專利名稱：結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌快速檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌快速檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是嚴(yán)重危害我國人民健康的慢性傳染病，它不僅是重要的公共衛(wèi)生問題， 而且是一個復(fù)雜的社會經(jīng)濟問題，在一定程度上影響了社會經(jīng)濟的發(fā)展。其疫情的嚴(yán)重性主要表現(xiàn)為高感染率、高患病率、高死亡率、高耐藥率、低遞降率。盡管近年來我國在執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化治療和提高治愈率上有了長足的進步，但仍然是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家。快速準(zhǔn)確診斷技術(shù)的缺乏和病人發(fā)現(xiàn)的困難是我國控制結(jié)核病的最大障礙。我國依舊用落后的細(xì)菌學(xué)方法 (痰涂片及固體培養(yǎng))作為結(jié)核病的實驗室診斷工具，檢出率低、漏檢率高、時效性差，嚴(yán)重延誤患者特別是耐多藥結(jié)核病患者的最佳治療時間。非結(jié)核分枝桿菌廣泛存在于自然界， 當(dāng)機體免疫受損時，也會引發(fā)肺內(nèi)或肺外感染，其臨床癥狀與結(jié)核病酷似，臨床上固體培養(yǎng)陽性的分枝桿菌中，5% -10%為非結(jié)核分枝桿菌。目前國內(nèi)外已建立了一些檢測結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)方法，但非結(jié)核分枝桿菌的檢測方法較少，同時檢測結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌并能穩(wěn)定應(yīng)用于臨床樣本的檢測方法更少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種快速檢測試劑盒， 以及基于該試劑盒的檢測方法。本發(fā)明通過對16S rRNA及新基因Rv0355的分析、引物的選擇以及檢測條件的優(yōu)化，設(shè)計一種準(zhǔn)確、靈敏、快速的雙重PCR檢測試劑盒及檢測方法，以期提高我國結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌檢測能力。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌快速檢測試劑盒，主要包括樣品DNA提取試劑、PCR反應(yīng)試劑和特異性擴增引物，其特征在于所述特異性擴增引物由16S rRNA擴增引物MTC與 Rv0355擴增引物⑶192組成，所述引物序列如下弓丨物MTC (產(chǎn)物長度M3bp)上游引物MTC-I :5，-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3，下游引物MTC-2 5，-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3，引物CD192(產(chǎn)物長度 238bp)上游引物CD192-1 :5，-TCCGCTGCCGAGAATGTTGTAAT-3，下游引物CD192-2 :5，-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3，。本發(fā)明的關(guān)鍵在于擴增引物的設(shè)計，試劑盒中其他組成，可按本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇。其中樣品DNA提取試劑可包括稀釋液和裂解液，PCR反應(yīng)試劑包括PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其中PCR緩沖液可采用市購商品，也可自行配制，例如將 Tris-HCl, KC1、MgCl2等按比例混合進行配制，進行檢測時，將PCR反應(yīng)試劑和擴增引物混說明書2/8頁CN 102277440 A合，再加入待測樣品或?qū)φ掌?，即可進行PCR擴增反應(yīng)。為進一歩提高試劑盒檢測準(zhǔn)確性，所述試劑盒中還可包括結(jié)核分枝桿菌陽性對照 品和非結(jié)核分枝桿菌陽性對照品。具體的，所述試劑盒可由5個凍存管組成凍存管A裝有裂解液5mL ；凍存管B裝有PCR反應(yīng)體系溶液，組成如下
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌快速檢測試劑盒，主要包括樣品DNA提取試劑、PCR反應(yīng)試劑和特異性擴增引物，其特征在于所述特異性擴增引物由16S rRNA擴增引物MTC與 Rv0355擴增引物⑶192組成，所述引物序列如下引物MTC 上游引物 MTC-I :5’ -ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’ 下游引物 MTC-2 :5’ -TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3’ 引物CD192 上游引物 CD192-1 :5’ -TCCGCTGCCGAGAATGTTGTAAT-3， 下游引物 CD192-2 :5，-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3，。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括結(jié)核分枝桿菌陽性對照品和非結(jié)核分枝桿菌陽性對照品。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒由5個凍存管組成 凍存管A裝有裂解液5mL;凍存管B裝有PCR反應(yīng)體系溶液，組成如下PCR buffer終濃度為1χTaq DNA polymerase0.05U/pLdNTP各 250μΜ引物MTC和CD192各ΙΟμΜ溶劑為水；凍存管C裝有0. 2mL結(jié)核分枝桿菌陽性對照溶液； 凍存管D裝有0. 2mL非結(jié)核分枝桿菌陽性對照溶液； 凍存管E裝有稀釋液5mL。
4.利用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的方法，所述方法包括(1)利用DNA提取試劑提取待測樣品DNA；(2)以待測樣品DNA為模板，加入PCR反應(yīng)試劑和特異性擴增引物配制PCR反應(yīng)體系， 進行PCR擴增；(3)擴增產(chǎn)物進行凝膠成像系統(tǒng)分析，若待測樣品擴增出543bp和238bp兩條條帶，判斷為結(jié)核分枝桿菌；若待測樣品只擴增出543bp條帶，則判斷為非結(jié)核分枝桿菌。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述試劑盒由5個凍存管組成 凍存管A裝有裂解液5mL;凍存管B裝有PCR反應(yīng)體系溶液，組成如下
全文摘要
本發(fā)明提供了一種結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌快速檢測試劑盒，主要包括樣品DNA提取試劑、PCR反應(yīng)試劑和特異性擴增引物，所述特異性擴增引物由16S rRNA擴增引物MTC與Rv0355擴增引物CD192組成，所述引物序列如下MTC-15’-ACGGTGGGTA CTAGGTGTGGGTTTC-3’，MTC-25’-TCTGCGATTACTAGCGACTC CGACTTCA-3’；CD192-15’-TCCGCTGCCGAGAATGT TGTAAT-3’，CD192-25’-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3’。本發(fā)明通過對結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌種屬特異性基因的分析、引物的選擇設(shè)計以及檢測條件的優(yōu)化后，提供的多重PCR檢測試劑盒在應(yīng)用中更加準(zhǔn)確、靈敏、快速。
文檔編號C12R1/32GK102277440SQ20111025344
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者叢黎明, 吳蓓蓓, 帥江冰, 王曉萌 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心