解折疊鄰近探針及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測樣品中分析物的基于鄰位探針的檢測分析，特別地涉及包括使用至少一組至少第一和第二鄰近探針的方法，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合分析物，其中至少一個(gè)所述鄰近探針的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過裂解核酸域而解折疊產(chǎn)生至少一個(gè)可連接游離末端或與所述樣品中另一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的區(qū)域，其中當(dāng)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，解折疊所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)允許所述至少第一和第二鄰近探針的核酸域直接地或間接地相互作用。
【專利說明】解折疊鄰近探針及其使用方法
[0001]本發(fā)明涉及針對樣品中的分析物的基于鄰近探針的檢測分析(“鄰近分析”)，主要是鄰近連接分析。本發(fā)明特別地涉及改進(jìn)降低在復(fù)雜生物樣品中出現(xiàn)的非特異性“背景”信號的方法，并簡化所述分析。所述改進(jìn)包括提供用于該測定的一個(gè)或多個(gè)修飾的“解折疊”鄰近探針，其中一個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸域的至少部分“反應(yīng)”或“功能”元件得到了保護(hù)(屏蔽或掩蔽)，避免了當(dāng)與包括分析物的樣品接觸時(shí)其與其它核酸分子相互作用。解折疊的鄰近探針的設(shè)計(jì)使得分析的至少一個(gè)鄰近探針的核酸域包括一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾環(huán)，從而使所述核酸域的反應(yīng)(功能)元件的至少一部分避免與其它核酸分子相互作用。一旦鄰近探針的分析物-結(jié)合域能夠與分析物相互作用(即，同時(shí)結(jié)合分析物)，則由于“解折疊”發(fā)夾結(jié)構(gòu)而可以從核酸域除去“保護(hù)”，能夠使核酸域的反應(yīng)元件與樣品中的其它核酸域/分子以鄰近依賴性方式相互作用。反應(yīng)中至少一個(gè)鄰近探針的核酸域的反應(yīng)(功能)元件可以通過裂解反應(yīng)解折疊，產(chǎn)生與所述樣品中另一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的至少一個(gè)游離末端或區(qū)域，其能夠與樣品中其它核酸域/分子相互作用。
[0002]因此，在本發(fā)明中，解折疊鄰近探針的作用是阻止加入到檢測反應(yīng)的探針彼此相互作用，盡管其具有互補(bǔ)序列元件，即能夠相互作用的核酸域。因此，鄰近探針能夠與彼此獨(dú)立的它們的靶分子(即分析物)相互作用，并且僅在解折疊之后，顯示出核酸域的反應(yīng)元件(例如，互補(bǔ)區(qū)域)且允許相互作用。解折疊機(jī)制也確保在反應(yīng)期間出現(xiàn)鄰近探針核酸域的“新”反應(yīng)元件。其為能夠參與連接或延伸反應(yīng)的反應(yīng)元件的“新”反應(yīng)元件(即，之前被屏蔽的元件)，例如呈連接或擴(kuò)增模板或者呈連接或延伸的核酸分子。解折疊機(jī)制也可以獲得核酸分子之間，例如鄰近探針的核酸域或樣品中存在的其它分子之間的非特異相互作用(例如，錯(cuò)配)的數(shù)量減少。因此，可觀察效應(yīng)是分析的特異性、靈敏性和效率都由此增加。本發(fā)明還提供一些解折疊鄰近探針和包括所述解折疊鄰近探針的試劑盒，用于鄰近分析，特別是鄰近連接分析和鄰近延伸分析。
[0003]鄰近分析依賴“鄰近探測”的原理，其中通過同時(shí)結(jié)合多個(gè)(即兩個(gè)或多個(gè)，通常兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè))探針來檢測分析物，所述的探針當(dāng)通過結(jié)合分析物到達(dá)鄰近(因此為“鄰近探針”)時(shí)，使得信號生成。一般地，鄰近探針中的至少一個(gè)包括連接于探針的分析物-結(jié)合域(或部分)的核酸域(或部分)，并且信號的生成涉及核酸部分和/或由其它探針攜帶的另外的功能部分之間的相互作用。因此，信號生成取決于探針之間(更具體地由它們攜帶的核酸或其它功能部分/域之間)的相互作用，因此僅當(dāng)兩個(gè)(或多個(gè))必須的探針都結(jié)合于分析物時(shí)才出現(xiàn)，從而向檢測系統(tǒng)提供改善的特異性。近年來發(fā)展了鄰近探測的概念，現(xiàn)在基于該原則的許多分析在本領(lǐng)域是熟知的。例如，鄰近連接分析(PLAs)依賴鄰近探針與分析物的鄰近結(jié)合，從而從連接反應(yīng)產(chǎn)生信號，所述的連接反應(yīng)涉及到鄰近分析的核酸域或者由所述鄰位分析的核酸域介導(dǎo)(例如，在其之間和/或通過其作為模板)。
[0004]因此，在鄰近分析中可以使用鄰近探針，所述的鄰近探針結(jié)合分析物并具有核酸域或部分，其在所述分析物結(jié)合后以鄰近依賴性方式相互作用，通常導(dǎo)致連接至少一個(gè)、優(yōu)選地兩個(gè)或多個(gè)核酸分子，以形成可檢測的、優(yōu)選可擴(kuò)增的核酸檢測產(chǎn)物，可以借助所述核酸檢測產(chǎn)物檢測所述分析物。
[0005]基于檢測分析的鄰近探針，特別是鄰近連接分析通過將存在的該分析物轉(zhuǎn)化為容易地可檢測的或可定量的基于核酸的信號，從而允許靈敏地、快速地和便利地檢測或定量樣品中的一種或多種分析物，并且能夠均質(zhì)的或異質(zhì)的形式進(jìn)行。
[0006]本領(lǐng)域的鄰近探針通常成對地使用，并且分別由對靶分析物具有特異性的分析物-結(jié)合域和與其偶聯(lián)的功能域構(gòu)成，所述功能域例如為核酸連接域。所述分析物-結(jié)合域可以是例如核酸“適體”(Fredriksson等人(2002)Nat Biotech20:473-477)或可以是蛋白質(zhì)的，比如單克隆或多克隆抗體(Gullberg等人(2004)Proc Natl Acad SciUSAlOl:8420-8424)。每個(gè)鄰近探針對的各自分析物-結(jié)合域可以對分析物上的不同結(jié)合位點(diǎn)具有特異性，所述分析物可以由單個(gè)分子或相互作用分子的復(fù)合物構(gòu)成，或例如在靶分析物作為多聚體存在的情況下可以具有相同的特異性。當(dāng)鄰近探針對彼此緊密相鄰時(shí)，這主要當(dāng)兩者結(jié)合于相同的分析物(其可以是相互作用分子的復(fù)合物)上的其各自的位點(diǎn)時(shí)發(fā)生，即當(dāng)多個(gè)探針同時(shí)結(jié)合靶分析物時(shí)，功能域(例如核酸域)能夠直接地或間接地相互作用。例如，核酸域通?？梢酝ㄟ^連接反應(yīng)結(jié)合形成新的核酸序列，其可以被加入反應(yīng)中的夾板寡核苷酸作為模板，所述夾板寡核苷酸包含與鄰近探針對的各自核酸域末端互補(bǔ)的區(qū)域。由此生成的新核酸序列用于報(bào)告樣品中分析物的存在或量，并可以定性地或定量地檢測，例如通過實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR)。
[0007]可選地，當(dāng)鄰近時(shí)，鄰近探針的核酸域可以在一個(gè)或多個(gè)加入的寡核苷酸(其可以是一個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸域)的相互連接時(shí)作為模板而不是彼此連接，所述的相互連接包括使加入的線性寡核苷酸成圓形的分子內(nèi)連接，例如基于所謂的鎖式探針原理，其中類似于鎖式探針的是，加入的線性寡核苷酸的末端通過雜交至模板而并列，以進(jìn)行連接，在本文中為鄰近探針的核酸域(在鎖式探針的情況下為探針的靶核酸)。各種這樣的分析形式在W001/61037中 描述。
[0008]W097/00446和US6，511，809公開了鄰近連接分析的不同形式，即首先借助特異性分析物結(jié)合試劑將分析物固定于固體基質(zhì)。
[0009]同質(zhì)鄰位連接分析(即，在溶液中的)公開在W001/61037，W003/044231，W02005/123963，F(xiàn)redriksson 等人(2002)Nat Biotech20:473-477 和 Gullberg 等人(2004)ProcNatl Acad Sci USAlOl: 8420-8424 中。
[0010]雖然通常使用鄰近探針對，但是在例如W001/61037和W02005/12963中描述了鄰近探針檢測分析的修飾，其中使用三個(gè)鄰近探針檢測單個(gè)分析物分子，第三探針的核酸域具有兩個(gè)游離末端，所述游離末端可以結(jié)合(連接)至第一和第二探針的核酸域各自游離末端，從而變成夾在其間。在該實(shí)施方案中，需要兩種夾板寡核苷酸對第一和第二探針的每個(gè)核酸域與第三探針的核酸域的連接進(jìn)行模板化。
[0011]在W02007/107743描述的一個(gè)進(jìn)一步修飾中，為兩個(gè)鄰位探針的核酸域的連接作為模板的夾板寡核苷酸攜帶于第三鄰位探針上。
[0012]不是所有鄰近分析均基于連接。W02007/044903公開了用于檢測分析物的基于鄰近探針的分析，所述分析依賴于釋放的核酸裂解產(chǎn)物的形成和檢測。某些描述的實(shí)施方案涉及的探針包括分析物結(jié)合部分和連接的酶，所述酶作用于連接第二探針的分析物結(jié)合部分的核酸部分，使得釋放可檢測的核酸裂解產(chǎn)物。[0013]分析物檢測分析，在某些實(shí)施方案中包括鄰近探針樣試劑，其中連接一個(gè)探針的分析物結(jié)合部分的聚合酶作用于連接第二探針的分析物結(jié)合部分的核酸部分，如在W02009/012220中描述的。這些分析中，作為探針對的一個(gè)探針的部分的“錨定”聚合酶的作用導(dǎo)致游離在溶液中的模板的生成，所述模板通過加入的聚合酶而易于擴(kuò)增。與錨定聚合酶不同，加入的聚合酶僅能夠作用于由所述錨定聚合酶生成的模板，并且不直接作用于探針對的不含聚合酶的探針的核酸部分。根據(jù)鄰近探測原理，加入的聚合酶的作用導(dǎo)致所生成模板的擴(kuò)增，擴(kuò)增的拷貝是可檢測的并指示樣品中分析物的存在。[0014]除了對鄰近探針檢測分析的修飾，鄰近探針自身結(jié)構(gòu)的修飾都進(jìn)行了描述，例如在TO03/044231中，其中使用了多價(jià)鄰近探針。這樣的多價(jià)鄰近探針包括至少兩個(gè)，最多100個(gè)分析物-結(jié)合域，所述分析物-結(jié)合域共軛至少一個(gè)、優(yōu)選地多于一個(gè)核酸。
[0015]在許多不同的應(yīng)用中，已證明基于鄰近探針的檢測分析，特別是鄰近連接分析在特異性和靈敏地檢測蛋白，例如弱表達(dá)或低豐度蛋白的檢測中非常有用。然而，這樣的分析在分析的靈敏度和特異性方面并非沒有問題，并且存在改進(jìn)空間。
[0016]常規(guī)鄰近分析的靈敏度，例如如上所述的鄰近連接分析，受到兩個(gè)主要因素的限制:(i)分析物-結(jié)合域?qū)Π蟹治鑫锏挠H和力，和(ii)由未結(jié)合的探針(特別是探針對)的隨機(jī)鄰位產(chǎn)生的非特異性背景信號。使用具有對分析物親和力高的結(jié)合域的探針，靈敏度限于檢測約6000個(gè)分子。傳統(tǒng)上，為了實(shí)現(xiàn)低背景水平，必須使用非常低濃度的鄰近探針。這排除了通過使用更高濃度的探針來補(bǔ)償包含低親和分析物-結(jié)合域的探針的任何嘗試。因此，發(fā)現(xiàn)了這可以限制分析的靈敏度和能夠得到定量結(jié)果的范圍。
[0017]已經(jīng)提出了用于降低非特異性背景信號的其它方法，比如將夾板(連接模板)寡核苷酸偶聯(lián)于第三鄰近探針和/或使用阻斷劑比如阻斷寡核苷酸，所述阻斷寡核苷酸結(jié)合鄰近探針上的核酸域的游離末端，直到被夾板寡核苷酸置換。僅當(dāng)鄰位探針結(jié)合于靶分析物時(shí)才容易發(fā)生置換(W02007/107743)。其它降低背景信號的方法集中于改進(jìn)對連接的核酸的檢測。
[0018]然而，仍然有空間來改進(jìn)背景信號的水平，來克服鄰近分析的限制，特別是本領(lǐng)域已知的鄰近連接試驗(yàn)。如上所述，目前已發(fā)現(xiàn)使用解折疊鄰近探針可顯著提高分析的靈敏度和特異性，因?yàn)槠湓试S反應(yīng)順序進(jìn)行，即以離散和/或可分離階段進(jìn)行。此外，在某些實(shí)施方案中，使用這樣的解折疊鄰近探針簡化了分析方案，因?yàn)槠湓试S所有可能的相互作用組分同時(shí)接觸樣品，而沒有相互作用，即由于解折疊鄰近探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)而阻止了該解折疊鄰近探針的核酸域的反應(yīng)(功能)元件的相互作用。因此，在第一種情況下，鄰近探針能夠與樣品相互作用，使得僅鄰近探針的分析物-結(jié)合域可以與樣品中的分析物相互作用。在允許鄰近探針結(jié)合分析物(即，探針同時(shí)結(jié)合分析物)的充分條件下，所述解折疊鄰近探針的核酸域可以被活化，即通過裂解反應(yīng)解折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以釋放核酸域的反應(yīng)元件，然后該反應(yīng)元件可以以鄰近依賴性方式相互作用。通過保護(hù)(屏蔽或掩蔽)分析的一個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸域以避免與樣品中的其它核酸分子或其它組分反應(yīng)，直到探針結(jié)合分析物，這有可能降低分析中存在的非特異背景信號。
[0019]雖然使用試劑阻斷鄰近探針的反應(yīng)元件在用于檢測樣品中的分析物的方法中是熟知的，但是與之前描述阻斷劑相比，在本發(fā)明中使用解折疊鄰近探針和折疊結(jié)構(gòu)的釋放機(jī)制的性質(zhì)提供獨(dú)特且出乎意料的優(yōu)點(diǎn)。[0020]本發(fā)明是建立在檢測單獨(dú)的、序列特異性蛋白質(zhì)-DNA-相互作用的分析的發(fā)展的基礎(chǔ)上。然而，從本說明書顯而易見的是，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的解折疊鄰近探針可用于許多鄰近探針分析，且不限于探測蛋白質(zhì)-DNA-相互作用。實(shí)際上，本發(fā)明的方法可用于如下定義的檢測樣品中的任一種分析物。
[0021]作為【背景技術(shù)】，控制基因表達(dá)的一個(gè)基本方面是由蛋白質(zhì)和核酸分子，例如轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白等之間的相互作用引起。過去，已經(jīng)通過方法比如電泳遷移位移分析和染色質(zhì)免疫沉淀在大量細(xì)胞群中研究了這樣的相互作用。雖然這種分析提供了有關(guān)結(jié)合一些DNA序列的蛋白質(zhì)的信息，但是該數(shù)據(jù)僅提供所述細(xì)胞中相互作用的概述。在這種分析中不能檢測到只在少量細(xì)胞中發(fā)生的任何相互作用，該相互作用產(chǎn)生的信號是來自大量細(xì)胞的平均信號。
[0022]應(yīng)當(dāng)理解，轉(zhuǎn)錄因子活性的表觀遺傳修飾或改變在控制基因表達(dá)方面起重要作用。實(shí)際上，這些假設(shè)位于將細(xì)胞轉(zhuǎn)化成所謂的癌癥干細(xì)胞(CSC)的初始事件中。通過研究當(dāng)癌細(xì)胞進(jìn)行上皮的-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)癌癥發(fā)展或特異性轉(zhuǎn)錄因子活化期間以基因組DNA水平的蛋白質(zhì)-DNA相互作用(PDI)，如表觀修飾變化，可以鑒別CSC和轉(zhuǎn)移性腫瘤集落的標(biāo)記物。然而，由于CSC只代表包括來自患者活組織檢查的腫瘤的所有細(xì)胞的一小部分，它們不能通過對全部細(xì)胞群求平均值的整體分析來鑒別。因此，需要能夠以細(xì)胞和亞細(xì)胞分辨率研究細(xì)胞和組織中roi的新方法。
[0023]為了解決該需要，本發(fā)明人研究了一種能夠檢測這種相互作用的鄰近連接分析，其一個(gè)實(shí)例顯示在圖1中。該圖描述了本發(fā)明的一個(gè)代表性的實(shí)施方案，顯而易見的是基于使用包括可以裂解而解折疊的核酸域的鄰近探針，有可能進(jìn)行該分析的許多變化。
[0024]然而，圖1中顯示的步驟代表起始點(diǎn)，從該起始點(diǎn)可以描述本發(fā)明的其余部分。在這點(diǎn)上，圖1中的分析包括具有能夠結(jié)合(直接地或間接地)PDI復(fù)合物(即分析物)的蛋白質(zhì)的域的第一鄰近探針，所述PDI復(fù)合物偶聯(lián)能夠與第二鄰近探針的核酸域相互作用的核酸域。在圖1中顯示的具體 實(shí)施方案中，第一鄰近探針為偶聯(lián)核酸域的抗體，其中所述抗體直接地結(jié)合分析物，即其結(jié)合PDI復(fù)合物的蛋白質(zhì)。
[0025]第二鄰近探針包括能夠結(jié)合(例如雜交)接近PDI復(fù)合物的蛋白質(zhì)的PDI復(fù)合物的核酸的域。所述鄰近探針的DNA-結(jié)合部分(分析物-結(jié)合域)偶聯(lián)能夠與第一鄰近探針的核酸域相互作用的核酸域。然而，第二鄰近探針的核酸域包括至少一個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)域，使其形成阻止其于第一鄰近探針的核酸域相互作用的莖環(huán)或發(fā)夾環(huán)。在圖1中顯示的具體實(shí)施方案中，第二鄰近探針是可環(huán)狀化的寡核苷酸，所謂的鎖式探針。包括自身互補(bǔ)區(qū)域的鎖式探針也稱為“喇叭”探針，如下進(jìn)一步定義的。
[0026]第一和第二鄰近探針與樣品接觸，分析物-結(jié)合域(即，能夠與PDI復(fù)合物相互作用的鄰近探針域)允許特異性結(jié)合其各自的靶標(biāo)。第二鄰近探針與分析物的相互作用的特異性得到第一連接反應(yīng)的證實(shí)，所述第一連接反應(yīng)以PDI復(fù)合物的核酸作模板，產(chǎn)生環(huán)狀寡核苷酸。然后，第二鄰近探針的莖環(huán)(所謂的喇叭探針)解折疊(通過裂解反應(yīng))釋放與第一鄰近探針的核酸域互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域。第一和第二鄰近探針的核酸域允許相互作用(即，雜交或退火)，并且第一鄰近探針的核酸域充當(dāng)?shù)诙徑结樅怂嵊虻尼尫诺目蛇B接末端的模板。第二鄰近探針的核酸域的可連接末端可以以第二連接反應(yīng)進(jìn)行連接，產(chǎn)生環(huán)狀寡核苷酸。所述連接反應(yīng)(即，第一和第二連接反應(yīng))可以是直接連接，例如，如果末端彼此直接相鄰，或者間接連接，例如如果在游離的可連接末端之間存在空間，則可以將“間隔”寡核苷酸加入到反應(yīng)中，使得每個(gè)游離末端連接到間隔寡核苷酸(如圖1所示)。所述間隔寡核苷酸包括至少一個(gè)與連接模板互補(bǔ)的區(qū)域，在中間存在鄰近探針的核酸域的可連接游離端。可以例如通過滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和將標(biāo)記探針雜交至RCA產(chǎn)物來檢測環(huán)狀寡核苷酸的形成，由此檢測兩個(gè)鄰近探針之間的相互作用。在某些實(shí)施方案中，RCA可以通過鄰近探針的核酸域或分析物啟動。
[0027]因此，應(yīng)當(dāng)看到使用至少一個(gè)解折疊鄰近探針能夠以控制的不同(離散的或可分離的)階段進(jìn)行反應(yīng)。在上述實(shí)施方案，所述階段可以視為:
[0028](i)使鄰近探針結(jié)合分析物；
[0029](ii)第一連接反應(yīng)；
[0030](iii)解折疊受保護(hù)的鄰近探針；
[0031](iv)第二連接反應(yīng)；和
[0032](V)檢測鄰近探針之間的相互作用。
[0033]應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步看到，所述分析的組分可以同時(shí)與包含分析物的樣品接觸，并且在解折疊鄰近探針的發(fā)夾解折疊之前，所述組分不會與鄰近探針的核酸域相互作用。這些特征的組合，即反應(yīng)可以分階段進(jìn)行，同時(shí)能夠同時(shí)加入分析的相互作用組分，是特別有利的。本文描述的方法降低了分析方案的復(fù)雜性，同時(shí)還提高了鄰近探針檢測分析的靈敏度和特異性。此外，可知的是本發(fā)明的解折疊鄰近探針可以用于任何合適的鄰近探針分析，進(jìn)一步阻止鄰近探針核酸域的非特異性相互作用，因此降低了非特異性背景信號。
[0034]因此，在最廣`義上，可以看出本發(fā)明提供一種檢測樣品中分析物的方法，稱為鄰近分析，其中該方法包括使用至少一組至少第一和第二鄰近探針，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合分析物，其中至少一個(gè)所述鄰近探針的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過裂解核酸域而解折疊以產(chǎn)生與所述樣品中另一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的至少一個(gè)可連接游離末端或區(qū)域，其中當(dāng)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，解折疊所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)允許所述至少第一和第二鄰近探針的核酸域直接地或間接地相互作用。
[0035]因此，顯而易見的是，在本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一和第二鄰近探針的核酸域在解折疊之后互相互補(bǔ)或與共用模板互補(bǔ)。
[0036]因此，解折疊允許的核酸域的相互作用可以彼此雜交或連接域，或者雜交共用模板(例如連接模板)。因此，應(yīng)當(dāng)看到共用模板可以是鄰近探針的核酸域(即，“相互作用”域)可以各自雜交的核酸分子(例如寡核苷酸)。因此，同用模板因此包含用于核酸域雜交的分離的或不同的結(jié)合位點(diǎn)，因此它們可以同時(shí)結(jié)合相同的(即“共用”)分子(即，同時(shí))。
[0037]因此，本發(fā)明的方法包括裂解核酸域以解折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)，來產(chǎn)生或釋放至少一個(gè)互補(bǔ)的可連接游離末端或區(qū)域的步驟。例如，在使探針結(jié)合分析物之后，核酸域可以裂解以解折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)和允許核酸域的相互作用。
[0038]另一個(gè)角度來看，本發(fā)明的方法可以看作提供一種提高鄰近分析的靈敏度和/或特異性的方法。以另一種方式表達(dá)，本發(fā)明可以看作提供一種降低鄰近分析中鄰近探針之間非特異性相互作用的方法。在另一個(gè)方面，所述方法可以看作降低鄰近分析中的背景噪聲或提高鄰近分析中背景噪聲與信號的比例。[0039]如在下述詳細(xì)描述的，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面是提供用于本發(fā)明的方法和一般鄰近分析中的解折疊鄰近探針，例如喇叭探針，其包括可以通過裂解核酸域而解折疊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。特別地，這樣的分析將是鄰近連接分析，盡管本發(fā)明的這一方面不限于檢測基于連接的鄰近探針的核酸域之間的相互作用(例如，核酸結(jié)構(gòu)之間的相互作用可以是基于雜交,例如在W097/00446或W001/61037中所公開的)。[0040]例如，如在US6，558，928中描述的使用鎖式探針(其中喇叭探針是一種特定類型)，或?qū)嶋H上使用任意環(huán)狀核酸分子作為模板的滾環(huán)擴(kuò)增，也可以用于產(chǎn)生獨(dú)特的核酸分子和可以用于擴(kuò)增現(xiàn)有的“信號”核酸分子(例如，由鄰近探針連接分析產(chǎn)生的)或檢測特定分析物，例如其中所述分析物是核酸分子。從下述說明書顯而易見的是，使用方法可以產(chǎn)生滾環(huán)擴(kuò)增方法可以應(yīng)用于其的環(huán)狀寡核苷酸。
[0041]因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供一種檢測樣品中分析物的方法，包括:
[0042]a)用至少一組的至少第一和第二鄰近探針接觸所述樣品，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合所述分析物，其中至少第一個(gè)所述鄰近探針的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過裂解核酸域而解折疊產(chǎn)生至少一個(gè)可連接游離末端，其中當(dāng)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，所述至少一個(gè)可連接游離末端能夠與所述第二鄰近探針的核酸域相互作用；
[0043](b)使所述至少一個(gè)可連接游離末端直接地或間接地連接鄰近探針的核酸域；和
[0044](C)檢測所述連接。
[0045]步驟(b)中的連接可以是分子間連接或分子內(nèi)連接。因此，裂解釋放的可連接游離末端可以連接不同鄰近探針的核酸域，或者其可以連接同一鄰近探針的核酸域的其它末端(其它末端也可以在裂解步驟中釋放出，如下進(jìn)一步討論的)。
[0046]本發(fā)明的可選的優(yōu)選的實(shí)施方案提供一種檢測樣品中分析物的方法，包括:
[0047]a)用至少一組的至少第一和第二鄰近探針接觸所述樣品，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合所述分析物，其中至少第一個(gè)所述鄰近探針的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過裂解核酸域而解折疊以產(chǎn)生與所述樣品中的一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的至少一個(gè)區(qū)域，所述互補(bǔ)的至少一個(gè)區(qū)域是至少能夠雜交所述第二鄰近探針的核酸域的連接模板，其中當(dāng)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，第二鄰近探針的核酸域可利用所述第一鄰近探針的所述雜交的連接模板介導(dǎo)的相互作用連接至鄰近探針的核酸域；
[0048](b)用鄰近探針的核酸域直接地或間接地連接所述第二鄰近探針的核酸域；和
[0049](C)檢測所述連接。
[0050]此外，步驟(b)的連接可以是分子內(nèi)連接或分子間連接，即連接相同或不同鄰近探針的核酸域。
[0051]本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步可選的實(shí)施方案提供一種檢測樣品中分析物的方法，包括:
[0052](a)用至少一組的至少第一和第二鄰近探針接觸所述樣品，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合所述分析物，其中至少第一個(gè)所述鄰近探針的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過裂解核酸域而解折疊產(chǎn)生與所述樣品中的一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的至少一個(gè)區(qū)域，所述互補(bǔ)的至少一個(gè)區(qū)域是能夠直接地或間接地雜交所述第二鄰近探針的核酸域的引物，其中當(dāng)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，第二鄰近探針的核酸域是用于所述第一鄰近探針的核酸域延伸的模板；
[0053](b)延伸所述第一鄰近探針的核酸域；和
[0054](c)檢測所述核酸延伸產(chǎn)物。
[0055]雖然不希望受到理論的束縛，相信本發(fā)明的方法依賴解折疊鄰近探針的核酸域中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)來保護(hù)(屏蔽或掩蔽)所述核酸域的反應(yīng)元件以避免當(dāng)沒有結(jié)合到分析物的靶位點(diǎn)時(shí)與核酸域的其它鄰近探針的相互作用。據(jù)認(rèn)為該保護(hù)作用可減少鄰近探針的核酸域之間的非特異性相互作用(即，在反應(yīng)混合物中探針的非靶特異性接近引起的相互作用)，從而減少非靶特異性相互作用產(chǎn)生的信號量。
[0056]如下將更詳細(xì)地描述的，本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的方面涉及其中核酸域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被解折疊的解折疊鄰近探針，優(yōu)選地通過裂解該發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以釋放兩個(gè)游離末端，5’和3’末端，這兩個(gè)游離末端都能夠與樣品中的其它核酸分子相互作用，優(yōu)選地其中所述核酸分子是其它鄰近探針的核酸域。
[0057]例如，在某些實(shí)施方案中，游離末端可以雜交一個(gè)或多個(gè)核酸域(共用模板)，該核酸域充當(dāng)使游離末端彼此連接產(chǎn)生環(huán)狀寡核苷酸的模板。這樣的連接可以是直接的，即其中游離末端雜交彼此直接鄰近的連接模板?；蛘撸鲞B接可以是間接的，即其中游離末端雜交連接模板，兩者之間具有間隔，該間隔被“間隔”寡核苷酸填充，使得每個(gè)游離末端連接所述間隔寡核苷酸的一個(gè)末端。在某些實(shí)施方案中，所述游離末端兩者之間的間隔可以通過例如在聚合酶反應(yīng)中，使用連接模板作為延伸模板將游離3’末端延伸來“填充”。一旦游離3’末端已經(jīng)延伸至接近游離5’末端，則兩個(gè)末端可以通過連接反應(yīng)結(jié)合。
[0058]在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，兩個(gè)游離末端中的一個(gè)或兩個(gè)可以連接至其它鄰近探針的核酸域，其中這樣 的連接以一個(gè)或多個(gè)連接模板(包含與鄰近探針的核酸域的每個(gè)末端互補(bǔ)的區(qū)域的寡核苷酸)作為模板。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)游離末端連接至不同鄰近探針的核酸域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)游離末端(5’和3’)連接第二鄰近探針的核酸域的各自3’和5’末端。在這樣的實(shí)施方案中，兩個(gè)鄰近探針的核酸域可以各自解折疊以釋放5’和3’末端，允許每個(gè)域各自的各自末端連接在一起形成環(huán)狀分子。因此，探針的核酸域的可連接5’和3’末端的釋放可以看作產(chǎn)生了用于兩個(gè)半環(huán)一起連接而環(huán)化的“半環(huán)”。本領(lǐng)域已知這樣的半環(huán)作為兩部分鎖式探針的兩個(gè)部分。在某些實(shí)施方案中，連接模板可以是其它鄰近探針的核酸域。
[0059]在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩部分鎖式探針的“半環(huán)”可以提供作為雜交第一鄰近探針的核酸域的寡核苷酸。這樣的雜交可以在用鄰近探針接觸樣品之前或之后，即兩部分鎖式探針可以看作是鄰近探針的核酸域的一部分，或者可以看作是加入到分析的另一種寡核苷酸。第二鄰近探針可以是解折疊鄰近探針，其中所述核酸域包括連接模板。因此，在鄰近探針結(jié)合分析物之后，第二鄰近探針可以例如通過裂解而解折疊，并且兩個(gè)連接反應(yīng)可以以第一和第二鄰近探針的核酸域作為模板，得到環(huán)狀寡核苷酸(參見例如圖16)。
[0060]如上所述，本發(fā)明涉及解折疊的鄰近探針的用途。以其最簡單的形式，解折疊可以定義為釋放出解折疊的鄰近探針的核酸域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一部分，以得到至少一個(gè)與另一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的可連接游離末端或區(qū)域。換言之，解折疊導(dǎo)致發(fā)夾結(jié)構(gòu)開放。在某些實(shí)施方案中，解折疊可以通過分裂發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈元件的至少一部分來實(shí)現(xiàn)。在其它實(shí)施方案中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈元件可以保留，并且可以通過修飾例如裂解發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)實(shí)現(xiàn)解折疊。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，鄰近探針的解折疊導(dǎo)致釋放兩個(gè)游離末端5’末端和3’末端。
[0061]顯而易見的是，可以以多種方式實(shí)現(xiàn)解折疊。對于在方法中使用的不同鄰近探針，可以使用不同的解折疊手段。雖然本發(fā)明的方法要求通過裂解解折疊鄰近探針的至少一個(gè)核酸域，但是沒有要求每個(gè)域通過解折疊裂解。因此，可以使用超過一個(gè)解折疊探針，但是只需要通過裂解解折疊一個(gè)探針。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)解折疊探針的解折疊都可以通過裂解核酸域?qū)崿F(xiàn)。在其它實(shí)施方案中，至少一個(gè)域是通過裂解解折疊的，并且至少一個(gè)其它域是通過其它手段解折疊的。優(yōu)選地，裂解發(fā)生的位點(diǎn)位于核酸域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即形成該發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一部分。如下所述，裂解優(yōu)選地為酶催化裂解。
[0062]如上所述，本發(fā)明的解折疊鄰近探針的核酸域包含至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可以稱為發(fā)夾環(huán)或莖環(huán)，這些術(shù)語在本文中可互換地使用。發(fā)夾是可以在單鏈DNA或RNA分子中出現(xiàn)的分子內(nèi)堿基對模式。當(dāng)核苷酸序列中通?；パa(bǔ)的同一鏈的兩個(gè)區(qū)域以相反方向讀取時(shí)，堿基對形成以不成對的環(huán)即單鏈端接的雙螺旋(duplex)，出現(xiàn)發(fā)夾。其結(jié)構(gòu)可以被描述為棒棒糖形。
[0063]在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)夾沒有形成鄰近探針的核酸域的末端，即每個(gè)發(fā)夾的雙螺旋由雙螺旋的5’和3’末端的單鏈區(qū)域側(cè)鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)夾可以是核酸域的一個(gè)末端，即雙螺旋的一個(gè)末端(3’或5’末端)形成核酸域的末端。
[0064]如上所述，也可以通過分裂發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈元件的至少一部分實(shí)現(xiàn)解折疊。這可以通過如下來實(shí)現(xiàn):改變樣品的條件，使得發(fā)夾結(jié)構(gòu)不再是熱力學(xué)有利的結(jié)構(gòu)，例如通過改變?nèi)芤旱臏囟然螓}濃度。類似地，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過修飾雙螺旋中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基以分裂氫鍵(所謂的Watso n-Crick堿基配對)使兩個(gè)鏈退火來去穩(wěn)定化。例如,來自核苷酸的堿的裂解可以足夠分裂雙螺旋充分達(dá)到“解折疊”所述發(fā)夾。
[0065]或者，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以解折疊開-競爭發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈元件與“抗阻斷”寡核苷酸。例如，在高濃度的抗阻斷寡核苷酸的存在下，所述抗阻斷寡核苷酸與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的鏈之一互補(bǔ)，抗阻斷寡核苷酸和鄰近探針的核酸域之間的相互作用(雜交)將對發(fā)夾結(jié)構(gòu)有利。因此，在本發(fā)明的鄰近分析中，“抗阻斷”寡核苷酸可以是鄰近探針的核酸域的形式，例如連接模板寡核苷酸或引物寡核苷酸。顯而易見的是，當(dāng)鄰近探針全部綁定到分析物時(shí)，所述探針的核酸域有效地以高局部濃度存在。因此，如果鄰近探針的核酸域之間的相互作用(雜交)比解折疊鄰近探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的元件之間的相互作用更穩(wěn)定(熱力學(xué)有利的)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)將解折疊以恢復(fù)鄰近探針的核酸域之間的相互作用。
[0066]在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，鄰近分析包括超過一個(gè)解折疊鄰近探針。在這樣的實(shí)施方案中，顯然這樣的解折疊鄰近探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以在同一反應(yīng)中以不同的方式解折疊，例如第一解折疊鄰近探針可以通過裂解而解折疊，第二解折疊鄰近探針可以通過與另一個(gè)鄰近探針的核酸域競爭而解折疊。例如，解折疊第一鄰近探針可以產(chǎn)生互補(bǔ)區(qū)域，其引起第二鄰近探針中發(fā)夾結(jié)構(gòu)分裂。
[0067]在其它實(shí)施方案中，可以使用一個(gè)或多個(gè)解折疊鄰近探針與“標(biāo)準(zhǔn)”非解折疊鄰近探針的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案，這樣的標(biāo)準(zhǔn)鄰近探針可以利用阻斷寡核苷酸(下文進(jìn)一步描述的)來保護(hù)(掩蔽或屏蔽)所述鄰近探針的核酸域的反應(yīng)元件，以使其與其它鄰近探針的核酸域或樣品中的其它組分的相互作用最小化。[0068]根據(jù)本發(fā)明的方法，至少一個(gè)解折疊鄰近探針通過裂解解折疊。
[0069]“裂解”在本文中廣義地定義為包括使核苷酸鏈(即核苷酸序列)斷裂或分裂的任何手段。因此，裂解可能涉及共價(jià)鍵斷裂。這可以包括，但不要求核苷酸鏈裂解(即，鏈裂解或鏈切斷)，例如通過磷酸二酯鍵裂解。
[0070]在某些實(shí)施方案中，解折疊鄰近探針的核酸域的裂解涉及使連接核酸分子的相鄰核苷酸殘基的至少一個(gè)共價(jià)鍵斷裂，例如水解磷酸二酯鍵。裂解優(yōu)選地包括水解發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一個(gè)鏈中的一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵。因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括裂解識別位點(diǎn)，例如被能夠裂解核酸分子的一個(gè)或多個(gè)酶識別的序列?？梢允褂萌魏魏线m的酶來裂解所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以解折疊鄰近探針的核酸域。
[0071 ] 例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以包括或可以被工程化或修飾以包括限制性核酸內(nèi)切酶識別序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如其中發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，所述限制性核酸內(nèi)切酶將只裂解發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙螺旋部分的單個(gè)鏈。
[0072]在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以被工程化以包括限制性核酸內(nèi)切酶識別序列。例如，這可以通過使寡核苷酸(本文稱為“限制性寡核苷酸”)雜交至發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)以包括所述環(huán)中的雙螺旋來實(shí)現(xiàn)。所形成的雙螺旋的至少一部分應(yīng)當(dāng)包括限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，其可以裂解導(dǎo)致解折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)。可以使用任何合適的限制性核酸內(nèi)切酶來解折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，限制性寡核苷酸可以是鄰近探針的核酸域的形式。
[0073]在本發(fā)明的再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以使用核酸外切酶降解發(fā)夾雙螺旋的一個(gè)鏈，從而釋放發(fā)夾的單鏈環(huán)，即解折疊探針。核酸外切酶可以具有5’或3’核酸外切酶活性，這取決于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的方向。
[0074]在其它實(shí)施方案中，裂解可以包括使核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸之內(nèi)的共價(jià)的鍵斷裂。例如，當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括尿嘧啶殘基時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)中雙螺旋的至少一部分可以通過除去一個(gè)或多個(gè)尿嘧啶堿基被分 裂，即使用尿嘧啶-DNA糖基化酶從核酸裂解所述堿基。所述一個(gè)或多個(gè)尿嘧啶堿基的除去導(dǎo)致發(fā)夾雙螺旋的兩個(gè)鏈之間的一些氫鍵損失，引起喪失穩(wěn)定性和核酸域的解折疊。
[0075]在某些實(shí)施方案中，裂解識別位點(diǎn)是通過產(chǎn)生核酸域?qū)崿F(xiàn)的，其中發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括一個(gè)或多個(gè)尿嘧啶殘基。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以用尿嘧啶-D NA糖基化酶(UNG)與能夠識別雙鏈DNA的脫嘌呤/脫嘧啶(AP)位點(diǎn)的核酸內(nèi)切酶，例如核酸內(nèi)切酶IV，結(jié)合處理來解折疊所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
[0076]在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用切口酶裂解發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且由此解折疊，其只裂解發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙螺旋中的一個(gè)鏈。切口酶是只裂解DNA雙螺旋的單鏈的核酸內(nèi)切酶。如上所述，在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)中，裂解識別位點(diǎn)可以被工程化，例如通過使寡核苷酸退火(雜交)至所述環(huán)。
[0077]某些切口酶通過結(jié)合和識別特定核苷酸識別序列只在DNA分子的特定位點(diǎn)引入單鏈切口。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量天然存在的切口酶，其中目前已經(jīng)確定了至少四個(gè)切口酶的序列識別性質(zhì)。切口酶描述在美國專利N0.6，867，028中，將其全部引入本文作為參考，在本發(fā)明的方法中可以使用任何合適的切口酶。
[0078]在利用切口酶的某些優(yōu)選的實(shí)施方案，在鄰近探針的核酸域解折疊之后，切口酶從分析中被除去或滅活，以避免非預(yù)期的連接產(chǎn)物的裂解。[0079]所述檢測自身依賴于樣品中分析物的存在，并檢測兩個(gè)(或多個(gè))鄰位探針與分析物結(jié)合(即，鄰近探針同時(shí)結(jié)合分析物)時(shí)這樣的探針之間的相互作用。因此，探針之間的相互作用(或更具體地，在其各自核酸域之間的相互作用)為鄰近依賴性的；鄰近探針一起結(jié)合到分析物使它們變得鄰近，使得它們(或更特別地，其核酸域)可相互作用。因此，通過檢測相互作用，例如連接反應(yīng)(例如通過檢測相互作用產(chǎn)物，例如連接反應(yīng)的產(chǎn)物)，可以檢測分析物。因此，在通常情況下鄰近探針的核酸域之間的相互作用可導(dǎo)致產(chǎn)物的生成，所述的產(chǎn)物通常為核酸產(chǎn)物，可以對其進(jìn)行檢測以檢測分析物。因此，在上述方法的步驟(C)中，通過檢測所述連接(例如通過檢測所述連接反應(yīng)的產(chǎn)物)，可檢測分析物。類似地，在其中檢測步驟涉及檢測延伸產(chǎn)物的實(shí)施方案，例如通過另一個(gè)鄰近探針的核酸域作為最初的模板延伸引物，可以通過檢測該延伸產(chǎn)物檢測分析物。
[0080]如上可知，基于連接的鄰近依賴性分析代表了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案(即，其中用于檢測方法中的至少第一和第二鄰近探針包括核酸域，其中至少一個(gè)核酸域包括通過裂解可解折疊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并且其間的相互作用涉及連接反應(yīng))。一般來看，探針的核酸域可以直接地或間接地介導(dǎo)(例如參與)連接反應(yīng)。這樣的連接反應(yīng)可以涉及鄰近探針的核酸域的連接(例如，其中核酸域雜交共用模板)，和/或核酸域可以作為連接反應(yīng)的模板(例如，其中核酸域互相互補(bǔ))。
[0081]通過一個(gè)更具體的實(shí)例，在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，鄰位探針可以通過彼此相結(jié)合，例如通過連接而相互作用。所述相互作用可以通過檢測結(jié)合產(chǎn)物來進(jìn)行檢測(相互作用產(chǎn)物；連接產(chǎn)物)。在該方法的一種形式中，所述核酸域的相互作用需要一個(gè)或多個(gè)連接模板(夾板)寡核苷酸與域結(jié)合，并介導(dǎo)其相互作用(具體地，在連接的情況下，所述夾板寡核苷酸雜交所述域，并充當(dāng)連接反應(yīng)的模板)，以及所述夾板促進(jìn)或介導(dǎo)該相互作用。如從上述各種鄰近分析和下述具體實(shí)施例的描述中可以認(rèn)識到，在其它形式/實(shí)施方案中，所述夾板可 以作為第三鄰近探針的核酸域提供，和/或核酸域的連接可以是直接的(即，核酸域可以直接地彼此連接)，或間接的，即，它們可以間接地連接，例如經(jīng)由間隔寡核苷酸的中介性；在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，核酸域可以雜交到夾板寡核苷酸，并在它們各自的末端留下間隔，可通過間隔寡核苷酸或通過使用聚合酶延伸核酸域之一的末端(游離的3’端)填充該間隔。鄰近連接分析的這樣的“間隔填充”的實(shí)施方案在文獻(xiàn)中有充分描述,例如在 W001/61037 或在 W02007/107743 中。
[0082]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，三個(gè)鄰近探針的核酸域可以由兩個(gè)連接模板(夾板)寡核苷酸介導(dǎo)而連接在一起，如圖2所示。在該實(shí)施方案中，第一鄰近探針的核酸域通過裂解解折疊，產(chǎn)生兩個(gè)游離可連接末端5’和3’末端。每個(gè)游離末端分別連接第二和第三鄰近探針的核酸域，每個(gè)連接都由連接模板寡核苷酸(即，共用模板)所介導(dǎo)。顯而易見的是，第二和第三鄰近探針的一個(gè)或兩個(gè)都可以是解折疊鄰近探針的形式。在其中所有的解折疊鄰近探針都可以通過單一機(jī)制，例如裂解，來解折疊的實(shí)施方案中，在探針已經(jīng)結(jié)合分析物之后，加入單一試劑，例如裂解酶，將引起核酸域解折疊，促進(jìn)它們的相互作用。在其中解折疊鄰近探針需要不同的解折疊機(jī)制的實(shí)施方案中，每個(gè)探針可以分別如上所述解折疊。解折疊的順序性可以使樣品中核酸分子之間非預(yù)期的相互作用最小化。
[0083]來自這樣的反應(yīng)的連接產(chǎn)物可以通過任何合適的手段檢測，例如連接產(chǎn)物的部分或全部的PCR擴(kuò)增，其中如下詳細(xì)描述的檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。[0084]在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在鄰近探針結(jié)合分析物之后，第一鄰近探針通過裂解解折疊，得到部分雙鏈的核酸域，其中一個(gè)鏈包括兩個(gè)游離可連接的末端(類似于鎖式探針，如本文在別處描述的)。每個(gè)末端包括與第二鄰近探針的核酸域互補(bǔ)的區(qū)域。第二鄰近探針的核酸域充當(dāng)介導(dǎo)第一鄰近探針的兩個(gè)游離末端連接以形成環(huán)狀寡核苷酸的連接模板(看例如圖3A)。該環(huán)狀寡核苷酸，即連接產(chǎn)物可以以任何合適的手段例如滾環(huán)擴(kuò)增來檢測。圖3A中顯示的實(shí)施方案可以看作是通過裂解所述解折疊探針釋放環(huán)狀寡核苷酸，即鎖式探針。雖然沒有在圖3A或圖4中描述，但是顯而易見，在一個(gè)代表性的實(shí)施方案中，第二鄰近探針的核酸域可以充當(dāng)介導(dǎo)第一鄰近探針的兩個(gè)游離末端連接的連接模板，和充當(dāng)用于擴(kuò)增連接產(chǎn)物的引物，例如用于滾環(huán)擴(kuò)增的引物。
[0085]如下更詳細(xì)描述的，圖3B顯示兩部分鎖式探針的釋放，所謂的連接的兩個(gè)半環(huán)的釋放，一個(gè)來自兩個(gè)鄰近探針的每個(gè)核酸域(或者，釋放的一個(gè)半環(huán)連接第二鄰近探針的核酸域提供的一個(gè)半環(huán))。
[0086]在某些實(shí)施方案中，解折疊鄰近探針的游離末端的連接可以是間接地連接，例如經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)間隔寡核苷酸，或者在“間隔-填充”延伸寡核苷酸的3’末端之后，如在本文別處描述的。
[0087]在進(jìn)一步實(shí)施方案，第一或第二鄰近探針的核酸域之一可以充當(dāng)滾環(huán)擴(kuò)增的引物。因此，沒有直接參與連接反應(yīng)的第一鄰近探針的核酸域的部分可以具有可延伸的3’末端?；蛘撸谶B接反應(yīng)之后，第二鄰近探針的連接模板也可以充當(dāng)引物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增環(huán)狀寡核苷酸的引物可以提供在第三鄰近探針上。
[0088]因此，在某些實(shí)施方案中，可能期望沒有連接的第一鄰近探針的核酸域的部分，或者釋放不具有能夠使其充 當(dāng)引物的游離3’末端的連接模板((即，它們具有游離5’末端且不能充當(dāng)引物))的第二鄰近探針的核酸域的部分。因此，引發(fā)連接產(chǎn)物(例如環(huán)化寡核苷酸)的擴(kuò)增只能通過加入引物或例如在第三鄰近探針(其也可以解折疊)上提供的引物來進(jìn)行。
[0089]當(dāng)加入合適的聚合酶(如有必要時(shí)，以及加入引物)時(shí)，可以通過環(huán)化的寡核苷酸的滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)檢測樣品中分析物的存在。多聯(lián)體RCA產(chǎn)物提供用于檢測分析物的標(biāo)記物“信號”，所述多聯(lián)體RCA產(chǎn)物只能當(dāng)鄰近探針鄰近時(shí)結(jié)合，即形成用于雜交或寡核苷酸和/或連接反應(yīng)的模板時(shí)才能形成。所述信號可以通過本領(lǐng)域已知的(參見下述進(jìn)一步的實(shí)例)及如US7，320，860中教導(dǎo)的任何合適的手段，例如將標(biāo)記的探針雜交到在整個(gè)多聯(lián)體RCA產(chǎn)物中重復(fù)的報(bào)導(dǎo)體域序列來檢測。如上所述，使用包括具有發(fā)夾環(huán)的核酸域的鄰近探針意味著鄰近探針的核酸域不能彼此相互作用，直到發(fā)夾結(jié)構(gòu)被解折疊。因此，在代表性的實(shí)施方案中，可以將檢測鄰近探針相互作用例如擴(kuò)增相互作用產(chǎn)物可需要的另外的試劑與鄰近探針同時(shí)加入到反應(yīng)中，由此避免以單獨(dú)步驟中加入特定檢測試劑的需要。使鄰近分析的步驟數(shù)最小化可以促進(jìn)減少進(jìn)行該分析需要的全部次數(shù)，即提高分析效率，并且有助于提高信噪比，即有助于減低非特異性背景。
[0090]在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第二鄰近探針的核酸域可以包括部分雙鏈的核酸分子，其中一個(gè)鏈具有兩個(gè)游離可連接末端。在該實(shí)施方案中，分析中存在連接模板寡核苷酸介導(dǎo)第一和第二鄰近探針的核酸域的連接(直接地或間接地)，以生成環(huán)狀寡核苷酸(參見圖3B)。因此，所述連接模板寡核苷酸各自具有與第一和第二鄰近探針的兩個(gè)核酸域的一個(gè)末端互補(bǔ)的區(qū)域。例如，第一連接模板寡核苷酸可以具有與第一鄰近探針的3’末端和第二鄰近探針的5’末端互補(bǔ)的區(qū)域，而第二連接模板寡核苷酸可以具有與第一鄰近探針的5’末端和第二鄰近探針的3’末端互補(bǔ)的區(qū)域。因此，所述連接模板可以被看作是鄰近探針的核酸域同步地或同時(shí)地結(jié)合的共用模板，即在該實(shí)施方案(和涉及共用連接模板的其它實(shí)施方案中)，所述連接模板包括與每個(gè)核酸域互補(bǔ)的不同區(qū)域。如上所述，超過一個(gè)分析的鄰近探針可以是解折疊的鄰近探針，參見例如圖4和5。而且，一個(gè)或兩個(gè)連接模板寡核苷酸都可以作為鄰近探針的核酸域提供(參見例如圖6)，其也可以是解折疊鄰近探針。
[0091]在一個(gè)進(jìn)一步的具體實(shí)例中，鄰近探針的一個(gè)或多個(gè)核酸域可以充當(dāng)一個(gè)或多個(gè)加入的寡核苷酸的連接中的模板。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，在解折疊一個(gè)或多個(gè)鄰近探針，例如通過裂解所述發(fā)夾，之后，首先加入的寡核苷酸可以雜交到所有核酸域，也可以加入一個(gè)或多個(gè)僅雜其中一個(gè)交域的其它寡核苷酸，例如可以與每個(gè)核酸域結(jié)合的寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸鄰近第一寡核苷酸的每個(gè)末端，所述加入的寡核苷酸可以在核酸域作為模板的反應(yīng)中與第一寡核苷酸連接。而且，可以通過任何合適的手段檢測連接產(chǎn)物。
[0092]在可選的實(shí)施方案中，加入的寡核苷酸可以通過連接反應(yīng)環(huán)化(即，類似于如上所述鎖式探針)。因此，舉例來說，連接于各自探針的分析物特異性結(jié)合部分的鄰位探針對(其中至少一個(gè)是通過裂解解折疊的解折疊鄰近探針)的核酸域可分別與加入的線性寡核苷酸(類似與“鎖式探針”)的α)5’和3’端，和αυ所述末端之間的區(qū)域具有互補(bǔ)性。當(dāng)鄰近探針對的兩個(gè)探針均由于結(jié)合相同分析物而鄰近時(shí)，在解折疊鄰近探針的發(fā)夾解折疊之后，各自探針的核酸域能夠與加入的寡核苷酸(可視為共同模版)的各自部分進(jìn)行雜交。與加入的寡核苷酸的5’和3’端互補(bǔ)的核酸域可以作為并列雜交和所述末端的連接的模板(加入合適的連接酶時(shí))，導(dǎo)致加入的寡核苷酸的環(huán)化。然后，使用其它核酸域作為引物，通過滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)檢測該環(huán)化的寡核苷酸；所述對中的另一個(gè)探針的核酸域具有3’游離末端，所述的核酸域雜交加入的寡核苷酸區(qū)域的連接末端之間。在加入合適的聚合酶時(shí)，可以通過環(huán)化寡核苷酸的滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)來檢測樣品中的分析物的存在。僅當(dāng)鄰近探針鄰近結(jié)合時(shí)才能夠形成的多聯(lián)體RCA產(chǎn)物為分析物的檢測提供了 “替代”標(biāo)志物。
`[0093]應(yīng)當(dāng)理解，單一加入的寡核苷酸能夠被兩個(gè)寡核苷酸取代，所述兩個(gè)寡核苷酸可連接到一起形成環(huán)(這樣的連接可以由一個(gè)或兩個(gè)核酸域作為模板，但是所述域中的一個(gè)應(yīng)當(dāng)具有游離3'端以充當(dāng)引物)?；蛘?，單一加入的寡核苷酸可以是預(yù)形成環(huán)的形式，因此不需要連接反應(yīng)。例如，所述預(yù)形成環(huán)可以雜交第一鄰近探針的核酸域，使環(huán)狀寡核苷酸與能夠充當(dāng)用于RCA的引物的第二鄰近探針的核酸域鄰近。在這些實(shí)施方案中，所述鄰近探針的一個(gè)或兩個(gè)可以是解折疊鄰近探針。因此，預(yù)形成環(huán)可以僅在解折疊之后雜交或僅作為在解折疊之后RCA的模板，或兩者。
[0094]鄰近探測反應(yīng)也可通過利用兩個(gè)游離3’端來進(jìn)行，一個(gè)在每個(gè)鄰位探針上并具有弱的互補(bǔ)性，當(dāng)鄰近時(shí)(在至少一個(gè)解折疊鄰近探針解折疊之后產(chǎn)生互補(bǔ)區(qū)域)，DNA聚合酶可以通過加入dNTP延伸這些末端，從而形成可檢測的DNA模板，如在7，306，904和6，511，809號美國專利中所述的。
[0095]在再一個(gè)進(jìn)一步的證實(shí)本發(fā)明方法的潛在復(fù)雜性的特定實(shí)施方案中，可以使用至少四個(gè)鄰近探針，其中任一個(gè)或多個(gè)所述鄰近探針可以是如本文定義的解折疊鄰近探針。一個(gè)實(shí)例為如在圖14中顯示的，其中第一鄰近探針的核酸域包括用于滾環(huán)擴(kuò)增的引物。第二鄰近探針的核酸域，例如當(dāng)通過裂解解折疊時(shí)，能夠形成環(huán)狀寡核苷酸(即，當(dāng)裂解時(shí)，其可以釋放鎖式探針，或環(huán)狀寡核苷酸)，并且包括與由其雜交的預(yù)形成環(huán)狀寡核苷酸互補(bǔ)的區(qū)域。第三鄰近探針的核酸域包括與第二鄰近探針的核酸域互補(bǔ)的區(qū)域，使得其在裂解之后能夠介導(dǎo)第二鄰近探針的核酸域的游離可連接末端的相互作用，即第三鄰近探針的核酸域包括連接模板。第四鄰近探針的核酸域包括與雜交至第二鄰近探針的核酸域的預(yù)形成環(huán)狀互補(bǔ)的區(qū)域，以便形成裂解識別位點(diǎn)，優(yōu)選限制性核酸內(nèi)切酶裂解位點(diǎn)。
[0096]因此，在該實(shí)施方案中，一旦鄰近探針結(jié)合分析物，則核酸域可以如本文在別處描述的解折疊。優(yōu)選地，至少第二鄰近探針的核酸域通過裂解解折疊，使得釋放兩個(gè)游離可連接末端，即裂解核酸域使得生成部分雜交的核酸的兩個(gè)單鏈，其中一個(gè)核酸鏈包括保持雜交連接于分析物-結(jié)合域的母體核酸鏈的一部分的中間區(qū)域。
[0097]因此，只有當(dāng)結(jié)合分析物時(shí)，四個(gè)鄰近探針的“解折疊”核酸域可以基于如上所述相互作用域而相互作用，如圖14所示。第二鄰近探針的核酸域可以連接形成環(huán)狀寡核苷酸，其中所述連接以第三鄰近探針的核酸域作為模板。雖然第一鄰近探針的核酸域可以雜交連接的環(huán)狀寡核苷酸，但是第一核酸域的核酸域的延伸(使用第二鄰近探針的連接的環(huán)狀寡核苷酸作為RCA的模板)受到存在的預(yù)形成環(huán)狀寡核苷酸的抑制，所述預(yù)形成環(huán)狀寡核苷酸雜交第二和第四鄰近探針的核酸域。然而，在預(yù)形成環(huán)狀寡核苷酸和第四鄰近探針的核酸域之間的相互作用(雜交)所形成的裂解識別位點(diǎn)裂解時(shí)，RCA反應(yīng)可以進(jìn)行，即裂解導(dǎo)致預(yù)形成環(huán)狀寡核苷酸的線性化。然而，線性化的預(yù)形成環(huán)狀寡核苷酸包括核酸外切酶嵌段(如下詳細(xì)描述的)，其阻止該寡核苷酸充當(dāng)RCA的引物。因此，只有當(dāng)?shù)谒泥徑结樀暮怂嵊蛞呀?jīng)解折疊且允許雜交第二鄰近探針的連接的環(huán)狀寡核苷酸，才可以進(jìn)行RCA。RCA產(chǎn)物的檢測相應(yīng)于第二鄰近探針的核酸域的連接，由此發(fā)出樣品中存在分析物的信號。
[0098]可以在本文描述的任何鄰近分析中使用核酸外切酶嵌段，其中其用于阻止鄰近探針的一個(gè)或多個(gè)核酸域充當(dāng)引物，例如以確保經(jīng)由合適的引物實(shí)現(xiàn)核酸延伸，所述合適的引物可以是鄰近探針或游離核酸分子的核酸域。其也可用于阻止核酸域生成不需要的延伸產(chǎn)物。例如，在其中分析物-結(jié)合域是核酸分子(參見例如圖7和8)的實(shí)施方案中，將核酸外切酶嵌段引入沒有用作引物的核酸中是有用的，所述引物用于檢測鄰近探針的核酸域之間相互作用，例如用于避免核酸的延伸，其可能引起附近結(jié)合的類似構(gòu)建物向下游移位。在代表性的實(shí)施方案中，有可能同時(shí)檢測多聯(lián)的單個(gè)核酸上的幾個(gè)區(qū)域(例如，使用圖7和8中圖示的鄰近探針)，并且核酸分析物-結(jié)合域的延伸可引起鄰近探針的下游結(jié)合的其它鄰近探針復(fù)合物移位。
[0099]核酸外切酶嵌段在利用具有3’核酸外切酶活性的聚合酶的分析中特別地有用，例如滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，盡管阻止核酸分子用作引物的其任何修飾都將是合適的，例如阻止核酸被聚合酶識別。在一個(gè)代表性的實(shí)施方案中，滾環(huán)擴(kuò)增有利地利用具有3’核酸外切酶活性的聚合酶，例如Phi29，其中所述核酸外切酶的活性是沿著鏈從3’到5’，而聚合酶延伸引物是從5’到3’。如果所述酶遭遇連接到DNA的阻斷基團(tuán)，其阻止了所述酶起作用。因此，包含阻斷基團(tuán)的核酸分子不能起用于核酸延伸的引物作用?？梢允褂萌魏魏线m的阻斷基團(tuán)，比如核苷酸修飾，例如修飾具有阻止聚合酶結(jié)合引物的基團(tuán)的核苷酸，例如通過空間位阻修飾，例如生物素或酶不能處理的基團(tuán)。在代表性的實(shí)施方案中，對于待阻斷的核酸分子，例如待阻斷的核酸外切酶，可以引入本領(lǐng)域已知的任何合適的修飾，比如2’ O-Me-RNA殘基、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯修飾的核酸、核酸之間的聚乙烯基接頭骨架段等。已有一些修飾核酸使得它們是核酸外切酶抗性的和/或不會起引物作用的手段，并且預(yù)期本發(fā)明的方法不限于上述實(shí)例。
[0100]如上所述，分析物-結(jié)合域可以是靶分析物的任何結(jié)合配偶體，并且其可以是直接或間接結(jié)合配偶體。因此，其可以直接地結(jié)合靶分析物，或經(jīng)由中間分子或結(jié)合靶分析物的結(jié)合配偶體間接地結(jié)合，所述分析物-結(jié)合域結(jié)合所述中間分子(結(jié)合配偶體)。特別地，分析物-結(jié)合域或中間結(jié)合配偶體是分析物的特異性結(jié)合配偶體。結(jié)合配偶體是能夠結(jié)合其靶標(biāo)例如靶分析物的任意分子或?qū)嶓w，以及特異性結(jié)合配偶體是能夠特異性結(jié)合其靶標(biāo)(例如靶分析物)的配偶體，即結(jié)合配偶體以比樣品中的其它組分更高的親和力和/或特異性結(jié)合靶標(biāo)(例如分析物)。因此，與靶分析物的結(jié)合可以區(qū)分于非靶分析物；特異性結(jié)合配偶體不與非靶分析物結(jié)合或以可忽略的或不可檢測的或任意該非特異性結(jié)合的方式結(jié)合，如果發(fā)生了則可以區(qū)分。靶分析物及其結(jié)合配偶體之間的結(jié)合通常是非共價(jià)的。
[0101]在其中鄰近探針經(jīng)由中間分子結(jié)合分析物的某些實(shí)施方案中，可以采用中間分子預(yù)培養(yǎng)鄰近探針。例如，在其中鄰近探針是結(jié)合其它鄰近探針的核酸域的喇叭探針(如在本文別處描述的)的實(shí)施方案中，所述其它鄰近探針直接地結(jié)合靶分析物，則該喇叭探針可以預(yù)雜交到其它鄰近探針的核酸域。在該實(shí)施方案中，喇叭探針可以看作是形成其它鄰近探針的核酸域的一部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，喇叭探針沒有預(yù)雜交其它鄰近探針的核酸域。這樣的表示描述在圖11中。在這樣的實(shí)施方案中，喇叭探針可以看作第一鄰近探針(其間接地結(jié)合分析物)。在這樣的條件下，直接地結(jié)合分析物的兩個(gè)鄰近探針可以看作第二和第三鄰近探針。另一個(gè)角度來看，喇叭探針可以看作是“第三”鄰近探針的核酸域的一部分。
[0102]可以選擇分析物結(jié)合域以對靶分析物具有較高的結(jié)合親和力。較高的結(jié)合親和力是指結(jié)合親和力至少為約10_4m，通常至少約10_6M或更高，例如10_9M或更高。當(dāng)作為鄰近探針的一部分存在時(shí)，分析物結(jié)合域可以是任何多種不同類型的分子，只要其對靶分析物顯示出所需的結(jié)合親和力。在其它實(shí)施方案中，分析物結(jié)合域可以是配體，所述配體對其靶分析物具有中等或甚至較低 的親和力，例如低于約10_4M。
[0103]因此，鄰近探針的分析物結(jié)合域可以是能夠選擇性地結(jié)合靶分子的任何分子。例如，所述結(jié)合域可選自蛋白質(zhì)，比如單克隆或多克隆抗體、凝集素、可溶性細(xì)胞表面受體、來自噬菌體展示或核糖體展示的組合地衍生蛋白、肽、糖類、核酸，比如包括靶核酸的互補(bǔ)序列的適體或核酸分子，或其組合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析物結(jié)合域?yàn)榈鞍踪|(zhì)，優(yōu)選抗體或其衍生物或片段。
[0104]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，鄰近探針的分析物-結(jié)合域是核酸分子。鄰近探針的分析物-結(jié)合域可以由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸以及合成核苷酸殘基構(gòu)成，它們是能夠參與沃森-克里克類型或類似堿基對相互作用的。因此，核酸域可以是DNA或RNA或其任意修飾物，例如PNA或含有非核苷酸骨架的其它衍生物。在某些實(shí)施方案中，分析物-結(jié)合域可以包括核酸外切酶嵌段，使其不能用作核酸延伸反應(yīng)中的引物，即不能作為引物被聚合酶所識別。
[0105]其中鄰近探針的分析物-結(jié)合域是核酸分子的如上所述鄰近連接反應(yīng)的實(shí)例顯示在圖7和8中。雖然這些實(shí)例描述了其中所有鄰近探針均為解折疊鄰近探針的分析，但是應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明涵蓋其中僅僅一個(gè)鄰近探針是通過裂解可解折疊的解折疊鄰近探針的分析。然而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，超過一個(gè)鄰近探針是解折疊鄰近探針。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)中的所有鄰近探針都是解折疊鄰近探針。然而，如上所述，解折疊鄰近探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以以不同的方法解折疊。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)中的所有解折疊鄰近探針的核酸域都以同樣的方法解折疊，優(yōu)選通過裂解。
[0106]在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)至少一個(gè)鄰近探針的分析物-結(jié)合域是核酸時(shí)，至少一個(gè)鄰近探針是鎖式探針，即可環(huán)化寡核苷酸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，鎖式探針包括至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即所謂的喇叭探針。
[0107]因此，喇叭探針是一種特定類型的解折疊鄰近探針，可以定義為寡核苷酸，包括:
[0108](i)第一域，其包括與第一目標(biāo)序列互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，其中所述第一互補(bǔ)區(qū)域位于寡核苷酸的5’末端，所述第二互補(bǔ)區(qū)域位于寡核苷酸的3’末端，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)域雜交第一目標(biāo)序列，使得5’和3’末端是直接地或間接地可連接的；
[0109](ii)第二域，其包括與第二目標(biāo)序列互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，其中至少一個(gè)所述互補(bǔ)區(qū)域的至少一部分與寡核苷酸之內(nèi)的序列互補(bǔ)，使得其形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一部分，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)抑制所述互補(bǔ)區(qū)域雜交第二目標(biāo)序列；
[0110]其中所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)的解折疊能夠使第二域的互補(bǔ)區(qū)域雜交第二目標(biāo)序列。
[0111]任選地，其中當(dāng)裂解而解折疊所述發(fā)夾時(shí)，第二域的互補(bǔ)區(qū)域能夠雜交第二目標(biāo)序列，使得5’和3’末端直接地或間接地可連接。更特別地，第二域的互補(bǔ)區(qū)域位于通過裂解探針釋放的第二域的5’和3’末端。
[0112]在其中第一和/或第二域的區(qū)域雜交其各自靶標(biāo)使得它們是間接地可連接地，即5’和3’末端之間存在間隔的實(shí)施方案中，所述間隔可以被間隔寡核苷酸填充或者通過延伸3’末端直到其直接地連接第二域的5’末端來填充。
[0113]在本發(fā)明的方法中，第一域優(yōu)選地為分析物-結(jié)合域，其直接地結(jié)合分析物或者間接地即經(jīng)由中間分子結(jié)合分析物，所述中間分子例如能夠特異性結(jié)合如上定義的的靶分析物或分析物-結(jié)合域的適體，所述靶分析物或分析物-結(jié)合域偶聯(lián)至包括第一目標(biāo)序列的核酸分子。
[0114]類似地，第二域優(yōu)選地為核酸域(即，鄰近探針的核酸域)。探針的第二靶標(biāo)可以是如本文定義的第二鄰近探針的核酸域。
[0115]與“標(biāo)準(zhǔn)”鎖式探針的單一連接相比，形成本發(fā)明的一個(gè)方面的如本文描述的喇叭探針是特別有利的，因?yàn)樗鼈兛梢岳脙蓚€(gè)鄰近依賴性連接反應(yīng)生成環(huán)狀寡核苷酸。據(jù)信另一個(gè)連接反應(yīng)提高了鄰近探針分析的特異性和選擇性。
[0116]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述喇叭探針包括兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，例如其中第二域的兩個(gè)所述互補(bǔ)區(qū)域的至少一部分與寡核苷酸之內(nèi)的不同序列互補(bǔ)(參見，例如圖9)。所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)的解折疊能夠使第二域的互補(bǔ)區(qū)域雜交第二目標(biāo)序列。
[0117]因此，本發(fā)明的喇叭探針可用于檢測樣品中分析物的方法中。在本發(fā)明的一個(gè)方面，當(dāng)分析物是核酸分子時(shí)可以使用一個(gè)或多個(gè)喇叭探針。例如，喇叭探針的第一和第二目標(biāo)序列可以存在于單個(gè)核酸分子中。圖15描述了一個(gè)喇叭探針，其中第一域的第一和第二互補(bǔ)區(qū)域雜交分析物(核酸分子)中的第一目標(biāo)序列，其為連接第一域的模板。探針通過例如裂解來解折疊，其能夠使喇叭探針的第二域的兩個(gè)區(qū)域雜交核酸分析物中的第二目標(biāo)序列。在該實(shí)施方案中，第二目標(biāo)序列作為連接第二域的模板，其得到可以例如通過RCA檢測的環(huán)狀寡核苷酸。顯而易見的是，可以使用兩個(gè)喇叭探針進(jìn)行類似的反應(yīng)，參見例如圖
10。在該實(shí)施方案中，包括每個(gè)喇叭探針的第一目標(biāo)序列的核酸域存在于單個(gè)核酸分子上，并且每個(gè)喇叭探針的第二域的一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域的第二目標(biāo)序列存在于連接模板寡核苷酸中。
[0118]因此，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面是提供至少一個(gè)喇叭探針在檢測樣品中核酸分析物中的用途，其中所述核酸分析物是至少部分單鏈的。
[0119]以另一種方式表達(dá)，本發(fā)明提供一種用于檢測樣品中部分單鏈核酸分析物的方法，包括:
[0120]a)用至少一個(gè)喇叭探針接觸所述樣品，所述喇叭探針包括:
[0121](i)第一域，其包括與第一目標(biāo)序列互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，其中所述第一互補(bǔ)區(qū)域位于寡核苷酸的5’末端，所述第二互補(bǔ)區(qū)域位于寡核苷酸的3’末端，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)域雜交第一目標(biāo)序列，使得5’和3’末端是直接地或間接地可連接的；
[0122](ii)第二域，其包括與第二目標(biāo)序列互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，其中至少一個(gè)所述互補(bǔ)區(qū)域的至少一部分與寡核苷酸之內(nèi)的序列互補(bǔ)，使得其形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一部分，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)抑制所述互補(bǔ)區(qū)域雜交第二目標(biāo)序列；
[0123]其中所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)的解折疊能夠使第二域的互補(bǔ)區(qū)域雜交第二目標(biāo)序列；
[0124](b)當(dāng)至少一個(gè)喇機(jī)探針結(jié)合所述分析物時(shí),直接地或間接地連接所述第一域的第一和第二互補(bǔ)區(qū)域；和
[0125](C)檢測所述連接。
[0126]在某些實(shí)施方案中，所述至少部分單鏈核酸分析物包括分別與喇叭探針的第一和第二域互補(bǔ)的第一目標(biāo)序列和第二目標(biāo)序列。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法也包括當(dāng)至少一個(gè)喇機(jī)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，直接地或間接地連接第二域的第一和第二互補(bǔ)區(qū)域。
[0127]在其它實(shí)施方案中，所述至少部分單鏈核酸分析物包括至少一個(gè)與每個(gè)喇叭探針的第一域互補(bǔ)的第一目標(biāo)序列。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述方法使用超過一個(gè)喇叭探針，每個(gè)喇叭探針的第二域的一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域的第二目標(biāo)序列存在于連接模板寡核苷酸中，該連接模板寡核苷酸可以形成核酸分析物的一部分。因此，在某些實(shí)施方案中，喇叭探針的第二域的第一和/或第二互補(bǔ)區(qū)域連接至另一個(gè)喇叭探針的第二域的第一和/或第二區(qū)域。
[0128]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分析物是完全單鏈的的。如有必要，可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的手段，例如酶消化/降解、加熱變性等使核酸分析物變成部分或完全單鏈。在用至少一個(gè)喇叭探針接觸樣品之前、之后或同時(shí)，可以使核酸分析物變成部分或完全單鏈。優(yōu)選地，在用所述樣品接觸至少一個(gè)喇叭探針之前，使核酸分析物變成部分或完全單鏈。
[0129]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及解折疊鄰近探針，包括偶聯(lián)核酸域的分析物-結(jié)合域(如本文定義的)，其中所述核酸域包括:
[0130]⑴至少一個(gè)與目標(biāo)序列互補(bǔ)的區(qū)域；和
[0131](ii)自身互補(bǔ)的區(qū)域，使得其形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)抑制所述至少一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域雜交目標(biāo)序列；[0132]其中發(fā)夾結(jié)構(gòu)的解折疊產(chǎn)生部分雙鏈的核酸域，其包括游離5’和3’末端且能夠使核酸域的所述至少一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域雜交目標(biāo)序列。
[0133]在一個(gè)代表性的實(shí)施方案中，解折疊鄰近探針的核酸域可以被裂解，從而生成核酸的兩個(gè)單鏈，其彼此部分雜交，其中一個(gè)核酸鏈包括保持雜交連接于分析物-結(jié)合域的母體核酸鏈的一部分的中間區(qū)域。
[0134]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述解折疊鄰近探針的分析物-結(jié)合域不是核酸。[0135]上述給出的解折疊鄰近探針用于如本文描述的本發(fā)明的方法中。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)序列包括連接模板的一部分，其中所述連接模板可以是鄰近探針的核酸域的形式。或者，所述連接模板可以是游離的寡核苷酸，即未偶聯(lián)分析物-結(jié)合域。
[0136]在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，部分雙鏈的核酸域的游離5’和3’末端可以直接地或間接地連接形成環(huán)狀寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，部分雙鏈的核酸域的5’末端可以連接其它鄰近探針的核酸域的3’末端。在另一個(gè)或可選的實(shí)施方案中，部分雙鏈的核酸域的3’末端可以連接其它鄰近探針的核酸域的5’末端(參見，例如圖2)。
[0137]顯而易見的是，不同類型的鄰近探針可以組合用于本發(fā)明的方法中。例如，第一鄰近探針的分析物-結(jié)合域可以包括抗體或其片段，第二鄰近探針的分析物-結(jié)合域可以包括核酸，例如第二鄰近探針可以是喇叭探針。在一個(gè)進(jìn)一步代表性的實(shí)例中，第一鄰近探針的分析物-結(jié)合域可以包括凝集素，第二鄰近探針的分析物-結(jié)合域可以包括可溶性細(xì)胞表面受體。本文涵蓋所有可能的組合。
[0138]類似地，本發(fā)明的方法也涵蓋核酸域的不同組合。例如，第一鄰近探針可以是解折疊探針，第二鄰近探針可以不包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)。類似地，在某些實(shí)施方案中，第三、第四等鄰近探針可以不包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)?；蛘撸朽徑结樁伎梢允墙庹郫B鄰近探針。本發(fā)明的方法涵蓋任何這樣的組合。
[0139]在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少第一和第二鄰近探針的分析物-結(jié)合域包括抗體或其片段。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少第一和第二鄰近探針包括喇叭探針，參見例如圖10。在再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一鄰近探針是喇叭探針，第二鄰近探針是非喇叭探針，參見例如圖1。在某些實(shí)施方案中，喇叭探針間接地結(jié)合分析物，例如經(jīng)由其它(例如“第三”)鄰近探針的核酸域(參見圖11)。
[0140]本發(fā)明的方法涵蓋的任何間接連接反應(yīng)都可以涵蓋使用間隔寡核苷酸。因此，在利用喇叭探針的實(shí)施方案中，第一和第二連接反應(yīng)都可以涉及間隔寡核苷酸(參見例如圖12)。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案，即其中在單個(gè)分析中檢測多于一種分析物時(shí)，這是特別有利的，其中所述間隔寡核苷酸可以包括獨(dú)特的“標(biāo)記物”或識別序列(例如，條碼序列，或特定檢測探針的結(jié)合位點(diǎn))以允許單獨(dú)檢測和/或定量樣品中的各種分析物。因此，在多重分析中，每個(gè)鄰近探針組可以包括不同的標(biāo)記物，并且檢測所述探針的相互作用，即檢測每種分析物可以是平行檢測(即同時(shí))，例如使用用不同可以雜交其各自標(biāo)記物的不同熒光團(tuán)標(biāo)記的寡核苷酸?；蛘?，可以使用連續(xù)可視化反應(yīng)檢測每種標(biāo)記物(因此，每種分析物)，其中每個(gè)反應(yīng)可以通過例如反萃取或漂白步驟隔開。適用于本發(fā)明的方法的連續(xù)可視化反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域已知的，例如G0ransson等人，2009 (A single molecule arrayfor digital targeted molecular analyses.Nucleic Acids Res.2009Jan;37(I):e7),WShlby 等人，2002 (Sequential immunofluorescence staining and image analysisfor detection of large numbers of antigens in individual cell nucle1.Cytometry, 47 (I):32-41,2002)將其并入引入作為參考。在本發(fā)明的某些代表性的實(shí)施方案中，可以平行檢測多種分析物。在本發(fā)明的其它代表性的實(shí)施方案中，可以順序檢測多種分析物。
[0141]因此，在單個(gè)連接產(chǎn)物生成中利用超過一種間隔寡核苷酸的實(shí)施方案可以加入超過一種標(biāo)記物，因此所述連接是例如雙標(biāo)記的。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的鄰近探針的核酸域可以包括標(biāo)記物序列，并且間隔寡核苷酸的連接引入其它標(biāo)記物序列。
[0142]在這方面，在某些實(shí)施方案中，間隔寡核苷酸可以包括與連接模板互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，其中所述區(qū)域被與連接模板不互補(bǔ)的序列分開。因此，與連接模板互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域分別位于間隔寡核苷酸的5’和3’末端。因此，與連接模板沒有互補(bǔ)的序列形成環(huán)或凸出(參見例如圖13)，并且可以包括標(biāo)記物序列，例如條碼序列。
[0143]本發(fā)明的解折疊鄰近探針的一種益處是未反應(yīng)的探針的解折疊核酸域，例如沒有結(jié)合其靶分析物的探針，可以阻止參與可產(chǎn)生不需要的背景信號的任何不需要的反應(yīng)。例如，本領(lǐng)域已知具有游離3’末端的未反應(yīng)的寡核苷酸探針(例如，沒有環(huán)化的鎖式探針)可能參與引發(fā)不需要的延伸反應(yīng)，包括不需要的擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR或RCA反應(yīng))，例如引起非特異性序列的不期望的擴(kuò)增。本領(lǐng)域進(jìn)一步已知，所述發(fā)夾可以包括在這樣的探針中，以便使未反應(yīng)的探針“失活”而防止這種不需要的活化產(chǎn)應(yīng)。因此，當(dāng)未反應(yīng)的探針中的3’末端參與發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，可以使用探針的其余部分作為模板延伸3’末端。這樣的延伸穩(wěn)定了所述發(fā)夾，且消除了未反應(yīng)的探針起引物作用的能力(在反應(yīng)的探針中，當(dāng)與其靶標(biāo)反應(yīng)時(shí)發(fā)夾打開)。這樣的系統(tǒng)描述在舊6，573，051(418111&(1丨等人)和冊03/012119中。應(yīng)當(dāng)看到，根據(jù)本發(fā)明的鄰近探針的解折疊核酸域可以與上述“自毀探針(”類似的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得任何未反應(yīng)的探針的解折疊核酸域可以使用域序列的一部分作為模板從3’末端延伸出，以便穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu) 。
[0144]術(shù)語“檢測”在本文廣泛地使用，以包括測定分析物存在的任何手段(即，如果其存在與否)，或測量分析物的任意形式。因此，“檢測”可以包括以各種方式測定、測量、評估或分析分析物的存在或不存在或量或位置。包括定量和定性測定、測量或評估，包括半定量。這樣的測定、測量或評估可以是相對的，例如當(dāng)對樣品中兩種或多種不同的分析物進(jìn)行檢測時(shí)，或絕對的。同樣的，當(dāng)用于定量樣品中靶分析物時(shí)，術(shù)語“定量”可以指絕對或相對定量。絕對定量可以通過包含已知濃度的一種或多種對照分析物和/或?qū)z測到的靶分析物水平與已知對照分析物進(jìn)行對比(例如，通過生成標(biāo)準(zhǔn)曲線)來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，相對定量可以通過比較兩種或多種不同靶分析物之間的檢測水平或量來實(shí)現(xiàn)，以提供兩個(gè)或多個(gè)不同分析物的相對定量，即相對于彼此。
[0145]“分析物”可以是期望通過本發(fā)明的方法檢測的任意物質(zhì)(例如分子)或?qū)嶓w。所述分析物是本發(fā)明的分析方法的“靶標(biāo)”。因此，分析物可以是期望檢測的任意生物分子或化學(xué)化合物，例如肽或蛋白，或核酸分子或小分子，包括有機(jī)和無機(jī)分子。所述分析物可以是細(xì)胞或微生物，包括病毒或其片段或產(chǎn)物。因此，可以看出分析物可以是任何物質(zhì)或?qū)嶓w，其中可以形成特異結(jié)合配偶體(例如親和結(jié)合配偶體)。所需要的是分析物能夠同時(shí)結(jié)合于至少兩個(gè)結(jié)合配偶體(更特別地，至少兩個(gè)鄰位探針的分析物-結(jié)合域)。基于鄰近探針的分析，比如本發(fā)明的分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在蛋白或多肽的檢測中有著特定的應(yīng)用。因此，特別感興趣的分析物可以包括蛋白質(zhì)分子比如肽、多肽、蛋白或朊病毒或包括蛋白或多肽組分等的任何分子，或其片段。所述分析物可以是單個(gè)分子或包含兩個(gè)或多個(gè)分子亞基的復(fù)合物，例如包括但不限于蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，所述分子亞基可以是或不是彼此共價(jià)結(jié)合的，并且可以相同或不同。因此，除了細(xì)胞或微生物之外，這樣的復(fù)合分析物也可以是蛋白復(fù)合物或蛋白相互作用。因此，該復(fù)合物或相互作用可以是同型或異型多聚體。分子聚集物，例如蛋白也可以是靶分析物，例如相同蛋白或不同蛋白的聚集物。所述分析物也可以是蛋白或肽和核酸分子比如DNA或RNA之間的復(fù)合物。特別感興趣的可以是蛋白和核酸之間的相互作用，例如，調(diào)節(jié)因子，比如轉(zhuǎn)錄因子和DNA或RNA。在其它代表性的實(shí)施方案中，分析物可以是核酸分子或其區(qū)域。因此，分析物可以是DNA(例如基因組、線粒體)或RNA(例如信使RNA、核糖體RNA、微型RNA等)。有利地，核酸可以原位檢測，即無需從細(xì)胞移出或萃取核酸。
[0146]包括所有生物和臨床樣品,例如,生物體的任何細(xì)胞或組織樣品，或來自其的任何體液或標(biāo)本，以及樣品比如細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞標(biāo)本、細(xì)胞裂解物等。也包括環(huán)境樣品，例如土壤和水樣品或食物樣品?？梢孕迈r制備樣品或可以以任何方便的方式對樣品預(yù)先處理以用于例如儲存。
[0147]因此，代表性樣品包括任何可以包含生物分子、或者可以包含任意其他期望的或者靶分析物的材料，其包括例如食物和關(guān)聯(lián)產(chǎn)物、臨床和環(huán)境樣品。樣品可以是生物樣品，其可以包含任意病毒或細(xì)胞材料，包括所有原核或真核細(xì)胞、病毒、噬菌體、支原體、原生質(zhì)體和細(xì)胞器。因此，這樣的生物材料可以包括所有類型的哺乳動物和非哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類，所述的藻類包括藍(lán)綠藻、真菌、細(xì)菌、原生動物等。因此，代表性的樣品包括全血和血衍生的產(chǎn)物比如血漿、血清和血沉棕黃色層、血細(xì)胞、尿液、糞便、腦脊液或任何其它體液(例如，呼吸系統(tǒng)分泌物、唾液、乳汁等)、組織、活檢切片、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞懸液、條件培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)組分的其它樣品等?？梢砸匀魏畏奖愕幕蚱谕姆绞筋A(yù)處理樣品以準(zhǔn)備用于本發(fā)明的方法中，例如通過細(xì)胞裂解或純化，分離分析物等。
[0148]在一組中針對鄰近探針的各自分析物-結(jié)合域的分析物上的結(jié)合位點(diǎn)可以是相同或不同的。因此，例如在包含兩個(gè)或多個(gè)相同亞單元或蛋白成分的同數(shù)蛋白復(fù)合物或聚集物的情況下，兩個(gè)或多個(gè)探針`的分析物-結(jié)合域可以是相同的。當(dāng)分析物是單個(gè)分子或包括不同亞單元或組分時(shí)(例如不同蛋白的異數(shù)復(fù)合物或聚集物或不同分子之間的相互作用)，分析物-結(jié)合域可以是不同的。
[0149]由于可以構(gòu)建鄰位探針的核酸域的長度以跨越不同分子距離，因此對于分析物-結(jié)合域的分析物上的結(jié)合位點(diǎn)不需要在相同的分子上。它們可以在獨(dú)立的但緊密放置的分子上。例如，可以通過本發(fā)明的方法靶向生物體比如細(xì)菌或細(xì)胞或病毒的，或蛋白復(fù)合物的或相互作用的多個(gè)結(jié)合域。
[0150]用于本發(fā)明檢測方法的鄰近探針包括分析物-結(jié)合域和功能域(其優(yōu)選地為核酸域)，但是如上所述，在鄰近分析中使用的一個(gè)或多個(gè)鄰近探針包括不同的功能基比如酶。鄰近探針實(shí)際上是結(jié)合分析物(經(jīng)由分析物-結(jié)合域)的檢測探針，可以利用在這樣的結(jié)合時(shí)在功能(例如核酸)域之間發(fā)生的相互作用的檢測來檢測所述結(jié)合(以檢測分析物)。因此，當(dāng)功能域是核酸分子時(shí)，探針可看作分析物的核酸標(biāo)記的親和配體或結(jié)合配偶體，分析物-結(jié)合域是親和結(jié)合配偶體，核酸域是核酸標(biāo)記。核酸域偶聯(lián)分析物-結(jié)合域，并且該“偶聯(lián)”或連接可通過本領(lǐng)域已知的任意手段，可以是需要的或方便的，可以是直接的或間接的，例如經(jīng)由連接基團(tuán)。當(dāng)分析物-結(jié)合域和功能域都是核酸時(shí)，優(yōu)選地該域通過核苷酸鍵，即磷酸二酯鍵偶聯(lián)。其中蛋白質(zhì)可以偶聯(lián)至核酸的方式的實(shí)例詳細(xì)描述如下。優(yōu)選地，當(dāng)鄰近探針不只包括核酸時(shí)，用于偶聯(lián)分析物-結(jié)合域和鄰近探針的核酸域的連接基或方式與每個(gè)鄰近探針的的接頭或方式相同。
[0151]在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選的方面，至少一個(gè)鄰近探針(進(jìn)一步優(yōu)選地，至少兩個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選地所有鄰近探針)的分析物-結(jié)合域是擬蛋白質(zhì)分子。因此，分析物-結(jié)合域可以是小肽分子或較大多肽或蛋白。肽的大小可以例如為約5至約100個(gè)氨基酸殘基，通常約5至約50個(gè)殘基，更通常約10個(gè)至約30個(gè)殘基。大的多肽或蛋白是指大小為約100個(gè)氨基酸殘基或更大的分子。作為分析物-結(jié)合域而特別感興趣的是抗體，以及其結(jié)合片段和衍生物或模擬物。當(dāng)抗體為分析物-結(jié)合域時(shí)，它們可以來自多克隆組分，使得通過特異性區(qū)分的抗體的異質(zhì)群體均各自“標(biāo)記”相同的標(biāo)記核酸(核酸域)，或來自單克隆組分，其中對靶分析物具有相同特異性的相同抗體的均質(zhì)種群均各自標(biāo)記相同的核酸。同樣地，分析物-結(jié)合域可以是單克隆或多克隆抗體。在再其它實(shí)施方案中，親和結(jié)合域是抗體片段或其衍生物或模擬物，其中這些片段、衍生物和模擬物對靶分析物具有所需的結(jié)合親和力?？贵w、抗體片段、其模擬物和衍生物的實(shí)例如上所述，本發(fā)明考慮所述親和結(jié)合域可以是任意類型的這些分子，只要它們對靶分析物具有所需的結(jié)合親和力。
[0152]如本文使用的術(shù)語“抗體”可以指抗體結(jié)合片段或其衍生物或模擬物，其中這些片段、衍生物和模擬物對于靶分析物具有結(jié)合親和力。例如，抗體片段，比如Fv、F(ab)2和Fab可以通過裂解完整蛋白來制備，例如通過蛋白酶或化學(xué)裂解。還感興趣的是重組或合成制備的抗體片段或衍生物，比如單鏈抗體或scFv，或其它抗體衍生物比如嵌合抗體或CDR接枝抗體，其中該重組或合成制備的抗體片段保留上述抗體的結(jié)合特征，即它們不能夠特異性結(jié)合靶分析物。這樣的抗體片段或衍生物通常包括主體抗體的至少VH和VL域，以保持主題抗體的結(jié)合特征。本發(fā)明的這樣的抗體片段、衍生物或模擬物可以使用任何方便的方法容易地制備，比如5，851，829和5，965，371號美國專利中所公開的方法，將其公開引入本文作為參考。
[0153]上述抗體、其片段、衍生物和模擬物可以由商業(yè)來源獲得和/或使用任何方便的技術(shù)制備而成，其中制備多克隆抗體、單克隆抗體、其片段、衍生物和模擬物(包括其重組衍生物)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0154]在如上所述其它優(yōu)選的實(shí)施方案，一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選地兩個(gè)或多個(gè)或全部的)鄰近探針的分析物-結(jié)合域可以是核酸分子。
[0155]重要地，分析物-結(jié)合域應(yīng)當(dāng)是一種域，其包括可以共價(jià)結(jié)合核酸域而基本上不會消除分析物-結(jié)合域?qū)ζ潇敕治鑫锏慕Y(jié)合親和力的部分。
[0156]在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，鄰近探針可以是多價(jià)鄰近探針。這樣的多價(jià)鄰近探針包括至少兩個(gè)共軛至少一個(gè)，優(yōu)選地多于一個(gè)，核酸的分析物-結(jié)合域。因此，多價(jià)鄰近探針可以包括至少5、10、20、50、100、200、500或1000個(gè)共軛至少一個(gè)且優(yōu)選地多于一個(gè)核酸的分析物-結(jié)合域。
[0157]“偶聯(lián)”或連接可以是本領(lǐng)域已知的任何手段，其可以是需要的或方便的且可以是直接或間接的，例如經(jīng)由連接基團(tuán)。例如，域可以通過共價(jià)鍵(例如化學(xué)交聯(lián))或通過非共價(jià)連接來互相連接，所述非共價(jià)連接例如經(jīng)由基于鏈酶親和素-生物素的偶聯(lián)(在一個(gè)域上提供生物素，在另一個(gè)上提供鏈酶親和素)。
[0158]鄰近探針的兩種組分可以通過鍵直接連接或通過連接基團(tuán)間接連接。
[0159]當(dāng)采用連接基團(tuán)時(shí)，可以選擇該基團(tuán)以提供結(jié)合域和核酸域通過連接基團(tuán)的共價(jià)連接。感興趣的連接基團(tuán)可以根據(jù)組分域的性質(zhì)有很大的變化。當(dāng)連接基團(tuán)存在時(shí)，其在許多實(shí)施方案中是生物惰性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種連接基團(tuán)，并且已發(fā)現(xiàn)其應(yīng)用于本發(fā)明的鄰近探針中。在代表性的實(shí)施方案中，連接基團(tuán)通常為至少約50道爾頓，通常至少約100道爾頓，可以高達(dá)1000道爾頓或以上，例如如果連接基團(tuán)含有間隔基時(shí)可高達(dá)1000000道爾頓,但通常不會超過約500道爾頓,通常不會超過300道爾頓。一般而言,這樣的接頭包括在任一端由反應(yīng)性官能團(tuán)封端的間隔基團(tuán)，所述反應(yīng)性官能團(tuán)能夠共價(jià)結(jié)合核酸域或蛋白組分。感興趣的間隔基團(tuán)可以包括脂肪族的和不飽和的烴鏈、含有雜原子比如氧(醚比如聚乙二醇)或氮(多胺)、肽、碳水化合物、可能包含雜原子的環(huán)狀或非環(huán)狀系統(tǒng)。間隔基團(tuán)也可以由結(jié)合于金屬的配體構(gòu)成，使得存在的金屬離子與兩種或多種配體進(jìn)行配位以形成復(fù)合物。具體的間隔元件包括:1，4-二氨基己烷、二甲苯二胺、對苯二甲酸、3，6-二氧雜辛二酸、乙二胺-N，N-二乙酸、1，-乙烯雙(5-氧代-3-吡咯烷羧酸)、4，4’-乙烯二哌啶?？赡艿姆磻?yīng)性官能團(tuán)包括親核官能基團(tuán)(胺、醇、硫醇、酰肼)，親電官能基團(tuán)(醛、酯、乙烯酮、環(huán)氧化合物、異氰酸酯、馬來酰亞胺)，能夠發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)、形成二硫鍵或結(jié)合金屬的官能基團(tuán)。具體實(shí)例包括伯和仲胺、異羥肟酸、N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基琥珀酰亞胺碳酸酯、氧基羰基咪唑、硝基苯基酯、三氟乙酯、縮水甘油醚、乙烯砜和馬來酰亞胺?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記物的特定接頭包括雜官能團(tuán)化合物，比如疊氮基苯甲酰基酰肼、N-[4-(對疊氮基水楊基氨基)丁基]-3' -[2'-吡啶基二硫]丙酰胺)、雙-磺基琥珀酰亞胺辛二酸酯、己二亞胺二甲酯、雙琥珀酰亞胺酒石酸酯、N-馬來酰亞胺丁酰基氧基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-疊氮基苯基]-1 ,3' -二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-碘乙?；鵠氨基苯甲酸酯、戊二醛、和琥珀酰亞胺基-4_[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(STOP)、4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(SMCC)等。
[0160]在本發(fā)明的方法中使用的鄰近探針可以使用任何常規(guī)方法制備。在代表性的實(shí)施方案中，分析物-結(jié)合域和核酸域可以直接偶聯(lián)或通過連接基團(tuán)偶聯(lián)。所述組分可以通過如本領(lǐng)域已知的官能基團(tuán)彼此共價(jià)結(jié)合，其中這樣的官能基團(tuán)可以存在于所述組分上或者使用一個(gè)或多個(gè)步驟例如氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、裂解反應(yīng)等引入到所述組分上?？梢杂糜趯⒔M分共價(jià)鍵合在一起以制備鄰近探針的官能基團(tuán)包括:羥基、巰基、氨基等。可以選擇經(jīng)過修飾以提供共價(jià)鍵的不同組分的特定部分，以便于基本上不會不利地干擾組分對于其靶分析物的結(jié)合親和力。換言之，共價(jià)連接應(yīng)當(dāng)不會抑制鄰近探針的分析物-結(jié)合域與靶分析物的結(jié)合，并且應(yīng)當(dāng)不會促進(jìn)核酸域結(jié)合靶分析物。當(dāng)必要和/或需要時(shí)，可以使用本領(lǐng)域已知的阻斷基團(tuán)保護(hù)組分上的某些部分，參見例如Green&Wuts, Protective Groups inOrganic Synthesis (John Wiley&Sons) (1991)。用于制備核酸/抗體共軛物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見例如美國專利N0.5，733，523，將其公開的內(nèi)容引入本文作為參考。[0161]在其它實(shí)施方案中，可以使用體外方案制備鄰近探針，產(chǎn)生核酸-蛋白共軛物，gp分子具有共價(jià)結(jié)合蛋白的核酸例如編碼序列，即其中由編碼鄰近探針的載體在體外制備分析物-結(jié)合域或蛋白組分。感興趣的這樣的體外方案的實(shí)例包括:基于RepA的方案(參見例如 Fitzgerald, Drug Discov.Today (2000) 5:253_258and W098/37186),基于核糖體展不的方案(參見例如 Hanes 等人,Proc.Natl Acad.Sc1.USA (1997) 94:4937-42; Roberts, Curr Opin Chem Biol (1999) Jun; 3:268-73; Schaffitzel 等人，J Tmmunol Methods (1999)DeclO; 231:119-35; and W098/54312)等。
[0162]如上所述，分析物-結(jié)合域可以直接或間接地結(jié)合分析物。在間接結(jié)合的情況下，靶分析物可以首先被特異性結(jié)合配偶體(或親和配體)結(jié)合，并且鄰近探針的分析物-結(jié)合域可以結(jié)合該特異性結(jié)合配偶體。這使得能夠設(shè)計(jì)作為通用試劑的鄰近探針。例如，分析物特異性結(jié)合配偶體可以是抗體，通用鄰近探針組可以通過部件結(jié)合各種不同分析物特異性抗體的Fe區(qū)域來檢測不同分析物。
[0163]鄰近探針的核酸域可以被認(rèn)為是核酸“標(biāo)記”，其相互作用形成可檢測產(chǎn)物，可以被檢測到以報(bào)告分析物的檢測。因此，核酸域可以被認(rèn)為是反應(yīng)性核酸官能團(tuán)，或者包括反應(yīng)元件，其相互作用以提供信號，利用所述信號來檢測分析物(例如形成產(chǎn)生信號的產(chǎn)物(例如它們可以連接到一起形成連接產(chǎn)物)，或介導(dǎo)產(chǎn)生信號的產(chǎn)物的形成或促進(jìn)其形成，例如作為連接模板和/或引物，例如作為RCA引物)。換言之，核酸域可以被認(rèn)為是“檢測標(biāo)記”，所述“檢測標(biāo)記”可以相互作用而形成“可檢測的”標(biāo)記或產(chǎn)物。當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)分析物存在于相同樣品中時(shí)，可以使用兩個(gè)或多個(gè)鄰近探針組同時(shí)檢測，其中設(shè)計(jì)每組鄰位探針以通過相互作用形成獨(dú)特的核酸序列“可檢測的標(biāo)記”?？梢允褂梦墨I(xiàn)中熟知的方法對這些獨(dú)特的“可檢測的標(biāo)記”分別進(jìn)行檢測和定量(任選地在擴(kuò)增之后)，所述方法包括液相色譜、電泳、質(zhì)譜、DNA陣列技術(shù)、DNA測序和多色實(shí)時(shí)PCR。在其中分析是異質(zhì)分析的某些實(shí)施方案中，例如反應(yīng)在 載玻片或陣列上進(jìn)行，則可以目測檢測所述檢測標(biāo)記。例如，可以通過雜交熒光標(biāo)記的核酸探針來檢測RCA生成的核酸多聯(lián)體，在可以例如使用顯微鏡檢查目測的載玻片得到“斑點(diǎn)”。如上所述，在檢測多種分析物的測定中，可以平行或順序檢測或目測不同的分析物。因此，可以進(jìn)行檢測和通過計(jì)數(shù)單獨(dú)的反應(yīng)產(chǎn)物定量。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于原位檢測樣品中的分析物。
[0164]如上所述，基于鄰近探針的檢測分析是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的，例如W097/00446、W001/61037, W003/04423U W02005/123963 和 W02007/107743，將其引入本文作為參考。其它鄰近分析也是本領(lǐng)域已知且描述的，例如在W02007/044903和W02009/012220中，也將其引入本文作為參考。清楚的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用本領(lǐng)域公開的方法修飾如本文描述的檢測方法，只要那些方法延伸至利用鄰近探針的基于鄰近探針的檢測分析。然而，本發(fā)明的檢測方法的特別優(yōu)選的方面為本文闡述的。
[0165]在一個(gè)優(yōu)選的本發(fā)明的檢測方法中，第一和第二鄰位探針的核酸域可以結(jié)合在一起，例如通過連接。該“結(jié)合”(或“共軛”)可以是直接的，即各個(gè)核酸域可以直接彼此結(jié)合在一起，或其可以是間接的，即各個(gè)核酸域可以間接結(jié)合在一起，例如通過分別與另一個(gè)中間核酸分子(例如，“間隔”寡核苷酸，在本領(lǐng)域也稱為“盒式”寡核苷酸)的兩端之一結(jié)合。該“共軛”或“相互作用”(通常為連接)可以通過一個(gè)或多個(gè)連接模板(夾板)寡核苷酸介導(dǎo)。同樣地，可以將夾板或間隔/盒式寡核苷酸以獨(dú)立核酸的形式加入樣品中，或可作為如下進(jìn)一步解釋的第三鄰近探針的核酸域提供。在新核酸分子或序列形成時(shí)的相互作用(通過連接)結(jié)果可以檢測到。
[0166]如上所述以及以下進(jìn)一步討論，連接模板寡核苷酸可以雜交第一和第二鄰近探針的核酸域，從而使其能夠連接?；蛘撸B接模板可以形成一個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸域。連接模板可以看作鄰近探針的核酸域同步地或同時(shí)地結(jié)合的共用模板，即連接模板包括與每個(gè)核酸域互補(bǔ)的不同區(qū)域。
[0167]雖然本發(fā)明的方法中的至少一個(gè)鄰近探針的核酸域包括可以通過如上所述裂解解折疊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，第二、第三、第四等鄰近探針的核酸域可以以任何合適的形式用于鄰近分析中。因此，所述鄰近探針的核酸域可以是單鏈核酸分子(例如，寡核苷酸)，部分雙鏈的和部分單鏈的分子，或包括雙鏈的區(qū)域和其中兩個(gè)核酸鏈不互補(bǔ)且因此為單鏈的區(qū)域的雙鏈分子。同樣地，在某些實(shí)施方案中，核酸域由單鏈核酸組成。在其它實(shí)施方案中，核酸域可以由兩個(gè)部分互補(bǔ)的核酸鏈組成，其中所述兩個(gè)鏈包括雜交區(qū)域和非雜交區(qū)域。
[0168]當(dāng)與靶分析物結(jié)合時(shí)，鄰近探針的核酸域的長度通常足夠允許發(fā)生與另一個(gè)鄰近探針的核酸域的連接模板介導(dǎo)的相互作用。核酸域的長度通常為約8至高達(dá)約1000個(gè)核苷酸，其中在某些實(shí)施方案中它們的長度為約8至約500個(gè)核苷酸，包括長度為約8至約250個(gè)核苷酸，例如長度為約8個(gè)至約160個(gè)核苷酸，比如長度為約12至約150個(gè)核苷酸，長度為約14至約130個(gè)核苷酸，長度為約16至約110個(gè)核苷酸，長度為約8至約90個(gè)核苷酸，長度為約12至約80個(gè)核苷酸，長度為約14至約75個(gè)核苷酸，長度為約16至約70個(gè)核苷酸，長度為約16至約60個(gè)核苷酸等。在某些代表性的實(shí)施方案中，核酸域的長度可以為約10至約80個(gè)核苷酸，長度為約12至約75個(gè)核苷酸，長度為約14至約70個(gè)核苷酸，長度為約34至約60個(gè)核苷酸，以及在所述范圍之間的任意長度。在某些實(shí)施方案中，核酸域的長度通常不超過約 28 、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、46、50、55、60、65或70個(gè)核苷酸。
[0169]解折疊鄰近探針的核酸域的至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以包括任何合適量的核苷酸殘基，使得可以解折疊所述發(fā)夾。優(yōu)選地，發(fā)夾結(jié)構(gòu)僅僅在合適的條件下，例如在加入裂解劑時(shí)，才能解折疊。顯而易見的是，該發(fā)夾的結(jié)構(gòu)將取決于用于促進(jìn)其解折疊的方法。在一個(gè)代表性的實(shí)例中，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸域的長度為約20至約1000個(gè)核苷酸，其中在某些實(shí)施方案中，其長度可以為約20至約500個(gè)核苷酸，包括長度為約20至約250個(gè)核苷酸，例如長度為約20至約160個(gè)核苷酸，比如長度為約20至約150個(gè)核苷酸，長度為約20至約130個(gè)核苷酸，長度為約20至約110個(gè)核苷酸，長度為約20至約90個(gè)核苷酸，長度為約20約80個(gè)核苷酸，長度為約20至約75個(gè)核苷酸，長度為約20至約70個(gè)核苷酸，長度為約20至約60個(gè)核苷酸，及所述范圍內(nèi)的任意長度。因此，至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙螺旋部分可以具有的長度為至少8個(gè)堿基對，優(yōu)選地長度為至少9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40或50個(gè)堿基對。在其它實(shí)施方案中，解折疊鄰近探針的至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙螺旋部分可以具有的長度為至少100、200、300或400個(gè)堿基對。
[0170]至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)優(yōu)選地包括至少8個(gè)核苷酸，優(yōu)選地至少9、10、11、
12、13、14、15、20、25、30、40或50個(gè)核苷酸。在其它實(shí)施方案中，至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)可以具有的長度為至少100、200、300或400個(gè)核苷酸。
[0171]在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，解折疊鄰近探針的核酸域的至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)尿嘧啶殘基，優(yōu)選地至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)尿嘧啶殘基。[0172]鄰近探針的核酸域可以由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸以及合成核苷酸殘基構(gòu)成，所述合成核苷酸殘基是能夠參與沃森-克里克類型或類似堿基對相互作用的。因此，核酸域可以是DNA或RNA或其任意修飾物，例如PNA或含有非核苷酸骨架的其它衍生物。
[0173]可以相對于連接模板挑選或選擇第一和第二鄰近探針的核酸域的序列(即，“檢測”核酸域)。在其中第一和第二鄰近探針的核酸域與共用連接模板互補(bǔ)(與相同連接模板的不同區(qū)域互補(bǔ))的實(shí)施方案中，即當(dāng)核酸域彼此連接時(shí)，共用連接模板可以提供在第三鄰近探針上。因此，各個(gè)核酸域的序列不是關(guān)鍵的，只要第一和第二域可以直接地或間接地相互作用，例如它們可以彼此雜交或雜交第三核酸域(例如，連接模板)。然而，除了解折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)所需的序列之外，應(yīng)當(dāng)選擇核酸域的序列以避免出現(xiàn)不同于第一和第二鄰近探針的核酸域與連接模板之間的雜交事件。例如，鄰近探針的核酸應(yīng)當(dāng)不能夠雜交間隔/盒式寡核苷酸。一旦選擇或識別核酸域的序列，則可以使用任何方便的方法合成該核酸域。
[0174]連接模板可以被看作為“連接子”寡核苷酸，其用于連接或?qū)⒌谝秽徫惶结樀暮怂嵊颉氨３衷谝黄稹?，例如在其中核酸域連接本身的實(shí)施方案中，生成環(huán)狀連接產(chǎn)物。連接模板可以被看作是將第一和第二(在某些實(shí)施方案中，以及第三)鄰近探針的核酸域保持在一起，這樣它們可以相互作用，例如可以連接在一起。
[0175]特別地，連接模板可以與第一和/或第二鄰近探針的核酸域雜交。更特別地，連接模板與至少第一和/或第二鄰近探針的核酸域同時(shí)雜交(退火)。當(dāng)連接模板為第三鄰近探針的核酸域的形式時(shí)，所有鄰位探針組的核酸域的彼此雜交在結(jié)合靶分析物時(shí)提高了探針-靶標(biāo)復(fù)合物的活動性。該活動性作用通過支持產(chǎn)生信號的鄰近探針-靶分析物復(fù)合物的形成而有助于分析的靈敏度。
[0176]如本文使用的術(shù)語“雜交(hybridisation) ”或“雜交(hybridises) ”指在核苷酸序列之間雙螺旋的形成，其足夠互補(bǔ)以通過沃森-克里克堿基配對形成雙螺旋。當(dāng)分子具有堿基對結(jié)構(gòu)的同源性時(shí)，兩個(gè)核苷酸序列彼此“互補(bǔ)”。因此，鄰近探針的核酸域中的互補(bǔ)區(qū)域指能夠形成分子內(nèi)或分子間雙螺旋，即相同分子(發(fā)夾結(jié)構(gòu))內(nèi)的雙螺旋或與不同分子的雙螺旋的核酸域的一部分?！盎パa(bǔ)的”核苷酸序列可以特異性地結(jié)合以在合適的雜交條件下形成穩(wěn)定的雙螺旋。例如，當(dāng)?shù)谝恍蛄械囊徊糠挚梢砸苑聪蚱叫械姆较蚪Y(jié)合第二序列的一部分時(shí)，兩個(gè)序列是互補(bǔ)的，其中每個(gè)序列的3’端結(jié)合其它序列的5'端，并且一個(gè)序列的每個(gè)A、T(U)、G和C分別與另一個(gè)序列的T(U)、A、C和G對準(zhǔn)。RNA序列也可以包括互補(bǔ)的G=U或U=G堿基對。因此，在本發(fā)明中，兩個(gè)序列不需要具有完美的同源性以“互補(bǔ)”。通常當(dāng)至少約85%(優(yōu)選至少約90%，最優(yōu)選至少約95%)的核苷酸在確定長度的分子內(nèi)共享堿基配對結(jié)構(gòu)時(shí)，兩個(gè)序列具有足夠的互補(bǔ)性。在某些實(shí)施方案中，第一和第二鄰近探針的核酸域包含對一個(gè)或多個(gè)連接模板寡核苷酸互補(bǔ)的區(qū)域，相反地，連接模板寡核苷酸的核酸域包含對第一和第二鄰位探針的每個(gè)核酸域互補(bǔ)的區(qū)域。在其中第一鄰近探針的核酸域?yàn)檫B接模板的實(shí)施方案中，第二鄰近探針的核酸域可以包含與第一鄰近探針的核酸域互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，即與第二鄰近探針的核酸域的每個(gè)末端5’和3’互補(bǔ)的區(qū)域，使得每個(gè)末端可以直接地或間接地連接。
[0177]互補(bǔ)區(qū)域(即，雜交區(qū)域)的長度范圍可以為4-30堿基對，例如6-20、6-18、7_15或8-12堿基對。
[0178]連接模板核酸域的長度通常足以提供上述第一和第二探針的單個(gè)探針的兩個(gè)末端的核酸域的同時(shí)結(jié)合。在代表性的實(shí)施方案中，連接模板寡核苷酸的長度為約6至約500個(gè)核苷酸，包括約20至約40個(gè)寡核苷酸，例如約25至約30個(gè)寡核苷酸。
[0179]如上所述，在一個(gè)上述優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二鄰近探針的核酸域之間的相互作用為各自域的結(jié)合。該結(jié)合可以優(yōu)選為連接，特別是模板引導(dǎo)的連接。在這種情況下，顯然應(yīng)當(dāng)理解連接模板由連接模板(夾板)寡核苷酸提供?？梢允褂眠B接酶進(jìn)行這樣的連接。
[0180]因此，在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二探針的核酸域可利用雜交夾板作為模板的反應(yīng)來連接，其中所述核酸域連接并且可檢測到連接產(chǎn)物。因此，在這樣的實(shí)施方案中，夾板可被看作為“夾板模板”或“連接模板”或“模板寡核苷酸”。
[0181]為了使相互作用，或更具體地進(jìn)行連接，第一和第二鄰近探針的核酸域之一通常可通過其5’末端偶聯(lián)擬蛋白質(zhì)分析物-結(jié)合域(留下游離3’羥基末端)，而另一個(gè)域可以通過其3’末端偶聯(lián)(留下游離的5’磷酸酯末端)。因此，第一和第二鄰位探針之一應(yīng)當(dāng)是具有游離3’羥基的5’探針，所述游離3’羥基能夠與另一個(gè)3’探針的5’磷酸酯相互作用。
[0182]為了能夠連接，第一和第二核酸域(相同探針的或不同探針的)分別雜交連接模板，一個(gè)的3’末端對準(zhǔn)另一個(gè)的5’磷酸酯。然而，如上所述并且如本文在別處更詳細(xì)地描述的，各自域的連接不需要是直接的，它們可以利用中間寡核苷酸連接在一起，或可以使用聚合酶延伸第一或第二鄰近探針中的攜帶游離3’核酸域末端的任一個(gè)以填充間隔，直到第一和第二核酸域可以通過連接反應(yīng)結(jié)合。因此，夾板(連接和/或延伸模板)上的相應(yīng)3’末端和5’末端不需互`相緊鄰地雜交，但是可以雜交夾板并在其中留下空間(或一段核苷酸)。
[0183]夾板同時(shí)與第一和第二鄰近的核酸域的雜交(即，在使鄰近探針的核酸域同步地結(jié)合夾板寡核苷酸是)產(chǎn)生包含所有三個(gè)核酸域的穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。例如，這樣的雙螺旋結(jié)構(gòu)使第一鄰近探針的核酸域的3’羥基游離末端和第二鄰近探針的核酸域的5’磷?；坞x末端結(jié)合在一起(雖然如上所述，但是這些不需要緊鄰地并列放置)。
[0184]因此，連接模版(夾板)可以包括對5’游離鄰近探針的核酸域互補(bǔ)的第一 3’區(qū)域和對3’游離鄰近探針的核酸域互補(bǔ)的第二 5’區(qū)域。夾板的第一和第二區(qū)域長度可以為3至20、6至17、6至15或6至12或8至12個(gè)核苷酸，例如長度為約13至17、12至16、11至15、或12至14個(gè)核苷酸或長度為約6至12、7至11或8至10個(gè)核苷酸。
[0185]如下將更詳細(xì)地描述的，相互作用(例如連接)產(chǎn)物的擴(kuò)增可用作檢測過程的一部分。因此，在某些實(shí)施方案中，需要設(shè)計(jì)夾板以便將在這樣的步驟中可能發(fā)生的任何錯(cuò)誤擴(kuò)增最小化，例如夾板充當(dāng)擴(kuò)增中使用的聚合酶的模板的任何可能性。因此，例如夾板可以作為RNA寡核苷酸或DNA/RNA雜交體來提供；通常用于擴(kuò)增反應(yīng)中的Taq聚合酶不能使用RNA模板?；蛘?，使用具有兩個(gè)短雜交區(qū)域的DNA夾板可以達(dá)到類似效果；由于雜交較弱，該夾板不能在PCR使用的高溫下為DNA聚合作為模板。
[0186]如上所述，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二探針的核酸域可以雜交彼此不緊鄰的夾板，而在其間留出間隔。為了使其能夠共軛(例如連接)本文稱為“間隔”或“盒式”寡核苷酸的另一個(gè)寡核苷酸，可以雜交該間隔中的夾板，更具體地，跨過該間隔。這樣的間隔/盒式寡核苷酸可以直接雜交其每個(gè)末端，所述末端與每個(gè)各自域的末端鄰近，使得每個(gè)這樣的域末端可以連接間隔/盒式寡核苷酸以形成單個(gè)的新核酸產(chǎn)物。這需要兩個(gè)連接事件，所述兩個(gè)連接事件都以夾板作為模板。間隔/盒式寡核苷酸的5’和3’末端以合適的方式結(jié)合(連接)第一和第二探針的核酸域的游離末端。因此，經(jīng)由間隔/盒式寡核苷酸連接或結(jié)合第一和第二域。這樣的排列使探針的核酸域的柔軟度增加。間隔寡核苷酸可以如上討論的用于引入標(biāo)記物或識別序列，例如條碼。如圖13中描述的，使用具有在互補(bǔ)末端之間具有非互補(bǔ)序列的間隔寡核苷酸可以促進(jìn)引入一個(gè)或多個(gè)或更長的這種標(biāo)記物序列。間隔/盒式寡核苷酸的長度(當(dāng)雜交夾板時(shí)第一和第二域的末端之間的間隔)可以不同，例如為 4 至 50，例如 6-30、6-25、6-22、8-22、10-22、6-20、8-20、10-20 個(gè)核苷酸。
[0187]間隔/盒式寡核苷酸在第一和第二核酸域的連接中充當(dāng)中間寡核苷酸，在探針與樣品接觸后可以將所述間隔/盒式寡核苷酸加入?；蛘撸梢酝瑫r(shí)將其加入，或可以將其預(yù)雜交至夾板寡核苷酸。
[0188]也可以使用聚合酶，通過延伸攜帶游離3’末端的第一或第二鄰近探針的任何一個(gè)核酸域來填充間隔。一旦填充了間隔，就通過連接步驟結(jié)合末端。
[0189]為了實(shí)施本發(fā)明的方法，可以在與至少一組探針接觸之前將樣品與阻斷試劑接觸，以降低非特異性鄰近探針的相互作用。[0190]在某些實(shí)施方案中，可以針對兩種或多種不同的靶分析物對樣品進(jìn)行分析。在這樣的實(shí)施方案中，將樣品與針對每個(gè)靶分析物的一組鄰近探針接觸，以使接觸樣品的探針組的數(shù)量可以為兩個(gè)以上，例如三個(gè)以上、四個(gè)以上等。該方法在多重和高通量應(yīng)用中有著特別的用途。在這方面，本發(fā)明的方法特別有利地用于檢測樣品中均質(zhì)和異質(zhì)形式的多種分析物。在某些實(shí)施方案中，例如用于檢測高突變的分析物比如病毒序列，針對相同分析物(例如轉(zhuǎn)錄本)可以使用多個(gè)探針組，以最佳化檢測效率。在其它代表性的實(shí)施方案中，分析物-結(jié)合域可以設(shè)計(jì)用于涵蓋某些錯(cuò)配的抗性，例如其中分析物-結(jié)合域和分析物都是核酸時(shí)，序列不需要100%互補(bǔ)，例如序列可以共享至少85、90或95%的序列一致性。
[0191]可以選擇加入到樣品中鄰近探針的量，以提供在反應(yīng)混合物中足夠低濃度的鄰近探針，從而確保在未結(jié)合靶分析物時(shí)，鄰近探針不會隨機(jī)地彼此緊密鄰近，至少不會以任何大的或很大的程度。同樣地，期望的是僅當(dāng)鄰近探針通過鄰近探針的分析物-結(jié)合域和分析物的結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合相互作用結(jié)合分析物時(shí)，鄰近探針才會彼此緊密鄰近(即，當(dāng)使鄰近探針同步地結(jié)合分析物時(shí))。在代表性的實(shí)施方案中，在與樣品組合之后的反應(yīng)混合物中的鄰近探針的濃度范圍為約IfM至I μ Μ,比如約IpM至約InM，包括約IpM至約ΙΟΟηΜ。
[0192]在與樣品和鄰近探針組(或多個(gè)探針組)組合后，可以將反應(yīng)混合物培養(yǎng)一段時(shí)間，如果存在于樣品中，所述時(shí)間足夠使鄰近探針結(jié)合于靶分析物。如上所述，一旦鄰近探針結(jié)合分析物，則樣品中解折疊鄰近探針通過裂解和任何其它合適的機(jī)制“解折疊”，以至少使鄰近探針的核酸域相互作用，即鄰近探針的核酸域結(jié)合分析物且彼此接近。當(dāng)在分析中使用超過一種類型的解折疊鄰近探針時(shí)，每種不同類型的解折疊探針可以分別“解折疊”，例如第一組探針可以通過裂解解折疊，第二組鄰近探針可以在隨后改變樣品的條件以促進(jìn)解折疊而解折疊。在某些實(shí)施方案中，鄰近探針可以以多于一步接觸樣品。因此，一個(gè)或多個(gè)解折疊鄰近探針可以接觸樣品，并且與分析物相互作用(在喇叭探針的情況下，這可能涉及連接反應(yīng))。所述解折疊鄰近探針被“解折疊”，然后另一個(gè)鄰近探針(其可以是解折疊鄰近探針)與樣品接觸。因此，鄰近探針可以在一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或多個(gè)階段中與樣品接觸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，鄰近探針與樣品同時(shí)接觸。在某些代表性的實(shí)施方案中，例如在原位分析或分析物被固定的其它分析中，可以在加入不同的鄰近探針之間、或者在加入鄰近探針和使該探針的核酸域解折疊之間、或者更特別地在裂解步驟之前包括沖洗步驟，例如用固定在基質(zhì)上的探針俘獲分析物，所述基質(zhì)可以被洗滌以除去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的分析物或樣品，之后加入其它鄰近探針，參見例如圖21和22?；蛘呋蛄硗獾?，在將鄰近探針已經(jīng)加入到樣品并允許其結(jié)合之后，但是在解折疊或裂解步驟之前，可以包括沖洗步驟。
[0193]在代表性的實(shí)施方案，(解折疊)鄰近探針和樣品可以在加入鄰近探針之前預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間，所述時(shí)間為5分鐘至約24小時(shí)。優(yōu)選地，在溫度為4至約50°C下，優(yōu)選地在室溫下例如18-30°C下，所述預(yù)培養(yǎng)為約20分鐘至約12小時(shí)。應(yīng)當(dāng)優(yōu)化保持反應(yīng)混合物的條件，以促進(jìn)鄰近探針特異性結(jié)合分析物，同時(shí)抑制非特異性相互作用。
[0194]在預(yù)培養(yǎng)之后，如果包括該步驟，解折疊鄰近探針的核酸域解折疊，并且可以在約4至約50°C下，包括約20至約37°C下培養(yǎng)一段時(shí)間，所述時(shí)間為約5分鐘至約48小時(shí)，包括約30分鐘至約12小時(shí)。條件應(yīng)當(dāng)允許在如上所述核酸域之間有效地且特異性地雜交。
[0195]在某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)混合物的有效體積至少在培養(yǎng)步驟的部分期間降低，在該步驟中探針鄰近探針結(jié)合靶分析物，如果靶分析物存在于樣品中的話。在這些實(shí)施方案中，培養(yǎng)混合物的有效體積由于許多不同原因而降低。在某些實(shí)施方案中，為了能使用中等和低親和性的分析物-結(jié)合域和/或提高分析的靈敏度，降低培養(yǎng)混合物的有效體積。例如，在培養(yǎng)混合物的有效量降低的某些實(shí)施方案中，分析物-結(jié)合域可以是中等或低親和性的結(jié)合物，所述中等或 低親和性的結(jié)合物是指分析物-結(jié)合域?qū)ζ浒蟹治鑫锏慕Y(jié)合親和力小于約10_4M，比如約lmMKd。在某些實(shí)施方案中，可以升高分析靈敏度使得該分析可以在I μ I樣品中檢測到低至約100個(gè)或更少的靶分析物，包括在I μ I樣品中低至約75個(gè)或更少的靶分析物，包括在I μ I樣品中低至約50個(gè)或更少的靶分析物。
[0196]在某些實(shí)施方案中，在上述培養(yǎng)步驟過程中在混合物中包括“聚集劑”或“體積排斥劑”，例如在鄰近探針與其靶分析物結(jié)合期間降低培養(yǎng)混合物的有效體積。通常，“聚集劑”是水溶性大分子材料。合適的大分子材料廣泛地包括具有平均分子量為約1500至數(shù)百萬的生物相容性天然或合成聚合物，其不與混合物中的其它試劑或產(chǎn)物發(fā)生特異性相互作用。這樣的聚合物在本領(lǐng)域被稱為“體積排斥劑”，因?yàn)槠渲饕δ苁窃隗w外反應(yīng)介質(zhì)中占據(jù)體積，并且為生物化學(xué)反應(yīng)提供高濃度的環(huán)境，例如，接近體內(nèi)條件。體積排斥劑聚合物當(dāng)然必須足夠可溶以提供所需濃度。合適的示例性的聚合物包括，但不限于:市售聚乙二醇(PEG)聚合物，例如具有平均分子量大于約2000的；FIC0LL聚合物，比如具有平均分子量為約70，000的那些，牛血漿白蛋白，糖原，聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖等。在代表性實(shí)施方案中采用更高分子量的PEG聚合物，尤其是具有分子量分別為約1450、3000-3700、6000-7500 和 15，000-20，000 的 PEG1450、PEG3350、PEG6000 (也作為 PEG8000 出售)，和PEG20，000。在代表性實(shí)施方案中采用PEG6000和PEG8000。在代表性實(shí)施方式中的培養(yǎng)反應(yīng)中體積排斥劑聚合物的濃度落入約5%w/v至約45%w/v,取決于聚合物類型及其分子量。通常，預(yù)期給定類型的更高分子量的聚合物需要以比相同類型的更低分子量的聚合物更低的濃度存在，以實(shí)現(xiàn)對酶活性相同的效果。
[0197]在其中使用體積排斥劑的那些實(shí)施方案中，在方法的下一步之前，由于解釋體積排斥劑的存在可以根據(jù)所存在的體積排斥劑的量、稀釋流體的性質(zhì)等稀釋培養(yǎng)混合物，例如稀釋至少約2倍或更多，比如至少約5倍或更多，包括至少約10倍或更多，其中在代表性實(shí)施方案中，所述稀釋流體為水或某些其它合適的水和一種或多種溶質(zhì)例如鹽、緩沖劑等的水性流體。
[0198]替代地或除了使用體積排斥劑外，例如經(jīng)由蒸發(fā)從培養(yǎng)混合物中除去部分水，可以降低培養(yǎng)期間孵培養(yǎng)混合物的體積。在這些實(shí)施方式中，流體體積可以根據(jù)需要降低至少約2倍以上，比如至少約5倍以上，包括至少約10倍以上。重要的，在這些實(shí)施方案中不是從培養(yǎng)混合物中除去所有水?？梢圆捎萌魏畏奖愕姆桨竿ㄟ^從其中除去一部分水來降低培養(yǎng)混合物的體積?？梢圆捎猛ㄟ^監(jiān)測和調(diào)整濕度和溫度的用于控制蒸發(fā)速率的儀器，其中在某些實(shí)施方案中，例如通過持續(xù)測量培養(yǎng)混合物的體積來監(jiān)測培養(yǎng)混合物的體積，其中當(dāng)適當(dāng)蒸發(fā)后，可以如上所述加入連接和PCR混合物。根據(jù)需要，可以使用加熱器來加快蒸發(fā)?？蛇x地，培養(yǎng)混合物的體積可以通過過濾出水來降低。在代表性的實(shí)施方案中，使用尺寸排阻過濾器選擇性地保留尺寸大于臨界值的分子，同時(shí)通過使小分子和水通過過濾器而將其除去?？梢酝ㄟ^離心或真空抽吸對溶液施加力而使其通過濾器移動。
[0199]當(dāng)鄰近探針的分析物-結(jié)合域與分析物結(jié)合時(shí)，鄰近探針的合適域彼此緊密鄰近。然而，核酸域應(yīng)當(dāng)直到解折疊鄰近探針已經(jīng)“解折疊”時(shí)才能相互作用。一旦解折疊已經(jīng)實(shí)現(xiàn)連接模板寡核苷酸，則如果使用夾板寡核苷酸，則能夠結(jié)合(雜交)至例如第一和第二探針的核酸域。
[0200]在樣品與鄰近探針組合之后，如果使用的話，可以加入間隔/盒式寡核苷酸并使其雜交?？蛇x地或另外地，針對多個(gè)鄰近探針，可以加入一個(gè)或多個(gè)間隔寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，間隔寡核苷酸可以預(yù)雜交至連接模板。如上所述，在某些實(shí)施方案中，可以雜交夾板的第一和第二探針的核酸域隨后可以通過第一和第二鄰位探針的核酸域的游離3’羥基和5’磷酸酯末端的核酸連接結(jié)合在一起。然后，分析反應(yīng)混合物中相互作用的存在。因此，通常通過檢測其連接產(chǎn)物來檢測第一和第二核酸域的連接。從上述實(shí)例顯而易見的是，所述連接可以在相同核酸域的兩個(gè)區(qū)域之間，或者可以包括第三鄰近探針的核酸域的連接。
[0201]通常，可以采用任何能夠檢測鄰近依賴性相互作用的存在的方便的方案。檢測方案可以需要或不需要分離步驟。
[0202] 在這些代表性的實(shí)施方案中，通過與例如由合適的核酸連接酶提供的具有核酸連接活性的反應(yīng)混合物接觸來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定鄰近探針的核酸域的夾板的連接，并且將混合物保持在足以發(fā)生核酸域的連接的條件下。
[0203]如本領(lǐng)域已知的，當(dāng)兩個(gè)緊鄰的核酸退火或雜交與其互補(bǔ)的第三核酸序列(即，模板)時(shí)，連接酶催化該兩個(gè)緊鄰的核酸的并列3’-羥基和5’-磷酸末端之間的磷酸二酯鍵的形成?？梢允褂萌魏畏奖愕倪B接酶，其中感興趣的代表性連接酶包括但不限于:溫度敏感的和熱穩(wěn)定的連接酶。溫度敏感的連接酶包括，但不限于，噬菌體T4DNA連接酶、噬菌體T7連接酶和大腸桿菌連接酶。熱穩(wěn)定的連接酶包括，但不限于，Taq連接酶、Tth連接酶、
Ampligase '和Pfu連接酶。熱穩(wěn)定的連接酶可以由嗜熱性或極端嗜熱性生物體獲得，所述生物體包括但不限于原核、真核或古生物體。在本發(fā)明的方法中，也可使用某些RNA連接酶。
[0204]在該連接步驟中，將必需和/或期望的合適的連接酶和任何試劑與反應(yīng)混合物組合，并保持在足夠發(fā)生雜交的連接寡核苷酸的連接的條件下。連接反應(yīng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在連接期間，在某些實(shí)施方案中將反應(yīng)混合物保持在約4°C至約50°C的溫度下，比如約20°C至約37°C下一段時(shí)間，所述時(shí)間為約5秒至約16小時(shí)，比如約I分鐘至約I小時(shí)。在其它實(shí)施方案中，可以將反應(yīng)混合物保持在約35°C至約45°C的溫度下，例如在或約37°C至約42°C，例如在或約38°C、39°C、40°C或41°C下一段時(shí)間，所述時(shí)間為約5秒至約16小時(shí)，比如約I分鐘至約I小時(shí)，包括約2分鐘至約8小時(shí)。在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，連接反應(yīng)混合物包括 50mM Tris pH7.5、10mM MgCl2UOmM DTTUmM ATP、25mg/ml BSA,0.25單位/ml RNA酶抑制劑、和0.125單位/ml的T4DNA連接酶。在仍然另一個(gè)代表性的實(shí)施方案中，使用2.125mM鎂離子、0.2單位/ml RNA酶抑制劑；和0.125單位/ml DNA連接酶。
[0205]顯而易見的是，連接條件可取決于在本發(fā)明的方法中使用的連接酶。因此，上述連接條件僅僅是一個(gè)代表性的實(shí)例，參數(shù)根據(jù)根據(jù)眾所周知的方案變化。例如，本發(fā)明的方法的一種優(yōu)選的連接酶即Ampjigaseli可以在高于50°C的溫度下使用。然而，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理
解，一個(gè)參數(shù)例如溫度的變化可能需要改變其它條件以確保分析的其它步驟不會受到抑制或破壞，例如鄰近探針與分析物的結(jié)合。鄰近分析法的這種處理是本領(lǐng)域常規(guī)的。
[0206]在連接之后，檢測連接產(chǎn)物(鄰近探針的連接的核酸域)作為樣品中分析物存在的指示，或者作為量和任選的位置的測量。在這些實(shí)施方案中，連接產(chǎn)物包括在單鏈核酸分子(其為至少第一和/或第二探針的兩個(gè)鄰近核酸域的連接產(chǎn)物，以及任意中間間隔/盒式寡核苷酸，如果使用的話)。在某些實(shí)施方案中，單鏈核酸分子可以在分析物-結(jié)合域的每個(gè)末端處終止。在其它實(shí)施方案中，單鏈核酸分子可以是環(huán)狀分子，其可以雜交一個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸域。
[0207]在連接步驟之后，該方法的下一個(gè)步驟是測定連接產(chǎn)物在反應(yīng)混合物中的存在以檢測樣品中的靶分析物。換言之，針對任何所產(chǎn)生的連接產(chǎn)物的存在對反應(yīng)混合物進(jìn)行篩選等(即，分析、評估、評價(jià)、測試等)以檢測所分析的樣品中靶分析物的存在。
[0208]在最廣泛的意義中，可以使用任何方便的方案檢測由上述方法產(chǎn)生連接產(chǎn)物。特定的檢測方案可以根據(jù)所需的靈敏度和實(shí)施方法的應(yīng)用而變化。在某些實(shí)施方案中，可以直接檢測核酸連接產(chǎn)物而不進(jìn)行任何擴(kuò)增，而在其它實(shí)施方案中，檢測方案可以包括擴(kuò)增部分，其中連接產(chǎn)物核酸的拷貝數(shù)增加，例如用于提高特定分析的靈敏度。當(dāng)可以不擴(kuò)增進(jìn)行檢測時(shí)，可以按照許多不同的方式檢測核酸連接產(chǎn)物。例如，可以直接標(biāo)記一個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸域，所述的標(biāo)記例如熒光標(biāo)記、或以其它方式分光光度標(biāo)記、或放射性同位素標(biāo)記或使用任何產(chǎn)生信號的標(biāo)記物，以使連接產(chǎn)物直接標(biāo)記。在這些實(shí)施方案中，可以按照大小將直接標(biāo)記連接產(chǎn)物與反應(yīng)混合物的其余部分分離，包括未連接的直接標(biāo)記的連接寡核苷酸(即，核酸域寡核苷酸或間隔/盒式寡核苷酸)，以檢測連接的核酸?？蛇x地，構(gòu)象選擇性探針，例如可以采用分子信標(biāo)(如以下更詳細(xì)描述的)檢測連接產(chǎn)物的出現(xiàn)，其中這些探針針對跨過連接的核酸的序列，因此僅以其整體存在于連接產(chǎn)物中。
[0209]如上所述，在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，檢測步驟包括擴(kuò)增步驟，其中連接核酸的拷貝數(shù)增加，例如為了提高分析的靈敏度。根據(jù)需要，擴(kuò)增可以是線性的或指數(shù)的，其中感興趣的代表性擴(kuò)增方案包括但不限于:聚合酶鏈反應(yīng)(PCR);恒溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)等。
[0210]當(dāng)檢測步驟包括擴(kuò)增步驟時(shí)(更具體地共軛產(chǎn)物的體外擴(kuò)增步驟)，可以檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物(或擴(kuò)增產(chǎn)物)以檢測分析物。
[0211]聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是本領(lǐng)域熟知的，描述在4，683，202 ;4，683，195 ;4，800，159 ；4，965，188和5，512，462號美國專利中，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考。在代表性的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，將包括上述連接核酸或連接產(chǎn)物(其也可以看作是擴(kuò)增反應(yīng)中的模板核酸)的反應(yīng)混合物與在引物延伸反應(yīng)例如PCR引物中采用的一種或多種引物組合(如在幾何(或指數(shù))擴(kuò)增中使用的正向和反向引物，或在線性擴(kuò)增中采用的單一引物)。模板核酸(為方便起見，以下稱為模板DNA)所接觸的寡核苷酸引物應(yīng)具有足夠的長度以在退火條件下(以下更詳細(xì)地描述)提供與互補(bǔ)模板DNA的雜交。引物的長度通常為至少10bp，長度通常為至少15bp，長度更通常為至少16bp，長度可以長至30bp或更長，其中引物的長度通常為18至50bp，長度通常為約20至35bp。模板DNA可以接觸單一引物或一組兩個(gè)引物組(正向和反向引物)，取決于引物是否延伸，期望模板DNA的線性或指數(shù)擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，引物可以提供為鄰近探針的核酸域。在其它實(shí)施方案中，連接模板也可以充當(dāng)引物。
[0212]除了上述組分之外，本發(fā)明的方法中制備的反應(yīng)混合物通常包括聚合酶和三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)。期望的聚合酶活性可以通過一種或多種不同的聚合酶提供。在許多實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包括至少家族A聚合酶，其中感興趣的代表性家族A聚合酶包括但不限于:棲熱水生菌聚合酶，包括天然存在的聚合酶(Taq)及其衍生物和同源物，比如Klentaq (如在 Barnes et al, Proc.Natl.Acad.Sci USA (1994) 91:2216-2220 中描述的)；嗜熱菌(Thermus thermophilus)聚合酶,包括天然存在的聚合酶(Tth)及其衍生物和同源物等。在高保真反應(yīng)中實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)的某些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物可以進(jìn)一步包括具有3’ -5’外切酶活性的聚合酶，例如由家族B聚合酶所提供的，其中感興趣的家族B聚合酶包括但不限于:嗜熱高溫球菌DNA聚合酶(Vent),比如描述在Perler等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1992) 89:5577-5581;火球菌屬物種GB-D (De印Vent);強(qiáng)烈熾熱球菌DNA聚合酶(Pfu),如在Lundberg等人，Gene (1991) 108:1-6中描述的,焦酹熱球菌(Pwo)等。其中反應(yīng)混合物包括家族A和家族B聚合酶，家族A聚合酶可以按照多于家族B聚合酶的量存在于反應(yīng)混合物中，其中活性的差異通常為至少10倍，更通常為至少約100倍。通常反應(yīng)混合物將包括四種不同類型的dNTP，其對應(yīng)于四種天然存在的堿基，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本發(fā)明的方法中，每種dNTP通常以約10至5000 μ M的量存在，通常為約20至1000 μ Μ。
[0213]在本發(fā)明方法的該檢測步驟中制備的反應(yīng)混合物可以進(jìn)一步包括水性緩沖介質(zhì)，所述緩沖介質(zhì)包括一價(jià)離子源、二價(jià)陽離子源和緩沖劑。可以使用任何方便的一價(jià)離子源，比如KC1、K-醋酸鹽、ΝΗ4-醋酸鹽、K-谷氨酸鹽、NH4C1、硫酸銨等。二價(jià)陽離子可以是鎂、錳、鋅等，其中陽離子通常為鎂?？梢允褂萌魏畏奖愕逆V離子源，包括MgCl2、Mg-醋酸鹽等。存在于緩沖液中的Mg2+的量可以為0.5至10mM，但優(yōu)選地為約3至6mM，理想地為約5mM?？梢源嬖谟诰彌_液中的代表性的緩沖劑或鹽包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS等，其中緩沖劑的量通常為約5至150mM，通常為約10至IOOmM,更通常為約20至50mM，其中在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖劑存在的量足以提供約6.0至9.5的pH，其中最優(yōu)選的是在72°C下pH為7.3。可以存在于緩沖介質(zhì)中的其它試劑包括螯合劑，比如EDTA、EGTA等。
[0214]滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)是本領(lǐng)域熟知的，描述在Dean等人的2001 (Rapid Amplificationof Plasmid and Phage DNA Using Phi29DNA Polymerase and Multiply-Primed RollingCircle Amplification, Genome Research, 11, pp.1095-1099)中，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考。在代表性的RCA反應(yīng)中，將包括上述連接的(即環(huán)化的)核酸或連接產(chǎn)物(其也可以看作是擴(kuò)增反應(yīng)中的模板核酸)的反應(yīng)混合物與一個(gè)或多個(gè)在引物延伸反應(yīng)中使用的引物混合，例如RCA可以以單個(gè)引物作為模板以產(chǎn)生單個(gè)多聯(lián)體產(chǎn)物，或者以多個(gè)引物作為模板，每個(gè)引物退火至環(huán)狀寡核苷酸的不同區(qū)域，以產(chǎn)生每個(gè)環(huán)多個(gè)多聯(lián)體產(chǎn)物。模板核酸所接觸的寡核苷酸引物應(yīng)具有足夠的長度以在退火條件下(以下更詳細(xì)地描述)提供與互補(bǔ)模板DNA的雜交。用于RCA的引物可以與如上所述用于PCR的引物的定義類似。在某些實(shí)施方案中，引物可以提供為鄰近探針的核酸域。在其它實(shí)施方案中，連接模板也可以充當(dāng)引物。
[0215]除了上述組分之外，本發(fā)明的方法中制備的反應(yīng)混合物通常包括聚合酶例如phi29DNA聚合酶和如上所述DNA聚合酶反應(yīng)所需的其它組分。期望的聚合酶活性可以通過一種或多種不同的聚合酶提供。
[0216]在制備本發(fā)明方法的該步驟的反應(yīng)混合物中，各種組成成分可以以任何方便的順序組合。例如，緩沖液可以與引物、聚合酶、然后與模板DNA組合，或所有的各種組成成分可以同時(shí)組合以產(chǎn)生反應(yīng)混合物。
[0217]可以使用任何方便的方案檢測擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，只要其中所使用的特定方案可以非特異性地或特異性地檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，如下文更詳細(xì)地描述的。感興趣的代表性的非特異性檢測方案包括使用信號生成系統(tǒng)的方案，所述信號生成系統(tǒng)例如通過相互作用選擇性地檢測雙鏈DNA產(chǎn)物。在這樣的實(shí)施方案中使用的代表性的可檢測分子包括熒光核酸染色劑，比如啡啶染料，包括其單體或同型或異型二聚體，當(dāng)與核酸復(fù)合時(shí)熒光增強(qiáng)。啡啶染料的實(shí)例包括乙啡啶同型二`聚體、溴化乙錠、碘化丙啶、和其它烷基取代的啡啶染料。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸染色劑為或包含吖啶染料、或其同型或異型二聚體，比如吖啶橙、吖啶同型二聚體、乙啡啶-吖啶異型二聚體、或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本發(fā)明的仍然另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸染色劑為吲哚或咪唑染料，比如H0echst33258、Hoechst33342、Hoechst34580(B10PR0BES34, Molecular Probes, Inc.Eugene。Oreg., (May2000)),DAPI (4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚)或DIPI (4’，6_( 二咪唑啉-2-基)_2_苯基吲哚)。其它允許使用的染色劑包括，但不限于7-氨基放線菌素D、羥基脒替、LDS751、選擇的補(bǔ)骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯基染料、金屬復(fù)合物比如釕復(fù)合物、和過渡金屬復(fù)合物(例如摻入Tb3+和Eu3+)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，核酸染色劑為花青染料或花青染料的同型或異型二聚體，當(dāng)與核酸連接時(shí)其賦予熒光增強(qiáng)?？梢允褂肔ee的4，883，867號美國專利(1989)、Yue等人的5，582，977號美國專利(1996)、Yue等人的5，321，130號美國專利(1994)、和Yue等人的5，410，030號美國專利(1995)(將所有四篇專利引入本文作為參考)中描述的任意染料，包括來自Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg的商標(biāo)為Τ0Τ0、Β0Β0、POPO, Υ0Υ0、T0-PR0, B0-PR0, P0-PR0和Y0-PR0的市售可獲得的核酸染色劑?？梢允褂肏augland等人的5，436，134號美國專利(1995)、Yue等人的5，658，751號美國專利(1997)、和Haugland等人的5，863，753號美國專利(1999)(將所有三篇專利引入本文作為參考)中所述的任意染料，包括來自Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg的商標(biāo)為SYBRGreen、evagreen、SYT0、SYT0X、PIC0GREEN、0LIGREEN、和 RIB0GREEN 的市售可獲得的核酸染色劑。在本發(fā)明的仍然其它實(shí)施方案中，核酸染色劑為摻入氮雜或多聚氮雜苯唑啉雜環(huán)的單體、同型二聚體、或異型二聚體花青染料，比如氮雜苯并噁唑、氮雜苯并咪唑、或氮雜苯并噻唑，當(dāng)與核酸相連時(shí)其賦予突光增強(qiáng)，包括來自Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg的商標(biāo)為SYTO、SYTOX, JOJO, J0-PR0, L0L0, L0-PR0的市售可獲得的核酸染色劑。
[0218]在其它實(shí)施方案中，與通常雙鏈分子相反的是，可以采用對擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性的信號生成系統(tǒng)來檢測擴(kuò)增。在這些實(shí)施方案中，信號生成系統(tǒng)可以包括特異性結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物中存在的序列的探針核酸，其中可以使用直接或間接可檢測的標(biāo)記物對所述探針核酸進(jìn)行標(biāo)記。直接可檢測的標(biāo)記物是能夠直接檢測而無需使用其它試劑的標(biāo)記物，而間接可檢測的標(biāo)記物是通過采用一種或多種其它試劑而可檢測的標(biāo)記物，例如，其中標(biāo)記物為由兩個(gè)或多個(gè)組分構(gòu)成的信號生成系統(tǒng)。在許多實(shí)施方案中，標(biāo)記物是直接可檢測的標(biāo)記物，其中感興趣的直接可檢測的標(biāo)記物包括但不限于:熒光標(biāo)記物、放射性同位素標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物等。在許多實(shí)施方案中，標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物，其中在這樣的實(shí)施方案中所采用的標(biāo)記試劑是熒光標(biāo)記的核苷酸(或多種核苷酸)，例如熒光標(biāo)記的CTP (如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等。可用于標(biāo)記核苷酸以制備標(biāo)記探針核酸的熒光部分包括，但不限于:熒光素、花青染料比如Cy3、Cy5、Alexa555、Bodipy630/650等。本領(lǐng)域已知也可采用其它標(biāo)記物，比如上文所述的那些。
[0219]在某些實(shí)施方案中，使用“能量轉(zhuǎn)移”標(biāo)記物對特異性標(biāo)記的探針核酸進(jìn)行標(biāo)記。如本文所使用的“能量轉(zhuǎn)移”是指一個(gè)過程，熒光修飾基團(tuán)借助所述過程改變熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射。如果熒光修飾基團(tuán)是淬滅基團(tuán)，則來自熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射會減弱(淬滅)。能量轉(zhuǎn)移可以通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移或通過直接能量轉(zhuǎn)移來發(fā)生。在這兩種情況下，具體的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制是不同的。應(yīng)當(dāng)理解，在本申請中對能量轉(zhuǎn)移的任何提及包括所有這些機(jī)制-不同的現(xiàn)象。如本文使用的“能量轉(zhuǎn)移對”指參與能量轉(zhuǎn)移的任何兩個(gè)分子。通常，一個(gè)分子充當(dāng)熒光基團(tuán)，另一個(gè)充當(dāng)熒光修飾基團(tuán)。“能量轉(zhuǎn)移對”用于指形成單一復(fù)合物的一組分子，在其中發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。這樣的復(fù)合物可以包括，例如彼此不同的兩個(gè)熒光基團(tuán)，和一個(gè)淬滅基團(tuán)，兩個(gè)淬滅基團(tuán)和一個(gè)熒光基團(tuán)，或多個(gè)熒光基團(tuán)和多個(gè)淬滅基團(tuán)。在存在多個(gè)熒光基團(tuán)和/或多個(gè)淬滅基團(tuán)的情況下，單個(gè)基團(tuán)可以彼此不同。如本文使用的“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”或“FRET”指能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，其中激發(fā)的熒光基團(tuán)所發(fā)射的光至少部分被熒光修飾基團(tuán)吸收。如果熒光修飾基團(tuán)為淬滅基團(tuán)，則該基團(tuán)能夠?qū)⑺盏墓廨椛錇椴煌ㄩL的光，或者其可以由于加熱而消散。FRET依賴熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜和淬滅基團(tuán)的吸收光譜之間的重疊。FRET也取決于淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)之間的距離。在高于某些臨界距離時(shí)，淬滅基團(tuán)不能夠吸收由熒光基團(tuán)發(fā)射的光，或僅能夠微弱地吸收。如本文使用的“直接能量轉(zhuǎn)移”指其中熒光基團(tuán)和熒光修飾基團(tuán)之間不存在光子的通過的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制。不受單一機(jī)制的束縛，據(jù)信在直接能量轉(zhuǎn)移中，熒光基團(tuán)和熒光-修飾基團(tuán)干擾彼此的電子結(jié)構(gòu)。如果熒光-修飾基團(tuán)為淬滅基團(tuán)，這甚至可導(dǎo)致淬滅基團(tuán)防止熒光基團(tuán)發(fā)射光。
[0220]可以以多種不同方式構(gòu)建能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的探針核酸，例如寡核苷酸，只要其包括供體、受體和靶核酸結(jié)合域。同樣地，在這些實(shí)施方案中使用的能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸為核酸檢測子，所述檢測子包括熒光能量供體即供體所處的熒光團(tuán)域，和熒光能量受體即受體所處的受體域。如上所述，所述供體域包括供體熒光團(tuán)。所述供體熒光團(tuán)可處于核酸檢測子中的任何位置，但是通常存在于檢測子的5’末端。受體域包括熒光能量受體。受體可以位于受體域的任何位置，但通常存在于核酸檢測子或探針的3’末端。[0221]除了熒光團(tuán)和受體域，能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的探針寡核苷酸也包括靶核酸結(jié)合域，所述靶核酸結(jié)合域結(jié)合感興趣(如上所述)的擴(kuò)增產(chǎn)物中存在的靶核酸序列(例如條碼序列)，例如在(如上所定義的)嚴(yán)格雜交條件下。該靶結(jié)合域的長度通常為約10至約60個(gè)核苷酸，通常為約15至約30核苷酸。根據(jù)寡核苷酸和分析本身的性質(zhì)，靶結(jié)合域可以雜交于模板核酸區(qū)域或引物延伸產(chǎn)物區(qū)域。例如，當(dāng)分析為5’核酸酶試驗(yàn)時(shí)，例如當(dāng)使用TaqMane類型的寡核苷酸探針時(shí)，靶結(jié)合域在嚴(yán)格的條件下雜交模板核酸的靶結(jié)合位點(diǎn)，所述位點(diǎn)為引物結(jié)合位點(diǎn)的下游或3’端。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，例如在分子信標(biāo)類型分析中，靶結(jié)合域雜交引物延伸產(chǎn)物的域。在這些實(shí)施方案中使用的包括所有上述三個(gè)域的能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸的總長度通常為約10至約60個(gè)核苷酸，通常為約15至約30個(gè)核苷酸。
[0222]在某些實(shí)施方案中，當(dāng)能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸沒有雜交靶核酸時(shí)，對能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行構(gòu)建以在熒光團(tuán)激發(fā)后，能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸探針的熒光團(tuán)和受體之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。
[0223]在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸為單鏈分子，其中不形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)并且由于供體和受體的間隔提供單鏈線性形式的能量轉(zhuǎn)移而在其中發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。在這些實(shí)施方案中，當(dāng)標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交靶核酸時(shí)，在熒光團(tuán)激發(fā)之后，標(biāo)記的寡核苷酸探針的熒光團(tuán)和受體之間也發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。這樣的標(biāo)記的寡核苷酸探針的具體實(shí)例包括TaqManK)類型探針，如在6，248，526號美國專利中描述的，將其全部內(nèi)容引入本文作為參考(以及 Held 等人，Genome Res.(1996)6:986-994;Holland 等人，Proc.Natl Acad.Sc1.USA (1991) 88:7276-7280;和 Lee 等人，Nuc.Acids Res.(1993)21:3761-3766)。在許多這些實(shí)施方案中，靶核酸結(jié)合域?yàn)殡s交即互補(bǔ)于模板核酸序列的域，即靶核酸結(jié)合域的靶核酸為存在于模板核酸中的序列(即，偽目標(biāo)或替代核酸)。
[0224]在其它實(shí)施方案中，當(dāng)能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交靶核酸時(shí)，對探針寡核苷酸進(jìn)行構(gòu)建以使在熒光團(tuán)激發(fā)之后在能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸探針的熒光團(tuán)和受體之間不發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。這些類型的探針結(jié)構(gòu)的實(shí)例包括:Scorpion探針(如在Whitcombe等人,Nature Biotechnology (1999) 17:804-807 ；6, 326，145 號美國專利中描述的，將其公開引入本文作為參考)，Sunrise探針(如在Nazarenko等人，Nuc.Acids Res.(1997)25:2516-2521 ;6，117,635號美國專利中描述的，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考)，分子信標(biāo)(Tyagi 等人，Nature Biotechnology (1996) 14:303-308 ;5，989，823 號美國專利，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考)，和構(gòu)象輔助探針(如在60/138，376號臨時(shí)申請系列中描述的，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考)。在許多這些實(shí)施方案中，靶結(jié)合序列或域包括與擴(kuò)增反應(yīng)的引物延伸產(chǎn)物的序列互補(bǔ)并且不與偽靶核酸中存在的序列互補(bǔ)的雜交域。
[0225]在本發(fā)明方法中的下一步為檢測來自感興趣的標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的信號，其中信號檢測可以根據(jù)所使用的特定信號生成系統(tǒng)而有所不同。在某些實(shí)施方案中，僅測定了可檢測信號例如熒光的存在或不存在，并且用于本發(fā)明的分析中，例如經(jīng)由檢測偽靶核酸和/或其擴(kuò)增產(chǎn)物來測定或確定靶核酸的存在或不存在。根據(jù)所使用的特定標(biāo)記，信號的檢測可以表明靶核酸的存在或不存在。
[0226]在信號生成系統(tǒng)是熒光信號生成系統(tǒng)的那些實(shí)施方案中，信號檢測通常包括檢測來自反應(yīng)混合物的熒光信號的變化以獲得分析結(jié)果。換言之，評估反應(yīng)混合物所生成的熒光信號的任意調(diào)整。根據(jù)所使用的標(biāo)記的性質(zhì)，改變可以是熒光增強(qiáng)或減弱，但是在某些實(shí)施方案中是熒光增強(qiáng)。可以使用任何方便的手段篩選熒光增強(qiáng)的樣品，例如合適的熒光計(jì)，比如熱穩(wěn)定比色杯或讀板式熒光計(jì)，或者當(dāng)樣品是在顯微鏡載玻片上的組織樣品時(shí)，可以使用熒光顯微鏡檢測熒光。使用已知的熒光計(jì)對熒光進(jìn)行合適的監(jiān)測。來自這些裝置的信號，例如以光電倍增電壓的形式發(fā)送到數(shù)據(jù)處理面板并轉(zhuǎn)化為與各樣品管相關(guān)的光譜?？梢酝瑫r(shí)評估多管，如96管。因此，在某些實(shí)施方案中，可以平行檢測多種分析物，而在其它實(shí)施方案中，可以順序檢測多種分析物，例如每次檢測一種分析物或每次檢測一組分析物。
[0227]當(dāng)檢測方案為實(shí)時(shí)方案，例如，當(dāng)在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)方案中使用時(shí)，在整個(gè)反應(yīng)中可以按照該方式在頻繁的間隔下收集數(shù)據(jù)，例如每次3分鐘。通過監(jiān)測每個(gè)循環(huán)中來自樣品的反應(yīng)性分子的熒光，可以以各種方式監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)程。例如，可以分析熔融峰提供的數(shù)據(jù)，例如通過計(jì)算熔融峰下的面積和將這些數(shù)據(jù)對循環(huán)數(shù)作圖。
[0228]可以例如使用預(yù)選擇的熒光部分比如染料的“擬合”來分辨以該方式生成的光譜，以形成代表每個(gè)發(fā)出信號的部分(即，熒光團(tuán))的峰。可以測定峰下的面積，此面積代表每個(gè)信號的強(qiáng)度值，如果需要，將其表示為彼此的商。信號強(qiáng)度和/或比例的微分使得能夠通過反應(yīng)或在不同反應(yīng)條件下比如不同溫度下記錄標(biāo)記的探針變化。所述的改變與寡核苷酸探針和靶序列之間的結(jié)合現(xiàn)象或結(jié)合靶序列的寡核苷酸探針的降解相關(guān)。在微分峰下的面積的積分使得能夠計(jì)算標(biāo)記效果的強(qiáng)度值。
[0229]針對熒光改變篩選混合物提供一個(gè)或多個(gè)分析結(jié)果，這取決于是否在引物延伸反應(yīng)結(jié)束時(shí)篩選樣品一次或 多次，例如在擴(kuò)增反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)之后(例如，如在實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測中所進(jìn)行的)。
[0230]可以以各種方式解釋如上所述生成的數(shù)據(jù)。在其最簡單的形式中，在擴(kuò)增反應(yīng)的過程中或結(jié)束時(shí)來自樣品的熒光增強(qiáng)或降低表示存在于樣品中的靶分析物的量升高，例如，與在反應(yīng)混合物中檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相關(guān)，表明擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的事實(shí)，因此靶分析物實(shí)際上存在于初始樣品中。也可以通過監(jiān)測整個(gè)擴(kuò)增過程的擴(kuò)增反應(yīng)來定量。如上所述，定量也可包括在反應(yīng)混合物中測試一種或多種核酸對照。
[0231]以這種方式，可以容易地針對靶分析物的存在篩選(或評估或分析等)反應(yīng)混合物。所述方法適于檢測單一靶分析物以及多重分析，在所述的多重分析中分析樣品中的兩種或多種靶分析物。在這些后面的多重情況下，可以使用的不同探針組的數(shù)量通常為約2個(gè)至約20個(gè)或更高，例如高達(dá)100個(gè)以上，1000個(gè)以上等，其中可以平行或順序檢測樣品中的多種分析物。
[0232]當(dāng)使用本發(fā)明的解折疊鄰近探針時(shí)，使用幾種不同的鄰近探針組(多重)同時(shí)以及在單一反應(yīng)中對許多分析物的分析通過所獲得的升高的特異性和靈敏度而得到提高?？梢栽O(shè)計(jì)每個(gè)探針組以產(chǎn)生獨(dú)特的相互作用(例如連接)產(chǎn)物，所述產(chǎn)物可用于測定探針組所尋找的分析物的存在或不存在、數(shù)量和/或位置?？梢灾苯拥鼗蛟跀U(kuò)增后使用任何由文獻(xiàn)中已知的已確定的核酸分子的分析方法檢測相互作用產(chǎn)物，所述方法包括液相色譜、電泳、質(zhì)譜、顯微鏡檢查、實(shí)時(shí)PCR、熒光探針等。特別感興趣的是結(jié)合本文描述的方法與具有“DNA陣列”讀出格式的組合。來自多重鄰近分析的若干獨(dú)特的相互作用產(chǎn)物可以雜交標(biāo)準(zhǔn)化的DNA陣列，所述標(biāo)準(zhǔn)化的DNA陣列攜帶許多與連接產(chǎn)物序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列(標(biāo)記)。可以通過在DNA陣列上的位置識別每種雜交于陣列的相互作用產(chǎn)物，并且在給定雜交點(diǎn)的檢測強(qiáng)度將表示特異性相互作用產(chǎn)物的量，因此表示導(dǎo)致該相互作用產(chǎn)物的分析物的量。相互作用產(chǎn)物的檢測可通過光譜測定、熒光、放射性同位素等實(shí)現(xiàn)。在擴(kuò)增反應(yīng)(PCR)中，可以使用熒光標(biāo)記的引物或熒光標(biāo)記的核苷酸將熒光部分方便地引入相互作用產(chǎn)物中。DNA陣列可以是膜上的簡單的斑點(diǎn)印跡陣列，其含有少量斑點(diǎn)或攜帶成數(shù)十萬個(gè)斑點(diǎn)的高密度陣列。
[0233]可以對本發(fā)明的方法的檢測步驟進(jìn)行改變以便進(jìn)一步降低與非特異性核酸雜交事件相關(guān)的背景。這樣的改變包括調(diào)整為能夠降低任何非特異性核酸雜交事件的方法。在某些實(shí)施方案中，可以將蛋白加入包含樣品和鄰近探針的混合物中以降低較弱的和非特異性的DNA雜交事件。例如，大腸桿菌單鏈DNA結(jié)合蛋白已經(jīng)用于提高引物延伸反應(yīng)和PCR反應(yīng)的產(chǎn)率和特異性(5，449，603和5，534，407號美國專利)。噬菌體T4的基因32蛋白(單鏈DNA結(jié)合蛋白)可以明顯提高擴(kuò)增較大DNA片段的能力(Schwartz等人，Nucl.Acids Res.18:1079 (1990))并提高 DNA 聚合酶的保真度(Huang, DNA Cell.Biol.15:589-594(1996))。當(dāng)使用時(shí)，這樣的蛋白可以用于使反應(yīng)混合物中的濃度達(dá)到約0.01ng/ μ L 至約 I μ g/ μ L ；比如約 0.1ng/ μ L 至約 IOOng/ μ L ;包括約 lng/ μ L 至約 IOng/μ L0
[0234]如上所述，設(shè)計(jì)本發(fā)明的方法以使鄰近探針的核酸域之間的相互作用(例如連接)僅在鄰位探針與分析物結(jié)合時(shí)或在解折疊鄰近探針已經(jīng)“解折疊”之后發(fā)生。然而，在所有該類型的分析的情況下，不能總保證這樣，并且可能有一些背景相互作用，例如，在該分析中使用的“標(biāo) 準(zhǔn)”鄰近探針的核酸域的連接；如果探針在溶液中隨機(jī)鄰近。通過利用連接模板寡核苷酸要求所有探針的核酸域并行彼此雜交可降低其可能性，以使這樣的相互作用發(fā)生。類似地，當(dāng)其中超過一個(gè)鄰近探針是解折疊鄰近探針，即至少一個(gè)鄰近探針是解折疊鄰近探針，優(yōu)選地兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)以上的鄰近探針是解折疊鄰近探針時(shí)，背景的可能性降低。因此，為了進(jìn)一步使得由于未反應(yīng)的(即未結(jié)合的)探針導(dǎo)致背景的可能性降低或者最小化，除了如上所述解折疊探針之外，可以使用阻斷寡核苷酸。
[0235]阻斷寡核苷酸與“標(biāo)準(zhǔn)”鄰近探針的核酸域的游離末端結(jié)合(即雜交或退火)。因此，阻斷寡核苷酸可以結(jié)合5’鄰近探針的核酸域的游離3’OH末端和3’鄰近探針的核酸域的游離5’磷酸酯末端。阻斷寡核苷酸的結(jié)合可以在高濃度抗阻斷寡核苷酸(其可以是例如連接模板)的存在下可以勝出。在其中連接模板是抗阻斷寡核苷酸的實(shí)施方案中，當(dāng)所有探針一起結(jié)合在分析物上時(shí)，連接模板可以看作呈高局部濃度，因此能夠結(jié)合鄰近探針的核酸域而優(yōu)先于阻斷寡核苷酸。阻斷寡核苷酸可以按照這種方式防止核酸域在分析物結(jié)合不存在時(shí)雜交到連接模板。因此，可以在與分析物的結(jié)合不存在時(shí)防止“標(biāo)準(zhǔn)”鄰近探針的游離末端相互作用。當(dāng)所有探針都結(jié)合分析物時(shí)，抗阻斷寡核苷酸例如夾板的局部濃度，尤其是當(dāng)夾板形成鄰近探針的核酸域時(shí)，足以超過阻斷寡核苷酸；核酸域雜交至夾板并且取代阻斷寡核苷酸。
[0236]因此，阻斷寡核苷酸允許使用基于競爭的策略來降低背景并因此進(jìn)一步提高分析的靈敏度。[0237]阻斷寡核苷酸的長度可以為約4-100個(gè)核苷酸，例如6-75或10_50個(gè)核苷酸。它們可以雜交第一或第二探針的核酸域的游離末端處或附近的區(qū)域(“附近”指在游離3’或5’末端的1-20或1-10個(gè)核苷酸之內(nèi)，例如1-6個(gè)核苷酸)。雜交區(qū)域的長度可以是3-15個(gè)核苷酸，例如3-12、3-10、3-8、4-8、3-6、4-6個(gè)核苷酸。
[0238]可以方便地設(shè)計(jì)阻斷寡核苷酸以具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得阻斷寡核苷酸可以連接不能雜交夾板的鄰近探針的末端。
[0239]通常以超過各自探針的量使用阻斷寡核苷酸，例如過量2-1000倍，例如20-500、50-300、100-500 或 100-300 倍，例如 20,200 或 300 倍。
[0240]在使用低親和力和慢結(jié)合動力學(xué)的鄰近探針檢測分析物的情況下，鄰近探針可以與樣品接觸，并且在足夠高以促進(jìn)鄰近探針與分析物結(jié)合的濃度下培養(yǎng)。該培養(yǎng)步驟可以迅速稀釋成大批的的冷緩沖液(例如，不包括分析物或鄰近探針的緩沖液)，并且隨后將一部分該稀釋液加入連接反應(yīng)混合物中。該連接反應(yīng)混合物可以包含間隔/盒式寡核苷酸(如果使用)、ATP和連接酶。低溫，例如約0°C至約20°C，包括約4°C至約10°C，使現(xiàn)有鄰近探針分析物復(fù)合物的解離最小化，而大量的稀釋導(dǎo)致未結(jié)合的鄰近探針濃度下降，從而降低其反應(yīng)性并使背景信號最小化。
[0241]在這樣的實(shí)施方案中，通過如下方法進(jìn)行分析:使用較小培養(yǎng)體積的樣品和鄰近探針，所述較小培養(yǎng)體積為約1μ I至約20 μ 1，比如約I μ 1、或約2 μ 1、或約3 μ 1、或約4 μ 1、或約5μ I或約6 μ 1，然后加入較大培養(yǎng)體積的間隔/盒，所述較大培養(yǎng)體積為約8 μ I至約1.5ml以上，比如約20 μ I至約1.3ml,比如約50 μ I至約Iml,比如約75 μ I至約800 μ 1，比如約100 μ I至約500 μ 1，比如約200 μ I至約300 μ I。由于探針和分析物之間的結(jié)合在核酸域連接之前沒有時(shí)間解離，因此在最終培養(yǎng)體積中的鄰近探針的有效濃度得到稀釋，在保持信號的同時(shí)降低了背景。只要能夠從較大比如超過100 μ I以上的體積中濃縮連接產(chǎn)物，然后檢測鄰位依賴性相互作用，該方法就能夠?qū)崿F(xiàn)極高的靈敏度。在這樣的實(shí)施方案中，可以通過使用單鏈結(jié)合蛋白降低探針-探針相互作用。
[0242]與復(fù)雜樣品相關(guān)的問題可以進(jìn)一步通過在分析之前稀釋復(fù)雜樣品來解決。復(fù)雜樣品的稀釋可以與本發(fā)明的解折疊鄰近探針組合，進(jìn)一步降低背景信號。實(shí)際上，稀釋樣品的步驟會極大降低探針和非特異性結(jié)合的蛋白的量，從而降低所需探針的濃度。雖然也稀釋分析物，但是鄰近探測的高靈敏度將提供良好的檢測和定量。
[0243]本發(fā)明的方法可以如上所述均質(zhì)(即，在溶液中)實(shí)施，或者不均質(zhì)實(shí)施，使用固相例如其中分析物固定在固相上，允許使用洗滌步驟。固相分析的使用帶來了優(yōu)勢，特別是對于檢測困難的樣品而言:洗滌步驟可以輔助抑制性組分的去除，并且可以從不想要的大樣品體積中濃縮分析物。由于未結(jié)合的分析物和探針可以通過洗滌除去，因此可以使用更高濃度和更大量的鄰近探針。通過洗滌除去未結(jié)合探針或未相互作用的探針的能力也意味著固相分析與均質(zhì)分析相比可以耐受更低純度的鄰近探針。在某些實(shí)施方案中，洗滌步驟可以在加入鄰近探針期間進(jìn)行，例如如果將探針分階段加入到樣品中，或者在加入探針之后且在解折疊/裂解步驟之前進(jìn)行。
[0244]可以以多種方式將分析物固定在固相上。因此，考慮固相鄰近探針分析的若干實(shí)施方案。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，可以將一個(gè)(或多個(gè))第一或第二(或第三，如果使用)鄰近探針(或可能能夠)固定在固相(或固體載體)上。分析物能夠首先被一個(gè)(或多個(gè))固定的(或可固定的)探針捕獲，其次被隨后加入的探針結(jié)合。
[0245]固定鄰近探針可以以任意方便的方式固定在，即結(jié)合在載體上。因此，固定的方式或手段和固體載體可以根據(jù)選擇選自任意數(shù)量的如本領(lǐng)域廣泛已知的和文獻(xiàn)中所描述的固定手段和固體載體來選擇。因此，探針可以直接結(jié)合載體，例如經(jīng)由分析物-結(jié)合域(例如，化學(xué)交聯(lián)的)，可以利用接頭基團(tuán)，或通過中間結(jié)合基團(tuán)(例如，利用生物素-鏈酶親和素相互作用的方式)間接結(jié)合。因此，可以將鄰近探針以及載體上提供的固定手段一起提供(例如，親和結(jié)合配偶體，例如能夠結(jié)合其結(jié)合配偶體的生物素或半抗原或核酸分子，即同源結(jié)合配偶體，例如鏈酶親和素或抗體或核酸分子)。可以在結(jié)合分析物之前或之后對探針進(jìn)行固定。此外，該“可固定的”探針可以與樣品和載體一起接觸。
[0246]固體載體可以為任意熟知的目前廣泛用于或提議用于固定、分離等的載體或基質(zhì)。這些可以采用顆粒(例如，磁性或非磁性珠粒)、片狀物、凝膠、濾膜、膜、纖維、毛細(xì)管或微滴定條、管、板或孔等的形式。
[0247]所述載體可以由玻璃、二氧化硅、乳膠或聚合材料制成。合適的是具有用于結(jié)合分析物的高表面積的材料。這樣的載體可以具有不規(guī)則表面，并且可以是例如多孔的或微粒狀的，例如顆粒、纖維、網(wǎng)、燒結(jié)物 或篩。微粒材料例如珠粒由于其更大的結(jié)合能力而有用，特別是聚合珠粒。
[0248]方便地，根據(jù)本發(fā)明使用的微粒固體載體可以包括球形珠粒。珠粒的大小不是關(guān)鍵的，但是它們的直徑的級數(shù)例如可以為至少I μ m,以及優(yōu)選至少2 μ m,最大直徑優(yōu)選地不大于10 μ m,以及例如不大于6 μ m。
[0249]單分散顆粒，即大小基本均勻的顆粒(例如具有直徑標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%的尺寸)的優(yōu)勢在于其提供非常均勻的反應(yīng)重現(xiàn)性。可以通過如US-A-4336173中描述的技術(shù)制備代表性的單分散聚合物顆粒。
[0250]然而，為了有助于處理和分離，磁性珠粒是有利的。如本文使用的術(shù)語“磁性”指當(dāng)置于磁場中時(shí)載體能夠具有賦予的磁矩，即順磁體，因此在磁場作用下可移動。換言之，包括磁性顆粒的載體可以容易地通過磁聚集來除去，其在分析物結(jié)合步驟之后提供快速、簡單和有效的分離顆粒的方式。
[0251]在另一個(gè)實(shí)施方案中，除了均質(zhì)結(jié)合夾板分析的非固定的鄰近探針之外，可以使用僅包括結(jié)合域的固定的(或可固定的)分析物特異性探針(即分析物俘獲探針)。因此，在這樣的實(shí)施方案中，分析物首先被固定的或可固定的俘獲探針俘獲，所述俘獲探針僅用于將分析物固定于固相上，隨后將固定的分析物與鄰近探針進(jìn)行培養(yǎng)。在這樣的實(shí)施方案中，俘獲探針可以是任意能夠直接地或間接地結(jié)合分析物的結(jié)合配偶體(例如，如以上所討論的關(guān)于鄰近探針的分析物-結(jié)合域)。更特別地，這樣的俘獲探針特異性地結(jié)合分析物。由于方法的該實(shí)施方案需要至少三個(gè)探針(結(jié)合域)同時(shí)結(jié)合至分析物或分析物復(fù)合物，因此可能找到至少三個(gè)不同的表位，這賦予分析較高的特異性。
[0252]在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，分析物可以自身被固定(或可固定)在固相上，例如通過非特異性吸附。在一個(gè)特定的這種實(shí)施方案中，分析物可以存在于任選地固定的和/或可滲透的細(xì)胞內(nèi)，所述分析物(能夠)連接固體支持物，例如包括分析物的組織樣品可以固定在顯微鏡載玻片上。
[0253]上述方法導(dǎo)致對存在于反應(yīng)混合物中的鄰近依賴性相互作用的檢測，轉(zhuǎn)而對所分析的樣品中的靶分析物的量提供測量。這樣的測量可以是定性的或定量的。
[0254]因此，檢測復(fù)雜樣品中的一種或多種靶分析物的存在的上述方法可用于多種不同應(yīng)用中。
[0255]本發(fā)明的方法可以用于針對樣品中一種或多種靶分析物的存在或不存在來篩選樣品。如上所述，本發(fā)明提供檢測樣品中一種或多種靶分析物的存在或定量的方法。
[0256]可以使用本發(fā)明的方法來檢測多個(gè)不同類型樣品中一種或多種靶分析物的存在，包括具有大量非靶向?qū)嶓w的復(fù)雜樣品，其中與未利用本發(fā)明的解折疊鄰近探針的等價(jià)方法相比，本發(fā)明的方法的解折疊探針允許更加優(yōu)越地檢測靶分析物。同樣地，本發(fā)明的方法是檢測簡單或復(fù)雜樣品中的一種或多種靶分析物的高度靈敏的方法。在本發(fā)明的方法中分析的樣品在許多實(shí)施方案中來自生理來源，如上更詳細(xì)地討論的。
[0257]除了檢測多種分析物，本發(fā)明的方法也可用于篩選化合物，所述化合物調(diào)節(jié)鄰近探針的分析物-結(jié)合域與分析物的結(jié)合區(qū)域之間的相互作用，即分析物-結(jié)合域與分析物的結(jié)合。術(shù)語調(diào)節(jié)包括降低(例如抑制)和提高兩個(gè)分子之間的相互作用。所述篩選方法可以是體外或體內(nèi)形式，其中本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地開發(fā)出兩種形式。
[0258]可以通過上述方法篩選多種不同的候選試劑。候選試劑涵蓋多種化學(xué)物種，但它們通常為有機(jī)分子，優(yōu)選具有分子量大于50并且小于約2，500道爾頓的小型有機(jī)化合物。候選試劑包括與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用所必需的官能基團(tuán)，特別是氫鍵，并且其通常包括至少一種胺、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個(gè)化學(xué)功能基團(tuán)。候選試劑通常包括被一種或多種上述官能基團(tuán)取代的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香或多芳香結(jié)構(gòu)。候選試劑也存在于生物分子中，包括肽、糖類、 脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。
[0259]從廣泛的來源中獲得候選試劑，包括合成或天然化合物庫。例如，可以用多種方式來隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī)寡核苷酸和寡肽的表達(dá)?；蛘?，以細(xì)菌、真菌、植物和動物提取物形式存在的天然化合物庫是可用的或容易制備的。此外，可以容易地將天然或合成制備的庫和化合物通過常規(guī)化學(xué)、物理和生物化學(xué)手段進(jìn)行修飾，并且可以用于制備組合庫。已知的藥理試劑可以經(jīng)受定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，比如?；⑼榛?、酯化、酰胺化等以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
[0260]在上述篩選分析中確定的試劑可用于各種方法中，包括調(diào)節(jié)靶分析物活性的方法，和用于與其存在和/或活性相關(guān)的條件中。
[0261]如上所述的，也提供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。例如，在某些實(shí)施方案中，用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒包括至少一組第一和第二鄰近探針，所述探針各自包括分析物-結(jié)合域和核酸域，其中所述鄰近探針的至少一個(gè)是解折疊鄰近探針，其中所述核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其可以裂解產(chǎn)生可連接的游離末端或與另一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的區(qū)域，如上所述。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括另外的探針，例如第三、第四等鄰近探針，如上所述。如上所述，某些方案可以使用兩個(gè)或多個(gè)不同組的這樣的探針以同時(shí)檢測樣品中的兩種或多種靶分析物，例如，以多重和/或高通量形式。同樣地，在某些實(shí)施方案中，試劑盒將包括兩個(gè)或多個(gè)不同組的鄰近探針。此外，采用試劑盒組分所實(shí)施的方案中要求或需要的另外的試劑是可以存在的，其中所述另外的試劑包括，但不限于以下物質(zhì)的一種或多種:解折疊所述鄰近探針的手段(例如，酶或酶的組合，比如切口酶、限制性核酸內(nèi)切酶或尿嘧啶-DNA糖基化酶和核酸內(nèi)切酶，例如核酸內(nèi)切酶IV)，連接酶，間隔/盒式寡核苷酸，可連接的寡核苷酸，阻斷寡核苷酸，用于固定探針、結(jié)合域或分析物的固體載體，用于固定探針、結(jié)合域或分析物的手段，檢測手段例如熒光標(biāo)記的核苷酸或寡核苷酸，互補(bǔ)核酸對，單鏈結(jié)合蛋白和PCR擴(kuò)增試劑(例如，核苷酸、緩沖液、陽離子等)等。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒可以包括如上所述的為降低培養(yǎng)混合物有效體積而采用的成分，例如體積排斥劑。試劑盒組分可以存在于獨(dú)立的容器中，或一種或多種組分可以存在于相同容器中，其中所述容器可以是儲存容器和/或用于設(shè)計(jì)試劑盒的分析期間采用的容器。
[0262]除了上述組分之外，本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步包括實(shí)施本發(fā)明的方法的說明書。這些說明書可以以各種形式存在于本發(fā)明的試劑盒中，其中一種或多種可以存在于試劑盒中。這些說明書可以存在的一種形式是在合適介質(zhì)或基質(zhì)上印刷的信息，所述的介質(zhì)或基質(zhì)是例如印刷了信息的一張或多張紙、在試劑盒的包裝中、在包裝內(nèi)含物上等。另一個(gè)手段可以是計(jì)算機(jī)可讀的介質(zhì)，例如軟磁盤、CD等，其中將信息記錄在其上?？梢源嬖诘牧硪粋€(gè)手段是網(wǎng)站地址，其中可以經(jīng)由因特網(wǎng)使用所述網(wǎng)站地址得到遠(yuǎn)端站點(diǎn)的信息。任何方便的手段都可以存在于試劑盒中。
[0263]因此，在一個(gè)在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種用于檢測樣品中分析物的方法中的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0264](a)至少一組的至少第一和第二鄰近探針，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合所述分析物，其中至少一個(gè)所述鄰近探針的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以被裂解產(chǎn)生至少一個(gè)可連接游離端或與所述樣品中另一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的區(qū)域，其允許所述至少第一和第二鄰近探針的核酸域直接地或間接地相互作用；
[0265](b)任選地，調(diào)節(jié)所述第一和第二鄰近探針的核苷酸之間相互作用的工具(例如，共用模板，例如連接模板寡核苷酸和/或連接酶)；
[0266](C)任選地，解折疊至少一個(gè)包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)的鄰近探針的工具(例如，酶催化手段，比如切口酶、限制性核酸內(nèi)切酶或尿嘧啶-DNA糖基化酶和核酸內(nèi)切酶，例如核酸內(nèi)切酶IV);和
[0267](d)任選地，用于檢測所述相互作用的工具。
[0268]如上所述，用于介導(dǎo)核酸之間的相互作用的工具可以包括一個(gè)或多個(gè)連接模板(夾板)寡核苷酸和/或連接酶，并且該工具可以任選地進(jìn)一步包括連接酶反應(yīng)必須的其它試劑。用于介導(dǎo)相互作用的工具可以是上述在分析方法的內(nèi)容中討論的任何手段，例如在第一和第二探針的核酸域上提供的標(biāo)記物，或可以是擴(kuò)增工具和用于檢測其擴(kuò)增產(chǎn)物的工具，例如用于PCR反應(yīng)的試劑(例如，擴(kuò)增引物，以及任選地聚合酶和/或核苷酸等)和用
于檢測PCR擴(kuò)增子等的試劑(例如，Taqman'探針等)。
[0269]所述試劑盒可以進(jìn)一步任選地包括用于標(biāo)準(zhǔn)鄰近探針的間隔/盒式寡核苷酸和/或阻斷寡核苷酸。
[0270]所述試劑盒可以進(jìn)一步任選地包括針對分析物的固定的俘獲探針，或用于固定的工具所提供的俘獲探針?？蛇x地，所述試劑盒可包括用于俘獲或結(jié)合于分析物的固相，或一個(gè)或多個(gè)所述第一、第二或第三鄰近探針可以按照固定或由用于固定的工具提供。根據(jù)上述說明書和下述代表性的實(shí)施例顯而易見的是，本發(fā)明的方法和產(chǎn)物具有優(yōu)于現(xiàn)有方法的大量優(yōu)點(diǎn)。有利地，使用解折疊鄰近探針(優(yōu)選地，其中至少一個(gè)探針被裂解解折疊)使得本發(fā)明的方法特別地用于同時(shí)檢測樣品中的多種分析物，即，多重分析。而且，每個(gè)探針組可以產(chǎn)生獨(dú)特標(biāo)記的相互作用產(chǎn)物，其允許平行檢測多種分析物?？蛇x地，對于用于檢測大量分析物的分析，其可用于順序檢測(例如，目測)相互作用產(chǎn)物，例如每次一個(gè)產(chǎn)物或每次一組產(chǎn)物。在本文描述的方法中使用的解折疊探針也能夠使其它試劑與探針同時(shí)加入到分析中。由于探針的相互作用域(即核酸域)直到它們已經(jīng)解折疊才能彼此相互作用，或與樣品中的其它組分相互作用，因此，可以將用于檢測相互作用產(chǎn)物的組分的加入到分析中而不會得到由非特異性相互作用而產(chǎn)生的產(chǎn)物。減少分析步驟的數(shù)量使可能的錯(cuò)誤最少化，并且使方案更適用于自動化。其它優(yōu)點(diǎn)將根據(jù)發(fā)明說明書是顯而易見的。
[0271]根據(jù)本文的詳細(xì)說明顯而易見的是，本發(fā)明涵蓋各種不同的實(shí)施方案，并且不同的這種實(shí)施方案可以得到不同的優(yōu)點(diǎn)。例如，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到如果鎖式探針仍然連接其靶分子，由于靶分子的拓?fù)湔系K，鎖式探針不容易通過RCA擴(kuò)增。然而，在本文描述的本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，核酸域的裂解產(chǎn)生環(huán)狀分子，其連接產(chǎn)生環(huán)狀報(bào)導(dǎo)體分子，該環(huán)狀報(bào)導(dǎo)體分子解環(huán)為靶分子，因此，可容易通過RCA擴(kuò)增，仍然允許局部錨定擴(kuò)增信號(即，由來自結(jié)合的鄰近探針核酸域或由其得到的引物而生成的RCA產(chǎn)物)。 [0272]將參照下述非限制性實(shí)施例、參照以下附圖進(jìn)行進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中:
[0273]凰！顯示使用兩個(gè)鄰近探針的鄰近連接分析，其中一個(gè)鄰近探針是解折疊鄰近探針，如所謂的喇叭探針。在該代表性的實(shí)施方案中，分析物為蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，其中第一鄰近探針結(jié)合分析物(描述為圓形)的蛋白質(zhì)元件，第二鄰近探針(喇叭探針)結(jié)合分析物的DNA元件。DNA充當(dāng)喇叭探針的分析物結(jié)合(“第一”)域的連接模板，并且第一鄰近探針的核酸域充當(dāng)?shù)诙徑结樀暮怂?“第二”)域的連接模板。其中所述連接涉及喇叭探針的核酸(“第二”)域的兩個(gè)末端之間的間隔寡核苷酸。
[0274]Si顯示使用三個(gè)鄰近探針的鄰近連接分析，其中一個(gè)鄰近探針是解折疊鄰近探針。解折疊鄰近探針的核酸域通過裂解解折疊，并且每個(gè)末端連接不同鄰近探針的核酸域。每個(gè)連接反應(yīng)以連接模板(“夾板”)寡核苷酸作為模板。鄰近探針結(jié)合的分析物沒有顯
/Jn ο
[0275]顯示使用兩個(gè)鄰近探針的鄰近連接分析，其中一個(gè)是解折疊鄰近探針。(A)解折疊鄰近探針的核酸域只有當(dāng)接近充當(dāng)連接模板的第二鄰近探針的核酸域時(shí)才能夠形成環(huán)狀寡核苷酸。(B)解折疊鄰近探針的核酸域形成兩部分鎖式探針的一個(gè)部分。鎖式探針的第二部分提供為第二鄰近探針的核酸域。只有當(dāng)所述探針鄰近結(jié)合(到分析物，沒有顯示)時(shí)，兩個(gè)部分才能夠形成環(huán)狀寡核苷酸。兩個(gè)“夾板”寡核苷酸作為連接反應(yīng)的模板。在(A)和(B)中的解折疊鄰近探針(描述為箭頭)的核酸域的游離3’末端能夠啟動RCA反應(yīng)。
[0276]Si顯示類似于圖3A的鄰近連接分析，其中兩個(gè)鄰近探針包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
[0277]Si顯示類似于圖4的鄰近連接分析，加入了具有發(fā)夾保護(hù)的核酸域的第三鄰近探針，該發(fā)夾保護(hù)的核酸域能夠啟動解折疊鄰近探針的環(huán)化寡核苷酸的RCA反應(yīng)。
[0278]_顯示類似于圖1的鄰近連接分析，加入了結(jié)合蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物(分析物)中另一種蛋白質(zhì)的第三鄰近探針，即第三鄰近探針可以看作是間接地結(jié)合分析物或所述分析物可以看作是復(fù)合物。喇叭探針的核酸(“第二”)域的兩個(gè)區(qū)域間接地連接，即經(jīng)由間隔寡核苷酸連接，針對每個(gè)連接利用了其它鄰近探針的核酸域作為連接模板。
[0279]Si顯示與圖4中顯示的類似的鄰近連接分析，其中鄰近探針的分析物-結(jié)合域和靶分析物都為核酸分子。該圖證實(shí)鄰近探針的核酸域如何可充當(dāng)RCA的引物。
[0280]_顯示與圖5中顯示的類似的鄰近連接分析，其中鄰近探針的分析物-結(jié)合域和革El分析物都為核酸分子。
[0281]圖9顯示具有兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的喇叭探針。
[0282]ΜΛ0顯示兩個(gè)喇叭探針如何相互作用以經(jīng)由兩個(gè)連接模板寡核苷酸形成環(huán)狀寡核苷酸。分析物可以看作是包括針對各個(gè)喇叭探針的第一域的兩個(gè)目標(biāo)序列的單個(gè)核酸分子，其中分析物核酸的插入序列沒有顯示?；蛘撸忍结樋梢钥醋鹘Y(jié)合鄰近探針的核酸域，所述鄰近探針結(jié)合分析物(沒有顯示)，即如間接地結(jié)合分析物。
[0283]圖11顯示與圖1中類似的鄰近連接分析，其中蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的DNA被鄰近探針代替。因此，喇叭探針可以看作是間接地結(jié)合分析物。
[0284]SIl顯示與圖1類似的鄰近連接分析，其中喇叭探針的第一和第二連接都涉及間
隔寡核苷酸。
[0285]自顯示與圖5類似的鄰近連接分析，其中環(huán)狀寡核苷酸的連接涉及間隔寡核苷酸。在該代表性的實(shí)施例中，間隔寡核苷酸包括與連接模板核酸域互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，使得其形成“凸出”或“環(huán)”。另外的“環(huán)”序列可以充當(dāng)并入用于檢測的環(huán)狀寡核苷酸的標(biāo)記物序列。
[0286]圖14顯示包括四個(gè)鄰近探針的鄰近連接分析,其中每個(gè)探針的核酸域的反應(yīng)元件通過發(fā)夾結(jié)構(gòu)加以保護(hù)。`預(yù)形成的環(huán)狀寡核苷酸，其雜交第二鄰近探針的核酸域，包含核酸外切酶嵌段(描述為在預(yù)形成的環(huán)狀寡核苷酸上黑色環(huán))，使得其被裂解之后不能用作滾環(huán)擴(kuò)增的引物。
[0287]ΜΙ5顯示單個(gè)喇叭探針如何可以用于檢測樣品中的核酸分子。
[0288]圖16晶示鄰近探針的核酸域如何可以通過包括兩個(gè)部分鎖式探針的一部分。第一鄰近探針是解折疊鄰近探針，其當(dāng)例如裂解解折疊時(shí)，提供針對鎖式探針的兩部分的連接模板。另一個(gè)連接模板提供為第二鄰近探針的核酸域。
[0289]圖17顯示基于雜交的原位鄰近連接分析(PLA)，其中:Ai顯示DNA-結(jié)合PLA探針雜交單鏈基因組DNA ；Aii顯示通過一級抗體和二級PLA-探針檢測組蛋白H3 ；Aiii顯示兩個(gè)環(huán)化寡核苷酸，一個(gè)鎖式探針和一個(gè)間隔寡核苷酸(鎖式探針包含針對熒光檢測的雜交位點(diǎn))，其都雜交兩個(gè)PLA-探針的核酸域；Aiv顯示形成環(huán)狀DNA分子的后續(xù)連接；和Av顯示現(xiàn)在通過RCA擴(kuò)增環(huán)狀DNA分子，并且通過與熒光標(biāo)記的寡核苷酸雜交來檢測。Bi顯示在人(BJhTert)和小鼠(NIH3T3)成纖維細(xì)胞中組蛋白H3的免疫熒光檢測(比例尺代表IOym)。Bii顯示在人類和小鼠細(xì)胞中雜交DNA-結(jié)合PLA-探針的RCA-介導(dǎo)的檢測(比例尺代表10 μ m)。C顯示接近Alu-副本(RCA產(chǎn)物看作點(diǎn))的單獨(dú)組蛋白H3蛋白質(zhì)的檢測。D顯示在人類和小鼠細(xì)胞中的組蛋白H3 - Alu-副本相互作用的定量，以及顯示來自三個(gè)復(fù)制物的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的33個(gè)(人類)和36個(gè)(小鼠)細(xì)胞中RCA產(chǎn)物的自動定量結(jié)果。每個(gè)點(diǎn)代表檢測單獨(dú)細(xì)胞中相互作用的數(shù)量。顯示中值百分?jǐn)?shù)(位于方框中)、25和75百分?jǐn)?shù)(方框)。
[0290]圖18顯示以基因組DNA作為樽板的原位PLA,其中:Ai顯示一級抗體和結(jié)合組蛋白H3的二級PLA-探針；Aii顯示兩部分鎖式探針(其中一部分包含熒光檢測的雜交位點(diǎn))，其雜交基因組DNA以形成與基因組DNA的單一 G/A錯(cuò)配；Aiii顯示兩部分鎖式探針的第一個(gè)連接；Aiv顯示利用MutY/EndoIV酶形成游離3’末端基因組DNA，所述MutY/EndoIV酶裂解兩部分鎖式探針形成的G/A錯(cuò)配；Av顯示結(jié)合鄰近探針的蛋白質(zhì)的核酸域與兩部分鎖式探針的未連接的區(qū)域的雜交，引入另一個(gè)間隔寡核苷酸(顯示為箭頭)；Avi顯示兩部分鎖式探針的第二個(gè)連接， 引入間隔寡核苷酸，以形成環(huán)狀DNA分子；和Avii顯示通過RCA對環(huán)狀DNA分子的擴(kuò)增，和通過使熒光標(biāo)記的寡核苷酸雜交兩個(gè)檢測位點(diǎn)(第一個(gè)來自兩部分鎖式探針的一個(gè)部分，第二個(gè)來自間隔寡核苷酸)，產(chǎn)生雙色信號進(jìn)行檢測。B顯示在人類(上部)和小鼠(下部)成纖維細(xì)胞中接近Alu-副本(RCA產(chǎn)物看作點(diǎn))的單獨(dú)組蛋白H3蛋白質(zhì)的檢測(比例尺代表10 μ m)。C顯示在人類和小鼠細(xì)胞中組蛋白H3 - Alu-副本相互作用的定量。顯示來自三個(gè)復(fù)制物的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的15個(gè)(小鼠)-29個(gè)(人類)細(xì)胞中RCA產(chǎn)物的自動定量結(jié)果。每個(gè)點(diǎn)代表檢測單獨(dú)細(xì)胞中相互作用的數(shù)量。顯示中值百分?jǐn)?shù)(位于方框中)、25和75百分?jǐn)?shù)(方框)。
[0291]圖19顯示基于喇叭探針的原位PLA,其中:Ai通過喇叭探針(包含鎖式探針的發(fā)夾，也包含針對突光檢測的雜交位點(diǎn))的雜交檢測-Alu副本；Aii顯示Ampligase連接的喇機(jī)探針的第一個(gè)連接；Aiii顯示一級抗體和結(jié)合組蛋白H3的二級PLA-探針；Aiv顯示如何通過UNG/EndoIV處理打開喇機(jī)探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以釋放互補(bǔ)末端。在同一步驟中，使用MutY/EndoIV酶裂解喇叭探針形成的G/A錯(cuò)配而產(chǎn)生基因組DNA的游離3’末端。Av顯示蛋白質(zhì)結(jié)合的鄰近探針的核酸域與喇叭探針的未連接互補(bǔ)的末端的雜交，引入另一個(gè)間隔寡核苷酸(顯示為箭頭)；Avi顯示喇叭探針的第二個(gè)連接，引入間隔寡核苷酸，以形成環(huán)狀DNA分子；和Avii顯示通過RCA對環(huán)狀DNA分子的擴(kuò)增，和通過使熒光標(biāo)記的寡核苷酸雜交兩個(gè)檢測位點(diǎn)(第一個(gè)來自喇叭探針的一個(gè)部分，第二個(gè)來自間隔寡核苷酸)，產(chǎn)生雙色信號進(jìn)行檢測。Bi顯示在人類和小鼠成纖維細(xì)胞中，Aii中的喇叭探針的擴(kuò)增單獨(dú)引起單獨(dú)的Alu-副本(RCA產(chǎn)物看作點(diǎn))的檢測。Bii顯示在人類和小鼠成纖維細(xì)胞中接近Alu-副本(同時(shí)與紅色和綠色熒光標(biāo)記的寡核苷酸雜交，得到RCA產(chǎn)物，看作黃色點(diǎn))的單獨(dú)的組蛋白H3蛋白質(zhì)的檢測(比例尺代表10 μ m)。C顯示在人類和小鼠細(xì)胞中組蛋白H3-A1U-副本相互作用(圖的左半部分)和單獨(dú)Alu-副本(圖的右半部分)的定量。顯示來自三個(gè)復(fù)制物的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的15個(gè)(人類，PDI)、21個(gè)(小鼠，PDI)、20個(gè)(人類，僅僅Alu-副本)和16個(gè)(小鼠，僅僅Alu-副本)細(xì)胞中RCA產(chǎn)物的自動定量結(jié)果。每個(gè)點(diǎn)代表單獨(dú)細(xì)胞中檢測的相互作用。顯示中值百分?jǐn)?shù)(位于方框中)、25%和75%四分位數(shù)(方框)。
[0292]顯示來自顯示在圖17-19的實(shí)驗(yàn)的BJhTert/NIH3T3細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞核的平均PDI計(jì)數(shù)的比值。
[0293]圖21顯示在具有雙連接系統(tǒng)的PLA芯片的原位斑點(diǎn)測序讀數(shù),其中:a)顯示具有雙連接系統(tǒng)的PLA芯片的圖解，其中一組共軛發(fā)夾結(jié)構(gòu)寡核苷酸的三個(gè)抗體充當(dāng)鄰近探針，即解折疊鄰近探針。一個(gè)探針通過連接附著在載玻片上的短寡核苷酸而固定在玻璃載玻片上，并且其它兩個(gè)鄰近探針攜帶條碼序列。當(dāng)鄰近探針結(jié)合同一靶分子且所述探針的核酸域解折疊時(shí)，加入另外的連接模板形成環(huán)狀DNA ;和幻顯示芯片的照片，其上使用VEGF和小鼠IgG作為靶蛋白，并且與1:1的比例摻入緩沖液中。鄰近探針中包括針對每個(gè)蛋白質(zhì)的特定蛋白條碼。在芯片上鄰近連接和RCA之后，通過使用Illumina測序試劑調(diào)用第一個(gè)堿基顯影擴(kuò)增產(chǎn)物。編碼小鼠IgG的堿基‘T’在紅色和綠色道中都出現(xiàn)，而編碼VEGF的堿基‘G’僅出現(xiàn)在綠色道中。[0294]圖22顯示在具有單一連接系統(tǒng)的PLA芯片的原位斑點(diǎn)測序讀數(shù),其中:a)顯示具有單一連接系統(tǒng)的PLA芯片的圖解，其中一組共軛發(fā)夾結(jié)構(gòu)寡核苷酸的三個(gè)抗體充當(dāng)解折疊鄰近探針。在三個(gè)探針中，一個(gè)探針通過雜交附著在載玻片上的長寡核苷酸而固定在玻璃載玻片上，其后來充當(dāng)RCA引物；一旦探針全部解折疊，一個(gè)攜帶條碼序列，并且另一個(gè)充當(dāng)連接模板山)說明首先怎樣采用簡化版本驗(yàn)證該系統(tǒng)，在所述簡化版本中僅僅一個(gè)探針需要解折疊反應(yīng)。使用VEGF和小鼠IgG作為靶蛋白，并且以1:1 (c)和1:10(d)和O蛋白(e)的比例慘入緩沖液中。在芯片上鄰近連接和RCA之后，通過使用Illumina測序試劑調(diào)用第一個(gè)堿基顯影擴(kuò)增產(chǎn)物。編碼小鼠VEGF的堿基‘T’在紅色和綠色道中都出現(xiàn)，而編碼小鼠IgG的堿基‘G’僅出現(xiàn)在綠色道中。
[0295]S23顯示使用具有單一分子分辨率的解折疊鄰近探針的RNA檢測，其中a)顯示通過解折疊探針進(jìn)行RNA檢測的圖解。使用合成模板作為驗(yàn)證系統(tǒng)。當(dāng)使用UNG時(shí)檢測斑點(diǎn)(b);相反，當(dāng)在反應(yīng)混合物(c)中不存在UNG時(shí),不用檢測斑點(diǎn)。
[0296]顯示一組靶向單獨(dú)的核酸分子(a)和蛋白質(zhì)(e)的三個(gè)解折疊鄰近探針。在酶消化之后，探針解折疊，其余鏈允許基于序列互補(bǔ)性(b)彼此雜交。報(bào)導(dǎo)體DNA分子通過DNA連接(c)環(huán)化，接著進(jìn)行RCA和原位檢測(d)。在模板和酶(f)的存在下，用于檢測合成DNA的探針誘導(dǎo)檢測信號，而當(dāng)模板(g)或酶(h)不存在時(shí)，沒有觀察到任何信號。
[0297]圖25顯示定向靶向細(xì)胞中單獨(dú)的mRNA分子的解折疊鄰近探針的結(jié)果。在細(xì)胞系SK0V3 (a)中觀察到HER2(圓形)的轉(zhuǎn)錄本，但是在細(xì)胞系BJhTERT (b)中沒有檢測到該轉(zhuǎn)錄本。在攜帶融合轉(zhuǎn)錄本(c)的靶形式的細(xì)胞系K562(圓形)中檢測到BCR-ABL融合轉(zhuǎn)錄本b3a2，但是在攜帶一種形式的所述融合轉(zhuǎn)錄本(缺乏解折疊鄰近探針(d)之一的目標(biāo)序列)的細(xì)胞系BV173中沒有檢測到該BCR-ABL融合轉(zhuǎn)錄本b3a2。
[0298]圖26顯示一個(gè)分析的結(jié)果,其中三個(gè)蛋白質(zhì)分析物即重組PSA、⑶F15和小鼠IgG被俘獲且用三組解折疊鄰近探針報(bào)道及原位斑點(diǎn)測序，(a)所有三種蛋白質(zhì)都存在，在緩沖液中稀釋，(b_d)分別摻入蛋白質(zhì)，(e)沒有摻入三種蛋白質(zhì)的任一種。
實(shí)施例
[0299]實(shí)施例1
[0300]如上所述，本文描述的方法是基于修飾的原位鄰近連接分析(PLA)的發(fā)展。下述實(shí)施例描述了針對Η)Ι(蛋白質(zhì)-DNA相互作用)的原位分析開發(fā)原位PLA的方法，其中評估三個(gè)分析，并且比較每個(gè)分析的效率和選擇性。所述比較包括研究組蛋白H3蛋白質(zhì)與作為模型系統(tǒng)的基因組Alu-副本的鄰近性。該模型系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是大量存在組蛋白H3，因此，通常存在與Alu-副本連接；基因組中的序列豐富。我們選擇作為目標(biāo)序列的26bp Alu-共有序列存在于人類中，但是不精確的拷貝存在于老鼠中。我們比較了使用雜交的設(shè)計(jì)與基于針對DNA目標(biāo)識別的鎖式探針的連接的更嚴(yán)格設(shè)計(jì)。本文給出的研究提供了原位研究表觀修飾變化的新方法，并且如上所述，已經(jīng)開發(fā)的方法和探針用于檢測樣品中分析物的多種分析中。[0301]通
[0302]細(xì)胞培養(yǎng)
[0303]將人類TERT無限增殖的成纖維細(xì)胞(BJhTert)和小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)接種在8-孔膠原蛋白涂層的腔室載玻片(BD Bioscience)上,在修飾的Eagle培養(yǎng)基(Gibco,針對BJhTert細(xì)胞)或Dulbecco's修飾的Eagle培養(yǎng)基(Sigma，針對NIH3T3細(xì)胞)+10%胎牛血清(FCS，加熱滅活的，Sigma)中33000個(gè)細(xì)胞/孔，并且在37°C下培養(yǎng)過夜。
[0304]固定和透化作用
[0305] 將細(xì)胞放置在冰上10分鐘，接著用冰冷的PBS洗滌兩次，每次5分鐘(900 μ I/孔)。在冰上，用2%(w/v)低聚甲醛(PFA, Sigma)的PBS中固定細(xì)胞30分鐘。在用900 μ I冰冷的PBS/孔短暫洗滌之后，將細(xì)胞在冰上用冰冷的70%乙醇滲透化處理30分鐘。接著，除去腔室載玻片的硅掩膜，將載玻片在室溫下干燥。接著，將載玻片在PBS中再水化10分鐘，在37°C下，在37°C溫的0.1M HCl (Sigma)中的2.9μ M胃蛋白酶(Sigma,由580 μ M原液新稀釋的)中滲透化處理細(xì)胞65秒。在37°C下，在IM NaCU0.lTris_HClpH7.5中洗滌之前和之后，將載玻片在PBS中洗滌兩次，每次約I分鐘，最后通過乙醇系列(70%/85%/99.6%，每次2分鐘)和在臺式離心機(jī)中短暫旋轉(zhuǎn)干燥。將疏水性屏障筆應(yīng)用于各孔的邊緣，并且將8-室安全密封(直徑9mm,深0.8mm ;Grace Bio-Labs)連接至載玻片。在37°C下,將細(xì)胞在洗滌緩沖液(IOOmM Tris-HCl (pH7.6)、150mM NaCl、0.05% 吐溫 20 (Sigma))中再水化 10分鐘。此后，在濕潤室中進(jìn)行所有的培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過30分鐘時(shí)用q-PCR膠帶密封各孔。在37°C下，用在 Ix NEB-緩沖液-4 中的0.5U/μ I 的AluI (New England Biolabs(NEB))和0.2 μ g/ μ I的BSA(NEB)消化基因組DNAlO分鐘。所有后續(xù)洗滌都是通過首先從各孔移除培養(yǎng)溶液，然后用約500 μ I合適的洗滌緩沖液吹掃各孔。在Alu1-處理之后，將細(xì)胞在洗滌緩沖液中洗滌，之后在37°C下，用在Ix λ -核酸外切酶緩沖液(NEB)中的0.2U/μ I的λ -核酸外切酶(NEB)、0.2 μ g/ μ I的BSA和10%的甘油(Sigma)處理制備部分單鏈的DNA。在冰上用在PBS中的l%(w/v)PFA后固定5分鐘的步驟之前和之后，將細(xì)胞在洗滌緩沖液中洗漆。
[0306]免疫熒光
[0307]如上所述處理細(xì)胞。在37°C下，在包含2.5mM的L-半胱氨酸(Sigma)和2.5ng/μ I 超聲處理的鮭魚精 DNA(Invitrogen)的 Starting Block T20PBS (Pierce)中阻斷細(xì)胞I小時(shí)。然后，在4°C下的阻斷緩沖液中2.5ng/y I的一級兔子-抗組蛋白H3抗體(#1791, Abeam)過夜。將各孔在含有 0.05% 吐溫 20 (TBS+T, 1000 μ I/孔)的 TBS (IOmMTris-HCl, 150mMNaCl, pH7.7)中洗滌，之后加入在 2xSSC、0.25 μ g/ μ I 的 BSA、7.5ng/ μ I 的聚(A) (Sigma),0.05% 吐溫 20 中的 7.5ng/ μ I 的驢-抗兔子-FITC F(ab’)2 片段(JacksonImmunoresearch),并且在37°C下培養(yǎng)30分鐘。最后,將載玻片在TBS中洗漆一次,除去安全密封，并且將載玻片在TBS中洗滌2x10分鐘，之后旋轉(zhuǎn)干燥，固定在包含100ng/ml的DAPI的 Vectashield 封固劑(Vector)中。
[0308]抗兔子PLA探針的共軛
[0309]在4°C 下，在透析杯(Slide-A-lyzer Mini 透析兀件 7，000MWC0, Pierce)中將IOOyg的驢-抗兔子(Jackson ImmunoResearch)逆著PBS滲析過夜。接著,通過在PBS中預(yù)洗漆的Amicon Ultra0.5mllOK ;Ultracelll0K膜(Millipore)中離心，將抗體濃縮至約20μ1。然后，在室溫下，以~25χ摩爾加入新溶于DMSO (Sigma)中的SMCC (Pierce)接觸抗體 2 小時(shí)。在 80°C下，使 PLA 寡核苷酸(5'硫醇-GTC TTA ACT ATT AGC GAT ACG GTC TCGCAG ATC GCT GAC AGA ACT AGA CAC3/ (SEQ ID NO:1)，HPLC-純，Biomers)脫氣 5 分鐘，冷凍，并在37°C下用50mM的DTT (PLA寡核苷酸的最終濃度50 μ Μ)培養(yǎng)Ih進(jìn)行還原。之后，通過加入緩沖液A(55mM的磷酸鹽緩沖液、150mM的NaCl、20mM的EDTA，pH7.0)使體積填充至約50 μ I。也使用緩沖液A預(yù)洗滌G-50柱(GE Healthcare)。然后，經(jīng)三個(gè)這樣的柱純化抗體和寡核苷酸，以除去活化的試劑。此后立即混合抗體和寡核苷酸，并在4°C下逆著PBS滲析過夜。
[0310]基于雜交的原位PLA
[0311]如上所述，將細(xì)胞固定并滲透化處理，之后在37°C下，用在1x T4DNA連接緩沖液(10mM 的 Tris-乙酸酯，ρΗ7.5，10mM 的乙酸鎂，50mM 的乙酸鉀)、250mM 的 NaCl、0.25 μ g/ μ 1的 BSA 和 0.05% 的吐溫 20 中的 200ηΜ 的 Hyboligonucleotide、“第一”鄰近探針(5' GCCTCC CM AGT GCT GGG ATT ACA GGA AM AAC ATG GAT GTT CTT GAC ATG GCA ATG ACG CTAA3' (SEQ ID NO: 2) ,PAGE純，整合DNA技術(shù)(IDT)，靶互補(bǔ)部分以斜體字顯示，與小鼠序列的錯(cuò)配以粗體顯示)培養(yǎng)30分鐘。然后，在37°C下使用洗滌緩沖液洗滌載玻片，接著在2xSSC+0.1%吐溫20中洗滌5分鐘。此后，將緩沖液改變?yōu)門BS+T。在37°C下，在包含2.5mM的L-半胱氨酸和2.5ng/μ I超聲處理的鮭魚精DNA的Starting Block T20PBS中阻斷細(xì)胞I小時(shí)。接著，在4°C下，在阻斷緩沖液中施用2.5ng/μ I的一級兔子-抗組蛋白Η3抗體或兔子IgG (Jackson Immunoresearch)過夜。在TBS+T (1000 μ I/孔)中洗漆各孔,并且在室溫下，在阻斷緩沖液中預(yù)培養(yǎng)2.5ng/ μ I的二級抗兔子-PLA探針(“第二”鄰近探針)30分鐘，之后將其在37°C下施用于載玻片。在37°C下，在IOmM的Tris-HCl pH7.5，0.1%吐溫20中洗滌和在TBS+T中短暫洗滌之后，在37°C下，以最終濃度125nM施用在Ix T4DNA連接緩沖液、0.05U/ μ 1 的 T4DN A 連接酶(Fermentas) > ImM 的 ATP(Fermentas)、0.25 μ g/ μ I 的BSA、250mM的NaCl和0.05%的吐溫20中的兩種寡核苷酸C磷酸酯-AGC GAT CTG CGAGAC AGT GAA TGC GAG TCC GTC TAA GAG AGT ACA GCA GCC GTC TTA GCG TCA TTG CCAT 3'，(SEQ ID NO: 3)PAGE 純，IDT; 5'磷酸酯-GTC AAG AAC ATC CAT GAA AGT GTC TAGTTC TGT C3' , (SEQ ID NO: 4) PAGE純，IDT) 30分鐘。所述寡核苷酸由鎖式探針和間隔寡核苷酸組成，以便產(chǎn)生環(huán)狀寡核苷酸的鎖式探針的連接以hyboligonucleotide和抗兔子-PLA探針的核酸域作為模板，如圖17Aiii中描述的。用TBS+T洗滌各孔，之后，在37°C下，用 IU/ μ I 的 phi29DNA 聚合酶(Fermentas)、lx phi29 緩沖液(Fermentas)、0.25mM 的dNTP (Fermentas)、0.2μ g/μ I 的 BSA、5% 甘油和 1:1000 的小鼠抗組蛋白 H3 (phospho S10)(Abcam)進(jìn)行RCA1.5小時(shí)。使用第一鄰近探針的核酸域作為RCA的引物。在37°C下用TBS+T洗滌30分鐘之后，進(jìn)行檢測，所述TBS+T含有在2x SSC、0.25 μ g/ μ l的BSA, 7.5ng/μ 1 的口017(么)、0.05%的吐溫20和6.5ng/ μ l 的驢-抗小鼠-FITC F’ab2_ 片段(JacksonImmunoresearch)中的 250nM 檢測寡核苷酸(5' Alexa Fluor555_CAG TGA ATG CGA GTCCGT CT3'，(SEQ ID N0:5)HPLC純，TriLink)。最后，在TBS中洗滌載玻片一次，除去安全密封，并在TBS中洗滌該載玻片2x10分鐘，之后將其旋轉(zhuǎn)干燥，固定在包含100ng/mL的DAPI的Vectashield封固劑中。
[0312]通過鎖式探針檢測雜交寡核苷酸[0313]如針對基于雜交的原位PLA描述的處理細(xì)胞，直到已經(jīng)阻斷載玻片。然后，施用在Ix T4DNA-連接緩沖液、0.25 μ g/ μ I的BSA、0.05U/ μ I的T4DNA連接酶、0.05%的吐溫
20、lmM的ATP和250mM的NaCl中的125ηΜ鎖式寡核苷酸(5'磷酸酯-TGT CAA GAA CATCCA TGT CAG TGA ATG CGA GTC CGT CTA AGA GAG TAG TAC AGC AGC CGT TTA GCG TCA TTGCCA3'，(SEQ ID NO:6)HPLC pure，IDT)—一種針對Hyb-寡核苷酸的游離部分的鎖式探針，并且在37°C下培養(yǎng)30分鐘。如上所述進(jìn)行RCA、檢測和固定。
[0314]以基因組DNA作為模板的原位PLA
[0315]將細(xì)胞固定并滲透化處理，之后阻斷載玻片，用一級抗體和二級PLA探針(“第一”鄰近探針)培養(yǎng)，如針對基于雜交的原位PLA描述的。在洗滌之后，施用在Ix T4DNA連接緩沖液、0.25 μ g/ μ I的BSA、0.05%的吐溫20和250mM的NaCl中的200nM基因組模板寡核苷酸 I (5'磷酸酯-CT GGGA TTA CAG GAA AAA AAG AGT GTC TAG TTC TGT C3'，(SEQID NO: 7) PAGE純，IDT,靶互補(bǔ)部分以斜體字顯示，與小鼠序列的錯(cuò)配以粗體顯示)和200nM的基因組模板-寡核苷酸2 (5'磷酸酯-CGC TAA TAG TTA AGA CGC TCA GTG AAT GCG AGTCCG TCT AAA AAA AGC CGC CCA AAG TG3/，(SEQ ID N0:8)PAGE 純，IDT，靶互補(bǔ)部分以斜體字顯示，與小鼠序列的錯(cuò)配以粗體顯示，用于MutY-裂解的G/A錯(cuò)配用下劃線顯示)，并在37°C下培養(yǎng)30分鐘。兩個(gè)寡核苷酸形成兩部分鎖式探針，其可以看作是“第二”鄰近探針。在用洗滌緩沖液洗滌步驟之后，在37°C下，施用在T4DNA-連接緩沖液、ImM的ATP、
0.25 μ g/μ I 的 BSA、250mM 的 NaCl 和 0.05% 的吐溫 20 中的 0.05U/ μ I T4DNA 連接酶。在37°C下，將載玻片在2xSSC+0.05%的吐溫20中洗滌5分鐘，接著在TBS+T中洗滌。接著，使用 0.64 μ M 的 MutY 蛋白質(zhì)(USB)、在 MutY 緩沖液(20mM 的 Tris-HCl pH7.6、30mM 的 NaCl、ImM 的 EDTA、IOOmM 的 KClUmM 的 DTT)中的 0.1U/μ I 的 EndoIV(Fermentas)和 0.5 μ g/μ 1BSA，用MutY/核酸內(nèi)切酶IV(EndoIV)消化所述探針30分鐘，產(chǎn)生能夠啟動環(huán)化鎖式探針的RCA的基因組DNA的游離3’末端。在TBS+T中的另一個(gè)洗滌步驟之后，在37°C下，在
0.05υ/μ I 的 T4DNA連接酶、Ix Τ4-連接緩沖液、ImM 的 ΑΤΡ、0.25 μ g/μ I 的 BSA、0.05% 的吐溫20和250mM的NaCl中培養(yǎng)125nM的另一種間隔寡核苷酸C磷酸酯-AGC GAT CTG CGAGAC CGT AT3'，(SEQ ID NO:9)HPLC純，Biomers) 30分鐘。第一鄰近探針的核酸域充當(dāng)經(jīng)由間隔寡核苷酸連接鎖式探針的模板，如圖18A所示。如上所述進(jìn)行RCA(通過基因組DNA啟動)、檢測和固定，不同在于向混合物中加入250nM的另一種檢測寡核苷酸(5' Cy5_AGCGAT CTG CGA GAC CGT AT3/，(SEQ ID NO: 10) HPLC 純，IDT)。
[0316]基于喇叭探針的原位PLA
[0317]通過兩個(gè)部分A (5'磷酸酯-CT G GGA TTA CAG GAA AAA AAG AGT GTC TAG TTCTGT CUT AAA AAA ATA AGA CAG AAC UAG ACA CUC TAA AAA AAG CGT CUT AA3' (SEQ IDNO: 11) -PAGE純，IDT，靶互補(bǔ)部分以斜體顯示，與小鼠序列的錯(cuò)配以粗體顯示)和B(5'磷酸酯-CTA UTA GCG ACA AAA AAG UCG CTA ATA GTT AAG ACG CTC AGT GAA TGC GAG TCCGTC TAA AAA AAG CCG CCC AAA GTG3/ (SEQ ID NO: 12) - PAGE純，IDT，靶互補(bǔ)部分以斜體顯示，與小鼠序列的錯(cuò)配以粗體顯示，用于MutY-裂解使用的G/A錯(cuò)配用下劃線顯示)的連接制備喇叭探針。將兩種寡核苷酸以最終濃度4.4 μ M混合，加入Ix T4DNA-連接緩沖液和2mM的ATP。首先，將該寡核苷酸混合物在90°C下培養(yǎng)，然后在65°C下培養(yǎng)10分鐘。在室溫下冷卻之后，加入0.025υ/μ I的T4DNA連接酶。在37°C下，使樣品連接30分鐘，然后在65°C下培養(yǎng)10分鐘以使連接酶失活。
[0318]如上所述，將細(xì)胞固定并滲透化處理，之后在37°C下，用在Ix T4DNA連接緩沖液、250mM的NaCl、0.25 μ g/ μ I的BSA和0.05%的吐溫20中的200ηΜ喇叭探針(“第一”鄰近探針)培養(yǎng)30分鐘。此后，在洗滌緩沖液中洗滌載玻片，并且在45°C下，用在Ix Amp-連接酶緩沖液(20mM Tris-HCl (ρΗ8.3)、75mM 的 KClUOmM 的 MgCl2、0.5mM 的 NAD (Sigma)、0.01%的 Triton X-100 (PlusOne)),0.25 μ g/μ I 的 BSA 和 5% 的甘油中的 0.25U/μ I 的 Amp-連接酶(Epicentre)連接喇叭探針30分鐘。然后，如上所述，將載玻片洗滌，并用一級抗體和二級PLA探針(“第二”鄰近探針)處理。接著，用MutY/EndoIV和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)消化探針，以在37°C下，用在MutY緩沖液和0.5 μ g/ μ I的BSA中的0.64 μ M的MutY糖基化酶、0.1U/ μ I 的 EndoIV,0.05 的 U/ μ IUNG (Fermentas)進(jìn)行 PDI 檢測 30 分鐘。加入U(xiǎn)NG引起喇叭探針解折疊，如圖19Α所示。對于其中僅使用鎖式探針作為DNA-檢測探針的樣品，從該步驟中省略UNG。如上述對于以基因組DNA作為模板的原位PLA，進(jìn)行所有后續(xù)步驟。
[0319]圖像獲取和預(yù)處理
[0320]使用Zeiss Axioplan2 落射突光顯微鏡、AxioCam MRm CCD 檢測器和 40x1.30ilPlanNeof Iuar物鏡與過濾器一起，獲取DAP1、FITC、Cy3和Cy5的圖像。使用FITC通道選擇圖像位置，避免顯示對有絲分裂標(biāo)記物磷組蛋白(phosphohistone)H3S10染色的細(xì)胞。對于每個(gè)條件，在孔的四個(gè)不同位置獲取間隔0.275 μ m的7個(gè)圖像的z_堆疊。因?yàn)榉至验g期的細(xì)胞相對扁平，通過采集單獨(dú)的Z-切片的最大強(qiáng)度投影摧毀Z-堆疊，同時(shí)多于一個(gè)焦平面的圖像的目的是為了避免縱向色差。使用剛性幾何變換矯正橫向色差。分別減去來自Cy3和Cy5通道的中值強(qiáng)度來減少背景照度。[0321]圖像分析
[0322]為了定量基于每個(gè)細(xì)胞的roi，鑒定單獨(dú)的細(xì)胞以及點(diǎn)-源信號。通過強(qiáng)度閾值處理從圖像背景分割DAPI中成像的細(xì)胞核，并且基于形狀分離接觸核的掩蔽物。此后，使用點(diǎn)-源信號檢測方法，分別在Cy3 (紅色)和Cy5 (綠色)通道中檢測單獨(dú)的信號。所述方法由兩個(gè)部件組成:檢測器，其是增強(qiáng)信號的余弦濾波器，和檢驗(yàn)器，其是驗(yàn)證來自檢測器的結(jié)果的正弦濾波器。將Cy3和Cy5通道中信號檢測的結(jié)果組合，從每個(gè)檢測信號提取來自兩種顏色染料的熒光強(qiáng)度的比例。此后，基于綠色至紅色強(qiáng)度的比例分布，將信號歸類為紅色、綠色或雙色的。與基于強(qiáng)度閾值處理的分類法相比，這類基于比例的分裂確保了強(qiáng)信號和弱信號歸屬于相同的類。針對基于雜交的原位PLA，單一顏色的Cy3信號被認(rèn)為是檢測的ΗΠ，而針對以基因組DNA作模板的原位PLA和基于喇叭探針的原位PLA，僅雙色(Cy3和Cy5)信號被認(rèn)為是真實(shí)的Η)Ι。對于在新條件下進(jìn)行的每個(gè)實(shí)驗(yàn)，將圖像數(shù)據(jù)分成訓(xùn)練組和試驗(yàn)組。訓(xùn)練組用于精調(diào)圖像分析管線中與信號大小和強(qiáng)度有關(guān)的參數(shù)，接著對較大的實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用算法以便對每個(gè)細(xì)胞群給出結(jié)果。
[0323]
[0324]使用上述鄰近連接分析檢測單獨(dú)固定細(xì)胞中DNA-結(jié)合蛋白和特定短的基因組DNA-序列的協(xié)同定位，對于這些分析的選擇性來評估這些不同的分析(如圖17-19中圖示的)。將對于特異性PDI所研究的細(xì)胞進(jìn)行PFA-固定，并用乙醇滲透化處理，接著進(jìn)行胃蛋白酶處理和在高鹽中洗滌，以使細(xì)胞核更容易探測。然后，通過AluI限制性內(nèi)切酶處理消化基因組DNA。由于雜交檢測基因組序列需要單鏈DNA，則用λ-核酸外切酶，利用其5’-3’活性處理細(xì)胞，以便產(chǎn)生在消化位點(diǎn)具有釋放3’末端的單鏈懸垂部分。作為原理的證實(shí),我們選擇研究組蛋白Η3和26bp Alu-共有序列(5' CCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGC3'(SEQ ID NO: 13))之間的鄰近性，如通過搜索理想序列-與人類基因組序列(NCBI36，2006年3月的組裝)匹配來確定的在人類中約60，000個(gè)拷貝/細(xì)胞。盡管在小鼠中不存在正合序列，但是它們的基因組包含與在約6，000個(gè)拷貝(理想序列匹配每個(gè)小鼠的基因組，NCBI36, 2006 年 3 月組裝)中人類 26bp Alu-共有序列(5' CCTTTAATCCCAGCACTCGGGAGGC3'(SEQ ID N0:14)，與人類序列的差異以粗體指示)類似的序列，其在人類中不存在。這提供了一個(gè)研究探測選擇性的良好模型。我們證實(shí)在人類(BJhTert)和小鼠(NIH3T3)成纖維細(xì)胞上使用免疫熒光，用于靶向組蛋白H3的抗體近似同樣地染色類人和小鼠細(xì)胞核(圖17Β?)。
[0325]基于雜交的原位PLA
[0326]以前使用原位PLA檢測單獨(dú)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。為了將其應(yīng)用延伸至特異性ΗΠ，我們研究了一種檢測基因組DNA序列的簡單雜交方法。在該設(shè)計(jì)中，我們使用與作為探針的寡核苷酸共軛的抗兔子免疫球蛋白抗體來檢測針對組蛋白H3的一級兔子抗體(即，鄰近探針間接地結(jié)合分析物)。另一個(gè)PLA探針是與目標(biāo)序列互補(bǔ)且采用PLA反應(yīng)所需的序列延伸的寡核苷酸(圖17A)。為了研究DNA-定向PLA-探針的特異性，我們使用其雜交攜帶目標(biāo)序列的人類細(xì)胞和攜帶類似的但不相同序列少約10倍拷貝的小鼠細(xì)胞。然后，通過RCA，使用針對雜交探針的游離3’末端的鎖式探針顯影結(jié)合的探針。鎖式探針是單鏈寡核苷酸，其雜交具 有彼此相對的其5’和3’末端的目標(biāo)序列。在完美雜交時(shí)，末端可以通過連接結(jié)合，得到環(huán)狀DNA-分子，然后其可以通過phi29DNA聚合酶局部擴(kuò)增進(jìn)行RCA。得到的單鏈DNA分子由約1000個(gè)原始環(huán)的互補(bǔ)復(fù)制物組成，形成低于μ m大小的DNA束。我們通過雜交熒光標(biāo)記的寡核苷酸檢測這些RCA產(chǎn)物。由于熒光團(tuán)以非常小體積集中，它們?nèi)菀着c本底熒光區(qū)分，且由熒光顯微鏡以亮點(diǎn)呈現(xiàn)。每個(gè)檢測的RCA產(chǎn)物都得到一個(gè)清楚的點(diǎn)，能夠在單細(xì)胞定量這些點(diǎn)的計(jì)數(shù)。顯著的檢測信號證實(shí)探針實(shí)際上雜交在人類細(xì)胞的細(xì)胞核中的DNA。然而，信號強(qiáng)度如此高，不能區(qū)分單獨(dú)的RCA產(chǎn)物。在小鼠細(xì)胞中也觀察到反應(yīng)產(chǎn)物，盡管它們?nèi)狈_的目標(biāo)序列(小鼠序列與人類序列在探針靶向區(qū)域的c.4G>C、c.18delT 和 c.19T>C 位點(diǎn)不同)(圖 17Bii)。
[0327]為了檢測組蛋白H3與基因組DNA中Alu-副本的協(xié)同定位，一起使用DNA-定向PLA探針與一級抗體和上述的二級PLA-探針。在加入寡核苷酸之后，這兩個(gè)探針以其作為模板的鄰近結(jié)合、雜交和連接，產(chǎn)生環(huán)狀DNA分子，然后通過RCA將其復(fù)制，并且使用上述熒光雜交探針檢測(圖17C和D)。在人類細(xì)胞中，基于雜交的原位PLA產(chǎn)生~160個(gè)信號/細(xì)胞，與在缺乏該精確基因組序列的小鼠細(xì)胞中觀察的~30個(gè)信號/細(xì)胞相比，提高了超過5倍(圖20)。當(dāng)用無關(guān)的兔子IgG代替一級抗體時(shí)，或者當(dāng)省略一級抗體或DNA-結(jié)合PLA探針時(shí)，則檢測到可忽略數(shù)量的信號(中值=0，上限百分?jǐn)?shù)≤1)，與使用的細(xì)胞系無關(guān)(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
[0328]以基因組DNA作為模板的原位PLA
[0329]為了提高靶基因組DNA序列的檢測選擇性，我們決定使用基因組DNA序列本身作為寡核苷酸探針的連接酶-依賴性環(huán)化的模板。因此，在該方案中，單鏈基因組DNA充當(dāng)PLA探針。對于第二個(gè)方案，將一級抗體和二級PLA-探針施用于具有固定和部分消化的DNAs的細(xì)胞。該基因組DNA提供寡核苷酸對(兩部分鎖式探針)的環(huán)化所需的兩個(gè)模板之一，另一個(gè)模板是連接PLA-探針的寡核苷酸(圖18A)。使用錯(cuò)配-特異性MutY糖基化酶(MutY)和核酸內(nèi)切酶IV(EndoIV)，使用探針-靶雜交體中故意的G/A錯(cuò)配來酶裂解探針結(jié)合位點(diǎn)的基因組序列。這得到可用于啟動RCA的基因組DNA序列中的游離3’末端。為了保證信號實(shí)際上反映真實(shí)的蛋白質(zhì)-DNA相互作用，我們設(shè)計(jì)反應(yīng)，使得短的所謂“間隔”寡核苷酸包括在環(huán)狀DNA分子中，其以連接于抗兔子免疫球蛋白抗體的寡核苷酸作為模板。該序列提供了 RCA產(chǎn)物中的第二檢測位點(diǎn)，除了已經(jīng)并入鎖式探針寡核苷酸的RCA產(chǎn)物之外。包含該另外的DNA片段能夠使我們區(qū)分已經(jīng)環(huán)化的任何鎖式探針，而無需加入抗組蛋白抗體。我們保證通過使用具有不同熒光的雜交探針檢測這兩個(gè)基序，可同時(shí)反映出RCA產(chǎn)物中的兩個(gè)片段。因此，僅采用同時(shí)針對兩個(gè)片段的探針可檢測RCA產(chǎn)物被認(rèn)為指示roi (圖18B和C)。正如所料，與信號降低至5個(gè)信號/細(xì)胞的小鼠細(xì)胞相比，使用基因組DNA作為PLA-探針提高了人類細(xì)胞中的信號比例13倍(圖20)。然而，采用該更嚴(yán)格的探測，在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的信號總數(shù)降低至~80個(gè)信號/細(xì)胞。當(dāng)使用無關(guān)的兔子代替一級抗體時(shí)，或者當(dāng)不加入一級抗體或環(huán)化寡核苷酸時(shí)，在兩個(gè)細(xì)胞系中都觀察到O個(gè)信號的中值(上限百分?jǐn)?shù)≤1）。
[0330]基于喇叭探針的原位PLA
[0331]即使以基因組DNA作為模板的原位PLA改善了信號檢測選擇性，在不存在精確目標(biāo)序列的小鼠細(xì)胞中仍然產(chǎn)生了假陽性信號。如上討論的，環(huán)化寡核苷酸(兩部分鎖式探針)雜交至類似而不是相同序列可能允許連接，因此，我們想要用更嚴(yán)格的連接酶，即Amp-連接酶代替T4DNA連接酶，所述Amp-連接酶耐受更高的溫度且提供更特異性的目標(biāo)識另O。然而，抗體很可能對實(shí)質(zhì)上高于37°C的溫度敏感。因此，為了使用更特異性的Amp-連接酶，必須改變反應(yīng)方案。首先，在45°C的更高溫度下，使鎖式探針(在該情況下，喇叭探針，如下討論的)雜交且連接，之后在37°C下進(jìn)行抗體培養(yǎng)。DNA環(huán)由使用一部分鎖式探針代替使用兩部分鎖式探針形成，如上所述。因此，兩個(gè)靶-互補(bǔ)序列連接形成一個(gè)分子。然而，當(dāng)使用一部分鎖式探針時(shí)，所述鎖式探針必須與用于檢測PDI的蛋白質(zhì)組分的PLA探針具有部分互補(bǔ)性，但是由于該互補(bǔ)性這些試劑在培養(yǎng)期間不必與PLA-探針結(jié)合在一起。
[0332]為了克服該障礙，我們發(fā)現(xiàn)了一般方法，其中DNA試劑之一，此處是鎖式探針，包括兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其屏蔽與用于蛋白質(zhì)檢測的PLA-探針(所謂的喇叭探針)的互補(bǔ)性。將一些尿嘧啶堿基并入各個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一個(gè)鏈中，以提供給基質(zhì)進(jìn)行酶消化。這允許我們在兩個(gè)探針獨(dú)立地結(jié)合它們的靶標(biāo)之后釋放與PLA探針互補(bǔ)的鎖式探針的序列(圖19A)。因此，通過Amp-連接酶，鎖式探針可以雜交到基因組DNA上且連接，而不會影響隨后的一級抗體和二級PLA-探針的培養(yǎng)。只有當(dāng)所有探針都結(jié)合時(shí)，通過用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)消化除去發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的補(bǔ)體，以除去尿嘧啶堿基，并且通過EndoIV-處理在堿性位點(diǎn)裂解DNA-骨架。這釋放了相鄰PLA-探針的雜交模板，其作為喇叭探針的其余部分連接的模板以產(chǎn)生環(huán)狀(現(xiàn)在，稍小)DNA分子。在同一步驟中，基因組DNA和環(huán)化的探針之間的G/A-錯(cuò)配被MutY/EndoIV-裂解，在基因組DNA中結(jié)合環(huán)化探針的位點(diǎn)產(chǎn)生游離3’末端。如對于以基因組DNA作為模板的原位PLA描述的，為了區(qū)分正確反應(yīng)的探針，需要將另一個(gè)序列元件(間隔寡核苷酸)引入喇叭探針中。這次，引入間隔寡核苷酸-引起雙色RCA產(chǎn)物-也起控制UNG/EndoIV裂解的作用，因?yàn)閱为?dú)的喇叭探針也可以通過RCA擴(kuò)增，即使沒有被UNG/EndoIV消化。在那種情況下，其充當(dāng)規(guī)則的鎖式探針，檢測基因組DNA但獨(dú)立于蛋白結(jié)合(圖19B)，而雙色信號表示在DNA-序列和靶蛋白的鄰近性(圖19B)。
[0333]以這種方式，以高選擇性顯影Alu序列和與DNA相互作用的組蛋白蛋白質(zhì)之間的鄰近性，得到~25個(gè)PDI信號/每個(gè)人類細(xì)胞，而在小鼠細(xì)胞中觀察到可忽略數(shù)量的信號，致使在人類細(xì)胞中檢測的信號高于在小鼠細(xì)胞中信號的500倍(圖19C和20)如上，在任何細(xì)胞類型中，利用無關(guān)兔子IgG、省略一級抗體或DNA-結(jié)合PLA-探針的技術(shù)控制中沒有一個(gè)產(chǎn)生信號(中值和上限百分?jǐn)?shù)都等于零)(數(shù)據(jù)沒有顯示)。與使用不含發(fā)夾片段的規(guī)則的鎖式探針相比，當(dāng)使用包含發(fā)夾的鎖式探針(喇叭探針)檢測基因組DNA時(shí)，結(jié)果類似，因此發(fā)夾結(jié)構(gòu)沒有影響檢測或擴(kuò)增(數(shù)據(jù)沒有顯示)。 [0334]討論
[0335]在描述的分析中靶向的Alu序列在人類基因組中存在~60，000個(gè)拷貝，而組蛋白H3(核小體的一種組分)確定位于鄰近大多數(shù)或所有的這些拷貝。為了使細(xì)胞核能夠接近檢測所需的所有試劑，必須對核膜進(jìn)行滲透化處理且除去某些蛋白質(zhì)。此處，我們內(nèi)必須找到接觸目標(biāo)序列和將感興趣的蛋白保留在適當(dāng)位置之間的平衡。因此，固定和滲透化處理步驟需要仔細(xì)地滴定，對于每個(gè)感興趣的新蛋白質(zhì)和序列可能需要重新進(jìn)行上述步驟。
[0336]我們選擇從我們的分析中排除被有絲分裂標(biāo)記物抗組蛋白H3(磷酸S10)染色的細(xì)胞，以避免研究細(xì)胞之間的變異來源。當(dāng)用鎖式探針靶向Alu-序列時(shí)，~0.13%的檢測效率暗示在我們使用的條件下，大部分的DNA不易探測。為了改善本文提出的方法檢測蛋白結(jié)合單拷貝基因的效率，將需要增加DNA的接近性的其它研究。
[0337]正如所料，本文顯示用于檢測靶DNA序列的基于雜交的方法具有最小的選擇性，產(chǎn)生~160個(gè)信號/人類細(xì)胞，以及產(chǎn)生~30個(gè)信號/小鼠細(xì)胞。使用基因組DNA直接作為形成可擴(kuò)增DNA環(huán)需要的兩個(gè)連接反應(yīng)之一模板而代替將寡核苷酸雜交至目標(biāo)序列且利用其作為連接的模板，在人類和小鼠細(xì)胞中檢測到信號之間的里比例增加至~13。同時(shí)，與基于雜交的原位PLA相比，在人類細(xì)胞中的信號數(shù)量下降約50%。我們推測大部分信號丟失是假陽性信號，因?yàn)閬碜躁幮詫φ招∈蠹?xì)胞的信號下降了 80%。由于限制性裂解和核酸外切產(chǎn)生大量的單鏈DNA，環(huán)狀探針交叉雜交的風(fēng)險(xiǎn)增加，我們保證僅僅由同時(shí)識別基因組目標(biāo)序列和結(jié)合的蛋白質(zhì)得到的RCA產(chǎn)物被評分。這是通過組蛋白H3結(jié)合PLA-探針引導(dǎo)另外的“間隔”寡核苷酸并入環(huán)化的(鎖式或喇叭探針)DNA分子中來實(shí)現(xiàn)。因此，可以使用不同熒光團(tuán)標(biāo)記的兩個(gè)探針檢測RCA產(chǎn)物。一個(gè)識別來自對基因組DNA特異性的環(huán)化(鎖式或喇叭)探針的基序，并且一個(gè)顯示出存在由抗組蛋白抗體提供的另一個(gè)“間隔”寡核苷酸。在數(shù)據(jù)分析中，僅僅雙色RCA產(chǎn)物被認(rèn)為是真實(shí)信號。也從所述分析中忽略在細(xì)胞核外、細(xì)胞質(zhì)中或細(xì)胞外發(fā)現(xiàn)的信號。
[0338]為了進(jìn)一步提高分析區(qū)分密切相關(guān)的序列的選擇性，我們轉(zhuǎn)向熱穩(wěn)定的Amp-連接酶，迫切需要一種更精心設(shè)計(jì)的探針方案。與T4DNA連接酶相比，Amp-連接酶需要更高的溫度，并且在連接位點(diǎn)更易于錯(cuò)配。因此，DNA-結(jié)合探針的連接將需要在檢測蛋白質(zhì)之前進(jìn)行，因?yàn)榭贵w不能耐受在實(shí)質(zhì)上高于37°C的溫度下培養(yǎng)。然而，如果使用環(huán)化(鎖式探針)寡核苷酸并且在結(jié)合PLA-探針之前連接，則預(yù)期用于蛋白質(zhì)檢測的PLA-探針攜帶的寡核苷酸可以雜交DNA結(jié)合環(huán)化寡核苷酸并且變得鄰近，與合適的靶蛋白的存在無關(guān)。因此，我們必須通過引入遮掩寡核苷酸的互補(bǔ)部分的兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)掩蔽DNA-結(jié)合探針的PLA-探針互補(bǔ)部分。采用該基于喇叭探針的原位PLA，我們觀察到與小鼠細(xì)胞相比，在人類細(xì)胞中的信號計(jì)數(shù)增加500倍。比較基于鎖式探針的原位PLA檢測的PDI信號數(shù)和Alu-序列，所有檢測的Alu序列的40%似乎非常接近于組蛋白H3。
[0339]因此，用于DNA檢測的喇叭探針與用于蛋白質(zhì)檢測的寡核苷酸-共軛抗體的組合經(jīng)由鄰近連接反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的選擇性檢測。這樣的方法將有助于鑒定具有特異性PDI和某些序列的表觀修飾變化的細(xì)胞，以及其在組織切片中的位置。然而，顯而易見的是，一般而言，本文描述的方法和探針將用于分析物的檢測，而不僅限于roi的檢測。因此，將以更加詳細(xì)分析細(xì)胞功能的單細(xì)胞水平檢測基因、轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的相關(guān)方法的組合變得可能。在一個(gè)進(jìn)一步的前景中，可以來源于以單細(xì)胞水平調(diào)芐基因表達(dá)的研究的新診斷時(shí)機(jī)成為可能。
[0340]實(shí)施例2
[0341]采用解折疊探針和原位斑點(diǎn)測序讀數(shù)的芯片內(nèi)鄰近連接分析(PLA)通過連接在載玻片表面(圖21a)上的寡核苷酸或雜交(圖22a)，將第一鄰近探針(或俘獲探針)固定在玻璃載玻片上。順序加入靶蛋白(分析物)和鄰近探針對，該鄰近探針對共軛包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)和六個(gè)核苷酸條碼基序的核酸域。在形成分析物-探針復(fù)合物之后，使用識別發(fā)夾結(jié)構(gòu)中特定序列的切口酶。解折疊寡核苷酸，如果鄰近存在，則能夠形成環(huán)狀DNA分子。然后，固定在固體載體上的寡核苷酸充當(dāng)滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)的引物。在一小時(shí)之內(nèi)，DNA環(huán)擴(kuò)增至高達(dá)約1000個(gè)拷貝。RCA產(chǎn)物保持連接玻璃載玻片。在與測序引物雜交之后，通過連續(xù)引入用不同熒光團(tuán)標(biāo)記的核苷酸重新編碼位于測序引物結(jié)合位下游的條碼序列。熒光信號的檢測對應(yīng)于分析物的存在。
[0342]方法&材料
[0343]在玻璃載玻片上的抗體固定
[0344]將胺修飾的寡核苷酸(biomers)印跡在TRIDIATM codelink載玻片(SurModics)上。每個(gè)載玻片印跡14個(gè)20x20特征的子陣列。陣列印跡和阻斷方案為由Ericsson等人描述的。在使用之前，將Secure Seal 16 (Grace Bio-labs)連接至載玻片。將40 μ I的50ηΜ俘獲共軛物加入到各個(gè)反應(yīng)室中，并且在4°C下培養(yǎng)過夜。接著，用Iml的Ix PBS輕輕地吹掃各孔，并干燥。在通過連接方法固定中(圖21a)，加入40 μ I的連接混合物(如之前描述的)，并且在37°C下培養(yǎng)10分鐘，之后干燥。此后，將玻璃載玻片貯存在4°C下，備用于 PLA。
[0345]玻璃載玻片上的PLA
[0346]通過用PLA緩沖液將抗原稀釋至有用的濃度制備樣品。向每個(gè)反應(yīng)室加入40 μ 1，并在37°C下培養(yǎng)1.5小時(shí)。用2ml的2x PBS輕輕地吹掃各孔，并干燥。接著，加入40 μ l的包含5nΜ每個(gè)鄰近 探針的PLA探針混合物，并且在37°C下再培養(yǎng)1.5小時(shí)。然后，洗滌各孔，加入40 μ l的切口混合物(lx NEB緩沖液(New England Biolabs)、0.1μ g/ μl純化的 BSA(New England Biolabs)、0.5 單位的 Nb.BtsI (New England Biolabs)),并在 37°C下培養(yǎng)30分鐘。在洗滌之后。加入40 μl的連接混合物(lx PCR緩沖液(Invitrogen)、
2.5mM MgCl2 (Invitrogen)，1 單位的 T4DNA 連接酶(Fermentas)、IOOnM 的兩個(gè)夾板寡核苷酸和0.08mM的ATP (Fermentas))，并在37 °C下培養(yǎng)10分鐘。洗滌各孔，之后加入40 μ I 的 UNG 混合物(lx PCR 緩沖液(Invitrogen)、2.5mM 的 MgCl2 (Invitrogen)、I 單位的UNG(Fermentas))。在37°C下培養(yǎng)5分鐘之后，洗滌各孔，用40 μ I的RCA混合物Ix phi29 緩沖液(Fermentas)、0.5 μ g/ μ I 純化的 BSA (New England Biolabs)、0.2mM 的dNTPs (Fermentas)、6 單位的 phi29 (Fermentas))重構(gòu)。在 37°C下，進(jìn)行 RCA 反應(yīng) 60 分鐘。
[0347]通過測序讀數(shù)
[0348]在37°C下進(jìn)行Ih RCA反應(yīng)之后，洗滌各孔，加入包含IOOnM的序列引物和Ix雜交緩沖液的雜交混合物。在37°C下培養(yǎng)玻璃載玻片30分鐘。之后，用Ix結(jié)合緩沖液(Illumina)平衡各孔。將各孔干燥，加入40μ1的結(jié)合混合物(Illumina),并在55 °C下培養(yǎng)10分鐘。最后，洗滌各孔，并再次干燥。加入封固劑，用蓋玻片蓋上玻璃載玻片，準(zhǔn)備在顯微鏡下觀察。用BlobFinder分析顯微圖像，并對斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。
[0349]實(shí)施例3
[0350]用于具有單分子分辨率的RNA檢測的解折疊探針
[0351]感興趣的RNA作為一組三個(gè)寡核苷酸的靶標(biāo)，并轉(zhuǎn)化到環(huán)狀DNA報(bào)導(dǎo)體分子中(圖23a)。寡核苷酸探針包括與靶RNA區(qū)域互補(bǔ)的序列，側(cè)接可以通過尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)除去尿嘧啶堿基和在堿性位點(diǎn)被核酸內(nèi)切酶例如EndoIV或Fpg裂解而解折疊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在三個(gè)解折疊探針中，一個(gè)攜帶可以雜交環(huán)化成第二探針的寡核苷酸，并且第三探針充當(dāng)RCA的引物，在37°C下I小時(shí)之后得到1000個(gè)環(huán)狀DNA的拷貝。然后，可以通過雜交熒光標(biāo)記的檢測寡核苷酸使RCA產(chǎn)物顯影。
[0352]方法&材料
[0353]解折疊探針的目標(biāo)識別
[0354]使用在雜交緩沖液(150mM的NaCl、5mM的EDTA、lx PBS和0.05%的吐溫20)的60nM的三個(gè)解折疊探針培養(yǎng)20nM合成DNA模板。然后，用雜交緩沖液將寡核苷酸混合物稀釋100倍。在室溫下，將50 μ I的稀釋混合物鋪開在聚L-賴氨酸-涂層的顯微鏡載玻片(Sigma-Aldrich)上，在RT下用時(shí)約15分鐘，該顯微鏡載玻片連接secure_Seal8 (GraceBio-labs)。將載玻片在IXPBS中洗滌，并且在乙醇系列之后干燥。
[0355]向各孔中加入50 μ I的UNG混合物(lx PCR緩沖液(Invitrogen)、2.5mM的MgCl2 (Invitrogen)、1 單位的 UNG(Fermentas)、1 單位的 EndoIV(New England Biolabs))。在37 °C下培養(yǎng)30分鐘之后，洗滌和干燥，加入50 μ I的連接混合物(lx PCR緩沖液r (Invitrogen) >2.5mM 的 MgCl2(Invitrogen)、Iunit 的 T4DNA 連接酶(Fermentas)和0.08mM的ATP (Fermentas))。將連接反應(yīng)物在37°C下培養(yǎng)30分鐘，接著在I XPBS中洗滌，并加入 50 μ I 的 RCA 混合物(lx phi29 緩沖液(Fermentas)、0.5 μ g/ μ I 純化的 BSA (NewEngland Biolabs)、0.2mM 的 dNTPs (Fermentas)、6 單位的 phi29 (Fermentas))。在 37°C下進(jìn)行RCA反應(yīng)60分鐘。
[0356]通過雜交IOnM熒光標(biāo)記的探針，在37°C下培養(yǎng)15分鐘，接著在I XPBS和乙醇系列中洗漆，使RCA產(chǎn)物顯影。此后,旋轉(zhuǎn)干燥載玻片,用約10μ I的VectaShield(Immunkemi)和蓋玻片固定，并成像。用BlobFinder分析顯微圖像，并計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。
[0357]實(shí)施例4
[0358]用于測量單獨(dú)的核酸和蛋白質(zhì)分子并使其成像的解折疊鄰近連接分析
[0359]將使用兩個(gè)或三個(gè)親和試劑的鄰近連接分析物加入到包括靶核酸分子或蛋白質(zhì)分子的生物樣品中。在同步靶結(jié)合時(shí)，使探針進(jìn)行酶“解折疊”以顯示互相互補(bǔ)序列，其引發(fā)一系列反應(yīng)，即雜交、連接和啟動RCA-局部擴(kuò)增。結(jié)果證實(shí)這提供了一種在各種環(huán)境中對核酸或蛋白質(zhì)的快速有效、靈敏的多重檢測。
[0360]每個(gè)探針組由三個(gè)雙功能試劑組成，即U鎖式(UPadlock)( 一種包括核酸域的鄰近探針，其折疊產(chǎn)生兩個(gè)部分雜交的單鏈核酸分子的，其中一個(gè)核酸鏈包括保持雜交至連接分析物-結(jié)合域的母體核酸鏈的一部分的中間區(qū)域，其中所述鏈可以參與分子內(nèi)連接以產(chǎn)生環(huán)狀寡核苷酸)、u隔板(uSplint)( —種包括核酸域的鄰近探針，其解折疊產(chǎn)生能夠作為解折疊uPadlock的連接模板的連接模板)和u引物(uPrimer)( 一種包括核酸域的鄰近探針，其解折疊產(chǎn)生能夠擴(kuò)增uPadlock的環(huán)化核酸的引物)(圖24a和e)。每個(gè)試劑都具有分析物-結(jié)合域，其起識別靶核酸或蛋白質(zhì)分子的作用，和一個(gè)報(bào)導(dǎo)體區(qū)域，當(dāng)加入酶時(shí)其有助于信號放大。親和力區(qū)域設(shè)計(jì)用于識別特定靶分子，例如用于檢測DNA或RNA分子或使用蛋白質(zhì)檢測的抗體的互補(bǔ)核苷酸序列。報(bào)導(dǎo)體區(qū)域折疊成發(fā)夾-環(huán)核酸結(jié)構(gòu)，在一組探針內(nèi)各自起不同作用。uPadlock包括與uSplint互補(bǔ)的兩個(gè)基序,和與uPrimer互補(bǔ)的一個(gè)基序。uSplint和uPrimer各自包括在其發(fā)夾莖專用的基序,其與uPadlock互補(bǔ)，設(shè)計(jì)使得它們在探針結(jié)合它們的靶標(biāo)之后可以經(jīng)由酶消化而得到單鏈。
[0361]在目標(biāo)識別之后，接著進(jìn)行酶消化，誘導(dǎo)所有的核酸發(fā)夾結(jié)構(gòu)解折疊。這引起uPadlock釋放一個(gè)DNA鏈,其中間區(qū)域保持與連接親和試劑的母體鏈雜交。現(xiàn)在，鎖式探針的游離鏈的兩個(gè)末端可以雜交uSplint的暴露基序,而解折疊的uPrimer堿基對雜交鎖式探針的另一片段(圖24b)。接著，由DNA連接酶結(jié)合鎖式探針的末端(圖24c)。然后，通過由uPrimer引發(fā)的RCA擴(kuò)增環(huán)化的DNA報(bào)導(dǎo)體。在培養(yǎng)I小時(shí)之后，每個(gè)RCA產(chǎn)物包括高達(dá)1000個(gè)環(huán)化探針的交聯(lián)體互補(bǔ)物。這一長DNA鏈形成具有直徑至多I μ m的無規(guī)卷曲，位于uPrimer的結(jié)合位點(diǎn)(圖24d)。針對雜交RCA產(chǎn)物的寡核苷酸，可以通過各種手段，例如經(jīng)由雜交熒光標(biāo)記的檢測寡核苷酸連接熒光標(biāo)記的短DNA標(biāo)記或聚合酶-輔助結(jié)合突光標(biāo)記的核苷酸，在突光顯微鏡下鑒定形成的RCA產(chǎn)物。
`[0362]材料和方法
[0363]設(shè)計(jì)uPLA探針
[0364]用于DNA和mRNA檢測的uPLA(解折疊鄰近連接分析)探針的序列顯示在表1中。靶向mRNA的親和區(qū)域設(shè)計(jì)為具有雜交片段，其具有的Tm為約60°C，最佳尺寸為約20個(gè)核苷酸，最小不需要的二級結(jié)構(gòu)，和與無關(guān)基因組序列的相似性最小。最初，使用引物 3 (http://frod0.w1.mit.edu/primer3/)和針對人類基因組的"blasted" (http://genome, ucsc.edu/cg1-bin/hgBlat)設(shè)計(jì)該序列。用于蛋白質(zhì)檢測的uPLA探針的報(bào)導(dǎo)體區(qū)域顯示在表2中。經(jīng)由雙功能接頭Sulfo-SMCC用硫醇基在共軛抗體的一個(gè)末端修飾寡核苷酸(表3)。所有的DNA探針都購自Integrated DNA Technologies (IDT)，抗體都購自R&D Systems。
[0365]采用uPLA探針探測合成DNA
[0366]將50 μ 120ρΜ的生物素化合成DNA模板加入到在IxPBS中的鏈霉親和素-涂層的Codelink 載玻片(SurModics)，并在 37°C下培養(yǎng) 15 分鐘。在含有 0.05%Tween20 的 IxPBS中洗滌兩次之后，將50 μ I探針混合物(包含在IxPBS中的5pmol每個(gè)uPLA探針)加入到載玻片，在37°C下培養(yǎng)30分鐘。在含有0.05%Tween20的IxPBS中洗滌兩次之后，向細(xì)胞中加入包含在Ix解折疊緩沖液(MutY緩沖液)中的5U尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)(Fermentas)、5U EndoIV(Fermentas)、1 μ g/μ I 的 BSA 的 50 μ I uPLA 探針混合物，并在37°C下培養(yǎng)30分鐘。然后加入50 μ I的連接混合物(lx PCR緩沖液(Invitrogen)、2.5mM的 MgCl2 (Invitrogen)、1 單位的 T4DNA連接酶(Fermentas)和 0.08mM 的 ATP (Fermentas))。在37°C下培養(yǎng)連接反應(yīng)物30分鐘，接著在IXPBS中洗滌，加入50 μ I的RCA混合物(Ixphi29 緩沖液(Fermentas)、0.5 μ g/μ I 純化的 BSA(New England Biolabs)、0.2mM 的dNTPs (Fermentas)、6 單位的 phi29 (Fermentas))。在 37°C下進(jìn)行 RCA 反應(yīng) 60 分鐘。接著，通過用IOnM熒光標(biāo)記的探針雜交，在37°C下培養(yǎng)15分鐘，接著在I XPBS和乙醇系列中洗漆來顯影RCA產(chǎn)物。此后,旋轉(zhuǎn)干燥載玻片,用~10 μ I的VectaShield(Immunkemi)和蓋玻片固定，并成像。
[0367]細(xì)胞培養(yǎng)物和制備
[0368]在補(bǔ)充有2mM的L-谷氨酰胺(Gibco)、10%FBS (Sigma)和I X青霉素鏈霉素(PEST, Sigma)的RPMI培養(yǎng)介質(zhì)(Sigma)中培養(yǎng)細(xì)胞系K562BV173和SK0V3。在不含酚紅和L-谷氨酰胺(Gibco)的、補(bǔ)充有10%FBS(Sigma)、lX非必需氨基酸(Gibco)和IXPEST(Sigma)的 MEM 中培養(yǎng) BJhTERT 細(xì)胞。以 1500g，將 BV173 細(xì)胞連接在 SupefrostPlus Gold 載玻片上(Thermo Scientif ic) 5 分鐘。將 K562、SK0V3 和 BJhTERT 細(xì)胞接種在載玻片上，并使其連接和展開至期望的融合。然后，在室溫下，將細(xì)胞固定在PBS中的3%(w/V)低聚甲醛(Sigma)中30分鐘。在固定之后，在DEPC-處理的PBS中洗滌載玻片兩次，并且在使用之前貯存在4°C下的70%乙醇中至少8小時(shí)。
[0369]采用uPLA 探針探測mRNA
[0370]在70°C下，用50 μ I的2XSSC(300mM的NaCl、30mM的檸檬酸鈉)、50%的甲酰胺(Sigma)、5U RNase抑制劑(Fermentas)培養(yǎng)在載玻片上生長的固定細(xì)胞10分鐘。在95°C下加入20pmol的每種探針90s,然后通過在benchtop上，在10 μ I的400mM的NaCl、50mM的NaHP04中30分鐘驟冷使其冷卻至室溫。接著，向細(xì)胞中加入50 μ I的探針混合物，所述探針混合物包含2 X SSC、5URNase抑制劑、0.5 μ g/ μ I的鮭魚精DNA (Invitrogen)、10%甲酰胺、0.2 μ g/μ I的BSA (NEB)、5%的硫酸葡聚糖(Invitrogen)和5pmol的每種uPLA探針,并在37°C下培養(yǎng)3-4小時(shí)。在用50μ I的2XSSC、10%甲酰胺洗滌兩次之后，向細(xì)胞中加入50 μ I的解折疊混合物，并在37°C下培養(yǎng)30分鐘，所述解折疊混合物包含在IX解折疊緩沖液(MutY buffer)中的 5U 的 UNG(Fermentas)、5U 的 EndoIV (Fermentas)、5U 的 RNase 抑制劑、I μ g/ μ I的BSA。在用50 μ I的I XDEPC-PBS、0.05%吐溫20洗滌兩次之后，向細(xì)胞中加入50 μ I的連接混合物,所述連接混合物包含在I XAmpligase緩沖液(Epicenter)中的12.5U 的 Ampligase(Epicenter)、5U 的 RNase 抑制劑、20% 的甲酰胺、50mM 的 KC1、0.2μ g/μ I的BSA，并在45 V下培養(yǎng)45分鐘。此后，通過加入50 μ I的RCA混合物進(jìn)行RCA，所述RCA混合物包含在lXphi29緩沖液(Fermentas)中的25U的phi29DNA聚合酶(Fermentas)、5U的 RNase 抑制劑、5% 的甘油(Invitrogen)、250nM 的 dNTP(Fermentas)、0.2 μ g/μ I 的 BSA,并在37°C下培養(yǎng)I小時(shí)。在用50μ I的1XDEPC-PBS、0.05%吐溫20洗滌兩次之后，向細(xì)胞中加入50 μ I的檢測混合物，該檢測混合物包含在2 X SSC中的5pmol檢測寡核苷酸、20%的甲酰胺，并在37°C下培養(yǎng)20分鐘，接著在50 μ I的I X DEPC-PBS、0.05%吐溫20中洗滌兩次，并在乙醇系列中干燥。此后，旋轉(zhuǎn)干燥載玻片，用~20 μ I的包含100ng/mL DAPI的VectaShield (Immunkemi)和 25 X 40mm 蓋玻片固定，并成像。
[0371]抗體固定在載玻片上
[0372]將胺修飾的寡核苷酸(Biomers)印跡在TRIDIATM codelink載玻片(SurModics)上。每個(gè)載玻片印跡14個(gè)20x20特征的子陣列。在使用之前,將Secure Seal 16 (GraceBio-labs)連接至載玻片。將40μ I的50nM俘獲共軛物(共軛至寡核苷酸的抗體，其能夠雜交載玻片上印跡的胺修飾的寡核苷酸)加入到各個(gè)反應(yīng)室中，并且在1XPBS、0.1%BSA(Sigma)中4°C下培養(yǎng)過夜。接著，用Iml的I XPBS輕輕地吹掃各孔，并干燥。
[0373]采用uPLA探針探測蛋白質(zhì)
[0374]通過用PLA 緩沖液(0.1%BSA (Sigma)、5mM 的 EDTA、IOOnM 的山羊 IgG (Sigma)、10 μ g/μ I 的鮭魚精 DNA (Invitrogen)、0.05% 的 Tween20 (Sigma)和 I X PBS)稀釋各自或總共為InM的重組蛋白、GDF15(957-GD-025, R&D),小鼠IgG (15381，Sigma)和PSA(1344-SE，R&D)制備樣品。向各反應(yīng)室中加入40 μ 1，并且在37°C下培養(yǎng)1.5小時(shí)。用Iml的I XPBS吹掃各孔，并干燥。接著，加入40 μ I的包含5ηΜ的三個(gè)探針對的PLA探針混合物，并在37°C下再培養(yǎng)1.5小時(shí)。然后，洗滌各孔，并根據(jù)在用于檢測合成DNA的uPLA探針中描述的步驟使探針消化、連接和擴(kuò)增。
[0375]經(jīng)由RCA產(chǎn)物的測序原位讀數(shù)
[0376]在37°C下RCA反應(yīng)I小時(shí)時(shí)，洗滌各孔，并加入40 μ I包含IOOnM的序列引物和IX雜交緩沖液的雜交混合物。在37°C下，培養(yǎng)玻璃載玻片30分鐘。此后，用IX結(jié)合緩沖液(Illumina)使各孔平衡。干燥各孔，加入40 μ I的結(jié)合混合物(Illumina),并在55°C下培養(yǎng)10分鐘。最后，洗滌各孔，并再次干燥。加入封固劑，用蓋玻片蓋住玻璃載玻片，接著在顯微鏡觀察。
[0377]結(jié)果
[0378]解折疊的PLA探針靶向固定在玻璃載玻片上的合成DNA模板分子?？蓹z測熒光點(diǎn)的出現(xiàn)顯然取決于模板的結(jié)合存在和解折疊反應(yīng)所需的酶(圖24f-h。為了評估使用三個(gè)而不是兩個(gè)探針的相對優(yōu)點(diǎn)，我們還設(shè)計(jì)了一套方案，其中由足夠產(chǎn)生信號的兩個(gè)探針進(jìn)行同步檢測。在這些實(shí)驗(yàn)中，一起使用uPadlock與另一種試劑，該試劑在解折疊之后可以通過作為連接的夾板和RCA的引物該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示當(dāng)使用三個(gè)而不是兩個(gè)探針時(shí)信噪比增強(qiáng)。
[0379]接著，我們通過原位直接靶向單獨(dú)的mRNA分子在生物系統(tǒng)中測試我們的探針。我們首先設(shè)計(jì)一組針對癌癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄本HER2特異性的三個(gè)探針，并將其應(yīng)用于兩個(gè)細(xì)胞系:人卵巢癌細(xì)胞系SK0V3和TERT-無限增殖的成纖維細(xì)胞(BJhTERT)。在SK0V3細(xì)胞(圖25a)觀察到信號(圓形)，而在BJhTERT細(xì)胞中沒有觀察到信號(圖25b)。
[0380]為了進(jìn)一步評估我們的探針的特異性，我們靶向稱為b3a2BCR_ABL融合轉(zhuǎn)錄本的變體，所述b3a2存在于人類紅細(xì)胞成髓細(xì)胞(erythromyeloblastoid)白血病細(xì)胞系K562中。人白血病細(xì)胞系BV173表達(dá)稱為b2a2的BCR-ABL融合轉(zhuǎn)錄本的另一個(gè)變體。我們設(shè)計(jì)uPrimer和uSplint祀向兩個(gè)融合變體中的兩個(gè)共用區(qū)域,和對b3a2中獨(dú)特?cái)帱c(diǎn)特異性的uPadlock，其在轉(zhuǎn)錄本b2a2中不存在。正如所料，在K562中觀察到可檢測水平的信號(圓形)，而在BV173中沒有觀察到信號(圖25d)。
[0381]uPLA探針提供自身用于代表幾個(gè)不同靶標(biāo)的單分子的并行檢測。我們研究了同時(shí)分析三種純化的蛋白質(zhì)的測定:生長分化因子(GDF)-15、前列腺-特異性抗原(PSA)和小鼠免疫球蛋白(IgG)，稀釋在緩沖液中。我們設(shè)計(jì)了三組探針，其均包括在uPadlock探針報(bào)導(dǎo)體區(qū)域中的6-nt標(biāo)記序列。對于每組探針，uPadlock和uSplint探針的報(bào)導(dǎo)體區(qū)域共價(jià)共軛不同等分試樣的同批多克隆抗體，所述多克隆抗體對于靶蛋白具有特異性。其它等分試樣的多克隆抗體也共軛固定在玻璃載玻片上的寡核苷酸，并且使uPrimers的親和區(qū)域雜交這些固定的DNA鏈。
[0382]首先，用固定在載玻片上的具有連接的UPrimer的抗體俘獲蛋白質(zhì)。在洗滌之后，加入uPadlock和uSplint探針,接著重新開始洗漆。接著，通過酶消化解折疊探針，隨后環(huán)化并由固定的引物進(jìn)行鎖式探針的RCA擴(kuò)增。最后，通過使用合成法進(jìn)行DNA測序的原理，解碼標(biāo)記序列的第一個(gè)核苷酸鑒定代表檢測蛋白質(zhì)分子的RCA產(chǎn)物(圖)。實(shí)驗(yàn)通過單獨(dú)的RCA產(chǎn)物的原位測序(一種可用于區(qū)分大量檢測的蛋白質(zhì)的技術(shù))，證實(shí)了檢測單獨(dú)的蛋白質(zhì)分子的可能性。[0383]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測樣品中分析物的方法，所述方法包括使用至少一組的至少第一和第二鄰近探針，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合所述分析物，其中至少一個(gè)所述鄰近探針的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過裂解所述核酸域而解折疊產(chǎn)生與所述樣品中另一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的至少一個(gè)可連接游離末端或游離區(qū)域，其中當(dāng)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，解折疊所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)允許所述至少第一和第二鄰近探針的核酸域直接地或間接地相互作用。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一和第二鄰近探針的核酸域在解折疊之后互相互補(bǔ)或與共用模板互補(bǔ)。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述核酸域通過雜交和/或連接而相互作用。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，包括: a)用至少一組的至少第一和第二鄰近探針接觸所述樣品，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合所述分析物，其中所述鄰近探針的至少第一個(gè)的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過裂解所述核酸域而解折疊產(chǎn)生至少一個(gè)可連接游離末端，其中當(dāng)所述探針結(jié)合所述分析物時(shí)，所述至少一個(gè)可連接游離末端能夠與所述第二鄰近探針的核酸域相互作用； (b)使所述至少一個(gè)可連接游離末端直接地或間接地連接鄰近探針的核酸域；和 (C)檢測所述連接。
5.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，包括: a)用至少一組的至少第一和第二鄰近探針接觸所述樣品，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合所述分析物，其中所述鄰近探針的至少第一個(gè)核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過裂解所述核酸域而解折疊產(chǎn)生與所述樣品中核酸分子互補(bǔ)的至少一個(gè)區(qū)域，所述互補(bǔ)的至少一個(gè)區(qū)域是至少能夠雜交所述第二鄰近探針的核酸域的連接模板，其中當(dāng)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，第二鄰近探針的核酸域可利用所述第一鄰近探針的所述雜交的連接模板介導(dǎo)的相互作用連接至鄰近探針的核酸域； (b)用鄰近探針的核酸域直接地或間接地連接所述第二鄰近探針的核酸域；和 (C)檢測所述連接。
6.權(quán)利要求4或5所述的方法，其中步驟(b)中的連接是分子間連接或分子內(nèi)連接。
7.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，包括: a)用至少一組的至少第一和第二鄰近探針接觸所述樣品，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合所述分析物，其中所述鄰近探針的至少第一個(gè)的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過裂解所述核酸域而解折疊產(chǎn)生與所述樣品中核酸分子互補(bǔ)的至少一個(gè)區(qū)域，所述互補(bǔ)的至少一個(gè)區(qū)域是能夠直接地或間接地雜交所述第二鄰近探針的核酸域的引物，其中當(dāng)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，第二鄰近探針的核酸域是用于所述第一鄰近探針的核酸域延伸的模板； (b)延伸所述第一鄰近探針的核酸域；和 (C)檢測所述核酸延伸產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)解折疊釋放兩個(gè)游離末端，5’和3’端，其都能夠與樣品中的其它核酸分子相互作用。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中樣品中的所述其它核酸分子是其它鄰近探針的核酸域。
10.權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述游離末端雜交一個(gè)或多個(gè)連接模板，該連接模板充當(dāng)游離末端彼此直接地或間接地連接的模板。
11.權(quán)利要求1至6和8至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可連接的核酸域的末端雜交彼此直接相鄰的連接模板。
12.權(quán)利要求1至6和8至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中可連接的核酸域的末端雜交連接模板，之間具有間隔。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中可連接的核酸域的末端之間的間隔被間隔寡核苷酸所填充，使得每個(gè)可連接的末端連接間隔寡核苷酸的一個(gè)末端。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中在連接反應(yīng)之前，通過使用連接模板作為延伸模板將游離3’末端延伸，填充可連接的核酸域末端之間的間隔。
15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中第一和第二鄰近探針的核酸域均包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中通過裂解核酸域來實(shí)現(xiàn)每個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的解折疊。
17.權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中裂解發(fā)生的位點(diǎn)位于核酸域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中。
18.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中裂解是酶催化裂解。
19.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括能夠裂解核酸分子的一種或多種酶可識別的裂解識別位點(diǎn)。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述一種或多種酶是切口酶或限制性核酸內(nèi)切酶。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中將所述切口酶從所述分析移除或在解折疊鄰近探針的核酸域之后失活。
22.權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶催化裂解包括尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)與能夠識別雙鏈DNA的脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)的核酸內(nèi)切酶的組合。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中能夠識別雙鏈DNA的脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)的核酸內(nèi)切酶是核酸內(nèi)切酶IV。
24.權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中對于檢測兩種或多種分析物，使用兩組或多組的至少第一和第二鄰近探針。
25.喇叭探針，其為一種寡核苷酸，包括: (i)第一域，其包括與第一目標(biāo)序列互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，其中所述第一互補(bǔ)區(qū)域位于寡核苷酸的5’末端，互補(bǔ)的第二區(qū)域位于寡核苷酸的3’末端，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)域雜交第一個(gè)目標(biāo)序列，使得5’和3’末端是直接地或間接地可連接的； (?)第二域，其包括與第二目標(biāo)序列互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)域，其中至少一個(gè)所述互補(bǔ)區(qū)域的至少一部分與寡核苷酸之內(nèi)的序列互補(bǔ)，使得其形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一部分，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)抑制所述互補(bǔ)區(qū)域雜交第二目標(biāo)序列，并且所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括可裂解位點(diǎn)； 其中當(dāng)裂解而解折疊所述發(fā)夾時(shí)，第二域的互補(bǔ)區(qū)域能夠雜交第二目標(biāo)序列，使得5’和3’末端直接地或間接地可連接。
26.權(quán)利要求25所述的喇叭探針，其中所述裂解為如在權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)所定義的。
27.權(quán)利要求25或26所述的喇叭探針，其中第一和/或第二域的互補(bǔ)區(qū)域雜交其各自的靶點(diǎn)，使得所述域的末端為如權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)定義的。
28.權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)所述的喇叭探針，其中所述探針包括兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
29.如在權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)所定義的至少一個(gè)喇叭探針在檢測樣品中核酸分析物中的用途，其中所述核酸分析物為至少部分單鏈的。
30.一種檢測樣品中部分單鏈核酸分析物的方法，包括: a)用如權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)定義的至少一個(gè)喇叭探針接觸所述樣品； (b)當(dāng)至少一個(gè)喇機(jī)探針結(jié)合所述分析物時(shí)，直接地或間接地連接所述第一域的第一和第二互補(bǔ)區(qū)域； (C)當(dāng)至少一個(gè)喇叭探針結(jié)合所述分析物時(shí)，通過裂解而解折疊第二域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)且直接地或間接地連接第二域的第一和第二互補(bǔ)區(qū)域；和 (d)檢測所述連接。
31.權(quán)利要求29的用途或權(quán)利要求30的方法，其中所述至少部分單鏈核酸分析物包括分別與喇叭探針的第一和第二域互補(bǔ)的第一目標(biāo)序列和第二目標(biāo)序列。
32.權(quán)利要求29的用途或權(quán)利要求30至31的方法，其中用至少兩個(gè)喇叭探針接觸樣品，并且所述至少部分單鏈核酸分析物包括至少與每個(gè)喇叭探針的第一域互補(bǔ)的第一目標(biāo)序列。
33.權(quán)利要求29、31或32中任一項(xiàng)的用途或權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸分析物是完全單鏈的。
34.解折疊鄰近探針，包括偶聯(lián)核酸域的分析物-結(jié)合域，其中所述核酸域包括: (i)至少一個(gè)與目標(biāo)序列互補(bǔ)的區(qū)域；和 (?)自身互補(bǔ)的區(qū)域，使得其形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)抑制所述至少一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域雜交目標(biāo)序列； 其中所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括可裂解位點(diǎn)，且通過裂解所述位點(diǎn)解折疊該發(fā)夾結(jié)構(gòu)獲得部分雙鏈核酸域，其包括游離5’和3’末端且能夠使核酸域的所述至少一個(gè)互補(bǔ)區(qū)域雜交目標(biāo)序列。
35.權(quán)利要求34所述的解折疊鄰近探針，其中所述分析物-結(jié)合域與核酸不同。
36.權(quán)利要求34或35所述的解折疊鄰近探針，其中所述裂解為如在權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)所定義的。
37.權(quán)利要求34至36中任一項(xiàng)所述的解折疊鄰近探針，其中所述目標(biāo)序列包括連接模板的一部分。
38.權(quán)利要求37所述的解折疊鄰近探針，其中所述連接模板是鄰近探針的核酸域形式。
39.權(quán)利要求37所述的解折疊鄰近探針，其中所述連接模板是游離寡核苷酸。
40.權(quán)利要求34至39中任一項(xiàng)所述的解折疊鄰近探針，其中所述部分雙鏈核酸域的游離5’和3’末端可以直接地或間接地連接形成環(huán)狀寡核苷酸。
41.權(quán)利要求34至39中任一項(xiàng)所述的解折疊鄰近探針，其中所述部分雙鏈核酸域的5’末端可以直接地或間接地連接其它鄰近探針的核酸域的3’末端。
42.權(quán)利要求34至39中任一項(xiàng)所述的解折疊鄰近探針，其中所述部分雙鏈核酸域的3’末端可以直接地或間接地連接其它鄰近探針的核酸域的5’末端。
43.權(quán)利要求40至42中任一項(xiàng)所述的解折疊鄰近探針，其中所述部分雙鏈核酸域的游離5’和3’末端雜交至其各自靶點(diǎn)，使得域的末端為如在權(quán)利要求10至14的任一項(xiàng)所定義的。
44.權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)的鄰近探針為如在權(quán)利要求25至28或34至43的任一項(xiàng)中定義的。
45.在檢測樣品中分析物的方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包括: (a)至少一組的至少第一和第二鄰近探針，其中探針各自包含分析物-結(jié)合域和核酸域且可以同時(shí)直接地或間接地結(jié)合所述分析物，其中至少一個(gè)所述鄰近探針的核酸域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以被裂解產(chǎn)生至少一個(gè)可連接游離末端或與所述樣品中另一個(gè)核酸分子互補(bǔ)的區(qū)域，其允許所述至少第一和第二鄰近探針的核酸域直接地或間接地相互作用； (b)任選地，調(diào)節(jié)所述第一和第二鄰近探針的核苷酸之間相互作用的工具(例如，連接模板寡核苷酸和/或連接酶)； (C)任選地，解折疊至少一個(gè)包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)的鄰近探針的工具(例如，酶催化工具，t匕如切口酶、限制性核酸內(nèi)切酶或尿嘧啶-DNA糖基化酶和核酸內(nèi)切酶，例如核酸內(nèi)切酶IV)；和 (d)任選地，用于檢測所述相互作用的工具。
【文檔編號】C12Q1/68GK103703145SQ201280034685
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月11日
【發(fā)明者】烏爾夫·蘭德格倫, 瑞琪兒·元·農(nóng), 歐拉·索德伯格, 艾琳·魏貝雷希特 申請人:歐凌科公司