專利名稱：用于位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的工程改造的Fc區(qū)的制作方法
用于位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的工程改造的Fe區(qū)I.相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2009年6月22日提交的美國臨時申請No. 61/219，225的優(yōu)先權(quán)，所述申請的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。2.序列表參考本申請以引用的方式并入以文本文件形式與本申請一起提交的序列表，所述文本文件的名稱為“MED0455. PCT_ST25”，于2010年6月14日創(chuàng)建并且大小為69千字節(jié)。3.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及產(chǎn)生用于偶聯(lián)反應(yīng)的基團(tuán)的Fe區(qū)。還提供設(shè)計、修飾、制備和使用所述Fe區(qū)的方法。4.
背景技術(shù)：
4. I癌癥和癌癥療法每年有超過一百二十萬美國人患上癌癥。在美國癌癥是死亡的第二主要病例，并且如果按照當(dāng)前趨勢繼續(xù)下去，那么預(yù)期到2010年，癌癥將成為死亡的主要原因。在美國，肺癌和前列腺癌是男性的最大癌癥殺手。而肺癌和乳癌是美國女性的最大癌癥殺手。在美國，每兩名男性中就有一名在他生命中的某一時間被診斷患有癌癥。而在美國，每三名女性中就有一名在她生命中的某一時間被診斷患有癌癥。當(dāng)前的治療選擇，如手術(shù)、化學(xué)療法和輻射治療，經(jīng)常無效或者存在嚴(yán)重的副反應(yīng)。開發(fā)抗轉(zhuǎn)移劑的一個障礙是用于設(shè)計和評估這些藥物的測定系統(tǒng)。最常規(guī)的癌癥療法靶向快速生長的細(xì)胞。然而，癌細(xì)胞并不一定生長得較快，而是能夠在不允許正常細(xì)胞存活和生長的條件下存活和生長(Lawrence和Steeg, 1996, World J. Urol. 14 124-130)。正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞行為之間的這些基本差異對于治療靶向提供了機(jī)會。微轉(zhuǎn)移腫瘤已在體內(nèi)散布的范例強(qiáng)調(diào)需要在外來和三維微環(huán)境的情形中評估潛在化學(xué)治療藥物。許多標(biāo)準(zhǔn)癌癥藥物測定測量在典型細(xì)胞培養(yǎng)條件(即，單層生長)下的腫瘤細(xì)胞生長或存活。然而，二維測定中的細(xì)胞行為通常并不能可靠地預(yù)測體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞行為。當(dāng)前，癌癥療法可能涉及手術(shù)、化學(xué)療法、激素療法和/或輻射治療來根除患者體內(nèi)的贊生性細(xì)胞(參見，例如 Stockdale, 1998, “Principles of Cancer PatientManagement”，Scientific American :Medicine,第 3 卷，Rubenstein 和 Federman 編著，第12章，第IV節(jié))。所有這些方法都對患者造成明顯的缺陷。例如，手術(shù)可能因患者的健康原因而不能使用或者可能不為患者所接受。另外，手術(shù)可能不能完全去除贅生性組織。輻射療法僅在贅生性組織顯示比正常組織對輻射的敏感性高的時候有效，并且輻射療法通常也會引起嚴(yán)重的副作用。激素療法極少作為單一藥劑給予，并且盡管可能有效，但通常用于在其它治療已去除了大部分癌細(xì)胞后預(yù)防或延遲癌癥的復(fù)發(fā)。關(guān)于化學(xué)療法，有多種可用于治療癌癥的化學(xué)治療劑。很大部分的癌癥化學(xué)治療劑是通過抑制DNA合成來起作用(參見,例如Gilman等，Goodman and Gilman’ s ThePharmacological Basis of Therapeutics,第八版(Pergamon Press, New York, 1990))。因而，化學(xué)治療劑在本質(zhì)上是非特異性的。此外，幾乎所有的化學(xué)治療劑都是有毒性的，并且化學(xué)療法會引起明顯的并且通常是危險的副作用，包括嚴(yán)重惡心、骨髓抑制、免疫抑制等(參見，例如 Stockdale, 1998,“Principles Of Cancer Patient Management”，ScientificAmerican Medicine,第 3 卷，Rubenstein 和 Federman 編著,第 12 章,第 10 節(jié))。此外，即使是在施用化學(xué)治療劑的組合時，許多腫瘤細(xì)胞也對化學(xué)治療劑具有抗性或者是發(fā)展出抗性。癌癥療法現(xiàn)在也可包括生物療法或免疫療法。生物療法/免疫療法的數(shù)量有限，并且盡管相比于化學(xué)治療劑更具特異性，但許多仍同時靶向健康細(xì)胞和癌細(xì)胞。另外，這些療法可能產(chǎn)生副作用，如皮疹或腫脹、流感樣癥狀(包括發(fā)熱、寒顫和疲勞)、消化道問題或過敏反應(yīng)。4. 2用于治療癌癥的抗體抗體是結(jié)合特定抗原的免疫蛋白質(zhì)。在大多數(shù)哺乳動物(包括人和小鼠)中，抗
體由成對的多肽重鏈和輕鏈構(gòu)成。各條鏈由兩個不同區(qū)構(gòu)成，稱為可變(Fv)區(qū)和恒定(Fe)區(qū)。輕鏈和重鏈Fv區(qū)含有分子的抗原結(jié)合決定簇并且負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原。Fe區(qū)界定抗體(例如IgG)的類別(或同種型)并且負(fù)責(zé)結(jié)合多種天然蛋白質(zhì)以引發(fā)重要的生物化學(xué)事件?？贵w的Fe區(qū)與多種配體(包括Fe受體和其它配體)相互作用，從而賦予一系列重要的功能性能力，稱為效應(yīng)功能。IgG類別的一個重要的Fe受體家族是Fe Y受體(FcyR)。這些受體介導(dǎo)抗體與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫部分之間的通信(Raghavan等，1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181-220 ;Ravetch 等，2001, Annu Rev Tmmunol 19:275-290)。在人中，此蛋白質(zhì)家族包括Fe Y RI (CID64)，包括亞型Fe Y RIA、Fe Y RIB和Fe Y RIC ；Fc Y RII (CD32)，包括亞型 Fe y RIIA,Fe y RIIB 和 Fe y RIIC ;和 Fe y RIII (CD16)，包括亞型 Fe Y RIIIA 和 Fe YRIIBCJefferis 等，2002，Immunol Lett 82:57-65)。這些受體通常具有介導(dǎo)與Fe的結(jié)合的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和可能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這些不同的Fe Y R亞型在不同的細(xì)胞類型上表達(dá)(在Ravetch等，1991，Annu Rev Immunol 9 :457-492中綜述)。例如，在人中，F(xiàn)e Y RIIIB僅發(fā)現(xiàn)于嗜中性粒細(xì)胞，而Fe Y RIIIA發(fā)現(xiàn)于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞亞群上。Fc/Fc Y R復(fù)合物的形成將效應(yīng)細(xì)胞募集到被結(jié)合抗原的位點(diǎn)，通常在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件并產(chǎn)生重要的后續(xù)免疫反應(yīng)，如炎癥介質(zhì)釋放、B細(xì)胞活化、內(nèi)吞作用、吞噬作用和細(xì)胞毒性攻擊。介導(dǎo)細(xì)胞毒性和吞噬效應(yīng)功能的能力是抗體破壞靶細(xì)胞的潛在機(jī)制。其中表達(dá)Fe Y R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體并隨后引起靶細(xì)胞溶解的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC) (Raghavan等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181-220 ;Ghetie 等，2000, Annu Rev Tmmunol 18:739-766;Ravetch 等，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290)。很明顯，介導(dǎo) ADCC 的原代細(xì)胞(NK 細(xì)胞)僅表達(dá) Fe Y RIIIA，而單核細(xì)胞表達(dá) FcyRI, Fcy RII 和 Fe y RIII (Ravetch 等，1991，同上)。另一重要的Fe配體是補(bǔ)體蛋白Clq。與Clq結(jié)合的Fe介導(dǎo)稱為補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的過程(在Ward等，1995，Ther Immunol 2 :77-94中綜述)。Clq能夠結(jié)合六個抗體，不過與兩個IgG結(jié)合即足以活化補(bǔ)體級聯(lián)。Clq與Clr和Cls絲氨酸蛋白酶形成復(fù)合物以形成補(bǔ)體路徑的Cl復(fù)合物?？贵w的若干種關(guān)鍵特征，包括但不限于對靶標(biāo)的特異性、介導(dǎo)免疫效應(yīng)機(jī)制的能力和在血清中的長半衰期，使得抗體和相關(guān)免疫球蛋白分子成為功效強(qiáng)大的治療劑。當(dāng)前有多種單克隆抗體正在開發(fā)，或者正在治療上用于治療包括癌癥在內(nèi)的多種病狀。其實(shí)例包括Herceptin (Genentech)，一種批準(zhǔn)用于治療乳癌的人源化抗Her2/neu抗體(例如，U. S. 5, 677, 171) ；CNTO 95 (Centocor)，一種人整聯(lián)蛋白 α v 抗體(PCT 公布 WO 02/12501)；Rituxan (IDEC/Genentech/Roche), 一種批準(zhǔn)用于治療非霍奇金氏淋巴瘤的嵌合抗⑶20抗體(例如，U. S. 5，736，137)；和 Erbitux (ImClone)，一種嵌合抗 EGFR 抗體(例如，U. S. 4，943，533)。存在多種抗體借以破壞腫瘤細(xì)胞的可能機(jī)制，包括通過阻斷需要的生長路徑的抗增殖、引起細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增強(qiáng)受體的下調(diào)和/或周轉(zhuǎn)、ADCC、CDC和促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)(Cragg 等，1999, Curr Opin Tmmunol 11 :541-547 ;Glennie 等，2000, TmmunolToday 21:403-410)。然而，盡管使用廣泛，但抗體對于臨床使用來說并未得到充分優(yōu)化并且許多具有并非最理想的抗癌效力。因此，明顯需要增強(qiáng)抗體破壞靶標(biāo)癌細(xì)胞的能力。4. 3抗體偶聯(lián)物在癌癥的治療中使用抗體偶聯(lián)物(即免疫偶聯(lián)物)進(jìn)行細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞抑制劑(即藥物)的局部遞送以殺死或抑制腫瘤細(xì)胞(Lambert, J. (2005)Curr. Opinion inPharmacology 5:543-549 ;Wu等(2005)Nature Biotechnology 23(9) :1137-1146 ；Payne,G. (2003) Cancer Cell 3 :207-212 ;Syrigos 和 Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614 ；Niculescu-Duvaz 和 Springer(1997)Adv. Drug Del. Rev. 26 151-172 ;美國專利No. 4，975，278)可以允許將藥物部分靶向遞送到腫瘤并在其中發(fā)生細(xì)胞內(nèi)積累，其中這些未偶聯(lián)藥劑的全身性施用可能對正常細(xì)胞以及試圖被消除的腫瘤細(xì)胞造成程度上不可接受的毒性(Baldwin 等(1986)Lancet 第(1986 年 3 月 15 日):603-05 頁；Thorpe,(1985) " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy A Review," inMonoclonal Antibodies ' 84 Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等(編著)，第475-506頁)。由此試圖以最低的毒性達(dá)到最大的功效。設(shè)計和改進(jìn)抗體偶聯(lián)物的努力已集中于單克隆抗體(mAb)的選擇性以及藥物連接和藥物釋放性質(zhì)(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549)。已報道多克隆抗體和單克隆抗體都適用于這些策略中(Rowland等(1986)Cancer Immunol. Immunother. ,21 183-87) ο這些方法中所用的藥物包括道諾霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和長春地辛(vindesine) (Rowland等(1986))?？贵w-毒素偶聯(lián)物中所用的毒素包括細(xì)菌毒素(如白喉毒素)、植物毒素(如蓖麻毒素和白樹毒素(gelonin))、小分子毒素(如格爾德霉素(geldanamycin) (Mandler 等(2000) J. ofthe Nat. Cancer Inst.92 (19) :1573-1581 ;Mandler 等(2000)Bioorganic & Med. Chem.Letters 10 :1025-1028 ；Mandler 等(2002) Bioconjugate Chem. 13 :786-791)、類美坦素(maytansinoid)(EP 1391213 ；Liu 等(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :8618-8623)和卡奇霉素(calicheamicin) (Lode 等(1998) Cancer Res. 58 :2928 ;Hinman 等(1993) CancerRes. 53 :3336-3342))。毒素可以通過包括微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制在內(nèi)的機(jī)制影響其細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用。一些細(xì)胞毒性藥物在偶聯(lián)于較大抗體或蛋白質(zhì)受體配體時傾向于不具活性或活性較低。已有若干種抗體偶聯(lián)物獲得了 FDA的批準(zhǔn)或者正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。例如，ZEVALIN (替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)由針對發(fā)現(xiàn)于正常和惡性B淋巴細(xì)胞表面上的⑶20抗原的鼠IgGl K單克隆抗體與通過硫脲連接子-螯合劑結(jié)合的 111In 或 9°Y 放射性同位素構(gòu)成(Wiseman 等(2000)Eur. J. Nucl. Med. 27(7) =766-77 ；Wiseman 等(2002)Blood 99(12) :4336-42 ；ffitzig 等(2002) J. Clin. Oncol. 20(10)2453-63 ；ffitzig 等(2002) J. Clin. Oncol. 20(15) :3262-69)。盡管ZEVALIN 具有針對B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的活性，但施用在大多數(shù)患者中造成嚴(yán)重和長期的血球減少。MYLOTARG (吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals),一種由人⑶33抗體連接于卡奇霉素構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，也在2000年被批準(zhǔn)用于通過注射治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future (2000) 25 (7) :686 ;美國專利 No. 4，970，198 ；No. 5，079，233 ；No. 5，585，089 ；No. 5，606，040 ；No. 5，693，762 ；No. 5，739，116 ；No. 5，767，285 ；No. 5，773，001)。奧瑞他汀(auristatin)肽，奧瑞他汀E(AE)和單甲基奧瑞他汀(MMAE)是多拉司他汀(dolastatin)的合成類似物(W0 02/088172),已被偶聯(lián)于(i)嵌合單克隆抗體
cBR96 (對癌瘤上的Lewis Y具有特異性(ii) cACIO，其對血液惡性腫瘤上的⑶30具有特異性(Klussman 等(2004)，Bioconjugate Chemistry 15(4) :765-773 ;Doronina 等(2003)Nature Biotechnology 21(7) :778-784 ;Francisco 等(2003)Blood 102(4) :1458-1465;US 2004/0018194 ；(iii)抗 CD20 抗體，如RITUXAN (W0 04/032828)用于治療表達(dá)CD20的癌癥和免疫病癥；(iv)抗EphB2R抗體2H9和抗IL-8，用于治療結(jié)腸直腸癌(Mao等(2004) Cancer Research 64(3) :781-788) ;(v)E_ 選擇素抗體(Bhaskar 等(2003) CancerRes. 63 :6387-6394);和(vi)其它抗CD30抗體(W0 03/043583)。奧瑞他汀E的變體公開于美國專利No. 5，767，237和美國專利No. 6，124, 431中。偶聯(lián)于單克隆抗體的單甲基奧瑞他汀E公開于2004年3月28日提交的Senter等，Proceedings of the AmericanAssociation for Cancer Research,第45卷,第623號摘要中。奧瑞他汀類似物MMAE和MMAF已被偶聯(lián)于各種抗體(W0 2005/081711)。連接(即通過共價鍵連接)藥物部分與抗體的常規(guī)手段可能產(chǎn)生其中藥物部分連接于抗體上多個位點(diǎn)的分子的異質(zhì)混合物。例如，細(xì)胞毒性藥物一般通過抗體中通常大量的賴氨酸或半胱氨酸殘基偶聯(lián)于抗體，從而產(chǎn)生異質(zhì)抗體-藥物偶聯(lián)物混合物。根據(jù)反應(yīng)條件，異質(zhì)混合物通常含有具有O至約8個或者更多的連接接藥物部分的抗體的分布。此夕卜，在藥物部分與抗體具有特定整數(shù)比率的偶聯(lián)物的各亞群中，可能存在其中藥物部分連接于抗體上的不同位點(diǎn)的異質(zhì)混合物。半胱氨酸硫醇在中性pH值下具有反應(yīng)性，這一點(diǎn)不同于在pH7附近被質(zhì)子化并且具有較低親核性的大多數(shù)胺。因?yàn)榱虼蓟?R-SH，巰基)相對具有反應(yīng)性，所以具有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)通常以其氧化形式作為二硫鍵連接的寡聚物存在或者具有內(nèi)部橋接二硫鍵。細(xì)胞外蛋白質(zhì)一般不具有游離硫醇(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling APractical Approach, Academic Press, London,第55頁)。蛋白質(zhì)中游離硫醇的量可通過標(biāo)準(zhǔn)埃爾曼測定進(jìn)行估算。IgM是二硫鍵連接的五聚體的一個實(shí)例，而IgG是具有將亞單位結(jié)合在一起的內(nèi)部二硫橋的蛋白質(zhì)的一個實(shí)例。在如此的蛋白質(zhì)中，可使用試劑(如二硫蘇糖醇(DTT)、硒醇(Singh 等(2002) Anal. Biochem. 304 :147-156)和三-(2-羧基乙基)膦(TCEP))將二硫鍵還原產(chǎn)生反應(yīng)性硫醇。
抗體半胱氨酸硫醇基對于親電子性偶聯(lián)試劑一般比抗體氨基或羥基更具反應(yīng)性，即更具親核性。已通過基因工程技術(shù)在蛋白質(zhì)中引入半胱氨酸殘基以與配體形成共價連接或形成新的分子內(nèi)二硫鍵(Better 等(1994) J. Biol. Chem. 13 :9644-9650 ；Bernhard 等(1994)Bioconjugate Chem. 5 :126-132 ;Greenwood 等(1994)Therapeutic Immunology
I:247-255 ;Tu 等(1999)Proc.Natl. Acad. Sci USA96 :4862-4867 ;Kanno 等(2000)J. of Biotechnology, 76 :207-214 ；Chmura 等(2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15)8480-8484 ;美國專利No. 6，248，564)。然而，通過使蛋白質(zhì)的各種氨基酸殘基突變成半胱氨酸氨基酸來設(shè)計半胱氨酸硫醇基可能存在問題，尤其是在不配對(游離Cys)殘基或者相對易于發(fā)生反應(yīng)或氧化的情況下。在蛋白質(zhì)濃溶液中，不管是在大腸桿菌(E.coli)的周質(zhì)、培養(yǎng)物上清液或是在部分或是在完全純化的蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)表面上的未配對Cys殘基都可以配對和氧化以形成分子間二硫鍵，并因此形成蛋白質(zhì)二聚體或多聚體。二硫鍵二聚體的形成使得新Cys對于與藥物、配體或其它標(biāo)記的偶聯(lián)不起反應(yīng)。此外，如果蛋白質(zhì)在新近工程改造的Cys與現(xiàn)有Cys殘基之間氧化形成分子內(nèi)二硫鍵，那么這兩個Cys基團(tuán)都
不可用于參與活性位點(diǎn)和相互作用。此外，通過錯誤折疊或喪失三級結(jié)構(gòu)可能使蛋白質(zhì)失活或無特異性(Zhang 等(2002) Anal. Biochem. 311 :1_9)。半胱氨酸不是唯一可用于偶聯(lián)的氨基酸，并且也可以使用其它氨基酸，如賴氨酸、酪氨酸、組氨酸、硒半胱氨酸、硒甲硫氨酸和其它氨基酸。先前已經(jīng)嘗試試圖將偶聯(lián)位點(diǎn)工程改造到抗體中。美國專利No. 5，219，916描述對“表面口袋”殘基進(jìn)行的修飾，如Ser 156或Thrl73 (根據(jù)Kabat等，Sequences ofImmunological Interest,第 4 版，US Dept, of Health and Human Services, 1987)。在相關(guān)研究中，研究人員確定僅“表面口袋”上的殘基能夠支持試圖工程改造偶聯(lián)位點(diǎn)的半胱氨酸取代(Lyons 等(1990) Protein Eng. 3 :8 pg 703-708)。因此，需要開發(fā)提供能夠與各種藥劑偶聯(lián)的反應(yīng)性基團(tuán)的穩(wěn)定的工程改造的抗體，包括提供能夠與各種藥劑偶聯(lián)的硫醇基的工程改造的抗體。本文中對參考文獻(xiàn)的引述或論述不應(yīng)解釋為承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。5.概述本發(fā)明提供含有能夠與各種藥劑偶聯(lián)的非天然存在的(即，它們通常不存在于蛋白質(zhì)中的那個位置)氨基酸殘基(其可為天然的和/或合成的)的Fe區(qū)。這種取代的一個實(shí)例是使用半胱氨酸，然而如下文所述，也可以使用其它取代，如賴氨酸、酪氨酸、組氨酸、硒半胱氨酸、硒甲硫氨酸和其它氨基酸。本發(fā)明的Fe區(qū)包含被一個或多個非天然存在的氨基酸取代的來自抗體的重鏈的Fe區(qū)的一個或多個氨基酸，由此提供能夠偶聯(lián)的基團(tuán)。在本發(fā)明的一個方面，取代是用半胱氨酸，由此取代的半胱氨酸氨基酸殘基提供硫醇基用于偶聯(lián)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fe 區(qū)包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20個或更多個取代的氨基酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fe區(qū)包括以下Fe區(qū)，其中選自親本或天然抗體的抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸或者可選地被非天然存在的氨基酸取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat等(1991，NIH Publication 91-3242，NationalTechnical Information Service, Springfield, VA,下文稱為“Kabat”)中所述的 EU 指數(shù)編號系統(tǒng)?！叭鏚abat中所述的EU指數(shù)”是指如Kabat等(同上)中所述的人IgGl EU抗體的殘基編號。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fe區(qū)構(gòu)成抗體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO :1_24的氨基酸序列的Fe區(qū)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含由SEQ ID NO :1-24所例示的任何取代的任何組合的Fe區(qū)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO 1~24的氨基酸序列的抗體。在另
一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含由SEQ ID NO :1-24所例示的任何取代的任何組合的Fe區(qū)。本發(fā)明的另一方面提供用于產(chǎn)生Fe區(qū)的核酸、載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供Fe區(qū)偶聯(lián)物和制備包含偶合于一種或多種其它物質(zhì)的本發(fā)明的Fe區(qū)的所述偶聯(lián)物的方法。在一個實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是藥物，其中所述藥物選自細(xì)胞毒性劑、化學(xué)治療劑、肽、模擬肽、蛋白質(zhì)骨架、酶、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、熒光標(biāo)簽或生物素。本發(fā)明的另一方面提供包含本發(fā)明的Fe區(qū)的抗體，其中所述抗體在結(jié)合至細(xì)胞表面受體時能夠內(nèi)化。在所述方面，本發(fā)明的抗體適用于將貨物分子和/或藥劑遞送到細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明的另一方面提供利用本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物治療、檢測和診斷癌癥、自體免疫性疾病、炎癥性疾病或感染性疾病的方法。本發(fā)明的另一方面提供包含本發(fā)明的Fe區(qū)的組合物。6.附圖簡述圖I. Fe區(qū)表面半胱氨酸工程改造。此圖為IgGl Fe結(jié)構(gòu)域的帶狀表示，其中對表面位點(diǎn)特異性突變進(jìn)行了圖形標(biāo)記并且以棒狀形式顯示。在此帶狀表示中，對CH2和CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了圖形標(biāo)記。糖鏈顯示為棒狀表示。二十個半胱氨酸工程改造突變ND2至ND21顯示為棒狀表示并且在括號中用各自的克隆名稱進(jìn)行了圖形標(biāo)記，其中NDl代表天然抗體。其編號基于如Kabat中所述的EU指數(shù)。圖2.蛋白質(zhì)A純化的Fe-半胱氨酸突變體在還原條件下的SDS-PAGE。所有突變體和野生型蛋白質(zhì)利用蛋白質(zhì)A進(jìn)行純化，透析至PBS IX IOmM EDTA(pH 7.2)中，并在還原和非還原條件下在10%均質(zhì)SDS-PAGE上進(jìn)行分析。使用SeeBlue Plus2 (Invitrogen)分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa,如圖中所示)。裝載3 μ g各樣品并使用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)對凝膠進(jìn)行染色。樣品在圖上進(jìn)行圖形標(biāo)記并且對應(yīng)于圖I中所呈現(xiàn)的克隆名稱。此SDS-PAGE分析證實(shí)，重組蛋白質(zhì)保留其預(yù)期的分子量。圖3(a_d).抗體突變體的尺寸排阻色譜。所有突變型蛋白質(zhì)利用蛋白質(zhì)A進(jìn)行純化，透析至PBS IX IOmM EDTA (pH 7.2)中，并在SEC-HPLC上進(jìn)行分析。樣品的標(biāo)識對應(yīng)于圖I中呈現(xiàn)的克隆名稱。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的峰位置(虛線色譜圖)從右至左為甲狀腺球蛋白670KDa;2，牛Y-球蛋白158KDa ;3，雞卵清蛋白44KDa ;4，馬肌紅蛋白17KDa ;5，維生素B12
13.5KDa。突變型抗體的保留時間為約8. 6分鐘，此對應(yīng)于約150KDa的分子量。還示出了各突變體的單體含量的百分比。此分析證實(shí)，重組蛋白質(zhì)除保留其預(yù)期分子量外，并不因所弓IΛ的半胱氨酸而形成二硫鍵連接的同源二聚體。圖4 (a-c).重鏈恒定結(jié)構(gòu)域序列。圖4示出NDl (天然)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域序列的序列。圖4a示出變體ND2至ND6的序列。圖4b示出變體ND7至NDll的序列。圖4c示出變體ND12至ND16的序列。圖4d示出變體ND17至ND21的序列。ND2至ND21中所引入的點(diǎn)突變以下劃線和粗體顯示。圖5. Fe結(jié)構(gòu)域變體的表達(dá)。示出Fe半胱氨酸變體的重組表達(dá)。各變體的表達(dá)水平和天然NDl相似。除變體ND5外的所有變體還以等于或大于93%的單體表達(dá)(通過SEC-HPLC 測定)。圖6. Fe結(jié)構(gòu)域變體與FcRn的結(jié)合。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測定半胱氨酸Fe工程改造變體與FcRn的結(jié)合。除呈70%單體的變體ND5 (D312C)和非糖基化變體
ND20 (N297C)以外，所有變體保持與天然抗體NDl類似的與FcRn的結(jié)合信號。圖7.差示掃描熱量法(DSC)分析。使用緩沖液25mM His (pH 6. O)在15°C至110°C的范圍內(nèi)以1°C /min的速率進(jìn)行ND1-21的DSC分析。除變體ND5 (D312C)、ND11 (E356C)和ND20 (N297C)外的變體具有與天然NDl類似的DSC曲線。圖8.偶聯(lián)方案。示出Img標(biāo)度的D1-21的使生物素-PEG2-馬來酰亞胺與抗體Fe半胱氨酸偶聯(lián)的各種方案。除非另外規(guī)定外，否則所示的摩爾過量相對于抗體摩爾數(shù)。圖9.來自偶聯(lián)方案D的樣品的還原蛋白質(zhì)凝膠的蛋白質(zhì)印跡。變體和天然蛋白質(zhì)利用蛋白質(zhì)A進(jìn)行純化，并透析至PBS IX IOmMEDTA(pH 7.2)中。編號1_21分別對應(yīng)于ND1-21。M是分子量標(biāo)準(zhǔn)。首先在NuPage 10%凝膠上通過SDS-PAGE對樣品進(jìn)行分析。具有轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的印跡在TBST 2% BSA中阻斷，與抗生物素蛋白-HRP —起孵育，并用HRP的顯色底物使其顯色。HC是對應(yīng)于抗體重鏈的蛋白質(zhì)條帶，而LC是對應(yīng)于抗體輕鏈的蛋白質(zhì)條帶。多個變體的重鏈上存在明顯偶聯(lián)(尤其是冊2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、18、19)，而NDl (天然)的HC上沒有可以檢測到的偶聯(lián)。在包括NDl在內(nèi)的所有變體的LC上存在一些偶聯(lián)。

圖10.來自偶聯(lián)方案D的樣品的考馬斯亮藍(lán)染色的非還原蛋白質(zhì)凝膠。變體和野生型蛋白質(zhì)利用蛋白質(zhì)A進(jìn)行純化，透析至PBS IXlOmM EDTA(pH 7.2)中，并在非還原條件下在10%均質(zhì)SDS-PAGE上進(jìn)行分析。使用SeeBlue Plus2 (Invitrogen)分子量標(biāo)準(zhǔn)。裝載3yg各樣品并使用SimplyBlue SafeStain (Invitrogen)對凝膠進(jìn)行染色。編號1-21分別對應(yīng)于ND1-21。M是分子量標(biāo)準(zhǔn)。大部分偶聯(lián)變體顯示類似于天然NDl的電泳遷移率圖譜。若干偶聯(lián)變體含有一些明顯的二聚體(ND 3、5、13、15、17、18、19)，而一種變體顯示一些明顯的斷裂(ND 20)。圖11.通過方案D偶聯(lián)的ND變體的完整質(zhì)量和肽圖數(shù)據(jù)匯總。變體ND4、7、10、
12、18在工程改造半胱氨酸上具有接近或大于90%的偶聯(lián)，且顯示沒有或極少寡聚化。DAR是偶聯(lián)樣品的藥物與抗體摩爾比。圖12.雙重變體。基于所選單一變體設(shè)計^ 個雙重變體。圖上方左邊的表格不出用于產(chǎn)生雙重變體的單一變體的組合。圖13.雙重變體的表達(dá)?；谒x單一變體ND4、ND7、ND10、ND12、ND18制備一組
11種雙重ND變體，并基于NDlO和ND19制備另一雙重變體。所有雙重變體通過瞬時轉(zhuǎn)染充分表達(dá)。這些雙重變體中僅四種DM8、DM9、DM10、DM11以高于93%的單體水平表達(dá)和純化(通過尺寸排阻色譜連同紫外線檢測(SEC-UV)進(jìn)行測定)。圖14.非還原SDS-PAGE上雙重ND變體的比較?！癈”是用作對照的天然NDl?！癕”是分子量標(biāo)準(zhǔn)。編號1-10對應(yīng)于DM1-10。SDS-PAGE結(jié)果與SEC-UV結(jié)果一致。變體DM4所具有的單體量最少，而DM8所含的單體的百分比最大。圖15.雙重變體的DSC分析。四種單體最多(> 93% )的雙重變體顯示DSC曲線極其類似于天然蛋白質(zhì)和單一變體NDlO。圖16.雙重變體的偶聯(lián)。使用方案D(參見圖8)、10 I的生物素-馬來酰亞胺抗體比率和20 I的生物素-馬來酰亞胺抗體比率的雙重變體DM8(ND4和ND10)和DM11(ND10和ND19)的偶聯(lián)。示出進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡和考馬斯亮藍(lán)染色的還原凝膠。圖17.如圖16中所述偶聯(lián)的雙重變體的完整質(zhì)量和肽圖數(shù)據(jù)。DM8(ND4和ND10)
和DMl UNDlO和ND19)在利用10 I生物素-馬來酰亞胺抗體比率或20 I生物素-馬來酰亞胺抗體比率時在工程改造半胱氨酸處具有接近或大于90%的偶聯(lián)。DAR是偶聯(lián)樣品的藥物與抗體摩爾比。圖18.單一和雙重ND變體的偶聯(lián)。使用偶聯(lián)方案D (圖8)，例外為在TCEP處理后采用強(qiáng)度更高的過夜透析和在室溫下偶聯(lián)I小時。單一變體的藥物mAb摩爾比是10 1，而雙重變體的藥物mAb摩爾比是20 I。示出進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡和考馬斯亮藍(lán)染色的還原凝膠以及用考馬斯亮藍(lán)染色的非還原凝膠。圖19.單一和雙重變體的肽圖。通過肽圖分析對上圖18示出的偶聯(lián)樣品進(jìn)行分析。此表匯總工程改造半胱氨酸處的偶聯(lián)效率，以及總體藥物與抗體比率(DAR)。DM9”是使用相同突變第二次制備的DM9。圖20.規(guī)模放大的偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)。以(a) 2. 5、(b)5、(c) 10、(d) 20 和(e)40mg/ml 的抗體進(jìn)行偶聯(lián)。使用如圖18所述的偶聯(lián)方案。藥物mab摩爾比是10 I。在蛋白質(zhì)凝膠中，C是天然ND1。示出進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡和考馬斯亮藍(lán)染色的還原凝膠以及用考馬斯亮藍(lán)染色的非還原凝膠。圖21.規(guī)模放大的偶聯(lián)的肽圖。通過肽圖分析對來自前述20的偶聯(lián)樣品進(jìn)行分析。示出偶聯(lián)效率結(jié)果。圖22.三重變體。此圖說明在基于單一變體的四種三重變體中選擇用于突變的殘基。圖上方左邊的表格示出用于產(chǎn)生三重變體的變體組合。圖23.四種三重變體的表達(dá)和單體水平。由O. 5L培養(yǎng)物純化蛋白質(zhì)。單體水平利用SEC-HPLC進(jìn)行測定。為進(jìn)行比較，天然抗體NDl具有99%單體。圖24.三重變體與生物素馬來酰亞胺的偶聯(lián)。使用方案D以及在室溫下偶聯(lián)I小時和I : 20的抗體藥物摩爾比。偶聯(lián)Tl的兩種不同蛋白質(zhì)制劑。天然NDl和雙重變體DMll包括在內(nèi)作為偶聯(lián)特異性和效率的對照。示出進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡和考馬斯亮藍(lán)染色的還原凝膠以及用考馬斯亮藍(lán)染色的非還原凝膠。圖25.三重變體的肽圖。通過肽圖分析對來自上圖24的偶聯(lián)三重變體進(jìn)行分析。呈現(xiàn)工程改造半胱氨酸處的偶聯(lián)效率。圖26.三重變體的DSC分析。Tl顯示在第一次轉(zhuǎn)變時解鏈溫度有稍許程度的降低，CH2。T2顯示在85°C下有一些沉淀。T3在高溫下沉淀。T4近乎與天然蛋白質(zhì)相同。7.詳細(xì)描述
本發(fā)明是基于如下的發(fā)現(xiàn)，存在于抗體的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的表面上的殘基(參見圖I)適合于用例如半胱氨酸取代天然氨基酸，并且用于對能夠與各種藥劑偶聯(lián)的位點(diǎn)進(jìn)行工程改造。除半胱氨酸以外的其它氨基酸，包括天然和/或非天然氨基酸，也可用于取代以允許各種藥劑的偶聯(lián)。這些其它氨基酸包括賴氨酸(描述于Benhar等，(1994) Bioconjug.Chem. 55, 321-326 中)、釀氛酸(描述于 Byers 和 Baldwin, (1988) Immunology. 65, 329-335中)、組氨酸(描述于 Waibel 等(1999)Nature Biotechnol. 17 :897-901 中)、硒半胱氨酸、硒甲硫氨酸和/或非天然氨基酸。因此，在本文中描述一個或多個半胱氨酸取代的情況中，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以任選地采用這些天然和/或非天然氨基酸中的一個或多個替代半胱氨酸。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還可以在取代中使用氨基酸的任何組合，如用半胱氨酸和賴氨酸取代以產(chǎn)生在一些位置被半胱氨酸取代而在其它位置被賴氨酸取代的抗體變體。本發(fā)明的Fe區(qū)包括工程改造的抗體，其中選自親本、天然或野生型抗體的抗體重鏈的位置 239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個或更多個氨基酸被另一種氨基酸(包括天然和合成氨基酸)取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat 等(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service,Springfield, VA，下文稱為“Kabat” )所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。應(yīng)注意，單一取代，例如半胱氨酸殘基，通常由于IgG分子的同源二聚體性質(zhì)而導(dǎo)致在所得抗體中呈現(xiàn)兩個相應(yīng)的殘基。本發(fā)明的所得工程改造的抗體可呈現(xiàn)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 個或更多個反應(yīng)性基團(tuán)用于偶聯(lián)藥物或化合物的目的。在一實(shí)施方案中，一個或多個取代是半胱氨酸取代，并且所得工程改造的抗體可呈現(xiàn)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個或更多個硫醇基用于偶聯(lián)藥物或化合物的目的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體在選自抗體重鏈的239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的位置包含至少一個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat等(同上)中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的至少兩個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422和442的至少三個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置 239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、
383、384、398、400、440、422和442的至少四個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置 239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422和442的至少五個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的至少六個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的至少七個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置 239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422和442的至少八個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置 239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440,422和442的至少九個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的至少十個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的至少4^一個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422和442的至少十二個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置 239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422和442的至少十三個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置 239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422和442的至少十四個取代。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置 239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440,422和442的至少十五個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的至少十六個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的至少十七個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422和442的至少十八個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體包含選自抗體重鏈的位置 239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、
384、398、400、440、422和442的至少十九個取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程改造的抗體在抗體重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442中的每一者處包含取代，其中恒定區(qū)的編號系統(tǒng)是如Kabat中所述的EU指數(shù)編號系統(tǒng)。在一個實(shí)施方案中，工程改造的抗體包含以下取代對a) 289 和 440 ；b) 330 和 440 ；c) 339 和 440 ；d) 359 和 440 ；e) 289 和 359;f) 330 和 359 ；g) 339 和 359 ；h) 289 和 339 ；i) 330 和 339 ；j) 289 和 330;和k) 339 和 442。在另一實(shí)施方案中，工程改造的抗體包含一個或多個以下取代組a) 289、339 和 442 ;b) 289、330 和 339 ;c)330、339 和 442 ;和d) 289、330 和 442。上述取代如下對應(yīng)于如下SEQ ID NO :1中的位置，并且預(yù)期本發(fā)明通篇關(guān)于Kabat的編號可與SEQ ID NO 1中取代的位置互換使用來描述本發(fā)明的組合物
ND Kabat位置 SEQ ID NO :1中的位置 ~2 239121
3 282164
~ 289171
5312194
6324206~ 330 2 Ζ~8 335 2Τ
9 337219
~10 33922權(quán)利要求
1.一種抗體的Fe區(qū)，其中所述Fe區(qū)包含選自位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422 和 442 的一個或多個氨基酸的取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Fe區(qū)，其中所述Fe區(qū)包含一個或多個以下取代對a)289 和 440 ；b)330 和 440 ；c)339 和 440 ；d)359 和 440 ；e)289 和 359 ；f)330 和 359 ；g)339 和 359 ；h)289 和 339 ；i)330和 339 ；j) 289 和 330 ;和k)339 和 442。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Fe區(qū)，其中所述Fe區(qū)包含一個或多個以下取代組a)289、339 和 442 ；b)289,330和 339 ；c)330,339 和 442 ;和d)289、330 和 442。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Fe區(qū)，其中所述Fe區(qū)選自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同種型。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Fe區(qū)，其中所述取代包括取代成選自半胱氨酸、賴氨酸、酪氨酸、組氨酸、硒半胱氨酸和硒甲硫氨酸的氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Fe區(qū)，其中所述取代包括半胱氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的Fe區(qū)，其中所述半胱氨酸包含硫醇基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的Fe區(qū)，其中所述硫醇基能夠進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的Fe區(qū)，其中所述Fe區(qū)偶聯(lián)于細(xì)胞毒性劑、化學(xué)治療劑、毒素、放射性核素、DNA、RNA、s iRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、熒光標(biāo)簽和生物素中的一者或多者。
10.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含根據(jù)權(quán)利要求I所述的Fe區(qū)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、完全人抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體或抗體樣分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體還包含選自所述抗體的CHl結(jié)構(gòu)域的位置131、132、133、134、135、136、137、138和139的一個或多個氨基酸的取代。
13.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
14.一種檢測有需要的受試者的癌癥、自體免疫性、炎癥性或感染性疾病或病癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述工程改造的抗體或其抗原結(jié)合片段包含選自重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、.359、361、383、384、398、400、440、422和442的一個或多個氨基酸的取代。
15.一種治療有需要的受試者的癌癥、自體免疫性、炎癥性或感染性疾病或病癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其結(jié)合片段包含選自重鏈的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422和442的一個或多個氨基酸的取代。
16.一種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求I所述的Fe區(qū)。
17.根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸，其中所述核酸包含編碼選自序列SEQID NO :1-24的氨基酸序列的序列。
18.—種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
20.一種制備抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括在適合表達(dá)所述抗體或抗原結(jié)合片段的條件下孵育根據(jù)權(quán)利要求19所述的宿主細(xì)胞，和分離所述抗體或抗原結(jié)合片段。
全文摘要
提供用于位點(diǎn)特異性偶聯(lián)于多種藥劑的Fc區(qū)。還提供用于設(shè)計、制備、篩選、選擇和使用所述Fc區(qū)的方法。
文檔編號C12P21/08GK102802661SQ201080027743
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
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