復(fù)合多肽類添加劑飼料及其制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種復(fù)合多肽類添加劑飼料及其制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于抗生素強(qiáng)大的抗菌殺菌作用，被大量使用于世界各地，并在動物疾病治療、提 高飼料利用率、促進(jìn)畜禽生長等方面發(fā)揮了重要作用。但是，其副作用也特別明顯，尤其體 現(xiàn)在細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等方面。2006年，歐盟全面禁止了應(yīng)用抗生素作為飼料的添加 劑。
[0003] 抗菌肽，原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)。其分 子量在2000~7000左右，由20~60個氨基酸殘基組成，這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、 熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)，尤其是對某些耐藥性病原菌具有很好的殺滅作用，這些特 點(diǎn)引起了人們的重視。
[0004] 除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽對部分病毒、真菌、原蟲和癌細(xì)胞等有殺滅作 用，甚至能提高免疫力、加速傷口愈合過程?？咕牡膹V泛生物學(xué)活性顯示了其在醫(yī)學(xué)上良 好的應(yīng)用前景。
[0005] 因此，在日常飼料中添加抗菌肽類物質(zhì)，一方面可以減少對抗生素的依賴和使用 量，減少抗生素濫用的污染；另一方面，尋找到新型的抗生素替代物，促進(jìn)畜禽業(yè)的健康發(fā) 展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷，現(xiàn)提供一種復(fù)合多肽類添加劑飼料及其制作方 法，以形成新的抗生素替代物，減少對抗生素的依賴和濫用，促進(jìn)畜禽業(yè)的健康發(fā)展。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，提供一種復(fù)合多肽類添加劑飼料，
[0008] 包括有抗菌肽片段，所述抗菌肽片段通過酵母基因提純濃縮形成，所述酵母基因 的配方材料包括：54%的玉米、16. 3%的豆柏、0. 084%的青糠、0. 04%的DDGS、0. 05%的棉 柏、0. 03%的蛋雞預(yù)混料、0. 06%的石粉、0. 02%的貝殼粉以及0. 01 %的魚粉。
[0009] 本發(fā)明復(fù)合多肽類添加劑飼料的有益效果在于，通過抗菌肽片段替代抗生素以形 成新種飼料。
[0010] 為更好地實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種復(fù)合多肽類添加劑飼料的制作方法， 包括以下步驟：
[0011] 利用化學(xué)合成法合成以酵母偏愛密碼子為編碼的抗菌肽蛙皮素基因片段；
[0012] 將所述抗菌肽蛙皮素基因片段與與酵母表達(dá)載體重組，以形成胞內(nèi)表達(dá)栽體；
[0013] 電機(jī)轉(zhuǎn)化所述胞內(nèi)表達(dá)栽體內(nèi)的宿主菌；
[0014] 對所述抗菌肽蛙皮素基因片段進(jìn)行提純和濃縮；
[0015] 將提純濃縮后的所述抗菌肽蛙皮素基因片段與常規(guī)配料原料混合，以形成所述復(fù) 合多肽類添加劑飼料。
[0016] 優(yōu)選地，在對所述抗菌肽蛙皮素基因片段進(jìn)行提純和濃縮之前，還包括：通過電泳 和藥敏試驗(yàn)驗(yàn)證所述胞內(nèi)表達(dá)栽體中的所述抗菌肽蛙皮素基因片段是否穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 為利于對本發(fā)明的結(jié)構(gòu)的了解，以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)行說明。
[0018] 本發(fā)明提供了一種復(fù)合多肽類添加劑飼料，包括有抗菌肽片段，所述抗菌肽片 段通過酵母基因提純濃縮形成，所述酵母基因的配方材料包括：54%的玉米、16. 3%的豆 柏、0. 084%的青糠、0. 04%的DDGS、0. 05%的棉柏、0. 03 %的蛋雞預(yù)混料、0. 06%的石粉、 0. 02 %的貝殼粉以及0. 01 %的魚粉。
[0019] 1.基因表達(dá)法獲取有效果的抗菌膚物質(zhì)：
[0020] 以酵母為基因工程受體菌來表達(dá)，酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī) 制和對表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，采用電泳技術(shù)獲得抗菌肽片段；
[0021] 2.抗菌肽片段的提純和濃縮技術(shù)：由于抗菌肽產(chǎn)量不高，需要進(jìn)行純化和濃縮， 獲得高質(zhì)量和濃度的抗菌肽；
[0022] 3.抗菌肽片段的飼喂效果：
[0023] 通過對實(shí)驗(yàn)動物小鼠的飼喂試驗(yàn)，檢驗(yàn)小鼠免疫機(jī)能的變化和效果。
[0024] 以下為上述配方材料的具體質(zhì)量比：
[0027] 在上述飼料組成結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了一種復(fù)合多肽類添加劑飼料的制 作方法，包括以下步驟：
[0028] 步驟S1，利用化學(xué)合成法合成以酵母偏愛密碼子為編碼的抗菌肽蛙皮素基因片 段；
[0029] 步驟S2,將所述抗菌肽蛙皮素基因片段與與酵母表達(dá)載體重組，以形成胞內(nèi)表達(dá) 栽體；
[0030] 步驟S3,電機(jī)轉(zhuǎn)化所述胞內(nèi)表達(dá)栽體內(nèi)的宿主菌；
[0031] 步驟S4,對所述抗菌肽蛙皮素基因片段進(jìn)行提純和濃縮；
[0032] 步驟S5,將提純濃縮后的所述抗菌肽蛙皮素基因片段與常規(guī)的配料原料混合，以 形成所述復(fù)合多肽類添加劑飼料。
[0033] 具體地，在本實(shí)施例中，上述步驟具體過程為：
[0034] -、抗菌肽的表達(dá)和生產(chǎn)
[0035] 用化學(xué)合成法合成了以酵母偏愛密碼子編碼的抗菌肽蛙皮素（magainin)基因片 段，合成片段拼接后，與PUC19重組，獲得magainin基因。magainin基因與酵母表達(dá)載體 PPIC3重組，構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)栽體pPIC3-Mag，電擊法轉(zhuǎn)化GS115宿主菌，經(jīng)表型篩選和PCR鑒 定證實(shí)了目的基因已穩(wěn)定整合人Pi chia pastoris酵母基因組中。
[0036] 二、抗菌肽的提純和濃縮
[0037] 表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽是通過電泳和藥敏試驗(yàn)來進(jìn)行鑒定的，通過以下條件的摸索來進(jìn) 行優(yōu)化：
[0038] 首先，挑YPDSZ平板上單個菌落接入YPDSZ液體培養(yǎng)基，30度230rpm振搖 22-24h ；
[0039] 然后，1 :100 接入 BMGY 中，30 度 230rpm22-24h ;
[0040] 隨后，菌體沉淀接入BMMY中，30度230rpm甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96h ;
[0041] 最后離心，取上清液進(jìn)行電泳分析，獲得的片段采用凝膠柱進(jìn)行純化。
[0042] 三、飼喂效果表達(dá)
[0043] 按照飼喂推薦量0. 9%。比例進(jìn)行添加，做成預(yù)混料，飼料工藝如下：
[0044] 首先，將所有外購的粒狀原料經(jīng)粉碎后進(jìn)入配料倉，粉狀原料經(jīng)清理篩后進(jìn)入配 料倉。而后，飼料配方輸入電腦自動配料系統(tǒng)，并自動配料。然后，將含有有益菌的預(yù)混料 直接投入混合機(jī)。之后，混合機(jī)進(jìn)行混合，每批次2噸，混合時間不少于120秒，混合均勻度 < 10%。最后，打包，經(jīng)檢驗(yàn)合格才出廠。
[0045] 完成上述實(shí)施過程后，應(yīng)能體現(xiàn)出本發(fā)明以下特點(diǎn)：
[0046] 1)酵母基因表達(dá)技術(shù)來生產(chǎn)抗菌肽；
[0047] 2)抗菌肽的純化和濃縮技術(shù)，獲得高質(zhì)量、高濃度的抗菌肽。
[0048] 以上結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員可根據(jù)上述說 明對本發(fā)明做出種種變化例。因而，實(shí)施例中的某些細(xì)節(jié)不應(yīng)構(gòu)成對本發(fā)明的限定，本發(fā)明 將以所附權(quán)利要求書界定的范圍作為保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種復(fù)合多肽類添加劑飼料，其特征在于， 包括有抗菌肽片段，所述抗菌肽片段通過酵母基因提純濃縮形成，所述酵母基因的配 方材料包括：54%的玉米、16. 3 %的豆柏、0. 084%的青糠、0. 04%的DDGS、0. 05 %的棉柏、 0. 03%的蛋雞預(yù)混料、0. 06%的石粉、0. 02%的貝殼粉以及0. 01 %的魚粉。2. -種復(fù)合多肽類添加劑飼料的制作方法，其特征在于， 包括以下步驟： 利用化學(xué)合成法合成以酵母偏愛密碼子為編碼的抗菌肽蛙皮素基因片段； 將所述抗菌肽蛙皮素基因片段與與酵母表達(dá)載體重組，以形成胞內(nèi)表達(dá)栽體； 電機(jī)轉(zhuǎn)化所述胞內(nèi)表達(dá)栽體內(nèi)的宿主菌； 對所述抗菌肽蛙皮素基因片段進(jìn)行提純和濃縮； 將提純濃縮后的所述抗菌肽蛙皮素基因片段與常規(guī)配料原料混合，以形成所述復(fù)合多 肽類添加劑飼料。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述復(fù)合多肽類添加劑飼料的制作方法，其特征在于，在對所述抗 菌肽蛙皮素基因片段進(jìn)行提純和濃縮之前，還包括： 通過電泳和藥敏試驗(yàn)驗(yàn)證所述胞內(nèi)表達(dá)栽體中的所述抗菌肽蛙皮素基因片段是否穩(wěn) 定。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種復(fù)合多肽類添加劑飼料及其制作方法，飼料包括有抗菌肽片段，所述抗菌肽片段通過酵母基因提純濃縮形成；制作方法包括：利用化學(xué)合成法合成以酵母偏愛密碼子為編碼的抗菌肽蛙皮素基因片段；將抗菌肽蛙皮素基因片段與酵母表達(dá)載體重組，以形成胞內(nèi)表達(dá)栽體；電機(jī)轉(zhuǎn)化胞內(nèi)表達(dá)栽體內(nèi)的宿主菌；對抗菌肽蛙皮素基因片段進(jìn)行提純和濃縮；將提純濃縮后的抗菌肽蛙皮素基因片段與常規(guī)配料原料混合，以形成所述復(fù)合多肽類添加劑飼料。本發(fā)明形成了新的抗生素替代物，減少對抗生素的依賴和濫用，促進(jìn)畜禽業(yè)的健康發(fā)展。
【IPC分類】A23K1/16
【公開號】CN105325673
【申請?zhí)枴緾N201410387071
【發(fā)明人】張澤宏
【申請人】上海延華飼料有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2014年8月7日