專利名稱：一種多肽類物質(zhì)及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥中間體化合物，特別是一種多肽類物質(zhì)(III)的化學結(jié)構(gòu)及其制備方法和用途。
一種多肽類物質(zhì)(III)，其特征是由多種氨基酸聚合組成，其氨基酸的排列序列為YKVVEIK*LGIAPTK**KRRVVE***EKRAVGIGA其中*為氨基酸P(脯氨酸)或氨基酸E(谷氨酸)或氨基酸R(精氨酸)**為氨基酸A(丙氨酸)或氨基酸R(精氨酸)***為氨基酸R(精氨酸)或氨基酸Q(谷氨酰胺)或氨基酸G(甘氨酸)多肽類物質(zhì)(III)的制備方法(一)化學合成法在自然界中每一種多肽或蛋白質(zhì)都是由游離的氨基酸通過多肽鍵的形式聚合而成。在蛋白質(zhì)的翻譯過程中，多肽鏈的延伸總是由氨基端(N-端)向羧基端(C-端)進行。在化學合成開始時，往往是先將羧基端的第一個氨基酸固定到活化的樹脂上，然后經(jīng)過氨基基團的去保護，再將羧基端的第二個氨基酸加入到反應(yīng)器中，二個氨基酸經(jīng)過相互反應(yīng)后即可形成肽鍵。然后依照多肽的氨基酸排列序列依次加入第三個、第四個氨基酸等等，直到最后一個氨基酸結(jié)合到肽鏈上為止。
在多肽類物質(zhì)(III)的化學合成中，每個氨基酸的氨基可以由以下化學基團加以保護①芐酯基(Carbobenzoxyl)②叔-丁基羧基(t-Butyloxycarbonyl)③甲苯磺?；?Tosyl)④9-亞芴基甲酯基(Fmoc9-Fluorenylmethoxycarbonyl)多肽類物質(zhì)(III)的化學合成步驟，具體操作如下1、合成先用氯乙醚將樹脂活化，然后在樹脂中加入第一個氨基酸(氨基已被保護)，從而固定到樹脂上。經(jīng)過二氯甲烷洗滌后，氨基的保護基團可以由六氫吡啶脫保護。與此同時，將第二個氨基酸經(jīng)過活化后，加入到結(jié)合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應(yīng)后即形成肽鍵。然后按照多肽的氨基酸排序，依次加入相應(yīng)的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最后第一個氨基酸結(jié)合到肽鏈上為止。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結(jié)合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(zhì)(III)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取適量的分離液浸泡上述結(jié)合有多肽類物質(zhì)(III)的樹脂，在室溫下攪拌，然后經(jīng)過過濾便可得到多肽類物質(zhì)(III)。游離的多肽類物質(zhì)(III)經(jīng)過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(zhì)(III)溶解在水或適當濃度的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的色譜方法，即可將完整的多肽類物質(zhì)(III)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(zhì)(III)，可以通過質(zhì)譜分析重新核實所合成的多肽類物質(zhì)(III)的氨基酸序列是否正確。(二)基因重組法將多肽類物質(zhì)(III)的基因序列利用化學合成法合成之后，克隆到預先被內(nèi)切酶(BamHI和EcoRI)處理過的PGEX-2載體中。重組的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化到BL21受體菌中，然后在培養(yǎng)基中大量繁殖、誘導。最后將細菌離心收集，再依靠層析柱將多肽類物質(zhì)(III)與GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)的融合蛋白純化出來。
多肽類物質(zhì)(III)可以通過凝血因子蛋白酶從GST融合蛋白上切割下來。最后再濃縮即可制得多肽類物質(zhì)(III)的純品。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結(jié)合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(zhì)(III)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結(jié)合有多肽類物質(zhì)(III)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然后經(jīng)過過濾便可得到多肽類物質(zhì)(III)混合液。游離的多肽類物質(zhì)(III)經(jīng)過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(zhì)(III)溶解在水或10-40％的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(zhì)(III)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(zhì)(III)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度并可通過質(zhì)譜分析重新核實所合成的多肽類物質(zhì)(III)的氨基酸序列是否正確。多肽制備實施例二多肽的氨基酸序列為YKVVEIKPLGIAPTKAKRRVVEQEKRAVGIGA
根據(jù)上述氨基酸的序列參照下列方法制備。1、合成首先將樹脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，并且用量可以變化±5％)，然后將羧基端的第一個氨基酸的氨基用氨基保護基團(芐酯基)保護起來后(用量10-80克/克)，再加入到樹脂中，從而使其固定到樹脂上。經(jīng)過二氯甲烷洗滌后，氨基的保護基團可以用六氫吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脫保護。與此同時，將第二個氨基酸的羧基經(jīng)過HBTU活化和二異丙基乙胺中和后，加入到結(jié)合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應(yīng)后即可形成肽鍵。然后按照多肽類物質(zhì)(III)的氨基酸排序，依次加入相應(yīng)的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸羧基的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最后一個氨基酸結(jié)合到肽鏈上為止。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結(jié)合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(zhì)(III)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結(jié)合有多肽類物質(zhì)(III)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然后經(jīng)過過濾便可得到多肽類物質(zhì)(III)混合液。游離的多肽類物質(zhì)(III)經(jīng)過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(zhì)(III)溶解在水或10-40％的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(zhì)(III)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(zhì)(III)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度并可通過質(zhì)譜分析重新核實所合成的多肽類物質(zhì)(III)的氨基酸序列是否正確。多肽制備實施例三多肽的氨基酸序列為YKVVEIKPLGIAPTKAKRRVVEGEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列按下列方法制備。
1、合成首先將樹脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，并且用量可以變化±5％)，然后將羧基端的第一個氨基酸的氨基用氨基保護基團(叔-丁基羰基)保護起來后(用量10-100克/克)，再加入到樹脂中，從而使其固定到樹脂上。經(jīng)過二氯甲烷洗滌后，氨基的保護基團可以用六氫吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脫保護。與此同時，將第二個氨基酸的羧基經(jīng)過HBTU活化和二異丙基乙胺中和后，加入到結(jié)合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應(yīng)后即可形成肽鍵。然后按照多肽類物質(zhì)(III)的氨基酸排序，依次加入相應(yīng)的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸羧基的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最后一個氨基酸結(jié)合到肽鏈上為止。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結(jié)合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(zhì)(III)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結(jié)合有多肽類物質(zhì)(III)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然后經(jīng)過過濾便可得到多肽類物質(zhì)(III)混合液。游離的多肽類物質(zhì)(III)經(jīng)過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(zhì)(III)溶解在水或10-40％的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(zhì)(III)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(zhì)(III)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度并可通過質(zhì)譜分析重新核實所合成的多肽類物質(zhì)(III)的氨基酸序列是否正確。多肽制備實施例四多肽的氨基酸序列為YKVVEIKPLGIAPTKRKRRVVEREKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列按下列方法制備。
1、合成首先將樹脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，并且用量可以變化±5％)，然后將羧基端的第一個氨基酸的氨基用氨基保護基團(甲苯磺?；?保護起來后(用量20-50克/克)，再加入到樹脂中，從而使其固定到樹脂上。經(jīng)過二氯甲烷洗滌后，氨基的保護基團可以用六氫吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脫保護。與此同時，將第二個氨基酸的羧基經(jīng)過HBTU活化和二異丙基乙胺中和后，加入到結(jié)合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應(yīng)后即可形成肽鍵。然后按照多肽類物質(zhì)(III)的氨基酸排序，依次加入相應(yīng)的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸羧基的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最后一個氨基酸結(jié)合到肽鏈上為止。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結(jié)合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(zhì)(III)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結(jié)合有多肽類物質(zhì)(III)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然后經(jīng)過過濾便可得到多肽類物質(zhì)(III)混合液。游離的多肽類物質(zhì)(III)經(jīng)過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(zhì)(III)溶解在水或10-40％的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(zhì)(III)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(zhì)(III)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度并可通過質(zhì)譜分析重新核實所合成的多肽類物質(zhì)(III)的氨基酸序列是否正確。多肽制備實施例五多肽的氨基酸序列為YKVVEIKPLGIAPTKRKRRVVEQEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列按照“多肽制備實施例一”的方法制備得到。多肽制備實施例六多肽的氨基酸序列為YKVVEIKPLGIAPTKRKRRVVEGEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例一”的方法制備得到。多肽制備實施例七多肽的氨基酸序列為YKVVEIKELGIAPTKAKRRVVEREKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例二”的方法制備得到。多肽制備實施例八多肽的氨基酸序列為YKVVEIKELGIAPTKAKRRVVEQEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例三”的方法制備得到。多肽制備實施例九多肽的氨基酸序列為YKVVEIKELGIAPTKAKRRVVEGEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例四”的方法制備得到。
多肽制備實施例十多肽的氨基酸序列為YKVVEIKELGIAPTKRKRRVVEREKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例五”的方法制備得到。
多肽制備實施例十一多肽的氨基酸序列為YKVVEIKELGIAPTKRKRRVVEQEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例一”的方法制備得到。
多肽制備實施例十二多肽的氨基酸序列為YKVVEIKELGIAPTKRKRRVVEGEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例二”的方法制備得到。
多肽制備實施例十三多肽的氨基酸序列為YKVVEIKRLGIAPTKAKRRVVEREKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例三”的方法制備得到。
多肽制備實施例十四多肽的氨基酸序列為YKVVEIKRLGIAPTKAKRRVVEQEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例四”的方法制備得到。
多肽制備實施例十五多肽的氨基酸序列為YKVVEIKRLGIAPTKAKRRVVEGEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例五”的方法制備得到。多肽制備實施例十六多肽的氨基酸序列為YKVVEIKRLGIAPTKRKRRVVEREKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例五”的方法制備得到。多肽制備實施例十七多肽的氨基酸序列為YKVVEIKRLGIAPTKRKRRVVEQEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例三”的方法制備得到。多肽制備實施例十八多肽的氨基酸序列為YKVVEIKRLGIAPTKRKRRVVEGEKRAVGIGA根據(jù)上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例二”的方法制備得到。多肽制備實施例十九分別按照“多肽制備實施例一”至“多肽制備實施例十八”的多肽氨基酸的排列序列，利用化學合成多肽類物質(zhì)(III)的基因序列之后，克隆到預先被內(nèi)切酶處理過的PGEX-2載體中。重組的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化到受體菌中，然后在培養(yǎng)基中大量繁殖、誘導。最后將細菌離心收集，再依靠層析柱將多肽類物質(zhì)(III)和與其結(jié)合的蛋白質(zhì)純化出來。
多肽類物質(zhì)(III)可以通過蛋白酶從與其融合的GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)的融合蛋白上切割下來。最后再濃縮即可制得多肽類物質(zhì)(III)的純品。
上述制備的多肽類物質(zhì)(III)在臨床上可以用于檢測、診斷病毒性疾病，特別是艾滋病等一些由病毒引起的疾病，也可以用作制備藥物制劑的原料。
權(quán)利要求
1.一種多肽類物質(zhì)(III)，其特征是由多種氨基酸組成，其氨基酸的排列序列為肽鏈的基本結(jié)構(gòu)為YKVVEIK*LGIAPTK**KRRVVE***EKRAVGIGA其中*為氨基酸P(脯氨酸)或氨基酸E(谷氨酸)或氨基酸R(精氨酸)**為氨基酸A(丙氨酸)或氨基酸R(精氨酸)***為氨基酸R(精氨酸)或氨基酸Q(谷氨酰胺)或氨基酸G(甘氨酸)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽類物質(zhì)(III)，其特征是用化學合成方法制備得到，合成的步驟為(1)、合成先用氯乙醚將樹脂活化，然后在樹脂中加入第一個氨基酸，并固定到樹脂上，用化學活性基團對氨基加以保護，經(jīng)過洗滌后，氨基的保護基團采用由六氫吡啶脫保護，再將第二個氨基酸經(jīng)過活化后，加入到結(jié)合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應(yīng)后即形成肽鍵，然后按照多肽的氨基酸排序，依次加入相應(yīng)的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長，直到最后第一個氨基酸結(jié)合到肽鏈上為止。(2)、分離利用分離液將多肽類物質(zhì)(III)從樹脂上游離下來，取適量的分離液浸泡上述結(jié)合有多肽類物質(zhì)(III)的樹脂，在室溫下攪拌，然后經(jīng)過濾便可得到多肽類物質(zhì)(III)，游離的多肽類物質(zhì)(III)經(jīng)過沉淀后，即可分離出來。(3)、純化將分離出來的多肽類物質(zhì)(III)溶解在水或適當濃度的堿溶液中，然后用常規(guī)的色譜方法，將完整的多肽類物質(zhì)(III)進行純化。(4)、鑒定純化后的多肽類物質(zhì)(III)，通過質(zhì)譜分析重新核實所合成的多肽類物質(zhì)(III)的氨基酸序列是否正確。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽類物質(zhì)(III)的化學合成方法，其特征是氨基酸的氨基可以由以下化學活性基團加以保護①芐酯基(Carbobenzoxyl)②叔丁基羰基(t-Butyloxycarbonyl)③甲苯磺酰基(Tosyl)④9-亞芴基甲酯基(Fmoc9-Fluorenylmethoxycarbonyl)
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽類物質(zhì)(III)的化學合成方法，其特征是在分離過程中使用的分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽類物質(zhì)(III)的化學合成方法，其特征是純化過程的堿溶液可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉的溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽類物質(zhì)(III)，其特征是用基因重組的方法制備得到，其制備的步驟為(1)將多肽類物質(zhì)(III)的基因序列利用化學合成法合成之后，克隆到預先被內(nèi)切酶(BamHI和EcoRI)處理過的PGEX-2載體中，重組的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化到BL21受體菌中，然后在培養(yǎng)基中大量繁殖、誘導。最后將細菌離心收集，再依靠層析柱將多肽類物質(zhì)(III)與GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)的融合蛋白純化出來。(2)多肽類物質(zhì)(III)可以通過凝血因子蛋白酶從GST融合蛋白上切割下來，最后再濃縮即可制得多肽類物質(zhì)(III)的純品。
7.一種權(quán)利要求1所述的多肽類物質(zhì)(III)，其用途是在臨床的檢測、診斷艾滋病病毒方面的應(yīng)用，或者作為藥物制劑的生產(chǎn)原料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多肽類物質(zhì)(III)的結(jié)構(gòu)、用途和制備方法，這類多肽物質(zhì)在臨床上用于檢測、診斷病毒性疾病，特別是艾滋病等一些由病毒引起的疾病，也可以用作制備藥物制劑的原料，多肽類物質(zhì)(III)可以用人工合成的方法制備得到，也可以用基因重組的方法制備得到。
文檔編號A61K38/16GK1473845SQ0211548
公開日2004年2月11日 申請日期2002年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月26日
發(fā)明者許衛(wèi)東, 魏勛斌, 潘勇 申請人:北海新升技術(shù)開發(fā)有限責任公司