專利名稱：提高棉花纖維品質(zhì)的GbAnn9基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠提高棉花纖維品質(zhì)的基因及其編碼的多肽。
背景技術(shù)：
在棉花育種中，提高棉花纖維的質(zhì)量是棉花育種的長期目標(biāo)之一。而提高棉花纖維的長度是提高棉花質(zhì)量的一個重要方面。棉纖維是從胚珠外表皮細(xì)胞發(fā)育而來的單細(xì)胞無分支的結(jié)構(gòu)。纖維的發(fā)育歷經(jīng)纖維起始、纖維伸長、次生壁增厚及脫水成熟四個互有重疊的階段，整個發(fā)育過程約需50-60 天。相對于模式植物擬南芥的表皮毛和根毛發(fā)育的研究，棉纖維的起始發(fā)育機理不清楚。盡管研究者證實例如陳曉亞等有關(guān)GaMyl^基因的研究以及Dermis實驗室有關(guān)GhMyb25基因的研究等證實上述基因具有用于棉花纖維品質(zhì)的改良潛力，但是目前還沒有確切的轉(zhuǎn)基因棉花的數(shù)據(jù)。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的提高纖維品質(zhì)基因。由于棉纖維發(fā)育是一個由基因時序控制的復(fù)雜過程，找出關(guān)鍵基因?qū)槔没蚬こ碳夹g(shù)改良棉纖維品質(zhì)奠定良好的理論基礎(chǔ)。而運用分子生物學(xué)手段從海島棉中分離提高纖維品質(zhì)基因，采用分子育種手段進(jìn)行纖維品質(zhì)育種是提高棉花纖維品質(zhì)的重要途徑。膜聯(lián)蛋白(ANNEXIN)是一類依賴鈣離子的磷脂結(jié)合蛋白家族。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過1000個膜聯(lián)蛋白亞家族成員，這些膜聯(lián)蛋白廣泛分布在動植物的各種組織和細(xì)胞之中。膜聯(lián)蛋白在進(jìn)化上較為保守，由于膜聯(lián)蛋白具備與鈣離子結(jié)合能力，因此膜聯(lián)蛋白能夠參與一系列的依賴于鈣離子的膜性生物學(xué)活動?，F(xiàn)有的研究證明，鈣離子濃度的增加能夠促進(jìn)植物花粉管的伸長、根尖的發(fā)育以及棉花纖維的伸長作用。因此，提供能夠在棉花纖維組織中特異表達(dá)膜聯(lián)蛋白將有助于提高棉花的品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的能夠提高棉花纖維長度的基因，并得到所述基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明首次采用分子克隆方法從構(gòu)建的海島棉cDNA文庫中分離獲得了新的 (ΛΑηη9基因，并且通過實驗證實了它具有高提高纖維品質(zhì)的功能，達(dá)到了發(fā)明目的。本發(fā)明包括以下內(nèi)容1、提供了一種新的分離出的(ΛΑηη9蛋白質(zhì)多肽，包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽；(b)將 SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(較佳地1-20個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高纖維品質(zhì)功能的(ΛΑηη9蛋白質(zhì)活性的由(a)衍生的多肽。2、提供了編碼上述多肽的多核苷酸，選自(a)編碼上述(ΛΑηη9蛋白質(zhì)多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO :1中46-987位的序列；(b)具有SEQID NO :1中1-600位的序列。3、提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。4、提供了制備上述(ΛΑηη9蛋白質(zhì)多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有活性的多肽。5、提供了上述多核苷酸和(ΛΑηη9蛋白質(zhì)多肽的用途，即，在培育提高棉花纖維長度的棉花品種方面的應(yīng)用。6、提供了一種提高棉花纖維品質(zhì)的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸，所述的GbArm9選自下組(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高纖維品質(zhì)的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使(ΛΑηη9基因編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入(ΛΑηη9基因的DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。在本發(fā)明中，術(shù)語“(ΛΑηη9蛋白質(zhì)”、“(ΛΑηη9多肽”或“提高纖維品質(zhì)蛋白”可互換使用，都指具有提高纖維品質(zhì)蛋白(ΛΑηη9氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的(ΛΑηη9蛋白質(zhì)。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的(ΛΑηη9蛋白或多肽”是指(ΛΑηη9多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化(ΛΑηη9蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主， 本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括(ΛΑηη9蛋白質(zhì)的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、 “衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然(ΛΑηη9蛋白質(zhì)相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽， 或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據(jù)本文所述，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“ (ΛΑηη9多肽”指具有提高纖維長度的SEQ ID Ν0.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與(ΛΑηη9蛋白質(zhì)相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個 (通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中， 用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和 /或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括(ΛΑηη9蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)程度條件下能與(AArm9DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含(ΛΑηη9多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 (ΛΑηη9多肽的可溶性片段。通常，該片段具有(ΛΑηη9多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約 80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供(ΛΑηη9蛋白質(zhì)或多肽的類似物。這些類似物與天然(ΛΑηη9多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。 這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到。在本發(fā)明中，“(ΛΑηη9蛋白質(zhì)保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表 權(quán)利要求
1.一種分離的(ΛΑηη9蛋白質(zhì)多肽，其特征為包含具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.權(quán)利要求1所述的多肽，所述保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一個或多個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的，且具有增加棉花纖維的長度或提高棉花纖維強度的多肽。
3.權(quán)利要求1或2所述的多肽在提高棉花纖維長度和強度方面的功能與應(yīng)用。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于，包含(a)編碼權(quán)利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)與(a)互補的多核苷酸。
5.權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，其序列選自(a)具有SEQID NO :1中46-987位的序列；或(b)具有SEQID NO :1中1-600位的序列。
6.權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸在提高棉花纖維長度和強度方面的功能與應(yīng)用。
7.一種載體，其特征在于含有權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸。
8.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求7所述的載體。
9.一種具有(ΛΑηη9蛋白質(zhì)活性的多肽的制備方法，其特征在于包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有(ΛΑηη9蛋白質(zhì)活性的多肽。
10.一種提高棉花植物纖維品質(zhì)的方法，包括(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使(ΛΑηη9蛋白質(zhì)DNA 編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入(ΛΑηη9蛋白質(zhì)DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的提高棉花纖維品質(zhì)的GbAnn9基因及其編碼的GbAnn9蛋白質(zhì)，本發(fā)明還提供了經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種GbAnn9蛋白質(zhì)的方法，以及GbAnn9基因和GbAnn9蛋白質(zhì)在提高棉花纖維長度和強度方面的功能與應(yīng)用。
文檔編號C12N1/15GK102286087SQ201110253458
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者左開井, 王勁, 陳繼軍, 黃逸群 申請人:左開井, 王勁