專利名稱：微陣列中的探針定位方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用微陣列檢測探針多核苷酸與靶多核苷酸的雜交的方法。
背景技術(shù)：
人們正在進行不僅弄清各種生物的基因結(jié)構(gòu)、還要以基因組規(guī)模闡明其基因功能的嘗試，用于有效率地分析基因功能的技術(shù)開發(fā)也正在迅速推進。微陣列是在玻璃片等載體上使多數(shù)的多核苷酸排列固定在每個規(guī)定的區(qū)域的高密度的陣列，對確定基因的核苷酸序列、以及同時分析基因的表達、突變、多態(tài)性等非常有用。使用該微陣列的基因信息的分析對開發(fā)新藥的研究、疾病的診斷或預(yù)防方法的開發(fā)等極為有用。在使用微陣列的檢測中，首先使以放射性同位素或熒光色素標記的靶多核苷酸與高密度地排列在載體表面的探針多核苷酸雜交。此時，具有與探針多核苷酸互補的核苷酸序列的靶多核苷酸與探針多核苷酸進行互補性雜交，而未雜交的多核苷酸通過清洗而除去。在使用微陣列的雜交的檢測中，有時會因每個微陣列的性能劣化或清洗不良等而發(fā)生誤判。但是，判斷是否存在該誤判則委托給使用微陣列的使用者，這是非常含糊的。在這樣的狀況下，不可能利用組合有檢測器和反應(yīng)裝置的自動裝置處理多數(shù)的試樣。專利文獻1中記載著下述方法當點的亮度為檢測器的檢測下限以下或為檢測上限以上時丟掉了產(chǎn)生的判定誤差，所以使用改變探針DNA的濃度而點上的微陣列，只根據(jù)具有特定范圍的亮度的點的結(jié)果進行判定。但是，在該方法中無法判定每個微陣列的性能劣化或清洗不良等。專利文獻2中記載著下述方法使標記物質(zhì)與探針陣列共價結(jié)合，根據(jù)該標記物質(zhì)的位置迅速且正確地特定各探針的點的位置。但是，在該方法中，即使可以判定每個探針陣列的性能劣化或清洗不良等，但也無法判定雜交中是否存在不良情形等?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 日本專利第0880361號專利文獻2 日本專利第4261661號

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供除了判定每個微陣列的性能劣化或清洗不良等、還客觀判定雜交不良的方法。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)使用除了具有固定有探針多核苷酸的檢測用點、還具有固定有基準多核苷酸的基準點的微陣列，使靶多核苷酸和與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸同時與上述微陣列接觸以進行雜交反應(yīng)，首先測定基準點的熒光，由此可以判定每個微陣列的可靠性以及雜交反應(yīng)的可靠性，從而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明包含以下發(fā)明。
(1)使用微陣列檢測探針多核苷酸與靶多核苷酸的雜交的方法，該方法包括以下步驟1)使熒光標記的靶多核苷酸和與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸與微陣列接觸的步驟，所述微陣列除了具有多個固定有探針多核苷酸的檢測用點以外，還具有一處以上的固定有基準多核苷酸的基準點；2)通過清洗微陣列除去未反應(yīng)的靶多核苷酸的步驟；3)測定基準點的熒光，當滿足規(guī)定的值時，判斷為可以測定的步驟；以及4)若判斷為可以測定，則測定固定有探針多核苷酸的各檢測用點的熒光的步驟。(2) (1)所述的方法，其中，標記多核苷酸的熒光標記與靶多核苷酸的熒光標記相同。(3)⑴或⑵所述的方法，其中，在微陣列中，檢測用點和基準點被排列配置，存在至少兩處基準點，以連接任意兩處基準點的線為基準線，根據(jù)距基準點的距離和偏離基準線的角度測定檢測用點的位置。(4) (3)所述的方法，其中，檢測用點和基準點被配置成外周為四角形的格子狀，基準點存在于四角形的不同的頂點處。(5)⑴或⑵所述的方法，其中，在微陣列中，檢測用點和基準點被排列配置成外周為正方形或長方形的格子狀，基準點存在于其對角線上的兩個頂點處，檢測通過各基準點上的兩條直線垂直相交的交點，檢測連接上述交點和各基準點的兩條連線的長度，根據(jù)上述連線的長度和點數(shù)檢測連線上的各檢測用點位置。(6) (1) (5)中任一項所述的方法，其中，標記多核苷酸和與基準多核苷酸互補的多核苷酸具有95%以上的同源性。(7)試劑盒，用于檢測探針多核苷酸與靶多核苷酸的雜交，該試劑盒包含微陣列，該微陣列除了具有多個固定有探針多核苷酸的檢測用點以外，還具有一處以上的固定有基準多核苷酸的基準點；以及與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸。本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本國專利申請2009-143390號的說明書和/或附圖中記載的內(nèi)容。


圖1顯示微陣列中的探針DNA和基準DNA的點的配置的一種形態(tài)。圖2顯示用于微陣列的熒光檢測的檢測器的一種形態(tài)。圖3顯示在微陣列中實施雜交反應(yīng)后測定熒光而得到的圖像。圖4是以紅圈顯示由2個基準點的坐標算出各檢測用點的座標并配置的點的圖。圖5顯示未添加PCR產(chǎn)物而僅使熒光標記寡DNA雜交時(檢體不良的情形)的熒光圖像。圖6顯示未添加模板DNA而進行PCR擴增，將2 μ L該反應(yīng)液與1 μ L添加有熒光標記寡DNA的雜交緩沖液混合進行雜交時(檢體不良的情形)的熒光圖像。圖7顯示使用超純水代替雜交緩沖液進行雜交時(雜交不良的情形)的熒光圖像。圖8顯示距作為本底(background)值的計算例測定亮度的點中心的一定范圍的位置。
具體實施例方式本發(fā)明涉及使用微陣列檢測探針多核苷酸與靶多核苷酸的雜交的方法。在本發(fā)明中，多核苷酸中包含寡核苷酸，還包含含有DNA和RNA的核酸。DNA包含單鏈DNA和雙鏈DNA。另外，核酸中還包含修飾了磷酸二酯位點的人工核酸；修飾了呋喃糖位點的糖基鍵或羥基的人工核酸；修飾了核酸堿基位點的人工核酸；以及利用了糖·磷酸骨架以外的結(jié)構(gòu)的人工核酸等；更具體而言，核酸中包含用硫原子取代磷酸位點的氧原子的硫代磷酸酯型、二硫代磷酸酯型、二氨基磷酸酯型、甲基膦酸酯型或硫代甲基膦酸酯型的人工核酸；呋喃糖環(huán)上的取代基修飾型、糖環(huán)骨架增加1個碳的吡喃糖型、或多環(huán)式糖骨架型的人工核酸；嘧啶C-5位修飾堿基型、嘌呤C-7位修飾堿基型、或環(huán)擴張修飾堿基型的人工核酸等。在本發(fā)明中，探針多核苷酸具有該技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的意義，是用于檢測目標基因的多核苷酸，是指與目的基因所對應(yīng)的多核苷酸或其片段特異性雜交的多核苷酸。作為探針多核苷酸，通常使用合成寡核苷酸、cDNA和基因組DNA、它們的片段、以及將它們改性而得到的多核苷酸(例如將單鏈改性成雙鏈的多核苷酸)等。探針多核苷酸通常具有3 5000個堿基、優(yōu)選10 1000個堿基。固定在微陣列上的探針多核苷酸的定位 (spotting)溶液的濃度通常為ΙμΜ 10 μ M的范圍。在本發(fā)明中，靶多核苷酸具有該技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的意義，是指作為檢測對象的多核苷酸。有時還將靶稱作目標。靶多核苷酸通常使用來自被檢試樣的多核苷酸以及以其為基礎(chǔ)進行酶合成/擴增而得到的多核苷酸，具體而言，使用mRNA、cDNA、aRNA、它們的片段、以及將它們改性而得到的多核苷酸等。使雜交(hybridize)、雜交反應(yīng)或雜交(hybrization)具有該技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的意義，是指具有互補序列的多核苷酸同伴、例如單鏈DNA同伴、單鏈RNA同伴、或單鏈 DNA與單鏈RNA在適當?shù)臈l件下形成雙鏈。本發(fā)明中，雜交優(yōu)選在嚴格的條件下實施。本發(fā)明中，使用熒光標記的靶多核苷酸。標記方法或標記的種類只要可以檢測探針多核苷酸與靶多核苷酸的雜交即可，沒有特別限定，在該技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。例如，在合成或擴增靶多核苷酸時攝入使熒光標記共價結(jié)合的基質(zhì)(主要是UTP)，從而可以得到熒光標記的靶多核苷酸。作為熒光標記，可以列舉Cy3和Cy5等的CyDye、FITC、RITC、羅丹明、 德州紅(Texas Red)、TET、TAMRA、FAM、HEX、ROX 等。本發(fā)明中，作為微陣列，使用除了具有多個固定有探針多核苷酸的檢測用點以外、 還具有一處以上、優(yōu)選至少2處、更優(yōu)選2 4處、進一步優(yōu)選2處的固定有基準多核苷酸的基準點的微陣列。基準多核苷酸通常具有3 5000個堿基、優(yōu)選10 1000堿基。固定在基準點上的基準多核苷酸的定位溶液的濃度通常為IyM 10 μΜ的范圍。本發(fā)明中，通過使熒光標記的靶多核苷酸和與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸與上述微陣列接觸來實施雜交反應(yīng)，再通過清洗除去未反應(yīng)的靶多核苷酸，之后首先測定基準點的熒光。與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸通常是指在嚴格條件下與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸。嚴格條件是指形成特異性雜化物、而不形成非特異性雜化物的條件，可以列舉嚴格性差的條件和嚴格性強的條件，但優(yōu)選嚴格性強的條件。嚴格性差的條件是指在雜交后的清洗中例如在42°C、用5XSSC、0. 1% SDS進行清洗的條件，優(yōu)選為在50°C、用5XSSC、 0. SDS進行清洗的條件。嚴格性強的條件是指在雜交后的清洗中例如在65°C、用 0. IX SSC和0. 1% SDS進行清洗的條件。在上述的嚴格條件下，由和與基準多核苷酸互補的多核苷酸具有高同源性(同源性為80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、進一步優(yōu)選98%以上)的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸可以與基準多核苷酸雜交。如上所述，標記多核苷酸設(shè)計成與基準多核苷酸雜交、并且具有熒光標記，所以即使靶多核苷酸不與探針雜交，在基準點中也應(yīng)該檢測到熒光。未檢測到熒光或熒光值低是指基準多核苷酸從微陣列中丟失、即其他探針多核苷酸也同樣丟失。或者是指雜交反應(yīng)中存在不良情形。因此，通過測定基準點的熒光，并判定是否滿足規(guī)定的值，可以判斷微陣列是否劣化，換言之，可以判斷微陣列的可靠性。并且，可以判定雜交反應(yīng)的可靠性。對標記多核苷酸的熒光標記沒有特別限定，優(yōu)選使用與靶多核苷酸的熒光標記相同的熒光標記。通過使用相同的熒光標記，可以使用相同的檢測器一次性測定兩者的熒光標記，可以迅速且簡便地實施測定。在本發(fā)明中使用的微陣列中，優(yōu)選探針多核苷酸的點(檢測用點)和基準點排列， 并優(yōu)選配置成格子狀。而且，優(yōu)選至少存在兩處基準點，以連接任意兩處的基準點的線為基準線，根據(jù)距基準點的距離和偏離基準線的角度測定各檢測用點的位置(點的中心)。更具體而言，由距基準點的距離和偏離基準線的角度(連接各檢測用點和基準點的線與基準線所成的角度)、以及所期望的點間距等可以確定各點的中心位置。另外，將檢測用點和基準點排列配置成外周為正方形或長方形的格子狀，可以使基準點存在于其對角線上的相對的兩處頂點處。此時，檢測通過各基準點上的兩條直線垂直相交的交點，并檢測連接該交點和各自的兩處基準點的兩條連線。然后，算出連線的長度，通過用該距離除以預(yù)先確定的(四角形的外周上的點數(shù)-1)的數(shù)目，求出連線上的各點間隔，由該點間隔可以測定各點位置。例如，使用點為4行X4列的微陣列。此時連線上的點數(shù)為4點。若連線的長度為900 μ m，則900+(4-1) = 300，點間隔為300 μ m?？梢允褂么它c間隔，從基準點起在連線上移動300 μ m時作為點的中心，并且從該中心起在連線上移動300 μ m時為下一個點的中心。構(gòu)成基準線的兩處基準點優(yōu)選在微陣列上排列的點組中以遠的位置存在。檢測用點和基準點優(yōu)選配置成外周為四角形的格子狀(例如圖1)、且基準點存在于四角形的不同的頂點。作為用于測定檢測用點和基準點的熒光的檢測器，例如使用熒光激光顯微鏡、連接冷卻CCD照相機和計算機的熒光掃描裝置，可以自動測定微陣列上的熒光強度?？梢允褂霉步裹c型或非焦點型的激光代替CCD照相機。由此，得到圖像數(shù)據(jù)。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，可以鑒定與固定在微陣列上的探針多核苷酸具有互補性的靶多核苷酸，可以基于此制作基因表達分布圖、或者確定多核苷酸的核苷酸序列。本發(fā)明中使用的微陣列是在載體上固定有探針多核苷酸和基準多核苷酸的微陣列。載體材料可以使用該技術(shù)領(lǐng)域公知的材料，沒有特別限定?？梢粤信e例如鉬、鉬黑、 金、鈀、銠、銀、汞、鎢、以及它們的化合物等貴金屬；石墨、碳纖維所代表的碳等導(dǎo)電體材料； 單晶硅、非晶硅、碳化硅、氧化硅、氮化硅等所代表的硅材料；SOI (絕緣襯底上的硅)等所代表的上述硅材料的復(fù)合材料；玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍寶石、陶瓷、鎂橄欖石、感光性玻璃等無機材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、環(huán)狀聚烯烴、聚異丁烯、聚對苯二甲酸乙二酯、不飽和聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯縮醛、丙烯酸樹月旨、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛樹脂、脲醛樹脂、環(huán)氧樹脂、三聚氰胺樹脂、苯乙烯/丙烯腈共聚物、丙烯腈/ 丁二烯苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚砜等的有機材料等。對載體的形狀也沒有特別限定，但優(yōu)選為平板狀。作為載體，優(yōu)選使用表面具有碳層和化學(xué)修飾基團的載體。表面具有碳層和化學(xué)修飾基團的載體包括在基板表面具有碳層和化學(xué)修飾基團的載體、以及在由碳層形成的基板的表面具有化學(xué)修飾基團的載體?；宓牟牧峡梢允褂迷摷夹g(shù)領(lǐng)域公知的材料，沒有特別限定，可以使用與作為上述載體材料而列舉的材料相同的材料。優(yōu)選使用具有微細的平板狀結(jié)構(gòu)的載體。形狀不限于長方形、正方形和圓形等，通常使用1 75mm的四方形載體，優(yōu)選1 IOmm的四方形載體，更優(yōu)選使用3 5mm的四方形載體。由于微細的平板狀結(jié)構(gòu)的載體容易制造，所以優(yōu)選使用由硅材料或樹脂材料形成的基板，特別是更優(yōu)選在由單晶硅形成的基板的表面具有碳層和化學(xué)修飾基團的載體。單晶硅還包括晶軸的方向一部分一部分地(部分部分T )極微小地發(fā)生變化的單晶硅(有時也稱作鑲嵌晶體)、包含原子尺度的散亂(晶格缺陷)的單晶硅。對形成于基板上的碳層沒有特別限定，但優(yōu)選使用合成金剛石、高壓合成金剛石、 天然金剛石、軟金剛石(例如類金剛石碳)、無定形碳、碳系物質(zhì)(例如石墨、富勒烯、碳納米管)中的任一種、它們的混合物、或?qū)⑺鼈儗雍隙玫降奶紝印＿€可以使用碳化鉿、碳化鈮、碳化硅、碳化鉭、碳化釷、碳化鈦、碳化鈾、碳化鎢、碳化鋯、碳化鉬、碳化鉻、碳化釩等碳化物。這里，軟金剛石是所謂的類金剛石碳(DLC=Diamond Like Carbon)等金剛石與碳的混合體、即不完全金剛石結(jié)構(gòu)體的總稱，對其混合比例沒有特別限定。碳層的形成可以按照公知的方法進行。例如，微波等離子體CVD(化學(xué)氣相沉積) 法、ECRCVD (電子回旋共振_化學(xué)氣相沉積)法、ICP (電感耦合等離子體)法、直流濺鍍法、 ECR(電子回旋共振)濺鍍法、離子化蒸鍍法、電弧式蒸鍍法、激光蒸鍍法、EB (電子束)蒸鍍法、電阻加熱蒸鍍法等。在基板表面形成碳層時，碳層的厚度通常為單分子層 100 μ m左右，若太薄，則底層基板的表面有可能局部暴露；反之，若變厚，則生產(chǎn)率變差，所以優(yōu)選2nm Ιμπι，更優(yōu)選為5nm 500nmo通過向形成有碳層的基板的表面導(dǎo)入化學(xué)修飾基團，可以將寡核苷酸探針牢固地固定在載體上。對導(dǎo)入的化學(xué)修飾基團沒有特別限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當選擇，例如
有氨基、羧基、環(huán)氧基、甲?；⒘u基和活性酯基。關(guān)于氨基的導(dǎo)入，例如可以通過在氨氣中對碳層進行紫外線照射或進行等離子體處理來實施?；蛘?，通過在氯氣中對碳層照射紫外線以將其氯化，再進一步在氨氣中進行紫外線照射來實施?；蛘撸€可以通過使甲二胺、乙二胺等多元胺類氣體與氯化的碳層反應(yīng)來實施。關(guān)于羧基的導(dǎo)入，例如，如上所述通過使適當?shù)幕衔锱c氨基化的碳層反應(yīng)即可實施。作為用于導(dǎo)入羧基的化合物，可以列舉如式X-Ri-COOiK式中，X表示鹵原子，R1 表示碳原子數(shù)為10 12的二價烴基)所示的鹵代羧酸、例如氯乙酸、氟乙酸、溴乙酸、碘乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、4-氯苯甲酸；式H00C-R2-C00H(式中，R2表示單鍵或碳原子數(shù)為1 12的二價烴基)所示的二元羧酸、例如草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸；聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四甲酸等多元羧酸；式 R3-CO-R4-COOH(式中，R3表示氫原子或碳原子數(shù)為1 12的二價烴基，R4表示碳原子數(shù)為 1 12的二價烴基)所示的酮酸或醛酸；式X-0C-R5-C00H(式中，X表示鹵原子，R5表示單鍵或碳原子數(shù)為1 12的二價烴基。)所示的二元羧酸的單鹵化物、例如琥珀酸單氯化物、 丙二酸單氯化物；富馬酸酐、琥珀酸酐、草酸酐、馬來酸酐、丁烷四甲酸酐等酸酐。關(guān)于環(huán)氧基的導(dǎo)入，例如，如上所述通過使適當?shù)亩鄡r環(huán)氧化合物與氨基化的碳層反應(yīng)即可實施?；蛘?，通過使有機過酸與碳層所含有的碳=碳雙鍵反應(yīng)即可得到。作為有機過酸，可以列舉過乙酸、過苯甲酸、二過氧鄰苯二甲酸、過甲酸、三氟過乙酸等。關(guān)于甲?；膶?dǎo)入，例如，如上所述通過使戊二醛與氨基化的碳層反應(yīng)即可實施。關(guān)于羥基的導(dǎo)入，例如，如上所述通過使水與氯化的碳層反應(yīng)即可實施。活性酯基是指在酯基的醇側(cè)具有酸性度高的親電子性基團(電子求引性基)以激活親核反應(yīng)的酯群、即反應(yīng)活性高的酯基。是指在酯基的醇側(cè)具有親電子性基團，較烷基酯更活化的酯基。活性酯基對氨基、硫醇基、羥基等基團具有反應(yīng)性。進一步具體而言，苯酚酯類、苯硫酚酯類、N-羥胺酯類、氰基甲基酯、雜環(huán)羥基化合物的酯類等作為具有遠高于烷基酯等的活性的活性酯基而已知。更具體而言，作為活性酯基，可以列舉如對硝基苯基、 N-羥基琥珀酰亞氨基、琥珀酰亞氨基、鄰苯二甲酰亞氨基、5-降冰片烯-2，3-二羧基亞氨基等，特別優(yōu)選使用N-羥基琥珀酰亞氨基。關(guān)于活性酯基的導(dǎo)入，例如，如上所述使用氰胺或碳化二亞胺(例如1-[3_( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亞胺)等脫水縮合劑和N-羥基琥珀酰亞胺等化合物將導(dǎo)入的羧基轉(zhuǎn)換成活性酯即可實施。通過該處理，可以形成經(jīng)由酰胺鍵在烴基的末端結(jié)合有 N-羥基琥珀酰亞氨基等活性酯基的基團(日本特開2001-139532)。將探針多核苷酸和基準多核苷酸分別溶解于定位用緩沖液中，制備定位用溶液， 之后將其分別注入96孔或384孔塑料板上，利用測位儀裝置等在載體上定位分別注入的溶液，從而可以制造微陣列?；蛘撸梢詫⒍ㄎ蝗芤菏褂梦⒘恳埔浩饕允謩拥姆绞竭M行定位。定位后，為了進行探針多核苷酸和基準多核苷酸與載體結(jié)合的反應(yīng)，優(yōu)選進行培育。通常在-20 100°C、優(yōu)選0 90°C的溫度下通常進行0. 5 16小時、優(yōu)選1 2小時的培育。培育優(yōu)選在高濕度的環(huán)境下、例如濕度為50 90%的條件下進行。優(yōu)選在培育后接著用清洗液(例如50mM TBS/0. 05% Tween20,2XSSC/0. 2% SDS溶液、超純水等)進行清洗，以除去未與載體結(jié)合的DNA。在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選在通過清洗微陣列除去未反應(yīng)的靶多核苷酸的步驟之后、而在實際的測定即固定有探針多核苷酸的各檢測用點的熒光測定之前進一步實施以下步驟。下述步驟可以在基準點的熒光測定之前實施，也可以在其后實施。對于多個點，分別測定距點中心一定距離的位置的亮度，得到多個本底值的步驟； 算出代表所得的多個本底值的本底代表值的步驟；以及對于所有的點或測定了本底值的所有的點，分別算出本底值與本底代表值之差，當存在具有規(guī)定的值以上的差的點時，判斷為無法測定的步驟。這里，點包括檢測用點和基準點兩者。作為得到本底值的多個點，在排列配置在微陣列中的點中，優(yōu)選至少對形成外周的所有點測定本底值。另外，雖然不必對所有的點測定本底值，但可以對所有的點測定本底值。關(guān)于將測定本底值的多個點，例如在檢測用點和基準點被配置成外周為四角形的格子狀時，通常為至少四角形的2個頂點、優(yōu)選為至少四角形的4個頂點、更優(yōu)選最外周的所有點。更具體而言，當為16行X 16列的點時，是指最外周的60點；或者，當為16行X 16列的點時，是指所有的點即256點。分別測定距點中心一定范圍的位置的亮度，將其作為本底值時，距中心一定的范圍根據(jù)點的大小和點間隔等適當設(shè)定。例如，如圖8所示，可以是距點中心一定距離以上、以點間隔長作為一個邊而以點的中心位置為中心的四角形的范圍內(nèi)。例如，距點中心 70 μ m以上、而一個邊為1000 μ m的四角形的范圍內(nèi)，優(yōu)選距點中心70 μ m以上、而一個邊為 380 μ m的四角形的范圍內(nèi)。另外，可以以對一定范圍的位置的所有或一部分點測定亮度而得到的平均值作為本底值，也可以測定一定范圍的位置的僅一個點的亮度，以其作為本底值。對點的中心的定位方法沒有特別限定，例如可以檢測各點中具有規(guī)定的熒光強度 (例如3000以上)的部分，作為該部分的中心?；蛘撸梢愿鶕?jù)以連接兩處基準點的中心的線為基準線，由距基準點的距離和偏離基準線的角度、以及點間距等確定各點的中心位置。本底代表值只要是代表測定的多個本底值的值即可，沒有特別限定，但優(yōu)選為多個本底值的平均值或中間值。對于所有的點或測定了本底值的所有的點，分別算出本底值與本底代表值之差， 當存在具有規(guī)定值以上的差的點時，可以判定點周圍的本底值中分散大，因此該微陣列清洗不良，缺乏可靠性，由此可以判斷為無法測定。這里，規(guī)定值根據(jù)條件等而不同，例如，當圖像的顯示為16位(bit)諧調(diào)時，可以設(shè)定為1000以上。當圖像的顯示為例如8位諧調(diào)時，可以設(shè)定小于50的值。在本發(fā)明的另一實施方案中，優(yōu)選在通過清洗微陣列除去未反應(yīng)的靶多核苷酸的步驟之后、而在實際的測定即固定有探針多核苷酸的各檢測用點的熒光測定之前進一步實施以下步驟。下述步驟可以在基準點的熒光測定之前實施，也可以在其后實施。對于多個點，分別測定距點中心一定距離的位置的亮度，得到多個本底值的步驟； 算出多個本底值的平均值或中間值作為本底代表值的步驟；以及當本底代表值為規(guī)定值以上時，判斷為無法測定的步驟。這里，點包括檢測用點和基準點兩者。作為得到本底值的多個點，在排列配置在微陣列中的點中，優(yōu)選至少對形成外周的所有點測定本底值。另外，雖然不必對所有的點測定本底值，但可以對所有的點測定本底值。關(guān)于將測定本底值的多個點，例如，當檢測用點和基準點被配置成外周為四角形的格子狀時，通常至少為四角形的2個頂點、優(yōu)選至少為四角形的4個頂點、更優(yōu)選為最外周的所有點。更具體而言，當為16行X 16列的點時，是指最外周的60點；或者，當為16行X 16列的點時，是指所有的點即256點。關(guān)于距點的中心一定距離、以及中心的確定方法如上所述。當作為多個本底值的平均值或中間值的本底代表值為規(guī)定值以上時，可以判定點周圍的本底值整體都大，因此該微陣列清洗不良、缺乏可靠性，由此可以判斷為無法測定。 這里，規(guī)定值根據(jù)條件等而不同，例如當為16位時，可以設(shè)定為1000以上。本發(fā)明還涉及用于檢測上述的探針多核苷酸與靶多核苷酸的雜交的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包含微陣列，其除了具有多個固定有探針多核苷酸的檢測用點以外，還具有一處以上的固定有基準多核苷酸的基準點；以及與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸。關(guān)于探針多核苷酸、靶多核苷酸、基準多核苷酸、微陣列、以及標記多核苷酸等如上所述。本發(fā)明的試劑盒可以進一步包含雜交緩沖液、清洗緩沖液、微量板、尼龍膜等。以下，利用實施例來更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于下述實施例。實施例1載體的制備采用離子化蒸鍍法，在下述條件下在邊長為3mm的硅基板上制備兩層的DLC層的膜。表 1
第1層第2層
原料氣體CH44.7547.5 (sscm)
H20.252.5 (sscm)
工作壓力3.08.0 (Pa)
基板偏壓直流電壓500500 (V)
高頻輸出100- (W)
陽極電壓5050 (V)
燈絲電壓 7 (V)
電流2222 (A)在下述條件下，使用氨等離子體，向所得的表面具有DLC層的硅基板上導(dǎo)入氨基。表2
原料氣體 NH330 (sscm)
工作壓力8.0 (sscm)
基板偏壓直流電壓500 (Pa)
高頻輸出— (W)
陽極電壓50 (V)
燈絲電壓 (V)
電流22 (A)在含有140mM的琥珀酸酐和0. IM的硼酸鈉的1_甲基_2_吡咯烷酮溶液中浸漬 30分鐘，導(dǎo)入羧基。之后在含有0. IM的磷酸鉀緩沖液、0. IM的1-[3-( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亞胺、20mM的N-羥基琥珀酰亞胺的溶液中浸漬30分鐘進行活化，得到在硅基板表面具有DLC層和作為化學(xué)修飾基團的N-羥基琥珀酰亞氨基的載體。實施例2微陣列的制作將基準DNA (基準多核苷酸)和探針DNA (探針多核苷酸)分別溶解于Sol. 6中，按照圖1那樣的配置在實施例1制作的載體上點點(spot)兒(日立卜制SPBI0)。 即，在基準點上點基準DNA、在檢測用點上點探針DNA。圖1中，以基準點形式顯示的點以外的點為檢測用點。需要說明的是，以不同的濃度點探針DNA。點間距為280μπι?；鶞蔇NA 和探針DNA的序列如下?；鶞蔇NA:5，-ACTG GCCGTCGTTTTACAACGT-3，(SEQ ID NO 1)
探針DNA :5，-TTGTCCGCGCCG G GCTTCGCTC-3，(SEQ ID NO 2)在80°C下實施1小時焙烤后，在2XSSC/0. 2% SDS中、室溫下邊攪拌邊清洗15分鐘，制作點有探針DNA和基準DNA的微陣列。實施例3與靶DNA的雜交(1)以λ噬菌體的基因組DNA為模板，使用下述引物組通過PCR擴增與上述探針 DNA雜交的區(qū)。引物 1 :5，-ACAG G GAATGCCCGTTCTGC-3，(SEQ ID NO 3)引物 2 :5，-AATAACCGACACG G GCAGAC-3，(SEQ ID NO 4)標記使用CyDye (Cy5)來進行。PCR溶液的組成如下。表3
引物 1 (IOyUM)1//L
引物 2 (IOpM)ImL
PCR緩沖液2廠L
dNTP ( dCTP 為 1/10 濃度)2 μ\,
Cy5-dCTP0.5 pL
模板DNA1 ML
Ex Taq0.1 /<L
H2O13 ^L
總計 20.6(2)向雜交緩沖液(3XSSC/0. 3% SDS)中添加以Cy5進行熒光標記的寡DNA(標記多核苷酸)。該寡DNA為基準DNA的互補鏈。寡DNA:5，-ACGTTGTAAAACGACG GCCAGT-3，(SEQ ID NO 5)(3)將IyL添加有該熒光標記寡DNA的雜交緩沖液與2 μ L(I)中得到的PCR產(chǎn)物混合，之后滴加到實施例2制作的微陣列中，在55°C下進行1小時的雜交。用2XSSC/0. 2% SDS、接著用2 X SSC清洗。(4)熒光測定使用圖2所示的檢測器來實施。利用激光對微陣列整面照射激發(fā)光。 使用熒光濾波器切割具有目標波長以外的波長的光。圖3顯示雜交后測定熒光的圖像。圖4是以紅圈顯示由2個基準點的坐標算出各檢測用點的坐標并配置的圖。點的平均熒光強度為59473。該結(jié)果顯示即使使PCR產(chǎn)物和熒光標記寡DNA同時雜交，對雙方也均無影響。(3)中未加入PCR產(chǎn)物而僅使熒光標記寡DNA雜交時的熒光圖像見圖5。只在基準點得到足夠的熒光強度。另外，在其他點處也沒有見到非特異性熒光。由此認為熒光標記寡DNA對檢測結(jié)果沒有影響。(1)中未添加模板DNA ( λ噬菌體的基因組DNA)而進行PCR擴增，之后將2 μ L該反應(yīng)液與1 μ L添加有熒光標記寡DNA的雜交緩沖液混合進行雜交時的熒光圖像見圖6。只在基準點觀察到熒光，在檢測用點未觀察到熒光。(2)中使用超純水代替雜交緩沖液(3XSSC/0. 3% SDS)進行雜交時的熒光圖像見圖7。包括基準點在內(nèi)在所有點均未觀察到熒光。由此可知若在適當?shù)臈l件下進行雜交， 則觀察不到基準點的熒光，因此根據(jù)基準點是否存在熒光，可以判定雜交的不良。
比較圖6和圖7時，在檢測用點均未觀察到熒光，而圖6只在基準點觀察到熒光。 在實際的試驗中，當在檢測用點未觀察到熒光時，通常難以判定是檢體、PCR擴增的情況不佳還是雜交的情況不佳。但是，根據(jù)本發(fā)明的方法，當只在基準點觀察到熒光時，至少可以判定微陣列的品質(zhì)和雜交是良好的，可以推測檢體或PCR中存在不佳情形的可能性。產(chǎn)業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，可以判定每個微陣列的可靠性，可以使用具可靠性的微陣列實施測定。并且，可以判定雜交反應(yīng)的可靠性。因此，可以控制誤判。另外，通過與自動反應(yīng)裝置等組合，可以具高可靠性地自動實施微陣列的測定。本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請直接作為參考而納入本說明書中。
權(quán)利要求
1.使用微陣列檢測探針多核苷酸與靶多核苷酸的雜交的方法，該方法包括以下步驟1)使熒光標記的靶多核苷酸和與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸與微陣列接觸的步驟，所述微陣列除了具有多個固定有探針多核苷酸的檢測用點以外，還具有一處以上的固定有基準多核苷酸的基準點；2)通過清洗微陣列除去未反應(yīng)的靶多核苷酸的步驟；3)測定基準點的熒光，當滿足規(guī)定的值時，判斷為可以測定的步驟；以及4)若判斷為可以測定，則測定固定有探針多核苷酸的各檢測用點的熒光的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，標記多核苷酸的熒光標記與靶多核苷酸的熒光標記相同。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，在微陣列中，檢測用點和基準點被排列配置，存在至少兩處基準點，以連接任意兩處基準點的線為基準線，根據(jù)距基準點的距離和偏離基準線的角度測定檢測用點的位置。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中，檢測用點和基準點被配置成外周為四角形的格子狀， 基準點存在于四角形的不同的頂點處。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中，在微陣列中，檢測用點和基準點被排列配置成外周為正方形或長方形的格子狀，基準點存在于其對角線上的兩個頂點處，檢測通過各基準點上的兩條直線垂直相交的交點，檢測連接上述交點和各基準點的兩條連線的長度，根據(jù)上述連線的長度和點數(shù)測定連線上的各檢測用點位置。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中，標記多核苷酸和與基準多核苷酸互補的多核苷酸具有95%以上的同源性。
7.試劑盒，用于檢測探針多核苷酸與靶多核苷酸的雜交，該試劑盒包含微陣列，該微陣列除了具有多個固定有探針多核苷酸的檢測用點以外，還具有一處以上的固定有基準多核苷酸的基準點；以及與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供除了判定每個微陣列的性能劣化或清洗不良等、還客觀判定雜交不良的方法。使用微陣列檢測探針多核苷酸與靶多核苷酸的雜交的方法，該方法包括以下步驟1)使熒光標記的靶多核苷酸和與基準多核苷酸雜交的熒光標記的標記多核苷酸與微陣列接觸的步驟，所述微陣列除了具有多個固定有探針多核苷酸的檢測用點以外，還具有一處以上的固定有基準多核苷酸的基準點；2)通過清洗微陣列除去未反應(yīng)的靶多核苷酸的步驟；3)測定基準點的熒光，當滿足規(guī)定的值時，判斷為可以測定的步驟；以及4)若判斷為可以測定，則測定固定有探針多核苷酸的各檢測用點的熒光的步驟。
文檔編號C12Q1/68GK102459641SQ20108002762
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者丹花通文, 山野博文, 平山幸一 申請人:東洋鋼鈑株式會社