一種防止神經(jīng)毒素Anntoxin失活的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防止神經(jīng)毒素Anntoxin失活的方法，其目的在于克服神經(jīng)毒素Anntoxin在蛋白游離狀態(tài)下容易被分解而失去活性且毒性不能有效針對昆蟲產(chǎn)生的問題。本發(fā)明將神經(jīng)毒素Anntoxin包埋在多角體中，使得神經(jīng)毒素Anntoxin不會受到環(huán)境影響而失活，長時間保存活性。此外，將神經(jīng)毒素Anntoxin包埋在多角體中，多角體易于被昆蟲食入，在昆蟲體內(nèi)降解釋放神經(jīng)毒素Anntoxin起作用，而多角體在爬行類、鳥類和哺乳類動物體內(nèi)穩(wěn)定，不會被降解而釋放神經(jīng)毒素Anntoxin。
【專利說明】-種防止神經(jīng)毒素 Anntox i η失活的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] Anntoxin是由雨蛙產(chǎn)生的一類對昆蟲、爬行類、鳥類和哺乳類動物具有很強(qiáng)致死 毒性的基因編碼的神經(jīng)毒素?？蓱?yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲的殺滅，但該蛋白質(zhì)（Anntoxin)不穩(wěn)定，在 環(huán)境中易被分解而失去活性，因此很難用于生物殺蟲劑。此外，單獨的Anntoxin不但對于 昆蟲有很強(qiáng)的致死毒性，同時對于爬行類、鳥類和哺乳類動物也同樣有很強(qiáng)的致死毒性，這 樣即使Anntoxin能穩(wěn)定存在能用于生物殺蟲劑，但是使用后毒性很威脅到各種動物及人， 因此也是無法應(yīng)用的。
[0003] 桿狀病毒中的核型多角體病毒在感染宿主后的晚期能夠產(chǎn)生大量的多角體蛋白， 并聚合形成一種獨特的超大分子蛋白質(zhì)結(jié)晶-多角體。它的功能是保護(hù)病毒顆粒免受外界 各種不良環(huán)境的破壞，它對各種蛋白分解酶有抗性，而在堿中易溶解，釋出病毒粒子，目前 的研究表明多角體的功能主要保護(hù)包埋在多角體內(nèi)部的病毒粒子，使之長時間保存活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服神經(jīng)毒素 Anntoxin在蛋白游離狀態(tài)下容易被分解而失去 活性且毒性不能有效針對昆蟲產(chǎn)生的問題，提供了一種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的方 法，將神經(jīng)毒素 Anntoxin包埋在多角體中，使得神經(jīng)毒素 Anntoxin不會受到環(huán)境影響而失 活，長時間保存活性。此外，將神經(jīng)毒素 Anntoxin包埋在多角體中，多角體易于被昆蟲食 入，在昆蟲體內(nèi)降解釋放神經(jīng)毒素 Anntoxin起作用，而多角體在爬行類、鳥類和哺乳類動 物體內(nèi)穩(wěn)定，不會被降解而釋放神經(jīng)毒素 Anntoxin。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是： 一種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的方法，包括以下步驟： (1) 神經(jīng)毒素 Anntoxin基因的克隆： 以從華西雨蛙(華西雨蛙的皮膚組織)抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到 神經(jīng)毒素 Aw 基因；RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用的引物包括正向引物和反向引物，正向引物 的序列見SEQ ID N0. 1，反向引物的序列見SEQ ID N0. 2 ; 本發(fā)明設(shè)計了特定的引物用以擴(kuò)增得到神經(jīng)毒素基因； 利用瓊脂糖凝膠電泳對神經(jīng)毒素基因進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析和純化，隨后將PCR 產(chǎn)物克隆進(jìn)pGEM-T Easy載體，得到pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體； (2) 含有神經(jīng)毒素 Anntoxin基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建： 用限制性內(nèi)切酶漢和ZAa/消化pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體得到J/wioxi/? 基因片段，然后將基因片段克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA得到重組的轉(zhuǎn) 移載體； 將得到的重組的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DHlOBmBac (polh+)感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞的選擇十 分重要，若不是選擇這樣的感受態(tài)細(xì)胞，則將不能形成多角體，也就不能包被神經(jīng)毒素)，擴(kuò) 大培養(yǎng)后，用PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行鑒定，提取陽性克隆的Bacmid DNA (現(xiàn)有常規(guī)方法)，將 Bacmid DNA、陽離子脂質(zhì)體和無血清的TC-100培養(yǎng)基混合物在室溫培育15min后轉(zhuǎn)染對數(shù) 生長期的家蠶Bm5細(xì)胞，將該轉(zhuǎn)染后的家蠶Bm5細(xì)胞先用無血清的TC-100培養(yǎng)基在27°C條 件下培養(yǎng)5h，再用含有10% (體積比）胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基在27 °C條件下培養(yǎng)120 h，收集上清進(jìn)行二次感染，獲得相應(yīng)的重組病毒，命名為vBmBac(polh+)-Anntoxin ; (3)家蠶Bm5細(xì)胞內(nèi)表達(dá)： 對家蠶Bm5細(xì)胞接種步驟（2)獲得的重組病毒，在27°C下感染三天以進(jìn)行感染表達(dá)，然 后離心收集家蠶Bm5細(xì)胞，用PBS緩沖液重懸后超聲破碎，離心收集多角體粗提物，將多角 體粗提物加入Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液混合液中，離心后收集純凈的多角體，最 后將純凈的多角體懸浮于含0.1% (體積比）SDS的PBS緩沖液中，室溫放置5 min，然后 用PBS緩沖液洗滌后得到最終純化的內(nèi)部固定有神經(jīng)毒素 Anntoxin的多角體。
[0006] 本發(fā)明利用能夠形成多角體的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)神經(jīng)毒素 Anntoxin，將重組 病毒感染家蠶Bm5細(xì)胞，這樣產(chǎn)生的多角體在細(xì)胞內(nèi)會將神經(jīng)毒素 Anntoxin包埋和固定入 多角體內(nèi)部。這樣解決了神經(jīng)毒素 Anntoxin容易失活的缺點，為開發(fā)神經(jīng)毒素 Anntoxin 作為生物殺蟲劑創(chuàng)造了條件。此外，將神經(jīng)毒素 Anntoxin包埋在多角體中，多角體易于被 昆蟲食入，在昆蟲體內(nèi)降解釋放神經(jīng)毒素 Anntoxin起作用，而多角體在爬行類、鳥類和哺 乳類動物體內(nèi)穩(wěn)定，不會被降解而釋放神經(jīng)毒素 Anntoxin。
[0007] 作為優(yōu)選，所述RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：一個循環(huán)，94°C模板變性5分鐘；接著35 個循環(huán)，94°C變性50秒，57°C退火30秒，72°C延伸25秒；最后1個循環(huán)，72°C延伸7分 鐘。
[0008] 作為優(yōu)選，步驟（2)所述擴(kuò)大培養(yǎng)為：在含有50 μ g/ml卡那霉素、7 μ g/ml慶 大霉素、10 yg/ml四環(huán)素、100 yg/ml X-gal和40 yg/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上室 溫培養(yǎng)48h。
[0009] 作為優(yōu)選，步驟（2)中Bacmid DNA、陽離子脂質(zhì)體和無血清的TC-100培養(yǎng)基混合 物的制備方法為：將2μ g的Bacmid DNA、6y 1的陽離子脂質(zhì)體加入聚苯乙烯錐形管內(nèi)，補(bǔ) 充無血清的TC-100培養(yǎng)基至200 μ 1。
[0010] 作為優(yōu)選，步驟（2)中二次感染具體為將收集的上清用含有10% (體積比）胎牛血 清的TC-100培養(yǎng)基在27°C條件下培養(yǎng)96-120 h。
[0011] 作為優(yōu)選，步驟（3)中Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液混合液中Percoll細(xì)胞 分離液與PBS緩沖液的體積比為9:1。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是： 1、將神經(jīng)毒素 Anntoxin包埋在多角體中，使得神經(jīng)毒素 Anntoxin不會受到環(huán)境影響 而失活，長時間保存活性。
[0013] 2、將神經(jīng)毒素 Anntoxin包埋在多角體中，多角體易于被昆蟲食入，在昆蟲體內(nèi)降 解釋放神經(jīng)毒素 Anntoxin起作用，而多角體在爬行類、鳥類和哺乳類動物體內(nèi)穩(wěn)定，不會 被降解而釋放神經(jīng)毒素 Anntoxin。
[0014]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0016] 圖2是重組病毒感染家蠶Bm5細(xì)胞的顯微鏡圖。
[0017] 圖3是多角體中神經(jīng)毒素 Anntoxin的Western blotting圖， Μ代表Marker，1代表重組病毒感染家蠶Bm5細(xì)胞收集的多角體，2代表野生型病毒感 染家蠶Bm5細(xì)胞收集的多角體。

【具體實施方式】
[0018] 下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0019] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0020] 1、華西雨蛙：由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院提供。
[0021] 2、pGEM-T Easy 載體：購于公司。
[0022] 3、PCR產(chǎn)物純化試劑盒：購于公司。
[0023] 4、cDNA合成試劑盒：購于Promega公司。
[0024] 5、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFast BacHTA、lipofectin (陽離子脂質(zhì)體)和6XHis的單 克隆抗體：均為美國//? h 公司產(chǎn)品。
[0025] 6、胎牛血清FCS、無血清TC-100培養(yǎng)基均為Gko份￡公司的產(chǎn)品。
[0026] 7、Percoll細(xì)胞分離液是Pharmacia公司產(chǎn)品。
[0027] 8、X_gal、IPTG 購自 Sigma 公司。
[0028] 本發(fā)明使用的 PBS 緩沖液配方為：20 mmol/L NaH2P04, 20 mmol/L Na2HP04, 150 mmol/L NaCl;pH 7. 2〇
[0029] 實施例： (1)神經(jīng)毒素 Anntoxin基因的克?。?以從華西雨蛙的皮膚組織抽提的總RNA為模板(抽提RNA的方法為現(xiàn)有常規(guī)的TRIzol RNA提取方法)，利用RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到神經(jīng)毒素基因；所述PCR擴(kuò)增所用的 引物設(shè)計如下：正向引物為含有酶切位點的5' GGATCC ATGAAGACTTCTGTGGTTTTC 3' (SEQ ID NO. 1), 反向引物為含有油aJ酶切位點的5 ' TCTAGATTCTGCTGTCACGCAGGT 3 '（ SEQ ID NO. 2)； RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)具體過程為： cDNA合成：（采用市售cDNA合成試劑盒） 反應(yīng)體系：提取的總RNA 2 μ g 01igo(dT)15 0·5μ1(ΜΗ20補(bǔ)充至 5 yl，70°C 5min，然后冰上放置 5min; 5Xbuffer 4μ 1 dNTP 1. 0μ 1 核糖核酸酶抑制劑1.〇μ 1 逆轉(zhuǎn)錄酶?.Ομ 1 補(bǔ)充ddH20至15 μ 1 ;將兩者混合。
[0030] 擴(kuò)增體系：25°C退火 5min，42°C延伸 lh，70°C滅活 15min。
[0031] PCR 反應(yīng)體系：5 X buffer 4 μ 1 模板1 μ 1 dNTP 1. 0μ 1 正反向引物各0. 5 μ 1 Taq 酶(市售）0· 5μ 1 補(bǔ)充 ddH20 至 20 μ 1。
[0032] PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：一個循環(huán)，94°C模板變性5分鐘；接著35個循環(huán)，94°C變性 50秒，57°C退火30秒，72°C延伸25秒；最后1個循環(huán)，72°C延伸7分鐘。
[0033] 利用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳對神經(jīng)毒素基因進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，如圖1 所示，從圖1可得知擴(kuò)增得到了 基因片段，并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，隨后將 PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pGEM-T Easy載體，得到pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體，于上海英駿生物 技術(shù)有限公司對重組載體進(jìn)行測序，確認(rèn)擴(kuò)增序列的正確性。
[0034] (2)含有神經(jīng)毒素 Anntoxin基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建： 用限制性內(nèi)切酶(市售）和油aJ (市售）消化pGEM-T Easyj/wiozi/?重組載體 得到基因片段，然后將基因片段克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA 得到重組的轉(zhuǎn)移載體。
[0035] 將得到的重組的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DH10BmBac(polh+)感受態(tài)細(xì)胞 (DH10BmBac(polh+)感受態(tài)細(xì)胞的制備方法見 Xingwei Xiang 等，Construction of a BmNPV polyhedrin-plus Bac-to-Bac baculovirus expression system for application in silkworm, Bombyx mori, Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:289_295)，在含有 50 yg/ml 卡那霉素、7 yg/ml 慶大霉素、10 yg/ml 四環(huán)素、100 yg/ml X-gal 和 40 yg/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)48h，挑取白色單菌落，并用PCR擴(kuò)增的方法 進(jìn)行鑒定，提取陽性克隆的Bacmid DNA (Bacmid DNA提取方法為現(xiàn)有常規(guī)方法)，將2yg 的Bacmid DNA、6yl的陽離子脂質(zhì)體（lipofectin)加入聚苯乙烯錐形管內(nèi)，補(bǔ)充無血清的 TC-100培養(yǎng)基至200 μ 1得混合物，混合物在室溫培育15min后轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的家蠶Bm5 細(xì)胞，將該轉(zhuǎn)染后的家蠶Bm5細(xì)胞先用無血清的TC-100培養(yǎng)基在27°C條件下培養(yǎng)5h，再用 含有10%胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基在27 °C條件下培養(yǎng)120 h，收集上清進(jìn)行二次感染，二 次感染具體為將收集的上清用含有10% (體積比)胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基在27°C條件下 培養(yǎng)96-120 h，獲得相應(yīng)的重組病毒，命名為vBmBac(polh+)-Anntoxin; (3)家蠶Bm5細(xì)胞內(nèi)表達(dá)： 對家蠶Bm5細(xì)胞接種步驟（2)獲得的重組病毒，在27°C下感染三天以進(jìn)行感染表達(dá)， 后通過離心收集家蠶Bm5細(xì)胞(如圖2所示，圖2表明家蠶細(xì)胞被重組病毒感染)。用10 mLPBS緩沖液懸浮后超聲破碎。于4°C，15,000 rpm離心10 min收集多角體粗提物。將 Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液按9:1的體積比混合，調(diào)節(jié)pH至7. 2。將多角體粗提 物緩慢的加入Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液混合液中，4°C，12, 000 rpm離心20 min 后收集純凈的多角體。最后將純凈的多角體懸浮于含0.1% (體積比）SDS的PBS緩沖液 (即PBS緩沖液99. 9ml與0. lml SDS配置而成）中，室溫放置5 min，然后用PBS緩沖液 洗漆2次得到最終純化的內(nèi)部固定有神經(jīng)毒素 Anntoxin的多角體。
[0036] (4)多角體晶體固定神經(jīng)毒素 Anntoxin的分析鑒定： 將上述離心收集到的家蠶Bm5細(xì)胞樣品進(jìn)行超聲波破碎，釋放細(xì)胞內(nèi)的多角體，用碳 酸緩沖液裂解，經(jīng)15% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，進(jìn)行Western Blotting 檢測，對固定入多角體內(nèi)的重組神經(jīng)毒素 Anntoxin進(jìn)行鑒定，檢測多角體用的一抗是鼠抗 6父把8的單克隆抗體（1:1，000)，二抗是！1即標(biāo)記的羊抗鼠186抗體（1 :1，000，市售）， 最后使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(市售）顯色并拍照，如圖3所示，能特異性的檢測到一 條分子量較小、大小約為9 KDa的蛋白條帶，與預(yù)測的重組神經(jīng)毒素 Anntoxin分子量大小 一致，證明這是重組神經(jīng)毒素 Anntoxin，這說明除多角體蛋白外，多角體內(nèi)還含有神經(jīng)毒素 Anntoxin,這一結(jié)果表明利用多角體固定神經(jīng)毒素 Anntoxin蛋白成功。
[0037] 神經(jīng)毒素 Anntoxin基因的序列見基因數(shù)據(jù)庫GenBank，編號FJ598043. 1，具體如 下： ATGAAGACTTCTGTGGTTTTCTTGGTTGTCCTCGCTGCCGGCCTCTTCCTGCTGTCAGAAGGCGCTCAAGAT TATAGATGTCAGTTATCTAGGAATTATGGGAAAGGAAGTGGTTCTTTTACCAATTATTACTACGATAAAGCAACAAG CTCCTGTAAGACATTCAGATACCGCGGCTCCGGGGGAAATGGCAATAGATTCAAAACCCTCGAGGATTGTGAGGCGA CCTGCGTGACAGCAGAATAA (SEQ ID NO. 3)〇
[0038] 以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的 限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。 SEQUENCE LISTING 〈110>浙江省海洋開發(fā)研究院 〈120> -種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的方法 <130> 2014.03.21 <160> 3 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 27 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 1 ggatccatga agacttctgt ggttttc 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 2 tctagattct gctgtcacgc aggt 24 <210> 3 <211> 246 〈212> DNA 〈213> 雨蛙 〈400> 3 atgaagactt ctgtggtttt cttggttgtc ctcgctgccg gcctcttcct gctgtcagaa 60 ggcgctcaag attatagatg tcagttatct aggaattatg ggaaaggaag tggttctttt 120 accaattatt actacgataa agcaacaagc tcctgtaaga cattcagata ccgcggctcc 180 gggggaaatg gcaatagatt caaaaccctc gaggattgtg aggcgacctg cgtgacagca 240 gaataa 246
【權(quán)利要求】
1. 一種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 神經(jīng)毒素 Anntoxin基因的克?。? 以從華西雨蛙抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到神經(jīng)毒素 基因；RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列見SEQ ID NO. 1，反向引物的序列見SEQ ID NO. 2 ; 利用瓊脂糖凝膠電泳對神經(jīng)毒素基因進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析和純化，隨后將PCR 產(chǎn)物克隆進(jìn)pGEM-T Easy載體，得到pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體； (2) 含有神經(jīng)毒素 Anntoxin基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建： 用限制性內(nèi)切酶漢和ZAa/消化pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體得到J/wioxi/? 基因片段，然后將基因片段克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA得到重組的轉(zhuǎn) 移載體； 將得到的重組的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DH10BmBac(p〇lh+)感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后，用PCR擴(kuò) 增的方法進(jìn)行鑒定，提取陽性克隆的Bacmid DNA，將Bacmid DNA、陽離子脂質(zhì)體和無血清 的TC-100培養(yǎng)基混合物在室溫培育15min后轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的家蠶Bm5細(xì)胞，將該轉(zhuǎn)染后 的家蠶Bm5細(xì)胞先用無血清的TC-100培養(yǎng)基在27°C條件下培養(yǎng)5h，再用含有10%胎牛血 清的TC-100培養(yǎng)基在27 °C條件下培養(yǎng)120 h，收集上清進(jìn)行二次感染，獲得相應(yīng)的重組 病毒，命名為 vBmBac(polh+)_Anntoxin; (3) 家蠶Bm5細(xì)胞內(nèi)表達(dá)： 對家蠶Bm5細(xì)胞接種步驟（2)獲得的重組病毒，在27°C下感染三天以進(jìn)行感染表達(dá)，然 后離心收集家蠶Bm5細(xì)胞，用PBS緩沖液重懸后超聲破碎，離心收集多角體粗提物，將多角 體粗提物加入Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液混合液中，離心后收集純凈的多角體，最 后將純凈的多角體懸浮于含0. 1%SDS的PBS緩沖液中，室溫放置5 min，然后用PBS緩 沖液洗滌后得到最終純化的內(nèi)部固定有神經(jīng)毒素 Anntoxin的多角體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于：所 述RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：一個循環(huán)，94°C模板變性5分鐘；接著35個循環(huán)，94°C變性50 秒，57°C退火30秒，72°C延伸25秒；最后1個循環(huán)，72°C延伸7分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步驟（2)所述擴(kuò)大培養(yǎng)為：在含有50 yg/ml卡那霉素、7 yg/ml慶大霉素、10 yg/ml 四環(huán)素、100 yg/ml X-gal和40 yg/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)48h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步驟（2)中Bacmid DNA、陽離子脂質(zhì)體和無血清的TC-100培養(yǎng)基混合物的制備方法為：將 2 μ g的Bacmid DNA、6 μ 1的陽離子脂質(zhì)體加入聚苯乙烯錐形管內(nèi)，補(bǔ)充無血清的TC-100培 養(yǎng)基至200 μ 1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步驟（2)中二次感染具體為將收集的上清用含有10%胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基在27°C條 件下培養(yǎng)96-120 h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種防止神經(jīng)毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步驟（3)中Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖液混合液中Percoll細(xì)胞分離液與PBS緩沖 液的體積比為9:1。
【文檔編號】C12N7/01GK104059921SQ201410109882
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】相興偉, 章耀, 周宇芳, 徐珊, 楊會成 申請人:浙江省海洋開發(fā)研究院