xù)的lmm厚冠狀切片，其中所述的梗塞距額極2mm開(kāi)始。將經(jīng)TTC染色的切片放置在10%中性的緩沖福爾馬林中，并在黑暗狀態(tài)下，在4'C下保持至少24小時(shí)。使用計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各切片中的梗塞的面積，其中所述的計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)由裝配有QuickCapture圖像采集卡的PowerMacintosh計(jì)算機(jī)、安裝在Olympus顯微鏡上的HitachiCCD照相機(jī)、以及照相機(jī)支架構(gòu)成。使用NIHImageAnalysisSoftware,v.1.55。獲取圖像，并在7個(gè)切片上測(cè)定損害的總面積。由對(duì)治療狀態(tài)為盲的單個(gè)操作者進(jìn)行所有的測(cè)量。通過(guò)對(duì)切片的梗塞體積求和來(lái)計(jì)算梗塞體積。通過(guò)采用以下能夠消除水胂影響的公式來(lái)計(jì)算梗塞的尺寸00:(對(duì)側(cè)體積-同側(cè)未損傷的體積)X100/對(duì)側(cè)體積。腦血流量的測(cè)量通過(guò)使用激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)腦血流量(CBF)。CBF值以百分比的形式測(cè)定，這是因?yàn)橛杉す舛嗥绽昭鲀x顯示的值并非為絕對(duì)值。如上文所述，使用氟烷來(lái)麻醉動(dòng)物(70%/30%^2/02中的1%氟烷，通過(guò)面罩麻醉)。在與MCA阻塞同側(cè)的腦半球中，坐標(biāo)如下點(diǎn)A,前囪點(diǎn)后0.5mm、中線(xiàn)側(cè)部2mm;點(diǎn)B,前囪點(diǎn)后lmm、中線(xiàn)側(cè)部1.2mm;點(diǎn)D，前囪點(diǎn)后lmm、中線(xiàn)側(cè)部1.7mm;點(diǎn)C，在對(duì)側(cè)半球中，前囪點(diǎn)后lmm、距中線(xiàn)2mm。在缺血發(fā)作前測(cè)定CBF,并在灌注結(jié)束后的2小時(shí)持續(xù)測(cè)量。在注射化合物之前和注射之后進(jìn)行測(cè)定(在缺血前15分鐘、至注射結(jié)束后30分鐘內(nèi)進(jìn)行連續(xù)的測(cè)量，并且每30分鐘記錄一次)。將MCA阻塞后且在施用前的平均值作為基線(xiàn)值，此后的數(shù)據(jù)以基線(xiàn)值的百分比表示。行為評(píng)估121后的小鼠中測(cè)定行為分析(神經(jīng)缺損)情況。神經(jīng)學(xué)評(píng)分如下0,正常的運(yùn)動(dòng)功能；1,當(dāng)通過(guò)尾巴將動(dòng)物提起來(lái)時(shí)，軀干和對(duì)側(cè)前肢彎曲；2，當(dāng)通過(guò)尾巴將動(dòng)物按在平面上時(shí)，會(huì)發(fā)生對(duì)側(cè)偏轉(zhuǎn)，但在休息時(shí)保持正常的姿態(tài)；3，在休息時(shí)發(fā)生對(duì)側(cè)傾斜；4，沒(méi)有自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性。所述研究中動(dòng)物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動(dòng)物在研究結(jié)束前(在任何時(shí)間點(diǎn)上)死亡的動(dòng)物。將至死亡時(shí)收集的數(shù)據(jù)提供給GB;在阻塞后腦血流量沒(méi)有降低至基線(xiàn)值的20土5%(即，被認(rèn)為為非缺血)，或者是血流量沒(méi)有恢復(fù)至基線(xiàn)值的90±10%的動(dòng)物；在缺血損傷后發(fā)展出癲癇狀行為的動(dòng)物；在缺血過(guò)程中或缺血后片刻，檢測(cè)到過(guò)量出血的動(dòng)物。統(tǒng)計(jì)分析將結(jié)果表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。采用單因素協(xié)方差分析(A麗A)、再通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)(Fisher'sposthoctest)來(lái)分析生理學(xué)和組織學(xué)數(shù)據(jù)中的差異顯著性。在監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上計(jì)算重復(fù)測(cè)量的AN0VA，再通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)評(píng)價(jià)多組中的差異顯著性。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM602或者作為對(duì)照。以IV給藥方式給予動(dòng)物(30只動(dòng)物)以指示劑量的載體或GM602。小鼠中風(fēng)模型<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>結(jié)束MNTF對(duì)缺血和再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。針對(duì)腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物。將所有的測(cè)試組都提供給NTS;將GM602以固體材料的形式提供給NTS。測(cè)試組中所有的動(dòng)物都如上文指示給藥。結(jié)果小鼠中缺血的研究。對(duì)這些研究中的缺血的相對(duì)嚴(yán)重性進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)得自患有缺血損傷的小鼠，其中所述的小鼠靜脈內(nèi)注射載體或GM602。梗塞體積與載體注射組相比，在GM602組(0、3、6和12小時(shí))中，腦中梗塞體積明顯減小。GM602顯示出在缺血后的0至12小時(shí)使梗塞體積呈劑量依賴(lài)性地減小(參見(jiàn)表l)。梗塞體積示于圖26中。在腦中梗塞體積減小的百分比示于表23中。如表所示，在0、3、6和12小時(shí)的GM602顯示出使梗塞尺寸減小70%、68%、58%和36%。24小時(shí)梗塞體積雖然減小，但是與載體處理動(dòng)物相比沒(méi)有顯示出顯著性差異。表23.腦中梗塞減小的百分比組別劑量(mg/kg)梗塞體積(mm3)梗塞體積減小的百分比*P值,1074.26±12.090NA2522.05±7.29270.3%0.0013524.15±8.11067.5%0.0014531.03±9.25558.2%0.0015547.72±9.11835.7°/。0.0016564.13±12.5113.4。/00.0821減小的百分比與各自栽體對(duì)照動(dòng)物相比。*與組1(栽體)相比。死亡率在本研究中未發(fā)生死亡。生理學(xué)參數(shù)。在缺血期間或者再灌注之后，栽體小鼠和經(jīng)治療的小鼠之間，生理學(xué)參數(shù)(腦血流量、平均動(dòng)脈血壓、血液p02、pC02和pH)不具有顯著性差異，均為基線(xiàn)值(參見(jiàn)圖27-31)。123行為測(cè)定?；?至4的分值，針對(duì)神經(jīng)缺損對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估。使用GM602處理的動(dòng)物顯示出神經(jīng)缺損呈劑量依賴(lài)方式的減小(數(shù)據(jù)同樣示于圖32中)。表24<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>在美國(guó)，中風(fēng)是死亡的第三大常見(jiàn)原因，并且是造成殘疾的主要原因。局灶性腦缺血造成的結(jié)果和所形成的梗塞的尺寸可以通過(guò)"壞死性"(細(xì)胞凋亡)細(xì)胞死亡情況以及通過(guò)在缺血邊緣帶中延遲的神經(jīng)元細(xì)胞損失(程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡)情況來(lái)測(cè)定。近期出現(xiàn)的療法用于治療缺血性中風(fēng)，但是，一旦神經(jīng)元細(xì)胞死亡循環(huán)被引發(fā)，這些治療方法通常涉及溶解血液凝塊，但不會(huì)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、或者減小行為缺損或腦梗塞體積的作用。理解影響細(xì)胞損失的基礎(chǔ)機(jī)制將有助于減小與缺血性損傷有關(guān)的細(xì)胞死亡的藥物的設(shè)計(jì)和應(yīng)用。MNTF為這樣的營(yíng)養(yǎng)因子，其能夠提供保護(hù)從而免于神經(jīng)疾病，并可以在發(fā)生損傷或缺血性中風(fēng)后使神經(jīng)元組織再生。本發(fā)明所進(jìn)行的研究在此證明了GM602(匪TF的6氨基酸類(lèi)似物)能夠以有效且高效的方式保護(hù)腦免于受到由腦缺血和再灌注損傷而造成的有害作用的能力。在缺血損傷后在各時(shí)間靜脈內(nèi)施用5mg/kg的GM602證明了通過(guò)減小梗塞體積和行為性質(zhì)而在腦中產(chǎn)生對(duì)抗缺血/再灌注損傷的、呈時(shí)間依賴(lài)性的保護(hù)作用。這些研究表明，GM602在中風(fēng)中具有有利的作用。當(dāng)靜脈內(nèi)施用時(shí)，發(fā)現(xiàn)GM602在小鼠中具有對(duì)抗缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)施例9在永久性中腦動(dòng)脈阻塞的大鼠模型中測(cè)試GM602(MNTF6聚體)。在永久性中腦動(dòng)脈阻塞(MCA0)的大鼠模型(Kindy，Study#2CStroke)中、測(cè)《GenervonBiopharmaceuticais,LLC觀'J《希寸品GM602的效力。為了測(cè)定GM602在MCAO大鼠模型中的效力，使大鼠經(jīng)歷28天的永久性缺血。在缺血開(kāi)始后的3小時(shí)，經(jīng)尾靜脈向大鼠靜脈內(nèi)推注GM602。針對(duì)在腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)和梗塞體積(IFV)方面的變化對(duì)大鼠進(jìn)行檢測(cè)。雖然施用GM602證明在HR、BP、p02、pC02或pH方面沒(méi)有發(fā)生變化，但是在缺血后3小時(shí)施用GM602證明CBF增大。更重要的是，在施用GM602之后，觀察到ND、IFV、TNF(發(fā)炎的生物標(biāo)志物)和Fluoro-Jade(神經(jīng)元退行性病變的生物標(biāo)志物)以劑量依賴(lài)方式顯著降低。當(dāng)進(jìn)行施用時(shí)，IV注射2.5、IO或20mg/kg的GM602會(huì)顯示出明顯的保護(hù)作用從而免于受到梗塞損害，這解釋了對(duì)神經(jīng)缺損的保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)表明，在MCAO的永久性大鼠模型中，在缺血過(guò)程中IV注射GM602對(duì)腦具有神經(jīng)保護(hù)作用。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)用GM602進(jìn)行處理證明了保護(hù)作用，并且有利于臨床試驗(yàn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，決定在永久性中腦動(dòng)脈阻塞(MCAO)大鼠模型中，對(duì)GB測(cè)試制品GM602(其為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子的6氨基酸肽類(lèi)似物(MNTF6聚體))保護(hù)腦免于受到慢性缺血損傷的能力進(jìn)行測(cè)試。GM602在GMP認(rèn)證下化學(xué)合成(CSBioCo.,MenloPark,CA，lotD294)。方法和材料動(dòng)物在試驗(yàn)前，使重量為225-250克的Sprague-Dawley大鼠(Harlan)均自由進(jìn)食和進(jìn)水。使用氟烷來(lái)麻醉動(dòng)物(70%/30%N02/02中的1%氟烷，通過(guò)面罩麻醉)。收集血液樣品，從而測(cè)定動(dòng)脈pH水平以及PaC02和Pa02。<吏用VisitechSystem血壓監(jiān)觀'M義i己錄MABP和'G率。使用插入到顳肌肌肉中的直腸溫度計(jì)和熱敏探針來(lái)監(jiān)測(cè)腦的溫度。通過(guò)使用帶有水套的加熱墊，將動(dòng)物的體溫保持在37°C。在缺血前的1小時(shí)至缺血后的6小時(shí)監(jiān)測(cè)腦的溫度，并每隔30分鐘記錄一次。實(shí)驗(yàn)組所有的大鼠都經(jīng)歷了永久性缺血。將動(dòng)物隨機(jī)分成載體組(n-10)，或靜脈內(nèi)注射了劑量為2.5、10或20mg/kg的GM602的三個(gè)處理組(n=10)中的任一組中。在缺血發(fā)作后的3小時(shí)經(jīng)尾靜脈給予IV推注。研究者對(duì)處理組是盲的。由NTS配制GM6，其使用儲(chǔ)存在4。C下的標(biāo)準(zhǔn)鹽水溶液重構(gòu)GM6來(lái)作為原液。載體對(duì)照接受鹽水溶液。缺血的誘導(dǎo)本研究涉及缺血的永久性模型。對(duì)每只大鼠都進(jìn)行麻醉，并分離出頸外動(dòng)脈(ECA)和頸總動(dòng)脈(CCA)。將熱敏探針插入到直腸和顳肌肌肉中，從而監(jiān)測(cè)肌體和腦的溫度，其中通過(guò)外部加熱，^f吏大鼠保持在36-37。C。通過(guò)頸部正中切口使左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)暴露出來(lái)。對(duì)甲狀腺上動(dòng)脈和枕動(dòng)脈進(jìn)行電凝集并分開(kāi)。將顯微手術(shù)夾放置在頸外動(dòng)脈源(ECA)的周?chē)CA的遠(yuǎn)端用6-0絲綁結(jié)，并橫切。將6-0絲松散地系在ECA殘端的周?chē)Ｒ崎_(kāi)所述的手術(shù)夾，并將5-0尼龍縫合線(xiàn)(涂有有機(jī)硅)的經(jīng)燒邊的尖端溫和地插入到ECA殘端中。將環(huán)狀的6-0絲系緊在所述殘端的周?chē)?，并且使尼龍縫合線(xiàn)進(jìn)入并通過(guò)頸外動(dòng)脈(ICA)中大約17mm(根據(jù)體重進(jìn)行調(diào)節(jié))，直至所述的縫合線(xiàn)停留在前大腦動(dòng)脈(ACA)中，由此阻塞了前交通動(dòng)脈和中腦動(dòng)脈。在使用手術(shù)126吻合器插入尼龍縫合線(xiàn)后即刻封閉傷口。使所述的縫合線(xiàn)保持放置28天。組織學(xué)檢測(cè)關(guān)于組織學(xué)檢測(cè)，在誘導(dǎo)缺血之后的28天，釆用腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)來(lái)麻醉動(dòng)物。采用穿心灌注的方式，-使用4'C的10。/。的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、然后4y。的多聚曱醛(4。C)對(duì)腦進(jìn)行灌注。取出腦，將其在4%的多聚甲醛中過(guò)夜固定，然后再在4匸下30%的蔗糖中固定24小時(shí)。將所述的組織包埋到OCT培養(yǎng)基中，并在干冰上冷凍(儲(chǔ)存在-8(TC)。這些組織用于組織和免疫細(xì)胞化學(xué)分析。在缺血發(fā)作后28天收集腦，將其冷凍，然后切成16mhi的切片。使用蘇木精和曙紅對(duì)冠狀切片進(jìn)行染色，從而清晰地描繪出缺血損傷的程度。通過(guò)對(duì)在16-Mm染色的冠狀切片(由各腦的前自點(diǎn)點(diǎn)+2.46、+1.66、+0.86、+0.06、0.74、1.54、2.34和3.14mm收集得到)上的損傷面積進(jìn)行積分，來(lái)計(jì)算梗塞體積。使用計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析系統(tǒng)(NIHIMAGE,Version1.6)，對(duì)腦皮層、紋狀體(striatal)和海馬3止梗塞總體積進(jìn)行定量。由對(duì)治療狀態(tài)為盲的單個(gè)操作者進(jìn)行所有的測(cè)量。通過(guò)對(duì)切片中梗塞體積求和來(lái)計(jì)算梗塞體積。通過(guò)采用以下能夠消除水腫影響的公式來(lái)計(jì)算梗塞的尺寸(％):(對(duì)側(cè)體積-同側(cè)未損傷的體積)X100/對(duì)側(cè)體積。腦血流量的測(cè)量通過(guò)使用激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)腦血流量(CBF)。CBF值以百分比的形式測(cè)定，這是因?yàn)橛杉す舛嗥绽昭鲀x顯示的值并非為絕對(duì)值。如上文所述，使用氟烷來(lái)麻醉動(dòng)物(70%/30%N02/02中的1%氟烷，通過(guò)面罩麻醉)。在與MCA阻塞同側(cè)的腦半球中，坐標(biāo)如下點(diǎn)A,前囪點(diǎn)后0.5mm、中線(xiàn)側(cè)部2mm;點(diǎn)B，前囪點(diǎn)后lmm、中線(xiàn)側(cè)部1.2mm;點(diǎn)D,前囪點(diǎn)后lmm、中線(xiàn)側(cè)部1.7mm;點(diǎn)C，在對(duì)側(cè)半球中，前自點(diǎn)后lmm、距中線(xiàn)2mm。在缺血發(fā)作前、在誘導(dǎo)缺血后3小時(shí)但在施用測(cè)試制品之前、以及在施用測(cè)試制品之后1小時(shí)，測(cè)定CBF。將MCA阻塞前的平均值作為基線(xiàn)值，此后的數(shù)據(jù)以基線(xiàn)值的百分比表示。行為評(píng)估在缺血損傷之前，每天都對(duì)動(dòng)物處理10min,持續(xù)3天。在損傷之前的當(dāng)天，針對(duì)行為變化對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。所有的行為測(cè)試都是在中風(fēng)手術(shù)片刻之前、以及在施用測(cè)試制品之后的28天進(jìn)行。在測(cè)試開(kāi)始之前，在各階段都使動(dòng)物在測(cè)試房間里適應(yīng)30min。前肢放置測(cè)試一一針對(duì)各個(gè)前肢得到單獨(dú)的評(píng)分。就視覺(jué)放置的子測(cè)試而言，測(cè)試者將動(dòng)物垂直把握，并使其接近桌面。正常放置在桌子上的一肢得O分；延遲放置(<2s)的得l分；而沒(méi)有放置或非常延遲放置(>2s)的得2分。首先，當(dāng)將所述的動(dòng)物向桌子的前方拉拽、接著將所述的動(dòng)物向桌子的一側(cè)拉拽時(shí)，從而得到單獨(dú)的評(píng)分(每一肢的最大評(píng)分，4;分?jǐn)?shù)越高表示缺陷越重)。就觸覺(jué)放置的子測(cè)試而言，把握住動(dòng)物，使其不能看見(jiàn)或者用其胡須接觸到桌面上。當(dāng)將所述的動(dòng)物向桌子的前方拉拽、接著向桌子的一側(cè)拉拽時(shí)，都使前爪輕輕地接觸桌面。按照上文的標(biāo)準(zhǔn)(每一肢的最大評(píng)分，4)，對(duì)每一次放置評(píng)分。就本體放置的子測(cè)試而言，僅將動(dòng)物向前方拉拽，并向前爪施加更大的壓力；按照上文對(duì)放置評(píng)分(每一肢的最大評(píng)分，2)。將這些子評(píng)分加起來(lái)，從而得到每一肢前肢放置的總評(píng)分(范圍為O-IO)。后肢放置測(cè)試——按照與上述前肢相同的方式實(shí)施后肢放置測(cè)試，但是僅包括觸覺(jué)和本體的子測(cè)試(最大評(píng)分分別為4和2;總分范圍為0-6)。改進(jìn)的平衡木測(cè)試——改進(jìn)的平衡木測(cè)試檢測(cè)了前庭運(yùn)動(dòng)反射(vestibulomoterreflex)活性，其為使動(dòng)物在狹窄的平衡木(30x1.3cm)上保持60秒鐘。在平衡木上的平衡能力按照如下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分動(dòng)物以所有四只爪子都保持在平衡木的頂部的方式達(dá)到平衡，1;動(dòng)物將爪子放置在平衡木的一側(cè)或者在平衡木上晃動(dòng)，2;有一肢或兩肢從平衡木上滑落，3;有三肢從平衡木上滑落，4;動(dòng)物試圖用爪子在平衡木上保持平衡，但是跌落，5;動(dòng)物伸出了平衡木，然后跌落，1286;動(dòng)物未嘗試平衡而由平衡木上跌落，7。在手術(shù)前，動(dòng)物接受了三個(gè)訓(xùn)練試驗(yàn)；將這些分值中最后的評(píng)分作為基線(xiàn)評(píng)分。自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性一一在手術(shù)前的當(dāng)天、以及手術(shù)后的一周時(shí)，將動(dòng)物放置在狹窄的玻璃筒(16.5X25cm)中，并錄像10min。對(duì)動(dòng)物的自發(fā)運(yùn)動(dòng)評(píng)分。如下評(píng)分0，沒(méi)有運(yùn)動(dòng)；1,幾乎沒(méi)有或者沒(méi)有進(jìn)行探測(cè)(有限的運(yùn)動(dòng))；2，一定程度的探測(cè)(有限程度的運(yùn)動(dòng))；3，自由運(yùn)動(dòng)(對(duì)照，進(jìn)行正常的探測(cè))。生物標(biāo)志物分析將16mai厚的冠狀切片固定在顯微載玻片上，并干燥。將所述的栽玻片在包含溶于80%乙醇的1%氫氧化鈉(將20mL5%的NaOH加入到80mL的無(wú)水乙醇中)的溶液中浸漬5分鐘。然后，在70%的乙醇中浸漬2分鐘，再在蒸餾水中浸漬2分鐘。將所述的載玻片轉(zhuǎn)移到0.06%的高錳酸鉀溶液中，持續(xù)IO分鐘。然后，將所述的栽玻片在蒸餾水中沖洗2分鐘。由0.01%的原液制備成染色液，以用于Fluoro-JadeB。在所述的栽玻片于染色液中保持20分鐘之后，將其在3次蒸餾水洗滌，每次沖洗1分鐘。通過(guò)簡(jiǎn)單地將載玻片垂直在紙巾上(15秒)排水來(lái)除去過(guò)量的水。然后將所述的載玻片放置在被設(shè)定在大約50。C的切片加熱器上，直到完全干燥(例如5-10分鐘)。通過(guò)在二曱苯中浸漬至少1分鐘來(lái)清潔千燥的栽玻片，然后用DPX(Fluka，MilwaukeeWI，orSigmaChem.Co.,St.Louis,M0)(其為非水性非焚光的塑料周定介質(zhì))蓋片。就細(xì)胞因子(TNF)分析而言，將組織切片在pH7.4的Tris緩沖鹽水(TBS)中洗滌，并在合適的血清(山羊)中封閉。將切片在4。C下封閉過(guò)夜，然后在4。C下經(jīng)歷第一抗體過(guò)夜。將切片在TBS中洗滌，然后加入笫二抗體，并在室溫下溫育1小時(shí)。在洗滌后，將切片按照說(shuō)明書(shū)在VectorABCElite試劑盒中溫育，然后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。在水中終止反應(yīng)，并在經(jīng)歷二甲苯處理后蓋片。所述研究中動(dòng)物的排除基于以下若干標(biāo)準(zhǔn)從研究中排除動(dòng)物在研究結(jié)束前(在任何時(shí)間點(diǎn)上)死亡的動(dòng)物。將至死亡時(shí)收集的數(shù)據(jù)提供給GB;在阻塞后腦血流量沒(méi)有降低至基線(xiàn)值的20±5%(即，被認(rèn)為為非缺血情況)的動(dòng)物；在缺血損傷后產(chǎn)生癩癇狀行為的動(dòng)物；在缺血過(guò)程中或缺血后片刻，檢測(cè)到過(guò)量出血的動(dòng)物。處理組。所有的組都經(jīng)歷GM602或者作為對(duì)照。在誘導(dǎo)缺血后的3小時(shí)，動(dòng)物接受IV給藥的載體或GM602。大鼠中風(fēng)模型組別化合物劑量(mg/kg)途徑1(n=10只大鼠)載體0IV2(n=10只大鼠)GM6022.5mg/kgIV3(n=10只大鼠)GM602lOmg/kgIV4(n=10只大鼠)GM60220mg/kgIV結(jié)束GM602對(duì)缺血和再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。針對(duì)腦血流量(CBF)、心率(HR)、血壓(BP)、p02、pC02、pH、神經(jīng)缺損(ND)、梗塞體積(IFV)、發(fā)炎生物標(biāo)志物和神經(jīng)元退行性生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物。將所有的測(cè)試組都提供給NTS;將GM602以固體材料的形式提供給NTS。測(cè)試組中所有的動(dòng)物都如上文指示給藥。統(tǒng)計(jì)分析將結(jié)果表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。采用單因素協(xié)方差分析(ANOVA)、再通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)來(lái)分析生理學(xué)和組織學(xué)數(shù)據(jù)中的差異顯著性。在監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上計(jì)算重復(fù)測(cè)量的ANOVA，再通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)評(píng)價(jià)多組中的差異顯著性。結(jié)果大鼠中缺血的研究。對(duì)這些研究中缺血的相對(duì)嚴(yán)重性進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)得自患有缺血損傷的大鼠，其中所述的大鼠靜脈內(nèi)注射栽體或GM602。梗塞體積所有研究組中梗塞體積繪制于圖33中。在永久性缺血130后3小時(shí)，IV施用GM602減小動(dòng)物腦中的梗塞體積。梗塞體積減小的百分比示于表25中。表25.腦中梗塞減小的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>減小的百分比與各種載體對(duì)照動(dòng)物相比。*與組1相比(栽體)。死亡率在本研究中未發(fā)生死亡。生理學(xué)參數(shù)。在缺血期間或者在施用測(cè)試藥物之后，栽體小鼠和治療的小鼠之間，生理學(xué)參數(shù)(平均動(dòng)脈血壓、血液p02、pC02和pH)不具有顯著性差異(參見(jiàn)圖35-38)，均為基線(xiàn)值。但是，在使用GM602處理的組中，觀察到由GM602介導(dǎo)的腦血流量顯著增大(參見(jiàn)圖34)。表26—施用GM602之后CBF增加<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>行為測(cè)試?；诙鄠€(gè)不同的參數(shù)(如下文所指示)，針對(duì)神經(jīng)缺損對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估。使用GM602治療的動(dòng)物顯示出神經(jīng)缺陷呈劑量依賴(lài)方式的減小(數(shù)據(jù)同樣示于圖39中)。表27—施用GM602后的前肢放置測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>表28—施用GM602后的后肢放置測(cè)定化合物(組)測(cè)試評(píng)分與栽體相比的p值l-栽體5.1±0.74NA2-GM602(2.5mg/kg)3.9±1,20P<0.023-GM602(10mg/kg)2.7±0.95P<0.00014-GM602(20mg/kg)2.0±0.82P<0.0001表29—施用GM602后的平衡木測(cè)定化合物(組)測(cè)試評(píng)分與栽體相比的p值l-栽體5.300±1.059NA2-GM602(2.5mg/kg)4.100±0.9944P<0.01773-GM602(10mg/kg)3.200±0.7888P<0.00014-GM602(20mg/kg)2.700±0.4930P<0.0001表30—施用GM602后的自發(fā)活性化合物(組)測(cè)試評(píng)分與栽體相比的p值l-栽體0.2±0.42NA2-GM602(2.5mg/kg)0.9±0.74P<0.023-GM602(10mg/kg)1.6±0.52P<0.00014-GM602(20mg/kg)1.9±0.74P<0.0001生物標(biāo)志物分析。收集組織切片以用于生物標(biāo)志物分析(Fluoro-Jade和TNF)。在GM602施用組中，在第28天，在所述組織部分中所見(jiàn)的TNF染色明顯減少，并且這種減少呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性(參見(jiàn)表31和圖8)。在永久性缺血損傷后，在施用GM602之后的第28天所見(jiàn)的針對(duì)Fluoro-Jade的染色明顯減少(參見(jiàn)表32和圖41)。表31—施用GM602后TNF水平的減少情況化合物(組)TNF水平(對(duì)照的W與栽體相比的p值l-栽體89.07±17.96NA2-GM602(2.5mg/kg)64.24±16.18P<0.0053-GM602(10mg/kg)49.03±12.60P<0.00014-GM602(20nig/kg)32.72±11.15P<0.0001132表32—在施用GM602后Fluoro-jade水平的減少情況化合物(組)Fluoro-jade(細(xì)胞的#)與載體相比的p值1-載體7007±1054NA2-GM602(2.5mg/kg)4899±1248P=0.00073-GM602(10mg/kg)3504±959.4P<0.00014-GM602(20mg/kg)2889±719.6P<0.0001在美國(guó)，中風(fēng)是死亡的第三大常見(jiàn)原因，并且是造成殘疾的主要原因。局灶性腦缺血造成的結(jié)果和所形成的梗塞的尺寸可以通過(guò)"壞死性"(細(xì)胞凋亡)細(xì)胞死亡情況以及通過(guò)在缺血邊緣帶中延遲的神經(jīng)元細(xì)胞損失(程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡)情況來(lái)測(cè)定。近期出現(xiàn)的療法用于治療缺血性中風(fēng)。但是，一旦神經(jīng)元細(xì)胞死亡循環(huán)被引發(fā)，這些治療方法通常涉及溶解血液凝塊，但不會(huì)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、或者減小行為缺損或腦梗塞體積的作用。理解影響細(xì)胞損失的基礎(chǔ)機(jī)制將有助于減小缺血性損傷有關(guān)的細(xì)胞死亡的藥物的設(shè)計(jì)和應(yīng)用。MNTF為這樣的營(yíng)養(yǎng)因子，其能夠提供保護(hù)從而免于神經(jīng)疾病，并可以在發(fā)生損傷或缺血性中風(fēng)后使神經(jīng)元組織再生。本發(fā)明所進(jìn)行的研究在此證明了GM602(MNTF的6氨基酸類(lèi)似物)能夠以有效且高效的方式保護(hù)大鼠的腦免于受到由永久性腦缺血損傷而造成的有害作用的能力。在缺血損傷后3小時(shí)靜脈內(nèi)施用2.5、10或20mg/kg的GM602證明了通過(guò)減小梗塞體積、改善行為性質(zhì)、增加腦血流量、降低炎癥和神經(jīng)元退化而在腦中產(chǎn)生對(duì)抗缺血損傷的、呈劑量依賴(lài)方式的保護(hù)作用。這些研究表明，GM602在永久性中風(fēng)中具有有利的作用。當(dāng)將GM602進(jìn)行靜脈內(nèi)施用時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在大鼠中具有對(duì)抗缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。本文參考或提及的所有專(zhuān)利、出版物、科學(xué)論文、網(wǎng)站以及其他文件和材料指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平，并且每個(gè)此類(lèi)參考的文件和材料在此引入作為參考，其程度與其已單獨(dú)地整體引入作為參考或整體在本文中闡述相同。申請(qǐng)人保留將來(lái)自任何此類(lèi)專(zhuān)利、出版物、科學(xué)論文、網(wǎng)站、可電子獲得的信息、以及其他參考的材料或文件在形體上引入本說(shuō)明書(shū)內(nèi)的權(quán)利。本文描述的具體方法和組合物是優(yōu)選實(shí)施方案的代表，并且是示例性的而不意欲作為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。考慮本說(shuō)明書(shū)后，其他目.的、方面和實(shí)施方案將被本領(lǐng)域技術(shù)人員想到，并且包含在如由權(quán)利要求范圍限定的本發(fā)明的精神內(nèi)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，無(wú)需背離本發(fā)明的范圍和精神，可以進(jìn)行本文公開(kāi)的本發(fā)明的各種替具體公開(kāi)為必需的任何一種或多種元件，或一種或多種限制的情況下進(jìn)行實(shí)踐。因此，例如，在本文的每種情況下，在本發(fā)明的實(shí)施方案或?qū)嵤├校g(shù)語(yǔ)"包含"、"基本上由……組成"和"由……組成"中的任何一個(gè)在說(shuō)明書(shū)中都可以替換為其他2個(gè)術(shù)語(yǔ)中的任一。同樣地，術(shù)語(yǔ)"包含"、"包括"、"含有"等應(yīng)被廣泛而且沒(méi)有限制地序進(jìn)行實(shí)踐，'并且它們不必限制于本文或:利要求_中指出的e步驟順序。同樣如本文和附加權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另有明確說(shuō)明，單數(shù)形式"一種"、"一個(gè)"和"所述"等包括復(fù)數(shù)參考。該專(zhuān)利決不能被解釋為限制于本文具體公開(kāi)的具體實(shí)施例或?qū)嵤┓桨富蚍椒?。該?zhuān)利決不能被解釋為受由專(zhuān)利商標(biāo)局的任何審查者或任何其他官員或雇員進(jìn)行的任何陳述限制，除非此類(lèi)陳述由申請(qǐng)人以回答的書(shū)面形式特別地而沒(méi)有限定或保留明確地采用。已使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)作為描述性而非選擇性的術(shù)語(yǔ)使用，并且在其部分，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到在如要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)的各種修改是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征具體且此類(lèi)修改和變化被視為在如由附加權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明已在本文中得到廣泛和一般地描述。屬于一般公開(kāi)內(nèi)容的更窄的種類(lèi)和亞一般分類(lèi)中的每一種也可形成本發(fā)明的部分。這包括本發(fā)明的一般描述，條件或負(fù)面限制是從種類(lèi)中去除任何主題，不管刪除的材料是否在本文中具體引用。其他實(shí)施方案在下述權(quán)利要求內(nèi)。此外，當(dāng)本發(fā)明的特征或方面按照Markush組進(jìn)行描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明因此也按照Markush組的任何個(gè)別成員或成員亞組進(jìn)行描述。權(quán)利要求1.一種減輕遭受神經(jīng)元紊亂的動(dòng)物中的神經(jīng)元紊亂的方法，該方法包括以足以減輕所述紊亂的量，向所述的動(dòng)物施用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)類(lèi)似物。2.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂選自脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、腦缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化(MS)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變。3.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為脊髓損傷。4.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為神經(jīng)退行性疾病。5.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為腦缺血。6.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為亨廷頓氏疾病。7.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為帕金森氏疾病。8.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為MS。9.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的紊亂為ALS。10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的紊亂為阿茲海默氏疾病。11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的紊亂為糖尿病神經(jīng)病變。12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有選自SEQIDNO:1-142的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有選自SEQIDNO:1-7的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有SEQIDNO:1的6至33連續(xù)殘基的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的多肽具有包含SEQIDNO:4的至少6個(gè)連續(xù)殘基的氨基酸序列。16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多肽的序列包含SEQIDNO:2。17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多肽的序列包含SEQIDNO:3。18.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多肽的序列是SEQIDNO:l-7中的一個(gè)。19.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有選自SEQIDNO:1-142的氨基酸序列的多肽的類(lèi)似物，或該類(lèi)似物的鹽，其中所述的類(lèi)似物表現(xiàn)出MNTF活性。20.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有選自SEQIDNO:1-7的氨基酸序列的多肽的類(lèi)似物，或該類(lèi)似物的鹽，其中所述的類(lèi)似物表現(xiàn)出MNTF活性。21.權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的MNTF類(lèi)似物以非經(jīng)口途徑施用至所述的動(dòng)物。22.權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的MNTF類(lèi)似物以靜脈內(nèi)的方式施用至所述的動(dòng)物。23.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有SEQIDNO:1的6至33連續(xù)殘基的氨基酸序列的多肽或該多肽的鹽的類(lèi)似物。24.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。25.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的動(dòng)物是人。26.—種修復(fù)動(dòng)物中被損害的神經(jīng)通路的方法，該方法包括以足以至少部分修復(fù)所述通路的量，向所述的動(dòng)物施用MNTF類(lèi)似物。27.—種改善具有被損害的神經(jīng)通路的動(dòng)物中的運(yùn)動(dòng)功能的方法，該方法包括以足以改善所述動(dòng)物中的運(yùn)動(dòng)功能的量，向所述的動(dòng)物施用MNTF類(lèi)似物。28.—種再生具有被損害的神經(jīng)通路的動(dòng)物中的神經(jīng)通路的方法，該方法包括以足以再生所述動(dòng)物中的所述通路的量，向所述的動(dòng)物施用MNTF類(lèi)似物。29.—種減輕動(dòng)物中神經(jīng)元缺陷的方法，該方法包括以足以減輕所述所迷神經(jīng)元缺陷的量，向所述的動(dòng)物施用MNTF類(lèi)似物。30.—種包含MNTF類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有選自SEQIDNO:1-142的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。31.權(quán)利要求30所述的組合物，其中多肽具有選自SEQIDN0:l-7的氨基酸序列。32.權(quán)利要求30所述的組合物，其中多肽具有選自SEQIDNO:2-142的氨基酸序列。33.權(quán)利要求30所述的組合物，其中多肽具有選自SEQIDNO:2-7的氨基酸序列。34.—種包含MNTF類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受栽體的藥物組合物，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有SEQIDNO:1的6至32連續(xù)殘基的氨基酸序列的多肽、或該多肽的鹽。35.權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述的多肽具有包含SEQIDNO:4的至少6個(gè)連續(xù)殘基的氨基酸序列。36.權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述多肽的序列包含SEQIDNO:2。37.權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述多肽的序列包含SEQIDNO:3。38.—種包含MNTF類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受栽體的藥物組合物，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有選自SEQIDNO:1-142的氨基酸序列的多肽的類(lèi)似物、或該類(lèi)似物的鹽，其中所述的類(lèi)似物表現(xiàn)出MNTF活性。39.—種包含MNTF類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物，其中所述的MNTF類(lèi)似物是具有SEQIDNO:l的6至32連續(xù)殘基的氨基酸序列的多肽或該多肽的鹽的類(lèi)似物。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)涉及使用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)或其肽類(lèi)似物來(lái)治療神經(jīng)元紊亂的方法。本發(fā)明公開(kāi)進(jìn)一步涉及通過(guò)施用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子(MNTF)或其肽類(lèi)似物來(lái)治療受試者中脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)和腦缺血、亨廷頓氏疾病、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、阿茲海默氏疾病和糖尿病神經(jīng)病變的方法。文檔編號(hào)A01N61/00GK101534648SQ200780041924公開(kāi)日2009年9月16日申請(qǐng)日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日發(fā)明者M(jìn)·S·金迪,P-Y·D·寇申請(qǐng)人:健能萬(wàn)生物制藥公司