專利名稱：：受體特異性腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(trail)的突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于腫瘤壞死因子-(TNF-)相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosisfactor-(TNF)-relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL))領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及TRAIL受體l(TRAIL-Rl，有時(shí)稱為死亡受體4(DR4)選擇性TRAIL突變體。
背景技術(shù)：
：TNF相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是一種跨膜蛋白，其可在細(xì)胞表面切割形成可溶的配體。TRAIL通過在TRAIL-R1(死亡受體4(DR4)或TRAIL-R2(死亡受體5(DR5/TRICK2))處結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TRAIL在癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但不能在正常細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TRAIL有時(shí)也稱為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體2(apoptosis-inducingligand2，Apo2L)。經(jīng)由DR5發(fā)出信號(hào)在諸如肺癌、乳腺癌、大腸癌和其他癌癥的癌癥和癌癥模型中非常重要。經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)在諸如慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)的癌癥和癌癥模型中非常重要。Kelley等(2005JBiolChemVolum280，第2205-2212頁)公開了受體選擇性的TRAIL突變體的研究。這項(xiàng)研究的焦點(diǎn)是DR4和DR5活性之間的不同。研究了各種TRAIL突變體，結(jié)論是，在表達(dá)DR4和DR5這兩種死亡受體的癌細(xì)胞中，DR5可能比DR4更有助于TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。利用噬菌體顯示法，選擇對(duì)DR4或DR5具有相對(duì)結(jié)合選擇性的配體變體。在各種癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞中研究了這些突變體的作用。結(jié)果顯示在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中DR5比DR4起著更突出的作用。據(jù)報(bào)道，在TRAIL中用Ala取代Tyr-189對(duì)DR4的選擇性非常重要，因?yàn)樽鳛镈R4的選擇性變體而研究的所有4個(gè)克隆都具有這種突變。而且，據(jù)報(bào)道，H264R和/或D267Q取代能產(chǎn)生針對(duì)DR4結(jié)合的進(jìn)一步選擇性，并能在DR5親和性和生物活性上獲得適度改進(jìn)。MacFarlane等(2005CellDeathandDifferentiationVol.12第773-782頁)公開了多種細(xì)胞系和原發(fā)性細(xì)胞(primarycell)對(duì)經(jīng)由TRAIL-R1或TRAIL-R2發(fā)出信號(hào)的應(yīng)答的廣泛評(píng)述。這篇文獻(xiàn)的主要教導(dǎo)是在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(CLL細(xì)胞)中TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是在組蛋白脫乙酰酶抑制劑(histonedeacetylaseinhibitor,HDACi)存在的情況下，經(jīng)由TRAIL-Rl而進(jìn)行的。因此，為了使治療效果最大化，必須在開始治療前，先査明原發(fā)性腫瘤(primarytumour)是否經(jīng)由TRAIL-R1或TRAIL-R2發(fā)出信號(hào)。并建議治療CLL的具體治療組合。而且，公開了不同形式的TRAIL的細(xì)微變化會(huì)改變它們激活不同TRAIL受體的傾向。這就清晰而顯著地改變了它們的生物學(xué)活性。該文獻(xiàn)教導(dǎo)了使用TRAIL靶向治療需要在體外試驗(yàn)前，先評(píng)估不同腫瘤對(duì)TRAIL-Rl或TRAIL-R2的敏感性。Kaufmann和Steensma(2005Leukemiavol19第2195-2202頁)綜述了TRAIL的生物學(xué)功能、細(xì)胞毒性機(jī)制和TRAIL對(duì)體外各種細(xì)胞的作用。Kaufmann和Steensma認(rèn)識(shí)到DR5應(yīng)該是參與TRAIL誘導(dǎo)性殺死腫瘤細(xì)胞的最主要受體。他們評(píng)論了不能驗(yàn)證TRAIL對(duì)人肝細(xì)胞有毒的證據(jù)，特別是通過針對(duì)DR5的試劑。這強(qiáng)化了本領(lǐng)域中DR5信號(hào)傳輸仍然是有效治療的最佳候選者的觀點(diǎn)。該評(píng)論接著詳細(xì)討論了(見上文)MacFarlane等的文章(同上)。Kaufmann和Steensma沒有公開任何TRAILS。W097/25428公開了Apo-2配體。該文獻(xiàn)描述了Apo-2L的cDNA和克隆。描述了Apo-2L片段，并且提及了與Apo-2L序列具有各種序列同一性水平的分子。在其最廣泛的方面內(nèi)，該文獻(xiàn)教導(dǎo)了與Apo-2L的氨基酸114—281具有至少80%同源性的Apo-2配體，該配體在至少一種類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。沒有有關(guān)Apo-2L序列突變的教導(dǎo)。沒有有關(guān)功能保留的內(nèi)容。沒有有關(guān)哪一個(gè)殘基可以發(fā)生變化，以及為了保持Apo-2L功能而保留哪個(gè)殘基的教導(dǎo)。沒有指向具體受體或受體亞型的活性的教導(dǎo)。盡管該文獻(xiàn)涉及Apo-2L的多種截短的序列變體，但沒有公開顯示哪一個(gè)變體可能有活性，或者怎樣選擇它們。而且，沒有對(duì)DR4的選擇性有教導(dǎo)。WO99/36535描述了Apo-2配體多肽。而且權(quán)利要求中涉及了這些肽片段，如包含Apo-2L的氨基酸91-281或包含Apo-2L的氨基酸91-281的多肽。描述了Apo-2配體的三個(gè)具體突變。公開的突變是D203A、D218A和D269A。除了這三個(gè)具體突變外，該申請沒有給出對(duì)于生物活性而言應(yīng)該保留什么殘基，和什么殘基可以進(jìn)行突變的教導(dǎo)。沒有討論具體受體或受體亞型的活性。沒有指向DR4受體活性的教導(dǎo)。WO2004/101608描述了一系列Apo-2L受體結(jié)合肽。具體來說，該文獻(xiàn)的表8公開了91種不同的據(jù)報(bào)道能結(jié)合Apo-2L受體的肽。這些肽的長度為大約10個(gè)氨基酸到大約25個(gè)氨基酸。而且，公開了具體的半胱氨酸相關(guān)基元，這些肽優(yōu)選包含該基元。盡管提到了DR4和DR5受體，但其焦點(diǎn)主要是集中于抑制Apo-2L和這些受體之間的相互作用。該文獻(xiàn)總的教導(dǎo)是通過使用這些抑制性肽抑制Apo-2L發(fā)出信號(hào)。在該文獻(xiàn)中沒有教導(dǎo)新的TRAIL突變體。在該文獻(xiàn)中沒有教導(dǎo)如何能經(jīng)由DR4來產(chǎn)生信號(hào)。沒有對(duì)于可能對(duì)發(fā)出信號(hào)來說非常重要的TRAIL殘基的教導(dǎo)。Kelley等在2005年教導(dǎo)了為了讓DR4發(fā)出信號(hào)，TRAIL的Tyr189必須是Ala?，F(xiàn)有技術(shù)存在的問題是大多數(shù)研究是在培養(yǎng)的細(xì)胞系中而不是在原發(fā)性細(xì)胞中進(jìn)行的?，F(xiàn)有技術(shù)強(qiáng)調(diào)了DR5發(fā)出信號(hào)的重要性。現(xiàn)有技術(shù)的研究集中于受體結(jié)合，但很少提供或未曾提供有關(guān)生物學(xué)功能性的數(shù)據(jù)。完整的野生型TRAIL能引起細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。然而，在DR4和DR5背景中的水平相似。這導(dǎo)致肝毒性的問題。可將肝毒性歸因于肝細(xì)胞中TRAIL/細(xì)胞凋亡的激活。認(rèn)為該信號(hào)是經(jīng)由DR5而進(jìn)行。使用野生型TRAIL的治療方法已經(jīng)遇到了問題。本發(fā)明試圖克服與現(xiàn)有技術(shù)的有關(guān)問題。發(fā)明概述本發(fā)明基于意外發(fā)現(xiàn)了具有DR4選擇性的特異性TRAIL突變體。本發(fā)明人已證明，據(jù)報(bào)道具有DR4特異性的現(xiàn)有技術(shù)的配體令人意想不到地沒有生物學(xué)活性。這可能是因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)數(shù)據(jù)集中于對(duì)受體結(jié)合的研究而不是功能性的生物學(xué)分析。然而，本發(fā)明的優(yōu)勢在于提供了具有DR4生物學(xué)發(fā)信號(hào)能力的TRAIL突變體。而且，由于認(rèn)為肝細(xì)胞中的肝毒性主要經(jīng)由DR5起作用，因此本發(fā)明的優(yōu)勢是DR4選擇性的TRAIL突變體有助于降低或消除肝毒性?，F(xiàn)有技術(shù)研究集中于利用野生型TRAIL結(jié)合作為參考點(diǎn)。在現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)DR4或DR5的'選擇性，已用于描述與DR4或DR5的強(qiáng)結(jié)合性，而不是選擇性的生物學(xué)效果。如本發(fā)明所指出的，這種結(jié)合并不總會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)際的生物學(xué)活性。本發(fā)明的優(yōu)勢在于，對(duì)于DR4發(fā)出信號(hào)，TRAIL序列中生物學(xué)上重要的殘基已得以確定。在現(xiàn)有技術(shù)中，認(rèn)為Y189A突變對(duì)DR4發(fā)出信號(hào)非常重要。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有這種突變的TRAIL突變體沒有生物學(xué)活性。與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)相反，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Y189對(duì)DR4發(fā)出信號(hào)非常重要。因此，一方面，本發(fā)明提供了能經(jīng)由DR4選擇性發(fā)出信號(hào)的TRAIL，其包含189位置處的Y。另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的TRAIL,其還包含193S。另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的TRAIL,其還包含191L。另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的TRAIL,其還包含199V。另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的TRAIL,其還包含201R、213W和215D，優(yōu)選與199V組合。另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的TRAIL,其包含與TRAIL的至少氨基酸95-281相對(duì)應(yīng)的序列。另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的TRAIL,其還包含非肽多聚體。TRAIL與非肽多聚體的連接會(huì)有利地穩(wěn)定TRAIL。多聚體可以是本領(lǐng)域中已知的用于此目的的任何適宜的多聚體。優(yōu)選，所述的多聚體選自如下組成的組聚乙二醇、聚丙二醇和聚醚(polyoxyalkylene)。現(xiàn)有技術(shù)關(guān)注的是DR5在癌癥發(fā)出信號(hào)中的重要性，并且目的在于在消耗DR4的情況下產(chǎn)生DR5信號(hào)。然而，本發(fā)明人已經(jīng)意識(shí)到DR4信號(hào)的價(jià)值與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)相反。因此，另一方面，本發(fā)明提供了能經(jīng)由DR4選擇性發(fā)出信號(hào)的TRAIL在治療癌癥中的用途。優(yōu)選，癌癥是B細(xì)胞惡性腫瘤。優(yōu)選，癌癥是慢性淋巴細(xì)胞白血病或套細(xì)胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma,MCL)或B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin，slymphoma,NHL)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)一些癌癥經(jīng)由DR5發(fā)出信號(hào)/應(yīng)答，而有些則經(jīng)由DR4。實(shí)際上，現(xiàn)有技術(shù)如此強(qiáng)調(diào)DR5的一個(gè)原因是其主要基于體外永生細(xì)胞系(immortalizedcelllines)的研究。相反，本發(fā)明人洞察了原發(fā)性癌細(xì)胞(primarycancercdls)的信號(hào)情況，并令人驚訝地發(fā)現(xiàn)它們經(jīng)由DR4來應(yīng)答。因此，確定待治療的疾病是否對(duì)DR4應(yīng)答還是對(duì)不同的信號(hào)應(yīng)答是非常重要的，并據(jù)此來指導(dǎo)治療。所以，另一方面，本發(fā)明提供了通過施用能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL治療受試者癌癥的方法，所述的方法包括，確定所述受試者的靶細(xì)胞是否經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)，其中，如果所述靶細(xì)胞的確經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)，則施用能通過DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL。另一方面，本發(fā)明涉及輔助診斷受試者DR4應(yīng)答性張障礙癥(DR4-responsivedisorder)的方法，所述方法包括確定所述受試者的靶細(xì)胞是否經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)，其中，如果所述靶細(xì)胞的確經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)，那么DR4應(yīng)答障礙癥的診斷就得到確認(rèn)。"靶細(xì)胞"是指臨床上期望從受試者中除去、殺死、破壞或者以其他方式抑制或消除的細(xì)胞。優(yōu)選，所述抑制或消除是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式。優(yōu)選，靶細(xì)胞是與疾病有關(guān)或是導(dǎo)致疾病形成的實(shí)際細(xì)胞，如癌/腫瘤細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的治療方法，其還包括施用敏化劑(sensitizingagent)。優(yōu)選，所述敏化劑是HDAC抑制劑。優(yōu)選，所述HDAC抑制劑是丙戊酸(valproate)，優(yōu)選，丙戊酸鈉(sodiumvalproate)。另一方面，本發(fā)明提供了能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL在制備預(yù)防或治療癌癥的藥物中的用途，其中所述癌癥細(xì)胞經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)。優(yōu)選，本發(fā)明提供了能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL在制備癌癥藥物中的用途，其中所述癌癥細(xì)胞經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)。優(yōu)選，所述細(xì)胞主要經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)。另外，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的TRAIL,其能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)，優(yōu)選所述癌癥是CLL、MCL或NHL。另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者B細(xì)胞惡性腫瘤或受試者B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤或套細(xì)胞淋巴瘤或慢性淋巴細(xì)胞白血病的方法，所述方法包括向所述受試者施用能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL。另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的方法，其還包括向所述受試者施用組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)。優(yōu)選，在施用HDACi后施用TRAIL。優(yōu)選，在施用HDACi至少8小時(shí)后施用TRAIL。優(yōu)選，在施用HDACi至少16小時(shí)后施用TRAIL。優(yōu)選，在約8-16小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)施用HDACi。優(yōu)選，在約4-8小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)施用TRAIL,優(yōu)選約4小時(shí)。優(yōu)選，向所述受試者多次施用TRAIL和/或HDACi。另一方面，本發(fā)明提供了在血液惡性細(xì)胞中誘導(dǎo)死亡誘導(dǎo)性信號(hào)復(fù)合物(deathinducingsignalingcomplex,DISC)形成的方法，其包括使所述細(xì)胞與組蛋白脫酰酶抑制劑(HDACi)以及能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL接觸。另一方面，本發(fā)明提供了在血液惡性細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡蛋白酶(caspase)激活的方法，其包括使所述細(xì)胞與組蛋白脫酰酶抑制劑(HDACi)以及能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL接觸。優(yōu)選，HDACi選自下組縮酞(depsipeptide)、曲古霉素A(trichostatinA,TSA)和丙戊酸。優(yōu)選，HDACi是丙戊酸。另一方面，本發(fā)明提供了包含能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL和敏化劑的試劑盒。在如上所述的方法和試劑盒中，優(yōu)選TRAIL是如本文所述的TRAIL。優(yōu)選，本發(fā)明涉及TRAILRl(DR4)的應(yīng)用，如TRAILRl(DR4)選擇性TRAIL突變體。發(fā)明詳述TNF受體細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)配體(TRAIL)和其激動(dòng)性抗體(agonisticantibodies)——其目前正用于治療各種惡性腫瘤的早期臨床試驗(yàn)中，通過觸發(fā)TRAIL-R1或R2來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們目前明確地證朋了來自患有某種惡性淋巴瘤(lymphoidmalignancies)的患者的原發(fā)性細(xì)胞幾乎毫無例外地通過TRAIL-R1向細(xì)胞凋亡發(fā)出信號(hào)。因此，我們認(rèn)為用目前臨床試驗(yàn)中的主要通過TRAIL-R2，如HGS-ETR2(HumanGenomeScience)或通過Apo-2L/TRAIL(Genentech)發(fā)出信號(hào)的藥劑來治療此類患者不會(huì)產(chǎn)生治療效果。根據(jù)本發(fā)明，確定來自具體腫瘤的原發(fā)性細(xì)胞是否經(jīng)由TRAIL-R1或-R2發(fā)出信號(hào)是非常有利的。此類信息為優(yōu)化TRAIL治療提供了新的合理方法。然而，許多癌細(xì)胞系都對(duì)TRAIL敏感。來自患者如患有慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤的大多數(shù)原發(fā)性細(xì)胞都具有抗性。與化學(xué)治療劑組合治療可以用于增強(qiáng)抗性細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。我們證明通過促進(jìn)TRAILDISC形成的增加，組蛋白脫酰酶抑制劑(HDACi)如縮酞會(huì)使CLL細(xì)胞對(duì)TRAIL-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡變敏感。TRAIL在大范圍的腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞和組織是無毒的。己用HGS-ETR1和HGS-ETR2(HumanGenomeScience)進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，其分別是TRAIL-R1禾口TRAIL-R2的選擇性激動(dòng)抗體，也用Apo2L/TRAIL(Genentech)進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。盡管TRAIL可經(jīng)由TRAIL-R1或-R2發(fā)出細(xì)胞凋亡信號(hào)，但大多數(shù)的研究表明TRAIL-R2是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的原發(fā)性受體(primaryreceptor)。然而，這些研究大部分使用細(xì)胞系；僅少數(shù)使用來自患者的原發(fā)性腫瘤細(xì)胞。利用與細(xì)胞系組合的抗體和各種TRAIL配體，所述細(xì)胞系主要通過TRAIL-Rl(Ramos)或TRAIL-R2(Jurkat)發(fā)出信號(hào)，我們認(rèn)為臨床上相關(guān)的細(xì)胞如原發(fā)性CLL細(xì)胞主要通過TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)。使用定點(diǎn)誘變，我們已合成了一系列選擇性地與TRAIL-R1或-R2結(jié)合的TRAIL突變體。TRAIL-R1但非TRAIL-R2的選擇性突變體在原發(fā)性CLL細(xì)胞和原發(fā)性套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此確鑿地證明這些原發(fā)性淋巴細(xì)胞通過TRAIL-R1而不是通過TRAIL-R2發(fā)出信號(hào)。我們公開了CLL細(xì)胞經(jīng)由TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這對(duì)于將在臨床使用的TRAIL形式非常重要?，F(xiàn)有技術(shù)的Apo2L/TRAIL主要通過TRAIL-R2發(fā)出信號(hào)，而且它對(duì)于CLL和其他通過Rl發(fā)信號(hào)的惡性腫瘤沒有作用。我們根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成了假想的TRAIL-R1(DR4)選擇性突變體，發(fā)現(xiàn)它們是沒有活性的。現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)TRAIL-R1重要性的結(jié)論是錯(cuò)誤的。我們已經(jīng)對(duì)該結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修飾，并獲得了選擇性對(duì)TRAIL-R1起作用的突變體。這些DR4選擇性突變體對(duì)CLL細(xì)胞是有活性的，而TRAIL-R2選擇性突變體就沒有活性。這確鑿地證明了TRAIL-R1(DR4)在CLL中發(fā)出信號(hào)的重要性，如同典型的DR4發(fā)出惡性腫瘤信號(hào)一樣。TRAIL-R1在原發(fā)性腫瘤中比TRAIL-R2重要。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在治療經(jīng)由DR4(TRAIL-Rl)發(fā)出信號(hào)的腫瘤或惡性腫瘤中的應(yīng)用。TRAIL野生型TRAIL序列是本文在描述本發(fā)明的TRAIL突變體序列中所用的參考序列。野生型TRAIL序列優(yōu)選是人TRAIL,優(yōu)選的登錄號(hào)是NM—003810。TRAIL的參照物(referencestoTRAIL)包含可溶的TRAIL(有時(shí)稱為"sTRAIL")。優(yōu)選可溶的TRAILS或TRAIL突變體，因?yàn)樗鼈兊膬?yōu)勢是更易于制備或施用?？扇艿腡RAIL(sTRAIL)指TRAIL的aa95-281;aal-94表示跨膜結(jié)構(gòu)域，因此aa95-281是可溶的TRAIL。通常，本發(fā)明的"TRAIL"或"TRAIL突變體"的參照物指具有相關(guān)取代的sTRAIL或aa95-281，其根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容是顯而易見的。長度本發(fā)明的TRAIL突變體在長度上可以變化，如在它們的N末端。His-TRAIL編碼氨基酸95-281和N末端的His標(biāo)簽。Apo2L包含氨基酸114-281。沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明在TRAILN末端的短區(qū)域(如氨基酸95-114)能在TRAIL與其受體的結(jié)合中發(fā)揮任何關(guān)鍵性作用。因此，依賴于操作者的選擇，本發(fā)明的TRAIL突變體可包括或不包括在該N末端區(qū)域的氨基酸。本發(fā)明的關(guān)鍵性教導(dǎo)在于對(duì)TRAIL區(qū)域所作的氨基酸變化對(duì)DR4特異性來說是非常重要的。與此相一致，我們對(duì)Kelley等(2005JBiolChemVolume280,第2205-2212頁)建議的相同殘基進(jìn)行了突變，產(chǎn)生了Apo2L的TRAIL-R2特異性突變體，并且獲得了His-TRAIL的相似的TRAIL-R2特異性形式(TRAIL--R2-6)，從而證明本發(fā)明有關(guān)突變的教導(dǎo)可應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的不同的TRAIL環(huán)境中。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的TRAIL突變體包含與TRAIL的至少25個(gè)aa相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，優(yōu)選至少50個(gè)aa，優(yōu)選至少100個(gè)aa，優(yōu)選至少150個(gè)aa，優(yōu)選至少161個(gè)aa,優(yōu)選至少167個(gè)aa，優(yōu)選至少190個(gè)aa，優(yōu)選至少200個(gè)aa，優(yōu)選至少240個(gè)aa，優(yōu)選全部的281個(gè)aa。當(dāng)本發(fā)明的突變體包含總計(jì)小于TRAIL全長281個(gè)aa的氨基酸序列時(shí)，優(yōu)選，序列是來自TRAIL全部281個(gè)aa的C末端，優(yōu)選來自可溶的三聚體TRAIL序列。下文將更詳細(xì)地討論包含小于全長的TRAIL突變體?？扇艿娜垠wTRAIL的晶體結(jié)構(gòu)是基于殘基114-281，而與DR5絡(luò)合的TRAIL晶體結(jié)構(gòu)顯示，在各TRAIL單體中的殘基120-135以及146-281對(duì)于與DR5的相互作用是非常關(guān)鍵的。因此，優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的TRAIL包含至少殘基120-135以及146-281。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的TRAIL-R1/2的最小長度是殘基120-281。優(yōu)選，本發(fā)明的TRAIL突變體包含TRAIL的aal20-aa281;優(yōu)選，aall4-aa281，優(yōu)選aa95-aa281，優(yōu)選aa92扁aa281，優(yōu)選aa91陽aa281，或全長TRAIL。顯然，關(guān)于TRAIL1-281序列長度的討論僅適用于根據(jù)本發(fā)明的多肽的TRAIL部分，即，任何標(biāo)簽或融合體均在上述TRAIL殘基之外。而且，當(dāng)討論"長度"時(shí)，說配體包含例如TRAIL的120-281并不暗示該配體恰好包含該氨基酸序列，必須還要關(guān)注本發(fā)明的關(guān)鍵特征即所做的具體氨基酸取代。必須從上下文來理解長度的討論。作為缺省，除非上下文給出了不同的意思，優(yōu)選未指定的TRAIL氨基酸殘基與野生型人TRAIL的氨基酸殘基一樣。這同樣適用于編碼本發(fā)明的TRAIL多肽的任何核酸。本文所討論的TRAIL突變體殘基的編號(hào)方式采用本領(lǐng)域中已建立的常規(guī)方法，即，所用的編號(hào)對(duì)應(yīng)于野生型TRAIL序列上的位置。術(shù)語"其片段"可理解為僅涉及指定的TRAIL突變體能發(fā)出信號(hào)的片段。參考本文提出的DR4發(fā)出信號(hào)/死亡誘導(dǎo)試驗(yàn)，很容易對(duì)片段(或配體)是否能發(fā)出信號(hào)這一問題得以確認(rèn)。能發(fā)出信號(hào)的片段不需要具有全長TRAIL的全部活性，但必須具有相同性質(zhì)的活性，g卩，必須是DR4選擇性/特異性的。DR4選擇性/特異性的相同標(biāo)準(zhǔn)適用于TRAIL突變體片段，如同適用于配體自身一樣。無論如何，片段必須包含對(duì)應(yīng)于TRAIL的至少25個(gè)aa的氨基酸序列。TRAIL突變體序列取代如本文所用的，術(shù)語"突變體"具有本領(lǐng)域的正常涵義。具體來說，"TRAIL突變體"是在其序列優(yōu)選氨基酸序列的至少一個(gè)位置處與野生型TRAIL不同的TRAIL。本文詳細(xì)討論了單突變體和其突變。本文所公開的兩種最優(yōu)選的TRAIL突變體，相對(duì)于野生型TRAIL配體，具有5和4個(gè)氨基酸的變化。當(dāng)這些氨基酸中僅有某兩個(gè)發(fā)生改變(TRAIL.Rl-2:Y213W;S215D)時(shí)，不能獲得相同的活性。因此，本發(fā)明明確放棄這種TRAIL突變體的權(quán)利。另外的兩個(gè)氨基酸突變體TRAIL(N199V;K201R)，和三個(gè)氨基酸突變體TRAIL(Q193S;N199V;K201R)可以獲得特異性。當(dāng)僅在氨基酸199處進(jìn)行單個(gè)N199V取代時(shí)，可有利地賦予特異性。因此，這種單突變體TRAIL是本發(fā)明優(yōu)選的TRAIL。Y189除了現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了Y189A對(duì)DR4的特異性非常重要以外，TRAIL-R1禾口-R2(DR4和5)似乎在與TRAIL的Y189相互作用的受體區(qū)域中是保守的。因此，在不知道本發(fā)明的情況下，很難預(yù)測TRAIL該區(qū)域中的突變是可選擇的。弱疏水性(smallhydrophobic):根據(jù)我們的結(jié)構(gòu)模型，似乎Y189A會(huì)獲得與-Rl和-R2大約相同程度的弱蛋白-蛋白相互作用。這與本文提供的試驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。強(qiáng)疏水性(largerhydrophobic):預(yù)料Phe或Leu會(huì)減弱蛋白-蛋白相互作用(失去氫鍵，但保持疏水相互作用)，而以大約相同的程度影響-Rl和-R2的結(jié)合。如上文所指出的，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了Y189A取代對(duì)DR4選擇性非常重要。相反，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Y189A突變體在生物學(xué)相關(guān)的DR4信號(hào)傳輸中并沒有功能活性。事實(shí)上，在氨基酸189處取代為小極性殘基(Y189Q)或非極性殘基(Y189A)會(huì)導(dǎo)致DR4明顯喪失活性。因此，優(yōu)選，本發(fā)明的TRAIL突變體不包含Y189Q或Y189A。優(yōu)選，本發(fā)明的TRAIL突變體包含Y189，即位置189是野生型。在現(xiàn)有技術(shù)中，Kdley等的教導(dǎo)在選擇具體的突變(對(duì)應(yīng)于本文的TRAIL.Rl-6)中占統(tǒng)治地位。然而，我們已證明這6種氨基酸取代會(huì)獲得無活性型配體，而且活性和特異性僅保留于可替代的突變體中，如本發(fā)明優(yōu)選的4或5種氨基酸TRAIL突變體種類(例如TRAIL.Rl-4/5)。R191根據(jù)我們的模型(TRAIL/TRAIL-R1)，我們預(yù)測氨基酸191對(duì)TRAIL與TRAIL.R1的相互作用很重要。為了對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，我們對(duì)R191L進(jìn)行了突變(使其變?yōu)槭杷?，接著根據(jù)這種單個(gè)取代的效果，我們隨后對(duì)該氨基酸進(jìn)行了系統(tǒng)性突變。例如，R191Q(極性，更短，但不帶電荷)、R191A(非極性且小)，以及R191E(電荷反轉(zhuǎn))。據(jù)此，R191Q和R191E的比較能確定電荷的作用。R191與TRAILR2中的ASP(67)結(jié)合，形成鹽橋(2.6A)，其對(duì)TRAILR2的穩(wěn)定化非常重要。在本申請中，用于TRAIL-R2受體的殘基編號(hào)與Hymovitz等(MolcecularCellVolume4,563-571,1999)的文獻(xiàn)中所用編號(hào)相同，并且指沒有其N末端信號(hào)肽的TRAIL-R2。為了進(jìn)一步闡明這一點(diǎn)，在成熟的TRAIL-R2中，Asp67對(duì)應(yīng)于全長TRAIL-R2序列中的Asp120，包括N末端的信號(hào)肽。TRAIL的R191通過中間水分子還與TRAILR2中的Ser(68)形成間接的氫鍵。因?yàn)樵摻z氨酸殘基在TRAILRl中是保守的，因此，如果需要，可以對(duì)R1中的該間接氫鍵進(jìn)行作用。因此，該位點(diǎn)上的突變將增強(qiáng)DR4。優(yōu)選，在該位點(diǎn)引入負(fù)電荷的突變。根據(jù)本發(fā)明，在R191處可產(chǎn)生各種突變。依賴于所進(jìn)行的取代，可獲得不同的效果。其中一些將在下文討論。優(yōu)選，將R191突變?yōu)槌齋er之外的殘基。R191L可引入疏水性。R191Q使其具有極性并且更短，但沒有電荷。R191A完全除去側(cè)鏈。R191E導(dǎo)致電荷反轉(zhuǎn)。這是化學(xué)性強(qiáng)作用。R191Q和R191E的比較能更詳細(xì)地確定電荷的作用。因此，總之，我們教導(dǎo)了將R191取代為疏水性殘基(Leu)或電荷反轉(zhuǎn)性殘基(Glu)能賦予一定程度的對(duì)TRAIL-R1的特異性。對(duì)電荷反轉(zhuǎn)進(jìn)行解釋R191E/D可具有與TRAIL-R2的D67不利的相互作用，而且還通過與TRAIL-R1的K67的有利相互作用而增強(qiáng)與TRAIL-R1的相互作用。在本申請中，用于TRAIL-R1受體的殘基編號(hào)是指如圖3A和Hymovitz等的文獻(xiàn)中所表示的沒有N末端信號(hào)肽的TRAIL-Rl序列編號(hào)。為了進(jìn)一歩闡明這一點(diǎn)，在成熟的TRAIL-R1中，K67對(duì)應(yīng)于全長TRAIL-Rl序列中的K171。優(yōu)選R191E。極性、無電荷R191Q/N可能沒有R191E有效，但其可消除或者弱化與TRAIL-R2的D67的相互作用，從而增強(qiáng)與TRAIL-R1的結(jié)合。疏水性R191L/V/A可以弱化蛋白-蛋白相互作用，在TRAIL-R2中比在TRAIL-R1中更是如此，因而據(jù)此可賦予對(duì)TRAIL-R1的特異性。優(yōu)選R191L。本發(fā)明優(yōu)選的R191突變是R191E。具體的單突變體TRAILRl91L賦予DR4特異性，因此這種單突變TRAIL是本發(fā)明優(yōu)選的TRAIL突變體。N199氨基酸N199從極性殘基(Asn)取代為小的非極性殘基(如Val/Ala/Leu)會(huì)賦予對(duì)TRAIL-R1(DR4)的特異性，因此是優(yōu)選的突變位點(diǎn)。優(yōu)選的突變是任何破壞或者改進(jìn)氫結(jié)合的突變，如小的極性氨基酸。優(yōu)選N199L或N199V，優(yōu)選N199V。對(duì)疏水性進(jìn)行解釋預(yù)測N199A/V/L優(yōu)選N199V會(huì)影響蛋白-蛋白相互作用，在TRAIL-R2中比在TRAIL-R1更是如此，因此預(yù)料會(huì)賦予對(duì)TRAIL-R1的特異性。這種突變可與本文所述的其他突變組合使用。對(duì)于Leu和/或Val來說特異性可能更強(qiáng)，其可與TRAIL形成疏水相互作用，從而可以補(bǔ)償Cys[-Rl禾口-R2兩者]的羰基主鏈以及Arg[-R2)]側(cè)鏈所損失的氫鍵。D267和G160根據(jù)我們的模型，我們鑒定出了TRAIL中的兩個(gè)其他的氨基酸，即D267和G160，對(duì)與TRAIL-R1的相互作用非常重要。因而，這些氨基酸的系統(tǒng)取代是本發(fā)明的一部分。對(duì)于D267，較大的負(fù)電性殘基如D267E可增強(qiáng)與TRAIL-R1(經(jīng)由K67)的相互作用，因此是優(yōu)選的。Glyl60Leu可增強(qiáng)TRAILRl相互作用，因此是優(yōu)選的。原因在于疏水性主體(hydrophobicbulk):G160L可通過在空間上阻止鹽橋(TRAIL-R2的R62至TRAIL的E155)而使TRAIL-R2和TRAIL之間的界面不穩(wěn)定。另夕卜，通過形成其他的疏水相互作用，能進(jìn)一步增強(qiáng)與TRAILRl的相互作用。其他的TRAIL突變輔助突變包括靶向TRAILRl中賴氨酸67的相互作用。在不局限于理論的情況下，認(rèn)為該殘基可與TRAIL中的Asp267相互作用。因此，TRAIL中的Asp267是如上文所述的本發(fā)明的另外的取代靶點(diǎn)。殘基Asp203、Asp218或Asp269可有助于TRAIL/TRAIL-R1相互作用。優(yōu)選，將這些殘基中的一個(gè)或多個(gè)突變?yōu)锳la，或優(yōu)選突變?yōu)槌鼳la以外的氨基酸。優(yōu)選，本發(fā)明放棄Asp203Ala、Asp218Ala和Asp269Ala突變的權(quán)利。優(yōu)選保留Asp203作為Asp(野生型)。在該區(qū)域內(nèi)，TRAIL-R1禾n-R2未顯示不同。本發(fā)明優(yōu)選放棄Asp203Ala的權(quán)利。Asp218可與TRAIL-R2中的H53(等同的-R1殘基是A53)形成鹽橋。因此，優(yōu)選疏水性取代D218A可弱化TRAIL/TRAIL-R2相互作用，D218M既可弱化TRAIL/TRAIL-R2相互作用又可加強(qiáng)TRAIL/TRAIL-R1相互作用。因此，優(yōu)選D218M。優(yōu)選，將Asp269突變?yōu)檩^大的負(fù)性殘基D269E可以增強(qiáng)TRAIL-R1結(jié)合并弱化TRAIL-R2結(jié)合。因此，優(yōu)選D269E。突變組合為了便于理解，上文已單獨(dú)描述了每一種突變。必須指出，本發(fā)明涉及單個(gè)突變，但也涉及與單個(gè)TRAIL配體中其它突變的組合突變。除非另有說明，本發(fā)明包括每一種組合。優(yōu)選，本發(fā)明所有的TRAIL配體都包含位置189處的Tyr。因此，本文所描述或討論的組合優(yōu)選還包含189Y。特別優(yōu)選的是與R191L組合的Asnl99Val突變。優(yōu)選，位置213和215保持野生型。優(yōu)選位置191和201兩者相對(duì)于野生型都是突變的。優(yōu)選位置199和201兩者相當(dāng)對(duì)于野生型都是突變的。在位置201處，優(yōu)選突變成除Lys(野生型)以外的氨基酸，優(yōu)選，突變成除Arg或Lys(野生型)以外的氨基酸。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的TRAIL突變體包含199處的單個(gè)突變或191處的單個(gè)突變，優(yōu)選，19]和]99處的雙突變，優(yōu)選199和201處的雙突變，優(yōu)選，199和.201以及213或215之一的三突變。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的TRAIL突變體含有199、201和213、215處的四突變。如上文所述，優(yōu)選，這些中的每一個(gè)都還包含189Y。當(dāng)使用199/201處的雙突變時(shí)，優(yōu)選該氨基酸是Val/Arg。TRAIL突變體的其他特征為了純化和便于制備，可將本發(fā)明的TRAIL突變體加上標(biāo)簽，如FLAG-標(biāo)記或His標(biāo)記，優(yōu)選HIS標(biāo)記，優(yōu)選用6His標(biāo)簽。優(yōu)選，以未加標(biāo)簽的形式使用TRAIL突變體。優(yōu)選，TRAIL突變體是三聚體。His標(biāo)記不會(huì)影響三聚化。信號(hào)測定當(dāng)依據(jù)本發(fā)明使用試驗(yàn)系統(tǒng)時(shí)，從生物信號(hào)方面，對(duì)經(jīng)由TRAILRl或TRAILR2發(fā)出信號(hào)進(jìn)行評(píng)估是非常重要的。不同的結(jié)果或作用如觸發(fā)細(xì)胞凋亡，與TRAILRl或TRAILR2的表達(dá)水平無關(guān)，而與信號(hào)有關(guān)。因此，為了確定是否與信號(hào)相關(guān)，使用功能測定是非常重要的。當(dāng)然，如果沒有DR4存在于具體的細(xì)胞或者細(xì)胞類型中，那顯然就沒有DR4信號(hào)。然而，高水平的TRAILRl表達(dá)未不表示高水平的TRAILRl信號(hào)。例如，K562細(xì)胞能表達(dá)高水平的TRAILRl，但對(duì)TRAIL-R1特異性抗體不敏感。DR4選擇性/DR4發(fā)出信號(hào)DR4選擇性意指優(yōu)先選擇針對(duì)DR4受體的配體。優(yōu)選，針對(duì)DR4受體的特異性，即，優(yōu)選，DR4選擇性配體僅與DR4(并且優(yōu)選不與DR5)復(fù)合。一個(gè)DR4選擇性試驗(yàn)是在細(xì)胞環(huán)境中的體內(nèi)結(jié)合。優(yōu)選，其是經(jīng)由死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(deathinducingsignalingcomplex,DISC)數(shù)據(jù)而進(jìn)行的試驗(yàn)。在這點(diǎn)上，參考實(shí)施例部分，特別是參考圖2A(Ramos細(xì)胞/TRAILRl)以及圖2B(Jurkat細(xì)胞/TRAILR2)。優(yōu)選，DR4選擇性配體僅結(jié)合DR4?？捎肦l/R2特異性阻抑抗體進(jìn)行另一個(gè)試驗(yàn)。使用這些抗體是為了確定它們是否會(huì)中和具體配體的作用。如果R1(DR4)阻抑抗體會(huì)中和具體配體的作用，但R2(DR5)阻抑抗體并不中和該作用，那么該配體就是DR4選擇性的。另一個(gè)試驗(yàn)涉及測定在僅有Rl-(DR4-)的細(xì)胞中的作用。這是如本文戶萬討論的DR4選擇性的優(yōu)選試驗(yàn)。優(yōu)選，將配體應(yīng)用于僅有Rl-發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞中。優(yōu)選，該細(xì)胞是Ramos細(xì)胞。優(yōu)選，信息顯示(readout)是功能活性，優(yōu)選，死亡誘導(dǎo)活性(細(xì)胞凋亡)。這對(duì)試驗(yàn)至關(guān)重要一僅結(jié)合并不是同功能性死亡誘導(dǎo)一樣有力的指標(biāo)。因此，優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的DR4選擇性配體在僅有DR4發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞如Ramos細(xì)胞中誘導(dǎo)死亡。更優(yōu)選，所述配體不會(huì)在僅有DR5發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞如Jurkat細(xì)胞中誘導(dǎo)死亡。應(yīng)該指出，本發(fā)明優(yōu)選研究選擇性作用，而不是僅僅是偏愛或者特異性作用。優(yōu)選用于確定選擇性的標(biāo)準(zhǔn)是選擇性地分離活性TRAIL-R1受體復(fù)合物的能力，以及特異性的TRAIL-R1阻抑抗體中和突變的TRAIL-R1特異性配體的能力。為了進(jìn)行比較，可以進(jìn)行與TRAIL-R2有關(guān)的相同試驗(yàn)，適當(dāng)?shù)靥鎿QR2試劑。上文討論了適合DR4選擇性的序列特征。致敏/組合治療優(yōu)選，用TRAIL治療是與敏化劑組合。對(duì)于施用來說，組合意指同時(shí)、順序或一起。順序意指TRAIL緊隨敏化劑(sensitizer)之后，或意指敏化劑緊隨TRAIL之后。施用間隔(若有的話)可以是適合實(shí)際或治療理由而測定的任何適宜間隔。HDAC抑制劑優(yōu)選，敏化劑是HDACi。優(yōu)選，HDACi選擇下組:縮酞、曲古霉素A(TSA)和丙戊酸。優(yōu)選，HDACi是丙戊酸。之前，已知丙戊酸是抗痙攣劑并用于治療疾病如癲癇癥。本文令人驚訝地公開了丙戊酸在白血病如CLL中的應(yīng)用。這樣，可使用TRAIL突變體，其以有利的低水平在非靶組織中是無活性或有活性的。然而，通過用敏化劑如HDACi，聯(lián)合處理靶組織時(shí)，在該組織中的TRAIL活性會(huì)有利地得到增強(qiáng)，從而產(chǎn)生治療上有用水平的細(xì)胞死亡。優(yōu)選，至少一種TRAIL和敏化劑處理是定向靶組織的，優(yōu)選，這兩者都定向靶組織。靶向(targeting)意指非定向施用后，保留/結(jié)合/激活/切割成活性形式或其它能將藥劑定向耙組織的方式，或靶向意指局部施用或限制形式的施用，其物理性地將該物質(zhì)定向于靶組織。優(yōu)選，通過HDACi治療來進(jìn)行TRAIL治療。這能有利地殺死現(xiàn)有技術(shù)不能殺死的細(xì)胞。例如，HDACi預(yù)治療后，TRAIL-R1特異性突變體可殺死TRAIL-R1Ab(HGS-ETR1)不能殺死的細(xì)胞。這項(xiàng)研究已在細(xì)胞系中進(jìn)行。這表明配體的活性范圍比Abs更廣。在不限于理論的情況下，這種作用可能歸因于配體和Ab誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的某種不同機(jī)制而造成的。HDACi是與產(chǎn)瘤癌有關(guān)的優(yōu)選敏化劑。HDACi是與CLL有關(guān)的特別優(yōu)選的敏化劑。在各類HDAC抑制劑中，將優(yōu)選革巴向I類HDAC的藥劑優(yōu)選用于致敏。僅特異性地抑制II類HDAC的藥劑不能將TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏化至足夠高的水平，因此本發(fā)明優(yōu)選將其排除。因此，優(yōu)選I類HDAC抑制劑。在I類HDACi中，HDAC1禾口/或HDAC2的抑制劑是最優(yōu)選的。其他的敏化劑蛋白酶體抑制劑可用作敏化劑，如PS-341(硼替佐米)、MG132或其他?，F(xiàn)有治療劑可用作敏化劑，阿霉素、5FU、順鉑(Cisplatin)、夫拉平度(Flavopiridol)、CD20(利妥昔單抗(Rituximab))、白藜盧醇(Resveratrol)或其它。通過正調(diào)節(jié)TRAIL-R1受體水平，可實(shí)現(xiàn)CLL細(xì)胞(以及事實(shí)上其他的經(jīng)由TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)的原發(fā)性腫瘤)的敏化。這可在使用靶向API的化學(xué)治療劑或受到HBV感染后(例如，下列文獻(xiàn)中所描述的Guan等，Oncogene.2002,21:3121-9;G廳等，J.CellPhysiol.2001,188:98-105;Janssen等，JHepatol.2003,39:414-20)進(jìn)行。優(yōu)選，對(duì)APl轉(zhuǎn)錄進(jìn)行正調(diào)節(jié)從而敏化細(xì)胞。其他的致敏方式包括調(diào)節(jié)P53。其他的致敏方式包括放射治療。優(yōu)選，本發(fā)明的治療與放射治療進(jìn)行組合，從而增強(qiáng)對(duì)TRAIL的敏感性。其他的敏化劑包括HepV病毒、PKC抑制劑(PKCi)和蛋白酶體抑制劑，在每種情況下都應(yīng)適當(dāng)留意細(xì)胞環(huán)境。疾病我們已經(jīng)證明來自CLL和MCL患者的原發(fā)性細(xì)胞主要通過TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)，因此，本發(fā)明在這些疾病中具有特別的作用。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)可方包用于包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)特別是B細(xì)胞NHL的血液譜系(haematologicallineage)的其他原發(fā)性腫瘤中，并且可應(yīng)用于在其細(xì)胞主要纟5由TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)的其他疾病中。因此，TRAIL-R1/R2相互之間的關(guān)聯(lián)(relativeinvolvement)取決于細(xì)胞譜系，或者說，在原發(fā)性細(xì)胞和永生細(xì)胞之間存在差異。在此情況下，獲得的大部分支持TRAIL-R2發(fā)出信號(hào)起主要作用的數(shù)據(jù)是在永生細(xì)胞而非原發(fā)性細(xì)胞環(huán)境中。然而，有些使用細(xì)胞系的報(bào)告也支持TRAIL-R1在某些非血液惡性腫瘤中具有潛在的關(guān)鍵作用。這些包括前列腺、NSCLC、大腸和直腸腫瘤，以及轉(zhuǎn)化的人角化細(xì)胞。因此，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)可用于治療這些疾病。優(yōu)選，本發(fā)明應(yīng)用于血液譜系細(xì)胞，如非霍奇金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma)、急性髓系白血病(acutemyeloidleukaemia)或其他細(xì)胞，如Jurkat細(xì)胞系、Ramos細(xì)胞系、T細(xì)胞或B細(xì)胞或其衍生物。優(yōu)選，本發(fā)明應(yīng)用于B細(xì)胞譜系細(xì)胞。因?yàn)樵S多培養(yǎng)的細(xì)胞系都可能優(yōu)先通過DR5發(fā)出信號(hào)，所以優(yōu)選在原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行確認(rèn)。在廣泛的方面中，本發(fā)明涉及DR4選擇性TRAIL在治療其細(xì)胞主要通過TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)的疾病中的用途。藥物組合物本發(fā)明也提供了藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明TRAIL和/或敏化劑和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合物)。藥物組合物可以在人類醫(yī)學(xué)和畜牧醫(yī)學(xué)中用于人或動(dòng)物，并且通常包含任何一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。治療用的可接受載體或稀釋劑在藥學(xué)領(lǐng)域中是熟知的，并且描述于如Remington'sPharmaceutialSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中?？筛鶕?jù)預(yù)期的方fi用途徑和標(biāo)準(zhǔn)的藥物慣例來進(jìn)行藥用載體、賦形劑或者稀釋劑的選擇。藥物組合物除載體、賦形劑或稀釋劑以外，還可包含任何適宜的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑。防腐劑、穩(wěn)定劑、染料甚至調(diào)味劑可提供于藥物組合物中。防腐劑的實(shí)例包括苯甲酸鈉、山梨酸或?qū)αu基苯甲酸酯。也可使用抗氧化劑和懸浮劑。依賴于不同的遞送系統(tǒng)，可有不同的組合物/劑型要求。根據(jù)實(shí)例，可>|每本發(fā)明的藥物組合物配制成使用微泵或通過粘膜途徑施用，如配成吸入用鼻腔噴霧劑(nasalspray)或氣溶膠噴霧劑或可口服溶液，或通過可注射形式配制組合物用于非腸道施用，通過如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下途徑來施用。另外，可將劑型設(shè)計(jì)成可采用多種途徑來施用。當(dāng)通過胃腸道粘膜施用藥劑時(shí)，在通過胃腸道的運(yùn)輸過程中，它應(yīng)該保持穩(wěn)定；例如，應(yīng)該抵抗蛋白水解酶的降解作用、在酸性pH下穩(wěn)定且抵抗膽汁的凈化作用。適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，藥物組合物可以以下述方式施用，吸入施用、栓劑或陰道栓劑的形式、以洗劑、溶液、乳劑、藥膏或撒布粉(dustingpowder)的形式和皮膚用藥膏的形式局部施用；以含有賦性劑如淀粉或乳糖的片劑形式口服，或以膠囊或卵形囊劑(ovules)的形式單獨(dú)或與賦形劑混合口服，或以含有調(diào)味劑或著色劑的酏劑、溶液或懸濁液形式口服，或?qū)⑺鼈兘?jīng)非腸道注射，例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下注射。對(duì)于非腸道施用，組合物最好以無菌水溶液的形式施用，所述溶液可以含有其他的物質(zhì)，如足夠的鹽或單糖，從而使得該溶液與血液等滲。對(duì)于口腔或舌下施用，可以以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式來施用組合物。對(duì)于某些實(shí)施方案，本發(fā)明的TRAIL/敏化劑可與環(huán)糊精組合使用。已知環(huán)糊精可與藥物分子形成包合物或非包合復(fù)合物。藥物-環(huán)糊精復(fù)合物的形成可改善藥物分子的溶解性、溶解率、生物利用率和/或穩(wěn)定性。藥物-環(huán)糊精復(fù)合物通?？捎糜诖蠖鄶?shù)劑型和施用途徑。作為對(duì)直接與藥物混合的替代方法，環(huán)糊精可用作輔助性添加劑，例如，作為載體、稀釋劑或增溶劑。a、卩、Y環(huán)糊精是最常用的，適宜的實(shí)例描述于W0-A-91/11172、WO-A-94/02518以及WO-A-98/55148中?？稍谡邮苤委煹氖茉囌咧性恢苽銽RAIL。在此情況下，編碼所述TRAIL的核苷酸序列可通過使用非病毒技術(shù)(如通過使用脂質(zhì)體)和/或病毒技術(shù)(如通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒)來遞送，以便所述TRAIL蛋白可以由所述核苷酸序列表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物經(jīng)局部施用。優(yōu)選，藥物的形式適宜局部遞送的形式。施用術(shù)語"施用"包括通過病毒或非病毒技術(shù)遞送。病毒遞送機(jī)制包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(adeno-associatedviral,AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體、慢病毒載體以及桿狀病毒載體。非病毒遞送機(jī)制包括脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體(Lipofectin)、陽離子表面兩性分子(cationicfacialamphiphiles,CFAs)以及其組合。可以單獨(dú)施用本發(fā)明的組分，但通常以藥物組合物施用，例如，當(dāng)組分是以與根據(jù)預(yù)期的施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物慣例而選擇的適合的藥物賦形劑、稀釋劑或載體混合。例如，可以以片劑、膠囊、卵形囊劑、酏劑、溶液或懸濁液的形式施用(如口服或局部)組分，其可含有調(diào)味劑或著色劑，用于速釋、緩釋、修飾釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放或控釋的用途。如果藥物是片劑，那么所述片劑可含有賦形劑(如微晶質(zhì)纖維素、乳糖、醋酸鈉、碳酸鈣、磷酸二氫鈣和糖膠)、崩解劑(如淀粉(優(yōu)選玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸鈉(sodiumstarchglycollate)、交聯(lián)羥甲纖維素鈉和某些復(fù)合硅酸鹽)，和顆粒粘合劑(如聚乙烯吡咯垸酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯樹膠)。另外，還包括潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸、山崳酸甘油酯以及云母。在明膠膠囊中，也可將相似類型的固體組合物作為填充劑。在此情況下，優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、奶糖或高分子量的聚乙二醇。對(duì)于含水懸濁液和/或酏劑，所述藥劑可與各種增甜劑或調(diào)味劑、著色劑或染料、與乳化劑和/或懸濁劑、以及與稀釋劑如水、乙醇、丙二醇和丙三醇，及其組合進(jìn)行組合。施用(遞送)途徑包括但不限于下列中的一種或多種口部(如作為片劑、膠囊，或作為可攝食溶液)；局部、粘膜(如作為吸入用鼻腔噴霧劑或氣溶膠噴霧劑)；鼻腔；非腸道(如通過可注射的形式)；胃腸道；脊柱內(nèi)；腹膜內(nèi)；肌肉內(nèi)；靜脈內(nèi)；子宮內(nèi)；目艮內(nèi)(intraocular);皮內(nèi)；頭顱內(nèi)；氣管內(nèi)(intratracheal);陰道內(nèi)；偵'J腦室內(nèi)(intracerebroventricular);大腦內(nèi)；皮下；眼部(ophthalmic,包括玻璃體內(nèi)或房室內(nèi)(intracameral));透皮(transdermal);直腸；口腔；陰道；舌下。優(yōu)選，藥物組合物是局部遞送的?？梢岳斫猓⒎撬幬锏乃薪M分都通過相同的途徑施用。同樣，如果組合物含有多于一種的活性組分，則那些組分可通過不同的途徑施用。如果非腸道施用本發(fā)明的組分，則這種施用的實(shí)例包括下列中的一種或多種靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸內(nèi)、心室內(nèi)、尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)(intrasternally)、頭顱內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用所述組分；禾Q/或通過使用輸注技術(shù)(infusiontechniques)。對(duì)于非腸道施用，組分最好是以無菌水溶液的形式使用，其可含有其4也的物質(zhì)，例如足夠的鹽或葡萄糖，以獲得與血液等滲的溶液。如果需要，含水溶液可進(jìn)行適當(dāng)?shù)木彌_(優(yōu)選至pH3-9)。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)藥物技術(shù)，可很容易地實(shí)現(xiàn)適宜的非腸道劑型的制備。如上所述，本發(fā)明的組分可鼻內(nèi)施用，或通過吸入施用，可方便地以干粉吸入劑或氣溶膠噴霧劑的形式由加壓容器、泵、噴霧容器或噴霧器遞送，使用適宜的推進(jìn)劑給藥，適宜的推進(jìn)劑如二氯二氟甲垸、三氯一氟甲烷、氫氟烷(hydrofluoroalkane)如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134A頂)或1，1,1,2,3,3,3,-七氟丙烷(HFA227EATM)、二氧化碳或其他適宜的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可通過提供一個(gè)閥以釋放一個(gè)計(jì)量的量而確定。加壓容器、泵、噴霧容器或噴霧器可含有活性化合物的溶液或懸濁液，例如，使用乙醇和推進(jìn)劑作為溶劑的混合物，它們可另外含有潤滑劑，如脫水山梨醇三油酸酯(sorbitantrioleate)。在吸入器或吹入器中使用的膠囊和藥盒(例如由明膠制備)可配制為含有藥劑和適宜粉末載體例如乳糖或淀粉的粉末混合物。可選地，本發(fā)明的組分物可以以栓劑或陰道栓劑的形式施用，或以凝膠、水凝膠、洗劑、溶液、乳劑、藥膏或撒布粉的形式局部施用。本發(fā)明的組分也可皮膚施用或透皮施用，例如，通過使用皮膚用藥膏。它們也可通過肺部或直腸途徑施用。它們也可通過眼部途徑施用。對(duì)于眼部使用(ophthalmicuse)，可將化合物配制為等滲、pH調(diào)節(jié)的無菌鹽微粉懸濁液，或優(yōu)選配制為等滲、pH調(diào)節(jié)的無菌鹽溶液，任選地與防腐劑如苯扎氯銨(benzylalkoniumchloride)組合。另外，它們可以配制在藥膏如凡士林中。對(duì)于局部皮膚施用來說，可將本發(fā)明的化合物配制為適宜的藥膏，其含有懸浮或者溶解于混合物中的活性化合物，所述混合物與下述一種或多種物質(zhì)混合礦物油、液體凡士林(liquidpetrolatum)、白凡士林、丙二醇、聚乙烯聚丙烯化合物、乳化蠟和水。可選地，可將其配制成適宜的洗劑或乳劑，其懸浮或溶解于例如一種或多種下列物質(zhì)的混合物中礦物油、脫水山梨醇單硬脂酸(sorbitanmonostearate)、聚乙二醇、液體石蠟、聚山梨醇酯60(polysorbate60)、十六烷基酉旨蠟(cetylesterswax)、負(fù)京蠟酉享(cetearylalcohol)、2-辛基十二烷醇(octyldodecano1)、苯甲醇和水?？蓪⒈景l(fā)明的TRAIL和/或敏化劑與一種或多種其他藥學(xué)活性物一起施用。根據(jù)實(shí)例，本發(fā)明涵蓋了用本發(fā)明的TRAIL和/或敏化劑以及一種或多種類固醇、止痛劑、抗病毒劑或其他藥學(xué)活性物質(zhì)一起同時(shí)或順序治療?？梢岳斫?，這些治療方案包括順序地、同時(shí)地或一起施用所述物質(zhì)。由于在胃腸道中存在TRAIL遭破壞的風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選，不將TRAIL施用至胃腸道或口腔或直腸。優(yōu)選，TRAIL通過注射施用。優(yōu)選，以注射施用配制的TRAIL?？梢晕改c道的方式施用敏化劑如HDACi。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HDACi是丙戊酸鈉，優(yōu)選以適合口服施用來配制，并優(yōu)選采用口服施用。劑量水平通常，醫(yī)師可確定最適宜個(gè)體受試者的實(shí)際劑量。對(duì)任何特定患者來說，具體的劑量水平和劑量頻率可以變化，并且依賴于多種因素，包括所用具體化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)長、年齡、體重、綜合健康、性別、飲食、施用方式和時(shí)間、排泄速率、藥物組合、具體病癥的嚴(yán)重性，以及個(gè)體正經(jīng)受的治療。根據(jù)需要，藥劑的使用劑量可以為0.01-30mg/kg體重，如0.1-10mg/kg，更優(yōu)選0.1-1mg/kg體重。劑型可將本發(fā)明的組分配制至藥物組合物內(nèi)，如通過利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)與一種或多種適宜的載體、稀釋劑或賦形劑混合。藥物活性鹽本發(fā)明的TRAIL和/或敏化劑可作為藥學(xué)上可接受的鹽來施用。通常，通過適當(dāng)?shù)氖褂闷谕乃峄驂A，可很容易地制備藥學(xué)上可接受的鹽。鹽可從溶液中沉淀，并通過過濾收集，或可通過蒸發(fā)溶劑回收。其他的優(yōu)勢和應(yīng)用已證明現(xiàn)有技術(shù)的"DR4"TRAIL突變體在DR4細(xì)胞系中沒有活性。本發(fā)明人已制備了對(duì)DR4受體具選擇性的新型突變體。這些突變配體可用于治療和試驗(yàn)系統(tǒng)中，特別是，在治療癌癥如慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)和主要經(jīng)由DR4(TRAILR1)發(fā)出信號(hào)的其他癌癥中。正常的肝細(xì)胞是經(jīng)由TRAILR2(DR5)發(fā)出信號(hào)，因此，DR4選擇性的TRAIL配體可有利地減少肝毒性。因此，本發(fā)明的配體比現(xiàn)有技術(shù)的TRAIL突變體具有更強(qiáng)的特異性和更低的肝毒性。優(yōu)選，本發(fā)明的TRAIL突變體包含TRAIL的氨基酸95-281。特別優(yōu)選TRAIL突變體TRAIL.Rl-4以及TRAIL.Rl-5，如表1中所示。更優(yōu)選，不具有His標(biāo)簽的TRAIL突變體。TRAIL.Rl-4包含具有199Val、201Arg、213Trp以及215Asp的6HisTRAIL95-281。TRAIL.Rl-5包含具有193Ser、199Val、201Arg、213Trp以及215Asp的6HisTRAIL95-281。本發(fā)明也涉及非血液癌(如非B細(xì)胞衍生的癌癥)的治療，如乳癌。本發(fā)明也涉及如上文所述的用作藥物的TRAIL;如上文所述的TRAIL用于制備癌癥用藥物的用途；以及如上文所述的TRAIL用于治療癌癥的用途。現(xiàn)在，將通過實(shí)施例的方式來描述本發(fā)明，所述實(shí)施例本質(zhì)上并非旨在限制而是為了闡明和幫助理解本發(fā)明。附圖的簡要說明圖1示出可視化蛋白的曲線圖、柱狀圖和照片。圖2示出可視化蛋白照片和標(biāo)繪圖。圖3示出有注釋的序列比較以及TRAIL結(jié)構(gòu)可視模型。圖4示出曲線圖和柱狀圖。圖5示出印跡照片。圖6示出印跡照片、細(xì)胞的顯微照片和柱狀圖。更具體來說圖1示出由TRAIL受體突變體引起的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞型特異性誘導(dǎo)。用一定濃度的野生型TRAILO-)、TRAIL.Rl-5(n-n)、TRAILR2-60-"以及TRAIL.Rl-6(眾-眾)將A:Jurkat細(xì)胞和B:Ramos細(xì)胞培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)，并測量細(xì)胞凋亡。細(xì)胞還暴露于HGS-ETR1或HGSETR2(l叱ml")中。C:將Ramos或Jurkat細(xì)胞單獨(dú)或用TRAIL-R1封閉Ab(TRAIL-RlblockingAb)或TRAIL-R2中和Ab(TRAIL-R2neutralizingAb)(5pgml")預(yù)溫浴30分鐘。隨后，將Ramos細(xì)胞暴露于wtTRAIL、TRAIL.Rl-5(500ngml")，或HGS-ETR1(l嗎ml")中4小時(shí)，并將Jurkat細(xì)胞暴露于TRAIL-R2-6(250ngml")、TRAIL-R1-5(1pgmr1)，或HGS-ETR1和ETR2(l叫ml")中，評(píng)估細(xì)胞凋亡。D:將Ramos和Jurkat細(xì)胞暴露于如上文所述的wtTRAIL或TRAIL突變體中，并處理通過Western印跡分析法測定的凋亡蛋白酶-3和-8。星號(hào)表示非特異性條帶。用于檢測凋亡蛋白酶-8p18亞基的下組印跡的暴露時(shí)間是上組的兩倍。通過磷脂酰絲氨酸外翻(phosphatidylserineextemalization)評(píng)估細(xì)胞凋亡，并將結(jié)果用至少3個(gè)單獨(dú)測量的平均值土SEM來表示。圖2示出在不同的細(xì)胞類型中TRAIL突變體選擇性地誘導(dǎo)DISC形成。A:將Ramos細(xì)胞和B:Jurkat細(xì)胞暴露于500ngml"的生物素化型wtTRAIL(His-T)、TRAIL.R1-5——種TRAIL,R1選擇性突變體、TRAIL.R2-6——種TRAIL-R2選擇性突變體，以及TRAIL.Rl-6—一種相關(guān)但無活性突變體中。在細(xì)胞暴露30分鐘后，分離DISC復(fù)合物并通過Western印跡法分析顯示的蛋白。為了提供未受刺激的受體對(duì)照(u/s)，將生物素化wt或突變體TRAIL加入到未處理的細(xì)胞裂解物中。C:將從患有CLL患者獲得的新鮮分離細(xì)胞單獨(dú)或在縮酞(IOnM)存在的情況下溫浴16小時(shí)。隨后，將細(xì)胞在wtTRAIL(100ngml")或1ngml"的TRAILRl-5、TRAIL.R2-6、HGS-ETR1(ETR1)或HGS-ETR2(ETR2)中再暴露6小時(shí)，并評(píng)估細(xì)胞凋亡。用TRAIL.R1-5或TRAIL.R2-6(100ngml")獲得事實(shí)上相同的結(jié)果，但較高濃度顯示缺乏TRAIL.R2-6活性。用不同符號(hào)表示來自6個(gè)獨(dú)立患者的數(shù)據(jù)，實(shí)線表示平均值。為了清楚，省略了來自另一個(gè)患有高水平自發(fā)性細(xì)胞凋亡癥的患者數(shù)據(jù)，但其顯示了相同的趨勢。圖3示出TRAIL/TRAIL-R1復(fù)合物的模型以及TRAIL/TRAIL-R2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。A:TRAIL-R1和TRAIL-R2的序列比對(duì)。顯示的殘基編號(hào)是TRAIL-R2的編號(hào)(無其N末端的信號(hào)肽)；青色背景中的殘基在兩個(gè)結(jié)構(gòu)中相同，而且黃色背景中的那些殘基是保守的；在本文中討論了殘基Glu98(以藍(lán)色星號(hào)表示)和Arg(Ser)104(以紅色星號(hào)表示)在TRAIL/TRAIL-Rl/R2相互作用中的作用。B:TRAIL的序列和晶體學(xué)二級(jí)結(jié)構(gòu)(藍(lán)色)，示出TRAIL.Rl(紅色向下箭頭)和TRAIL.R2(藍(lán)色向上箭頭)取代的位置。C:TRAILAsnl99在TRAIL(黃色)/TRAIL-R1(青色)/R2(綠色)相互作用中的作用。在TRAIL-R1和-R2兩者中都存在的氫鍵顯示為黑色虛線，僅在TRAIL-R2中存在的氫鍵顯示為紅色虛線。由于TRIAL取代N199V而使這些氫鍵消失也進(jìn)行了圖解。D:TRAILTyr189在TRAIL(黃色)/TRAIL-Rl/R2(綠色)的相互作用中的作用。在TRAIL-R1/R2中從酪氨酸到保守的谷氨酸的氫鍵顯示為虛線。在TRAIL參與與Tyrl89疏水相互作用的殘基——在Y189取代的TRAIL中相互作用丟失一也已示出。使用ESPript(Gouet等，1999BioinformaticsVol.15,pp305-308)獲得圖A和圖B(PanelsAandB),使用PyMol(DeLano,2002:http:〃www.pymol.org)獲得圖C和圖D。具體實(shí)施例方式實(shí)施例利用下面的核心方法淋巴細(xì)胞的純化、細(xì)胞系和培養(yǎng)物如MacFarlane等(2005.CellDeathandDfferentiationvol.12第773-782頁)所述，培養(yǎng)Ramos和JurkatT細(xì)胞，其中所述Ramos細(xì)胞是EB病毒陰性巴克氏淋巴細(xì)胞系(Epstein-Barrvims-negativeBurkitt,slymphomacellline)。在患者同意和當(dāng)?shù)貍惱淼赖挛瘑T會(huì)批準(zhǔn)的情況下，從CLL患者中獲得血液樣品，按MacFarlane等(2002.Oncogene21,6809-6818)所述進(jìn)行CLL細(xì)胞純化。用E.Sausville博士(NCI,USA)提供的縮酞(IOnM)，將細(xì)胞溫育16小時(shí)。隨后，分別用下列材料將細(xì)胞再培養(yǎng)6小時(shí)HGSETRI或HS-ETR2，(HumanGenomeSciences,Roceville,MD)，其分別為TRAIL-R1或-R2的激動(dòng)性mAbs，His-TRAIL-LE(含有低內(nèi)毒素的重組TRAIL—AlexisCorporation,Nottingham,UK)，His-TRAIL，一種類似型的人重組TRAILE(MacFarlane等,1997.J.Biol.Chem272,25417-25420)但不另外進(jìn)行純化而減少內(nèi)毒素水平或一種如MacFarlan等(2005,同上)所描述的突變體型His-TRAIL突變體。在暴露于TRAIL之前，用分別來自Alexis和R&D系統(tǒng)的TRAIL-R1阻抑Ab和TRAIL-R2中和Ab將細(xì)胞系預(yù)溫育30分鐘。將來自患有MCL患者的新鮮分離細(xì)胞分離、純化并與上文描述CLL細(xì)胞所用形式不同的TRAIL溫育。馬上分析樣品的細(xì)胞凋亡或者保存于-S(TC供隨后的Western印跡使用。其他的方法和試劑如Inoue(004CellDeathDiffer77Swp;/2,S193-206)和MacFarlane等(2005,同上)所述。細(xì)胞凋亡的定量和Western印跡分析如MacFarlane等所述(2002,同上)在存在碘化丙啶的情況下，通過磷脂酰絲氨酸(PS)外翻來對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量。如Inoue等(2004，同上)和MacFarlane等(2005,同上)所述，制備用于Western印跡分析的樣品并進(jìn)行凋亡蛋白酶處理檢測。TRAIL突變體的合成使用Quik-Change定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene,CA,USA)，產(chǎn)生His-TRAIL突變體(殘基95-281)，利用DNA測序進(jìn)行確認(rèn)，并隨后在大腸桿菌中表達(dá)并純化，如前所述(MacFarlane等，1997，同上)。DISC分析將Ramos或Jurkat細(xì)胞(每次處理5><107個(gè)細(xì)胞)暴露于生物素標(biāo)記的重組His-TRAIL(生物素化TRAIL)或其一種突變體形式(500ngml—"中30分鐘，隨后評(píng)估DISC形成，如前所述(MacFarlane等，2002同上)。構(gòu)建TRAIL/TRAIL-R1復(fù)合物模型基于TRAIL/TRAIL-R2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，我們構(gòu)建了TRAIL/TRAIL-R2復(fù)合物模型。首先，基于TRAIL-R2的結(jié)構(gòu)，用同源性模式化("Modeller")獲得TRAIL-R1的結(jié)構(gòu)模型。隨后，在具有TRIAL的復(fù)合物中，通過讓TRAIL-R1模型的骨架原子與TRAIL-R2的相應(yīng)原子重疊，而構(gòu)建出TRAIL/TRAIL-R2復(fù)合物模型。實(shí)施例1:示例性和比較性的TRAIL突變體序列下列表格顯示與現(xiàn)有技術(shù)相比("Genentech")在選擇位點(diǎn)處的野生型TRAIL序列以及本發(fā)明的TRAIL突變體。特別優(yōu)選的本發(fā)明的TRAIL突變體是TRAIL.R1-4和TRAIL.R1-5。189191193199201209213215WtYRQNKYYSGenentech(=ARSVRYWDFLAG-Apo2L.DR4陽8)TRAIL.R1-5YRSVRYWDTRAIL.R1隱4YRQVRYWD另夕卜，該實(shí)施例的突變體比現(xiàn)有技術(shù)的突變體長，因?yàn)樗麄兒蠺RAIL的殘基95-281，而Genentech版本僅含有殘基114-281。TRAIL.R1-5突變體僅有一個(gè)氨基酸(=殘基189)不同于Genentech突變體。本發(fā)明的突變體保留了野生型酪氨酸，而Genentech突變體含有一個(gè)丙氨酸取代。通過體外結(jié)合測定，Genentech突變體顯示了對(duì)TRAILRl(DR4)的選擇性結(jié)合，但在經(jīng)由Rl發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞中沒有信號(hào)活性。我們證明，盡管Genentech突變體顯示了對(duì)Rl的選擇性結(jié)合，但其不具有任何R1特異性活性，艮口，其在經(jīng)由Rl發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞中不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而且，我們已經(jīng)證明，突變體TRAIL.Rl-5的確會(huì)誘導(dǎo)Rl選擇性細(xì)胞凋亡活性。這是本發(fā)明配體的意外作用，因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了用Ala取代Tyr-189對(duì)DR4選擇性很重要。TRAIL.R1-4也顯示了良好的Rl選擇性活性，從而強(qiáng)化了在位置189處的酪氨酸對(duì)R1選擇性細(xì)胞凋亡活性很重要這一發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例2:在原發(fā)性惡性淋巴瘤中TRAIL受體選擇性突變體經(jīng)由TRAIL-R1向細(xì)胞凋亡發(fā)出信號(hào)綜述基于使用激動(dòng)單克隆抗體(Mab)的研究，我們證明了盡管TRAIL-R2在細(xì)胞表面表達(dá)，但原發(fā)性慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)細(xì)胞可能主要通過TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)。我們已合成了對(duì)TRAIL-R1或TRAIL-R2具有特異性的突變體型TRAIL。這些突變體在細(xì)胞系中選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是因?yàn)樗鼈冞x擇性結(jié)合其同源受體，從而通過形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。使用這些突變體，我們確鑿地證明了，CLL和套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞幾乎無一例外地通過TRAIL-R1發(fā)出細(xì)胞凋亡信號(hào)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)這兩種TRAIL死亡受體可獨(dú)自發(fā)出信號(hào)，并且證明DR4受體-特異性突變體型TRAIL具有治療實(shí)用性。TRAIL受體選擇性突變體的細(xì)胞凋亡活性最近，基于對(duì)適當(dāng)?shù)氖荏w-Fc的親和性，利用新型噬菌體顯示法選擇出選擇性結(jié)合TRAIL-R1或-R2的TRAIL突變體。只有選擇性結(jié)合TRAIL-R2的突變體會(huì)在幾個(gè)細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而導(dǎo)致作者得出結(jié)論經(jīng)由TRAIL-R2而不是TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)對(duì)于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡更重要(Kdley等(2005JBioChemVolume280,第2205-2212頁))。然而，我們發(fā)現(xiàn)CLL細(xì)胞幾乎完全通過TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)。為了解決這個(gè)矛盾，我們合成了兩種突變體TRAIL.R1-6和TRAIL.R2-6(表1)，據(jù)報(bào)道分別對(duì)TRAIL-R1或-R2具有選擇性，并且評(píng)估了它們在Ramos和Jurkat細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，這兩種細(xì)胞分別主要通過TRAIL-R1禾QTRAIL-R2發(fā)出信號(hào)(MacFarlane等(2005CellDeathandDifferentiationvolume12第773-782頁))。HGS-ETR2和TRAIL.R2-6兩者，其為TRAIL-R2選擇性突變體，都有力地在Jurkat細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但在Ramos細(xì)胞中沒有誘導(dǎo)，如通過磷脂酰絲氨酸(PS)外翻所評(píng)估的(圖1A和B)。這些數(shù)據(jù)與以前的研究相一致，支持TRAIL.R2-6(表l)是選擇性TRAIL-R2突變體的結(jié)論。然而，TRAIL.Rl-6—推薦的TRAIL-R1選擇性突變體(Kelley等，2005)，在Jurkat細(xì)胞中如預(yù)料的一樣沒有活性，但在Ramos細(xì)胞中也大體沒有活性(圖1A&B和表1)。我們原本預(yù)測這種突變體在Ramos細(xì)胞中會(huì)有活性，分析觀察到無活性(Kelley等，2005)的原因是由于使用了主要通過TRAIL-R2而不是TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞系?；钚缘膩G失顯然是因?yàn)閷?duì)TRAIL.R1-6中6個(gè)靶氨基酸殘基中的一些或者全部進(jìn)行了取代。為了證明這一點(diǎn)，我們合成了在野生型(wt)蛋白和TRAIL,Rl-6(表l)之間具有中間取代的TRAIL突變體，并檢測了它們在Ramos和Jurkat細(xì)胞中的活性，目的是獲得在Ramos細(xì)胞中選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的突變體。首先，由于兩個(gè)氨基酸取代Tyr213Trp和Ser215Asp都包括在噬菌體顯示文庫中的全部TRAIL-R1突變體中，我們檢測了TRAIL.Rl-2，因?yàn)樗鼈儗?duì)TRAIL-Rl-Fc具有相似的親和性，但對(duì)TRAIL-R2-Fc的親和性則低10倍(Kelley等，2005)。然而，這種突變體在Ramos和Jurkat細(xì)胞中對(duì)wtTRIAL都具有非常相似的活性(表1)，表明其既對(duì)TRAIL-R1沒有特異性，也對(duì)R2沒有特異性。接下來，我們檢測了TRAL.Rl-4突變體，其在Ramos細(xì)胞中對(duì)wtTRAIL誘導(dǎo)相似水平的細(xì)胞凋亡，但在Jurkat細(xì)胞中則顯示活性降低(表1)，表明對(duì)TRAIL-R1具有一定程度的選擇性。在Tyrl89Ala處進(jìn)行另外的取代獲得TRAIL.Rl-5a突變體，由于其對(duì)Jurkat細(xì)胞完全無活性且對(duì)顯著地減少了對(duì)Ramos細(xì)胞的活性(表1)，因此該突變體丟失了對(duì)TRAIL-R2的所有活性但也丟失了對(duì)TRAIL-R1的許多活性。這就促使我們對(duì)僅有Tryl89Ala的單個(gè)氨基酸取代的作用進(jìn)行了檢測。與wtTRAIL相比，TRAIL.R1在Ramos細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中顯現(xiàn)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力降低(表1)。由于TRAIL.Rl-5a突變體中的Tyrl89Ala取代導(dǎo)致在Ramos細(xì)胞中沒有活性，因此我們選擇從原始的TRAIL.R1-6中忽略這種取代。所得的突變體，TRAIL.Rl-5，保留了對(duì)Ramos細(xì)胞的大部分wtTRAIL活性，但丟失了許多其對(duì)Juarkat細(xì)胞的wtTRAIL活性(表1)。其他的研究顯示，這種突變體顯示在Ramos細(xì)胞中，與wtTRAIL非常相似的濃度反應(yīng)，但在Jurkat細(xì)胞中就比wtTRAIL的活性要低很多(圖1A和B)。因此，這種突變體顯示出主要通過經(jīng)由TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的所需特性。TRAIL.R1-5突變體在Ramos細(xì)胞中通過TRAIL-R1發(fā)出信號(hào)的特異性是通過對(duì)TRAIL-R1而非TRAIL-R2特異性的阻抑抗體抑制細(xì)胞凋亡而得到證實(shí)的(圖1C)。TRAIL-R2中和性Ab的特異性是從其在Jurkat細(xì)胞中抑制TRAIL.R2-6和HGS-ETR2-誘導(dǎo)性細(xì)胞凋亡的能力而得以證實(shí)的(圖1C)。凋亡蛋白酶活性為了證實(shí)突變體能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，我們檢測了它們對(duì)加工凋亡蛋白酶-8(在死亡受體-誘導(dǎo)性細(xì)胞凋亡中的頂端凋亡蛋白酶)和凋亡蛋白酶-3(效應(yīng)器凋亡蛋白酶)的效力。在Ramos細(xì)胞中，wtTRAIL、TRAIL.R1-5以及HGS-ETR1，但非TRAIL.R2-6或HGS-ETR2，誘導(dǎo)凋亡蛋白酶-8加工成p43/41型和其p18催化活性大亞基，以及凋亡蛋白酶-3加工成其活性大亞基pl9/17(圖1D)。在Jurkat細(xì)胞的標(biāo)記性對(duì)照中，wtTRAIL、TRAIL.R2-6和HGS-ETR2在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(表1)和誘導(dǎo)凋亡蛋白酶-8和-3加工中(圖1D，泳道2、3禾B6)都最有效。TRAIL.R1-5和HGS-ETR1都誘導(dǎo)了少量的凋亡蛋白酶加工(圖1D，泳道4和5)，其與在Jurkat細(xì)胞中誘導(dǎo)低水平細(xì)胞凋亡的能力相當(dāng)(圖1A)并與少量殘留的TRAIL-R1信號(hào)一致。我們的發(fā)現(xiàn)——在Jurkat細(xì)胞中，TRAIL-R1阻抑性Ab會(huì)阻抑TRAIL.R1-5禾BHGS-ETR1而非TRAIL.R2-6或HGS-ETR2-誘導(dǎo)性細(xì)胞凋亡為這種觀點(diǎn)提供了支持(圖1Q。將這些資料合在一起就證明了，TRAIL.R1-5和TRAIL.R2-6分別對(duì)TRAIL-R1和TRAIL-R2是相對(duì)特異性的。TRAIL突變體蛋白誘導(dǎo)的DISC形成因?yàn)樾纬苫钚訢ISC在許多類型的死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中經(jīng)常是速度受限的，因此我們檢測了突變體蛋白在Ramos細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞兩者中形成DISC的能力。生物素化的wtTRAIL結(jié)合TRAIL-R1禾口-R2兩者，并且向Ramos細(xì)胞中的天然DISC募集FADD和凋亡蛋白酶-8,并且將凋亡蛋白酶-8加工為其p43和p41型(圖2A泳道2)。推薦的TRAIL-Rl選擇性突變體即TRAIL.R1-6(Kelley等，2005)或TRAIL-R2選擇性突變體即TRAIL.R2-6都不結(jié)合可檢測量的TRAIL-R1或R2，因此不能向DISC募集FADD或凋亡蛋白酶-8(圖2A泳道6和8)，據(jù)此解釋了它們不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖1和表1)。然而，TRAIL.Rl-5，我們的選擇TRAIL-R1突變體之一(圖1和表1)，主要結(jié)合TRAIL-R1和小量TRAIL-R2，募集FADD和凋亡蛋白酶-8，并將后者加工為其p43/41形式(圖2A泳道4)。因此，在Ramos細(xì)胞中，突變體如TRAIL.R1-5選擇性地結(jié)合與TRAIL-R1，在DISC中募集FADD隨后募集并活化凋亡蛋白酶-8。相反，在Jurakt細(xì)胞中，wtTRAIL和TRAIL.2-6(TRAIL-R2選擇性突變體)在DISC中廣泛結(jié)合TRAIL-R2并募集FADD和凋亡蛋白酶-8，凋亡蛋白酶-8也被加工為其p43/41的形式(圖2B泳道2和8)。無活性的突變體TRAIL.R1-6既不結(jié)合TRAIL-R1也不結(jié)合-R2，并且不為DISC募集FADD或凋亡蛋白酶-8(圖2B泳道6)。TRAIL.Rl-5結(jié)合小量TRAIL-R1禾口-R2以及一些DISC中的FADD和小量凋亡蛋白酶-8，所述凋亡蛋白酶-8也進(jìn)行了部分加工(圖2B泳道4)，這些數(shù)據(jù)合在一起證明了在Ramos細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中分別形成主要含有TRAIL-R1或TRAIL-R2的DISC是至關(guān)重要的。因此，配體中的微小結(jié)構(gòu)變化會(huì)使得其優(yōu)先與TRAIL-R1或-R2結(jié)合，從而決定其在適當(dāng)?shù)陌壹?xì)胞中形成DISC和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。取代對(duì)TRAIL和TRAIL-R1相互作用的影響為了獲得TRAIL突變對(duì)TRAIL結(jié)合TRAIL-R1影響的了解(表1)，我們構(gòu)建了TRAIL/TRAIL-R1復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型，并將其與TRAIL/TRAIL-R2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。兩種蛋白(TRAIL-R1和TRAIL-R2在其胞外結(jié)構(gòu)域中共享64%的氨基酸序列同一性)(圖3A)間的序列相似性水平促進(jìn)了該比較。如以前所觀察的，TRAIL與TRAIL-R2發(fā)生相互作用是通過含對(duì)高親和性結(jié)合重要的殘基的兩個(gè)主要的相互作用塊(interactionpatches)而進(jìn)行的。第一個(gè)相互作用塊是TRAIL/TRAIL-R2復(fù)合物頂部附近的疏水區(qū)，稱為50s環(huán)(50sloop)，其在許多TNF超家族成員中是保守的。第二個(gè)塊是稱為受體環(huán)(receptorloop)的區(qū)域，其在細(xì)胞膜附近靠近該復(fù)合物的底部，含有對(duì)每一個(gè)單個(gè)家族成員具有特異性的特征并且調(diào)控受體選擇性(圖3A)。受體環(huán)，其含有殘基91-104，與在三聚體復(fù)合物底部附近的TRAIL的Gln205周圍的殘基簇相互作用(圖3B)。與wtTRAIL相比，在TRAIL.R1-2中最初的取代，TRA213Trp和Ser215Asp，沒有對(duì)Ramos或Jurkat細(xì)胞顯示任何不同的作用(表1)。然而，進(jìn)一歩的兩個(gè)取代，即Asnl99Val和Lys201Arg，導(dǎo)致突變體TRAIL.R1-4,其保留了wtTRAIL對(duì)Ramos的活性，但失去了對(duì)Jurkat細(xì)胞的一些活性(表1)，因此，與TRAIL-R2相比，顯示了一些對(duì)經(jīng)由TRAILL-R1發(fā)出信號(hào)的選擇性。對(duì)TRAIL/TRAIL-R1(我們的模型)和TRAIL/TRAIL-R2界面的分析表明，TRAIL-R1選擇性的微小增加可能是因?yàn)锳snl99Val(但不是Lys201Arg)取代。在TRAIL/TRAIL-R2中，預(yù)測這種取代會(huì)引起兩個(gè)氫鍵的丟失(對(duì)Argl04的側(cè)鏈以及對(duì)Cysl25的羰基主鏈)。相反，Asnl99Val取代可能導(dǎo)致TRAIL/TRAIL-Rl中僅一個(gè)蛋白間氫鍵的丟失，因?yàn)樵赥RAIL-R1中，Argl04的等同物是一個(gè)更短的Ser殘基，其不能與Asnl99形成氫鍵(圖3A和C)。Tyrl89Ala取代存在于兩種TRAIL突變體即TRAI.R1-6和TRAIL.Rl-5a中，它們兩個(gè)都顯示了活性的顯著丟失(表1)。在TRAIL-R1禾B-R2結(jié)合中Tyrl89的重要性可通過直接和間接作用來合理化。Tyrl89會(huì)與TRAIL-R1和R2兩者中的保守Glu(對(duì)應(yīng)于TRAIL-R2中的Glu98)形成氫鍵。Tyrl89Ala取代除去了TRAIL/TRAIL-R1和-R2復(fù)合物中的氫鍵(圖3D)。Tyrl89Ala取代也會(huì)除去與接近TRAIL表面的Argl91、Asp267、Ala272HELys224的疏水相互作用(圖3D)。因此，這種取代通過使TRAIL表面變形而間接地影響了配體結(jié)合。實(shí)施例3:TRAIL-R1但非TRAIL-R2選擇性突變體在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡本實(shí)施例中的癌細(xì)胞是血液惡性腫瘤細(xì)胞如CLL細(xì)胞和MCL細(xì)胞。我們公開了，TRAIL通過經(jīng)由TRAIL-R1但非TRAIL-R2發(fā)出信號(hào)而在CLL細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。選擇性TRAIL突變體的合成使我們明確地證明了這一點(diǎn)?？s酞使CLL細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡變得敏感(圖2C)。最重要的是，縮酞使CLL細(xì)胞對(duì)TRAILR1-5即TRAL-R1選擇性突變體而不使TRAIL.R2-6即TRAIL-R2選擇性突變體變得敏感(圖2C)。而且縮酞使CLL細(xì)胞對(duì)HGS-ETR1即激動(dòng)性TRAIL-R1Ab而不使HGS-ETR2即TRAIL-R2激動(dòng)性Ab變得敏感(圖2C)。我們也從患套細(xì)胞淋巴瘤(MCI)的患者中獲得了三個(gè)樣品，套細(xì)胞淋巴瘤是一種不可治愈的侵入性疾病，其占所有非霍奇金氏淋巴瘤的6%。對(duì)于MCL沒有標(biāo)準(zhǔn)的治療，并且特別是對(duì)于母細(xì)胞變異型(blastoidvariant)的預(yù)后很糟。分離MCL細(xì)胞，在用縮酞(5nM)預(yù)處理16小時(shí)后，將其暴露于不同形式的TRAIL中。用原發(fā)性MCL細(xì)胞，獲得基本上與CLL細(xì)胞相似的結(jié)果。wtTRAIL(25.5士3.8。/。)沒有增加,但縮酞(35.4士5。/。)增加了自發(fā)性細(xì)胞凋亡(23.4±2.9%)。縮酞使MCL細(xì)胞對(duì)HGS陽ETR1(68.2士6.10/。)和TRAIL.R1-5(54.3±9.1%)但不對(duì)HGS-ETR2(38.3±4.3%)或TRAIL.R2-6(35.5土3.1。/。)變得敏感。這些數(shù)據(jù)合在一起明確地證明了TRAIL在包括CLL和MCL細(xì)胞的血液惡性腫瘤中，主要通過激活TRAL-R1而不是TRAIL-R2來向細(xì)胞凋亡發(fā)出信號(hào)。通過使用TRAIL-R1或TRAIL-R2選擇性突變體，我們已經(jīng)明確地證明了新鮮分離的CLL和MCL細(xì)胞，其直接從患者獲得，幾乎無一例外地經(jīng)由TRAIL-R1而非TRAIL-R2向細(xì)胞凋亡發(fā)出信號(hào)。無論其他的腫瘤亞型的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳輸優(yōu)選通過一種TRAIL受體還是其他的TRIAL受體，其都可以相同的方式方便地進(jìn)行測定。這些結(jié)果對(duì)于用TRAIL或其激動(dòng)性Abs的合理治療具有顯著的意義。如果原發(fā)性腫瘤，如CLL或MCL，主要通過TRIAL-R1發(fā)出信號(hào)，那么根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)該不要制備幾乎無一例外地通過TRAIL-R2發(fā)出信號(hào)的TRAIL,如HGS-ETR2(HumanGenomeScience)或Apo2L/TRAIL(Genentech)，并且作為替代，應(yīng)該使用根據(jù)本發(fā)明的DR4選擇性TRAIL。我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)，在開始治療前，即在診斷環(huán)境中，確定原發(fā)性腫瘤細(xì)胞是否經(jīng)由TRAIL-R1或經(jīng)由-R2發(fā)出信號(hào)是非常關(guān)鍵的。而且，我們的數(shù)據(jù)證明，TRAIL中的微小結(jié)構(gòu)變化會(huì)讓其優(yōu)先與TRAIL-R1或TRAIL-R2結(jié)合，隨后通過募集FADD和凋亡蛋白酶-8來形成TRAIL-R1或-R2DISC。顯然，此類突變的配體在治療中有用。表1各種TRAIL突變體的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>3從His標(biāo)記的TRAIL(95-281)中產(chǎn)生突變體。突變體用如Rl或R2標(biāo)記顯示，合成的該突變體分別對(duì)TRAIL-R1或-R2有特異性。突變體最后的數(shù)字表示與wtTRAIL相比的氨基酸取代數(shù)目。b氨基酸相對(duì)于野生型TRAIL的變化以粗體顯示。破折號(hào)表示在來自野生型TRAIL的氨基酸中沒有變化。e在TRAIL或其突變體(500ngml-l)中暴露4小時(shí)后，采用磷脂酰絲氨酸外翻，在指定的細(xì)胞類型中測量細(xì)胞凋亡。結(jié)果表示為至少三個(gè)獨(dú)立測定的平均值士SEM。實(shí)施例4:受體選擇性TRAIL突變體和對(duì)不同癌癥的應(yīng)用在本實(shí)施例中，我們進(jìn)一步提供了優(yōu)選的突變TRAIL配體。我們還證明了本發(fā)明對(duì)非血液癌(如非B細(xì)胞衍生的癌癥)如乳腺癌的應(yīng)用。如MacFarlane等(2005，同上)所述，培養(yǎng)Ramos細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞(克36隆E6-1)。如以前所述(MacFarlane等，2000J.CellBiol.148，1239-1254)，培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(克隆F43)。細(xì)胞用His-TRAIL(MacFarlane等，1997JBiolChem272,25417-25420)、HGS-ETR1或HGS-ETR2(HumanGenomeSciences),或突變體型His-TRAIL(MacFarlane等，2005同上)培養(yǎng)4小時(shí)(Ramos禾卩Jurkat)或6小時(shí)(MCF-7)。如MacFarlane等所述(2005同上；MacFarlane等，2002Oncogene21，6809-6818)，分析樣品的細(xì)胞凋亡、Western印跡或TRAILDISC激活。如MacFarlane等(1997同上)所述，利用Quik-Change定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene,CA)，產(chǎn)生His-TRAIL突變體(殘基95-281)，通過DNA測序進(jìn)行證實(shí)，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并純化。對(duì)于耙向TRAIL-R1/-R2的siRNA來說，在具有Ren等(2004Mol.Biol.Cell第15巻第5064-5074頁)所述的序列和有效性的情況下，在用陰性對(duì)照siRNA(30nM,Ambion,#461l)或TRAIL-R1或TRAIL-R2的預(yù)退火的siRNA寡核苷酸進(jìn)fi1effectene介導(dǎo)的RANi轉(zhuǎn)染(effectene-mediatedRNAitransfection)前，直接將MCF-7細(xì)胞接種到6孔板中。轉(zhuǎn)染40小時(shí)后，收集細(xì)胞，并評(píng)估總的TRAIL-R1或TRAIL-R2水平。特別注明，對(duì)RANi轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞不進(jìn)行處理或者將其暴露于wtTRAIL中，并根據(jù)Bax激活的程度評(píng)估細(xì)胞凋亡，所述激活程度利用構(gòu)象特異性BaxMab(conformationspecificBaxMAb)即克隆3進(jìn)行測定(Dewson等，2003Oncogene第22巻第2643-54頁)。另外的TRAIL-R1選擇性TRAIL突變體在本實(shí)施例中，我們證明了TRAIL中的單個(gè)氨基酸取代可賦予對(duì)TRAIL-Rl的特異性。參閱圖4:用濃度增加的His-TRAIL(100-1000ng/ml)或His-TRAIL(500ng/ml)的Argl91Leu或Asnl99Val單突變體、ETR1或ETR2(1000ng/ml)將Ramos細(xì)胞(A)和Jurkat細(xì)胞(B)培養(yǎng)4小時(shí)。通過測量y。PS+細(xì)胞，定量細(xì)胞凋亡，顯示于圖4中的結(jié)果為三次獨(dú)立測定的平均值土SEM。因此，在TRAIL-R1選擇性中TRAIL殘基R191和N199的生物重要性得以顯示。而且，顯示TRAILR191L和TRAILN199V是TRAIL-R1選擇性TRAIL突變體。不同癌癥細(xì)胞對(duì)DR4選擇性TRAILs的應(yīng)答使用本發(fā)明的受體-選擇性sTRAIL突變體揭露了乳腺癌細(xì)胞系MCF-7經(jīng)由TRAIL-R1向細(xì)胞凋亡發(fā)出信號(hào)。參閱圖5:(A)用濃度增加的wtTRAIL、TRAIL.Rl-5、TRAIL.R2-6(500-1000ng/ml)或ETR1、ETR2(500-2000ng/ml)將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)。利用Western印跡法，通過測量加工的凋亡蛋白酶-8、凋亡蛋白酶-7和PARP來對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量。將凋亡蛋白酶-8加工為其p43/p41型和其pl8大亞基，凋亡蛋白酶-7加工為其pl9大亞基，PARP加工為其p85切割產(chǎn)物。(B)通過TRAILDISC激活分析，進(jìn)一步證實(shí)MCF-7細(xì)胞中的TRAIL.R1-5選擇性，其揭露了僅TRIAL.R1-5即TRAIL-Rl-選擇性突變體會(huì)導(dǎo)致在DISC募集和加工凋亡蛋白酶-8，根據(jù)三次獨(dú)立試驗(yàn)的一個(gè)試驗(yàn)代表顯示結(jié)果。革巴向TRAIL-R1和TRAIL-R2的siRNA也揭露了sTRAIL在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中經(jīng)由TRAIL-R1向細(xì)胞凋亡發(fā)出信號(hào)。僅用effectene或存在陰性對(duì)照siRNA(30nM)或TRAIL-Rl或TRAIL-R2(30nM)的預(yù)退火的siRNA寡核苷酸時(shí)用effectene轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。參閱圖6:(A)轉(zhuǎn)染40小時(shí)后，收集細(xì)胞，并評(píng)估總的TRAIL-R1或TRAIL-R2的水平。(B)將RNAi轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞暴露于wt-TRAIL下，根據(jù)Bax的激活程度，評(píng)估細(xì)胞凋亡，所述激活程度利用構(gòu)象特異性BaxMAb即克隆3來測定。根據(jù)三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的一個(gè)試驗(yàn)代表顯示結(jié)果。(C)在三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中，在存在或不存在指定的siRNA的情況下，評(píng)估Bax激活的程度。顯示的結(jié)果為平均值士SEM。這些數(shù)據(jù)顯示乳腺癌細(xì)胞，如MCF7細(xì)胞系，通過DR4發(fā)出信號(hào)，并且因此，肯定地證明了DR4信號(hào)傳輸在不同癌癥以及血液衍生性癌癥中是非常重要的。因此這些發(fā)現(xiàn)還闡明了本發(fā)明的DR4特異性(DR4選擇性)突變體TRAILs的工業(yè)應(yīng)用。引入以上說明書中提到的所有出版物作為參考。在沒有偏離本發(fā)明范圍的情況下，對(duì)本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)作各種修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。盡管根據(jù)具體優(yōu)選的實(shí)施方案，已對(duì)本發(fā)明作了描述，但應(yīng)該理解，不應(yīng)該將如權(quán)利要求所述的本發(fā)明不適當(dāng)?shù)叵拗朴诖祟惥唧w的實(shí)施方案。事實(shí)上，為了實(shí)施本發(fā)明，對(duì)所述的模式作各種修改~"這些修改對(duì)生物化學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，都意欲落在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.能通過DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL，其包含位置189處的Y。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TRAIL,其還包含-(i)191L;或(ii)199V;或(iii)193S。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的TRAIL，其還包含201R、213W和215D。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的TRAIL,其包含對(duì)應(yīng)于TRAIL的至少氨基酸95-281的序列。5.能通過DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL在治療癌癥中的用途。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述癌癥是B細(xì)胞惡性腫瘤。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用途，其中所述癌癥是慢性淋巴細(xì)胞白血病或套細(xì)胞淋巴瘤或B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤。8.通過施用能通過DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL來治療受試者癌癥的方法，所述方法包括確定所述受試者的靶細(xì)胞是否經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)，其中如果所述靶細(xì)胞經(jīng)由DR4發(fā)出信號(hào)，則施用能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其還包括施用敏化劑。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述敏化劑是HDAC抑制劑。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述HDAC抑制劑是丙戊酸。12.能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL在制備用于預(yù)防或治療癌癥的藥物中的用途，其中所述癌癥細(xì)胞通過DR4發(fā)出信號(hào)。13.治療受試者B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，所述方法包括向所述受試者施用能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL。14.治療受試者B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤或套細(xì)胞淋巴瘤或慢性淋巴細(xì)胞白血病的方法，所述方法包括向所述受試者施用能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其還包括向所述受試者施用組蛋白脫乙酰酶抑制齊IJ(HDACi)。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中在施用所述HDACi后，施用戶/f述TRAIL。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中在施用所述HDACi至少8個(gè)小時(shí)后，施用所述TRAIL。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中在施用所述HDACi至少16個(gè)小時(shí)后，施用所述TRAIL。19.根據(jù)權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中在約8-16小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)施用所述HDACi。20.根據(jù)權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中在約4小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)施用TRAIL。21.在血液惡性細(xì)胞中誘導(dǎo)死亡誘導(dǎo)性信號(hào)復(fù)合物(DISC)形成的方法，其包括使所述細(xì)胞與組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)和能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL接觸。22.在血液惡性細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡蛋白酶激活的方法，其包括使所述細(xì)胞與組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)和能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL接觸。23.根據(jù)權(quán)利要求15-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述HDACi選自如下組成的組縮酞、曲古霉素A(TSA)和丙戊酸。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述HDACi是丙戊酸。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述丙戊酸是丙戊酸納。26.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的TRAIL，其還包含非肽多聚體。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的TRAIL,其中所述多聚體選自如下組成的組聚乙二醇、聚丙二醇和聚醚。28.試劑盒，其含有能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的TRAIL和敏化劑。29.根據(jù)權(quán)利要求8-11或權(quán)利要求13-25所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求5、6、7或12所述的用途，或根據(jù)權(quán)利要求28所述的試劑盒，其中所述TRAIL是根據(jù)權(quán)利要求1-4、權(quán)利要求26或權(quán)利要求27中任一項(xiàng)所述的TRAIL。全文摘要本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)，其能通過死亡受體4(DR4)選擇性地發(fā)出信號(hào)，其包含位置189的Y。優(yōu)選，TRAIL還包含19IL和/或199V；優(yōu)選，201R、213W和215D，和/或優(yōu)選還包含193S。本發(fā)明還涉及能經(jīng)由DR4選擇性地發(fā)出信號(hào)的此類TRAIL突變體在治療癌癥中的用途，以及在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。優(yōu)選，癌癥是慢性淋巴細(xì)胞白血病、套細(xì)胞淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。本發(fā)明還涉及包含它們的試劑盒。文檔編號(hào)C07K14/705GK101389651SQ200680050731公開日2009年3月18日申請日期2006年11月29日優(yōu)先權(quán)日2005年11月29日發(fā)明者杰勒德·M·科恩,邁克爾·薩特克利夫,馬里恩·麥克法蘭申請人:醫(yī)藥研究委員會(huì);萊斯特大學(xué)