在植物中產(chǎn)生狂犬病病毒樣顆粒的制作方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生病毒樣顆粒(virus?like?particle，VLP)的方法。所述方法包括將第一核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中。所述第一核酸包含第一調(diào)節(jié)區(qū)，所述第一調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可操作地相連接。所述核苷酸序列還可包含一種或多于一種擴(kuò)增元件。任選地，可將第二核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中。所述第二核酸包含第二調(diào)節(jié)區(qū)，所述第二調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼基質(zhì)蛋白(例如但不限于狂犬病基質(zhì)蛋白)的核苷酸序列可操作地相連接。在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或所述植物的一部分，從而產(chǎn)生所述VLP?！緦?zhuān)利說(shuō)明】在植物中產(chǎn)生狂犬病病毒樣顆?！?br>技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及在植物中產(chǎn)生天然病毒蛋白質(zhì)。更具體地，本發(fā)明還涉及在植物中產(chǎn)生包含天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的病毒樣顆粒?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]疫苗接種通過(guò)誘導(dǎo)對(duì)象在感染前進(jìn)行防御來(lái)提供針對(duì)由感染性病原體(agent)所導(dǎo)致之疾病的保護(hù)。常規(guī)地，這通過(guò)使用作為免疫原的感染性病原體(infectiousagent)的活的減毒形式或完整的滅活形式來(lái)完成。為了避免使用完整的病毒(例如死病毒或減毒病毒)作為疫苗的危險(xiǎn)，將重組病毒蛋白質(zhì)(例如亞單位)用作疫苗。肽疫苗和亞單位疫苗均受到許多潛在的限制。亞單位疫苗可展現(xiàn)出較差的免疫原性(由于不正確折疊)、較差的抗原呈遞或者糖類(lèi)和脂質(zhì)組成的差異。主要的問(wèn)題是很難確保經(jīng)改造蛋白質(zhì)的構(gòu)象模仿該抗原在其自然環(huán)境中的構(gòu)象。必須使用合適的佐劑和(在肽的情況中)載體蛋白質(zhì)以加強(qiáng)免疫應(yīng)答。另外，這些疫苗主要引起體液應(yīng)答，因此可能無(wú)法引發(fā)有效的免疫。亞單位疫苗對(duì)于疾病常常是無(wú)效的，但可證明完整的滅活病毒提供對(duì)所述疾病的保護(hù)。[0003]病毒樣顆粒(virus-likeparticle,VLP)對(duì)于免疫原性組合物的內(nèi)含物而言是潛在的候選物。VLP與成熟的病毒體非常類(lèi)似，但是它們不含有病毒基因組物質(zhì)。因此，VLP本身是非復(fù)制性的，這使得它們作為疫苗施用是安全的。另外，可將VLP改造以在VLP的表面上表達(dá)病毒糖蛋白，這是它們最天然的生理構(gòu)型。此外，由于VLP類(lèi)似完整的病毒體并且是多價(jià)的微粒結(jié)構(gòu)，所以VLP在誘導(dǎo)針對(duì)糖蛋白的中和抗體中可比可溶性包膜蛋白抗原更有效。[0004]到目前為止，已經(jīng)產(chǎn)生了用于感染人和其他動(dòng)物的超過(guò)30種不同病毒的VLP。該組最顯著的特征之一是在各個(gè)病毒之結(jié)構(gòu)的方面極其不同。其包括具有單衣殼蛋白、多衣殼蛋白的病毒，以及具有和沒(méi)有脂質(zhì)包膜的那些。[0005]對(duì)于具有脂質(zhì)包膜之病毒的VLP形成與對(duì)于具有多衣殼之病毒所產(chǎn)生的那些具有不同類(lèi)型的技術(shù)挑戰(zhàn)。對(duì)于這些病毒，表達(dá)系統(tǒng)的選擇對(duì)于VLP形成的效率可以是重要的。例如，漢坦(Hantaan)病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)容易從基于牛痘病毒的載體中形成VLP,但是VLP形成在昆蟲(chóng)細(xì)胞中則相對(duì)無(wú)效(BetenbaughM等1995,VirusRes.38,111-124)。[0006]狂犬病病毒(rabiesvirus,RV)是彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的成員。像該科的大部分成員一樣，RV為不分節(jié)負(fù)鏈RNA病毒(non-segmented,negativestrandedRNAvirus)，其基因組編碼五種病毒蛋白質(zhì):RNA依賴(lài)性RNA聚合酶(L);核蛋白(N);磷酸化蛋白質(zhì)(P);位于病毒蛋白質(zhì)包?旲內(nèi)側(cè)的基質(zhì)蛋白(M);以及外表面糖蛋白(G)。(DietzscholdB等，1991,Crit.Rev.1mmunol.10:427-439.)[0007]用于狂犬病的基于細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗局限于在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的滅活病毒株。這些疫苗包含培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒。當(dāng)前生物技術(shù)方法針對(duì)表達(dá)狂犬病病毒的外殼蛋白基因以開(kāi)發(fā)可用作活性疫苗的安全重組蛋白質(zhì)。已經(jīng)顯示在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白(Burger等，1991，JGenVirol.，F(xiàn)eb；72(Pt2):359-67)。獲得了與從病毒感染細(xì)胞分離的與G蛋白共遷移的67K的全長(zhǎng)糖基化蛋白質(zhì)。[0008]在昆蟲(chóng)細(xì)胞中狂犬病糖蛋白基因通過(guò)桿狀病毒載體的表達(dá)在感染后48小時(shí)給出了總細(xì)胞蛋白質(zhì)之18%的程度的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。PrehaudDH等(1989,Virology,Dec;173⑵:390-9)描述了將編碼CVS株之G蛋白的序列放置在AcNPV多角體蛋白(polyhedrin)啟動(dòng)子的控制下并使用草地貪夜蛾(Spodopterafugiperda)細(xì)胞系表達(dá)構(gòu)建體。由于聚糖組分的差異，昆蟲(chóng)來(lái)源的蛋白質(zhì)與野生型相比展現(xiàn)出改變的電泳遷移率。[0009]Rupprecht等(1993,Vaccine,11(9):925-8)表明，來(lái)源于經(jīng)重組桿狀病毒感染之昆蟲(chóng)細(xì)胞的糖蛋白(ERA株)在浣熊中作為口服疫苗是有效的。W0/1993/001833教導(dǎo)了在含有RNA基因組的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生病毒樣顆粒(VLP)，該基因組包含由狂犬病N蛋白和狂犬病M蛋白的鞘包圍的3'結(jié)構(gòu)域和填充結(jié)構(gòu)域(fillerdomain)。VLP還包含狂犬病G蛋白的脂質(zhì)包膜。鑒于昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的相對(duì)高成本，這些不是選擇用于作為開(kāi)發(fā)針對(duì)狂犬病之疫苗的策略的G蛋白表達(dá)的系統(tǒng)。[0010]McGarvey等(1995,Bio/Technology第13卷，第13期，第1484-1487頁(yè))描述了使用在花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus)35S/啟動(dòng)子控制下的編碼狂犬病病毒(ERA株)糖蛋白G的全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)化番茄子葉。蛋白質(zhì)在番茄中表達(dá)，并且與對(duì)于來(lái)自在BHK細(xì)胞中培養(yǎng)之病毒的G蛋白所觀察到的66kDa相比，免疫沉淀后在western印跡中表征為具有62kDa和60kDa的分子量。與天然糖蛋白相比，分子量的差異表明是由蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(蛋白酶剪切和/或經(jīng)修飾的糖基化)造成的。發(fā)現(xiàn)經(jīng)免疫沉淀的G蛋白的量為約I~10ng/mg可溶性蛋白，即可溶性蛋白的0.0001%至0.001%。可能是由于使用了較差設(shè)計(jì)的基因?qū)е碌牡捅磉_(dá)水平。例如，天然G蛋白編碼基因與其天然信號(hào)肽一起使用。[0011]通過(guò)在植物病毒表面上表達(dá)病毒表位，然后用經(jīng)重組修飾的病毒感染易感染宿主，報(bào)道了對(duì)例如水貂腸炎和狂犬病之疾病的植物來(lái)源免疫應(yīng)答(Modelska等，1998，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:2481-2485;Yusibov等，2002，Vaccine20:3155-3164)。在載體病毒表面上表達(dá)的抗原多肽的大小限于37個(gè)氨基酸，并且需要抗原的表位作圖。這種抗原的完全信息通常是不可用的，尤其是對(duì)新發(fā)現(xiàn)的疾病，其中全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的表達(dá)可以是唯一的選擇。在一些情況中，可需要多表位以對(duì)致病病毒的攻擊給出可接受的保護(hù)。另外，防護(hù)可被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)水平上的顯著問(wèn)題，尤其是當(dāng)使用環(huán)境穩(wěn)定的植物病毒(例如煙草花葉病毒(TobaccoMosaicVirus))時(shí)。[0012]W097/43428教導(dǎo)了在植物中產(chǎn)生狂犬病病毒或與所述狂犬病病毒相關(guān)之病毒的糖蛋白G的方法。構(gòu)建體包含編碼嵌合G蛋白的序列，所述嵌合G蛋白包含具有并非與病毒蛋白G天然相關(guān)之N端信號(hào)肽的成熟病毒蛋白G。糖蛋白具有約66kDa的分子量并且是高度不可溶的。需要洗滌劑(例如SDS或TritonX-100)來(lái)提取和溶解糖蛋白。作者推測(cè)，“不可溶性”糖蛋白與C端跨膜結(jié)構(gòu)域(糖蛋白羧基端的約40至60個(gè)氨基酸定位的區(qū)域)的存在有關(guān)，當(dāng)糖蛋白用作疫苗時(shí)，該結(jié)構(gòu)域?qū)ΡＷo(hù)性應(yīng)答是重要的。[0013]包膜病毒可在從經(jīng)感染細(xì)胞“出芽”時(shí)獲得其脂質(zhì)包膜，并且從質(zhì)膜獲得膜，或者從內(nèi)部細(xì)胞器的質(zhì)膜獲得膜。例如，在彈狀病毒中的裝配過(guò)程期間，N-P-L復(fù)合物封裝負(fù)鏈基因組DNA以形成RNP核心。M蛋白形成圍繞RNP的膠囊或基質(zhì)，并且RNP-M復(fù)合物遷移至包含糖蛋白插入物之質(zhì)膜的區(qū)域。M蛋白開(kāi)始卷繞，并且M-RNP復(fù)合物與糖蛋白相結(jié)合，其后完整的病毒從質(zhì)膜出芽。[0014]在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)內(nèi)，病毒從質(zhì)膜出芽是優(yōu)先的。相反，唾液腺中的病毒主要從細(xì)胞膜出芽，進(jìn)入腺泡內(nèi)腔(acinarlumen)。宿主動(dòng)物中出芽進(jìn)入唾液腺的病毒以及病毒誘導(dǎo)的侵略性咬合行為(biting-behavior)使新宿主之病毒感染的機(jī)會(huì)最大化。例如，在哺乳動(dòng)物或桿狀病毒細(xì)胞系統(tǒng)中，狂犬病病毒從質(zhì)膜出芽。已知僅有少數(shù)包膜病毒感染植物(例如，番茄偽曲頂病毒屬(Topovirus)和彈狀病毒屬(Rhabdovirus)的成員)。在已知的植物包膜病毒中，它們的特征在于從宿主細(xì)胞的內(nèi)膜出芽，而不是從質(zhì)膜出芽。然而，已在植物宿主中由質(zhì)膜產(chǎn)生了重組VLP(W02011/035422;其通過(guò)引用并入本文)。[0015]主要通過(guò)基質(zhì)(M)蛋白驅(qū)動(dòng)彈狀病毒中的組裝/出芽。M蛋白包含后期出芽結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)募集與細(xì)胞之空泡蛋白分選途徑有關(guān)的宿主蛋白質(zhì)以利于病毒-細(xì)胞分離。不希望受理論限制，認(rèn)為包膜病毒從細(xì)胞膜的出芽取決于與細(xì)胞質(zhì)病毒組分相互作用之跨膜刺突蛋白(spikeprotein)的存在。例如，用缺乏糖蛋白G或G胞質(zhì)尾區(qū)的狂犬病病毒突變體感染的細(xì)胞釋放無(wú)刺突彈狀病毒顆粒，表明病毒表面蛋白對(duì)于驅(qū)動(dòng)出芽過(guò)程不是必需的。(MebatsionT.等，1996，Cell，Mar22:84(6):941-51)。與此相反，在缺乏M蛋白的狂犬病病毒突變體內(nèi)產(chǎn)生的感染性顆粒主要是細(xì)胞相關(guān)的，并且無(wú)細(xì)胞的感染性病毒的產(chǎn)率降低了多達(dá)500，000倍。這表明了M蛋白在病毒出芽中的顯著作用。來(lái)自用缺乏M的狂犬病病毒感染之細(xì)胞的上清液包含長(zhǎng)桿狀病毒體，而不是典型的子彈狀彈狀病毒顆粒，這進(jìn)一步確證損害了病毒形成過(guò)程。與由質(zhì)粒表達(dá)的M蛋白的互補(bǔ)作用拯救了彈狀病毒形成。因此，M蛋白似乎在RNP針對(duì)質(zhì)膜的凝聚和靶向中以及在G蛋白并入出芽病毒體中發(fā)揮重要作用(MebatsionT.等，1999，JVirolJan；73(1):242-50)。[0016]發(fā)明概述[0017]本發(fā)明涉及在植物中產(chǎn)生天然病毒蛋白質(zhì)。更具體地，本發(fā)明還涉及在植物中產(chǎn)生包含天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的病毒樣顆粒。[0018]根據(jù)本發(fā)明，提供了在植物中產(chǎn)生狂犬病病毒樣顆粒(VLP)的方法(A)，其包括，[0019]a)將包含第一調(diào)節(jié)區(qū)的第一核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，所述第一調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可操作地相連接，[0020]b)在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或所述植物的一部分，從而產(chǎn)生所述狂犬病VLP。[0021]所述天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以是糖蛋白。如果所述天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白不是M蛋白，那么上述方法(A)還可包括以下步驟:[0022]c)引入包含第二調(diào)節(jié)區(qū)的第二核酸，所述第二調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼基質(zhì)蛋白的核苷酸序列可操作地相連接。[0023]第一核苷酸序列或第二核苷酸序列或者二者還可編碼、包含或者既編碼又包含一種或多于一種擴(kuò)增元件。所述一種或多于一種擴(kuò)增元件可選自一種或多于一種雙粒病毒組(geminivirus)擴(kuò)增元件。所述一種或多于一種雙粒病毒組擴(kuò)增元件可選自菜豆黃矮病毒長(zhǎng)基因間區(qū)(BeanYellowDwarfViruslongintergenicregion,BeYDVLIR)和BeYDV短基因間區(qū)(BeYDVDshortintergenicregion,BeYDVSIR)。[0024]在所述植物中有活性的所述第一調(diào)節(jié)區(qū)和在所述植物中有活性的所述第二調(diào)節(jié)區(qū)可以相同或不同。[0025]上述方法還可包括以下步驟:[0026]d)收獲所述植物并提取所述VLP。[0027]本發(fā)明還包括上述方法(A)，其中將所述第一核酸序列和第三核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，所述第一核酸序列包含與一種或多于一種豇豆花葉病毒屬增強(qiáng)子可操作地相連接的所述調(diào)節(jié)區(qū)，所述第三核酸編碼沉默抑制子(suppressorofsilencing)、雙粒病毒組復(fù)制酶或二者。或者，可將所述第一核酸序列、所述第二核酸和第三核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，所述第一核酸序列包含與一種或多于一種豇豆花葉病毒屬增強(qiáng)子可操作地相連接的調(diào)節(jié)區(qū)，所述第二核酸包含在所述植物中有活性并且與編碼所述基質(zhì)蛋白之核苷酸序列可操作地相連接的第二調(diào)節(jié)區(qū)，所述第三核酸編碼沉默抑制子、雙粒病毒組復(fù)制酶或二者。如果所述第三核酸僅包含所述沉默抑制子，那么可將編碼所述雙粒病毒組復(fù)制酶的第四核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中。所述一種或多于一種豇豆花葉病毒屬增強(qiáng)子可以是豇豆花葉病毒屬UTR，例如，豇豆花葉病毒超翻譯(CowpeaMosaicVirushyperanslatable，CPMV-HT)UTR如CPMV-HlV和/或3，UTR。[0028]本發(fā)明還包括上述方法(A)，其中在所述引入步驟(步驟a)中，所述第一核酸在所述植物中瞬時(shí)表達(dá)?；蛘?，在所述引入步驟(步驟a)中，所述第一核酸在所述植物中穩(wěn)定表達(dá)。[0029]本發(fā)明還提供了產(chǎn)生狂犬病病毒樣顆粒(VLP)的方法(B)，其包括:[0030]a)提供包含含有第一調(diào)節(jié)區(qū)之第一核酸的植物或植物的一部分，所述第一調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可操作地相連接，[0031]b)在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或所述植物的一部分，從而產(chǎn)生所述天然狂犬病VLP。[0032]在所述植物中有活性的所述第一調(diào)節(jié)區(qū)和在所述植物中有活性的所述第二調(diào)節(jié)區(qū)可以相同或不同。[0033]方法(B)中的所述天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以是糖蛋白。如果所述天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白不是M(基質(zhì))蛋白，那么在上述方法(B)中，所述植物還可包含含有第二調(diào)節(jié)區(qū)的第二核酸，所述第二調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼基質(zhì)蛋白的核苷酸序列可操作地相連接。或者，所述第一核酸可包含編碼基質(zhì)蛋白的核苷酸序列。[0034]在上述方法(方法B)中，所述第一核酸或所述第二核酸或者二者還可編碼、包含或者既編碼又包含一種或多于一種擴(kuò)增元件。所述一種或多于一種擴(kuò)增元件可選自一種或多于一種雙粒病毒組擴(kuò)增元件。所述一種或多于一種雙粒病毒組擴(kuò)增元件可選自菜豆黃矮病毒長(zhǎng)基因間區(qū)(BeYDVLIR)和BeYDV短基因間區(qū)(BeYDVSIR)。[0035]在上述方法(方法A或B)中，所述植物或所述植物的一部分還可包含編碼沉默抑制子(例如HcPro或pl9)、雙粒病毒組復(fù)制酶或二者的另一種核酸序列?；蛘?，所述植物或所述植物的一部分可包含編碼所述雙粒病毒組復(fù)制酶的另一種核酸。[0036]本發(fā)明還包括上述方法(B)，其中所述植物或所述植物的一部分瞬時(shí)表達(dá)所述第一核酸。或者，所述第一核酸在所述植物或所述植物的一部分中穩(wěn)定表達(dá)。[0037]上述方法⑶還可包括以下步驟:[0038]d)收獲所述植物并提取所述VLP。[0039]本發(fā)明提供了由上述方法㈧和/或⑶產(chǎn)生的VLP。所述VLP還可包含源自植物的一種或多于一種脂質(zhì)。所述VLP的所述一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白可包含植物特異性N-聚糖或經(jīng)修飾N-聚糖。本發(fā)明還提供了使用所述VLP制備的多克隆抗體。[0040]本發(fā)明包括組合物，其包含用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有效劑量的如上所述由所述方法(A)或⑶制得的VLP和可藥用載體。[0041]本發(fā)明還包括在對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)狂犬病病毒感染之免疫的方法，所述方法包括向所述對(duì)象施用如上所述的VLP。所述VLP可經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用給對(duì)象。[0042]本發(fā)明還提供了包含由上述方法㈧和/或⑶所產(chǎn)生之VLP的植物物質(zhì)。所述植物物質(zhì)可用于在對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)狂犬病病毒感染的免疫。所述植物物質(zhì)還可作為食品補(bǔ)充劑而混合。[0043]該發(fā)明概述不一定描述本發(fā)明的所有特征?！緦?zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0044]通過(guò)參照附圖的以下描述，本發(fā)明的這些和其他特征會(huì)更加顯而易見(jiàn)，其中:[0045]圖1示出了本塞姆氏煙草(Nicotianabenthamiana)中狂犬病G蛋白瞬時(shí)表達(dá)的Western印跡分析。在具有(1091)或沒(méi)有(1071)基于BeYDV之DNA擴(kuò)增系統(tǒng)的CPMV-HT的控制下表達(dá)狂犬病G蛋白(對(duì)于構(gòu)建體，參見(jiàn)實(shí)例中的表2)。括號(hào)中的數(shù)字是指用于制備細(xì)菌接種物之農(nóng)桿菌(Agrobacterium)培養(yǎng)物的量(毫升)。在3或4個(gè)滲入后天數(shù)(daypost丨11打1廿&^011，0?1)，收獲經(jīng)461^1/1091滲入的植物。收獲經(jīng)滲入植物的葉并進(jìn)行機(jī)械提取。蛋白質(zhì)提取物通過(guò)SDS-PAGE分離，并使用抗狂犬病G小鼠單克隆抗體(Santa-CruzSC-57995)通過(guò)western印跡進(jìn)行分析。[0046]圖2示出了來(lái)自用于狂犬病G蛋白之生物化學(xué)提取方法和機(jī)械提取方法的蛋白質(zhì)提取物中狂犬病G蛋白含量的比較。蛋白質(zhì)提取物通過(guò)SDS-PAGE分離，并使用抗狂犬病G小鼠單克隆抗體(Santa-CruzSC-57995)通過(guò)western印跡進(jìn)行分析。括號(hào)中的數(shù)字是指用于制備細(xì)菌接種物之農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的量(毫升)(對(duì)于構(gòu)建體，參見(jiàn)表2)。[0047]圖3A不出了通過(guò)尺寸排阻色譜(sizeexclusionchromatography,SEC)分離來(lái)自經(jīng)AGL1/1091滲入之植物的濃縮蛋白質(zhì)提取物后狂犬病G蛋白含量的western印跡分析。來(lái)自SEC的洗脫級(jí)分通過(guò)SDS-PAGE分離，并使用抗狂犬病蛋白G小鼠單克隆抗體(Santa-CruzSC-57995)通過(guò)western印跡進(jìn)行分析。圖3B示出了通過(guò)尺寸排阻色譜(SEC)分離來(lái)自經(jīng)AGL1/1091+AGL1/1086滲入之植物的濃縮蛋白質(zhì)提取物后狂犬病G蛋白含量的western印跡分析。來(lái)自SEC的洗脫級(jí)分通過(guò)SDS-PAGE分離，并使用抗狂犬病蛋白G小鼠單克隆抗體(Santa-CruzSC-57995)通過(guò)western印跡進(jìn)行分析。[0048]圖4A示出了引物IF-RabM-S3.c(SEQIDNO:1)。圖4B示出了引物IF-RabM_Sl_4.r(SEQIDNO:2)。圖4C示出了合成的M蛋白編碼序列(對(duì)應(yīng)于Genbank登錄號(hào)FJ913470的nt2496~3104)(SEQIDN0.3)。圖4D示出了1191號(hào)構(gòu)建體的示意圖。在示意圖上注釋了用于質(zhì)粒線性化的SacII和StuI限制性酶位點(diǎn)。圖4E示出了1191號(hào)構(gòu)建體，從左至右t-DNA邊界(下劃線)。具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒(沉默抑制子)的2X35S/CPMV-HT/NOS(SEQIDNO:4)。圖4F示出了1066號(hào)表達(dá)盒，從2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子。來(lái)自狂犬病病毒ERA株之M蛋白的開(kāi)放閱讀框用下劃線表示(SEQIDNO:5)。圖4G示出了來(lái)自狂犬病病毒ERA株之M蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。圖4H示出了1066號(hào)構(gòu)建體的示意圖。[0049]圖5A示出了1193號(hào)構(gòu)建體的示意圖。在示意圖上注釋了用于質(zhì)粒線性化的SacII和StuI限制性酶位點(diǎn)。圖5B示出了1193號(hào)構(gòu)建體，從左至右t-DNA邊界(下劃線)。引入到具有質(zhì)體藍(lán)素-TBSVP19-質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒(沉默抑制子)之BeYDV+復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)中的2X35S/CPMV-HT/N0S(SEQIDNO:7)。圖5C示出了1086號(hào)表達(dá)盒，從BeYDv左LIR至BeYDv右LIR。來(lái)自狂犬病病毒ERA株之TOISP/G蛋白的開(kāi)放閱讀框用下劃線表示(SEQIDNO:8)ο圖示出了1086號(hào)構(gòu)建體的示意圖。[0050]圖6A示出了引物IF-RabG-S2+4.c(SEQIDNO:9)。圖6B示出了引物IF-RabG-Sl-4.r(SEQIDN0:10)。圖6C示出了合成的狂犬病G蛋白編碼序列(對(duì)應(yīng)于Genbank登錄號(hào)EF206707的nt3317~4891)(SEQIDNO:11)。圖6D示出了1192號(hào)構(gòu)建體的示意圖。在示意圖上注釋了用于質(zhì)粒線性化的SacII和StuI限制性酶位點(diǎn)。圖6E示出了1192號(hào)構(gòu)建體，從左至右t-DNA邊界(下劃線)。具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒(沉默抑制子)的2X35S/CPMV-HT/roiSP/N0S(SEQIDNO:12)。圖6F示出了1071號(hào)表達(dá)盒，從2X35S啟動(dòng)子至NOS終止子。來(lái)自狂犬病病毒ERA株之PDISP/G蛋白的開(kāi)放閱讀框用下劃線表示(SEQIDN0:13)。圖6G示出了來(lái)自狂犬病病毒ERA株之TOISP-G蛋白的氨基酸序列(SEQIDN0:14)。圖6H示出了1071號(hào)構(gòu)建體的示意圖。[0051]圖7A示出了1194號(hào)構(gòu)建體的示意圖。在示意圖上注釋了用于質(zhì)粒線性化的SacII和StuI限制性酶位點(diǎn)。圖7B示出了1194號(hào)構(gòu)建體，從左至右t-DNA(下劃線)。引入到具有質(zhì)體藍(lán)素-P19-質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒(沉默抑制子)之BeYDV+復(fù)制酶擴(kuò)增系統(tǒng)中的2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS(SEQIDNO:15)?圖7C示出了1091號(hào)表達(dá)盒，從BeYDv左LIR至BeYDv右LIR。來(lái)自狂犬病病毒ERA株之H)ISP/G蛋白的開(kāi)放閱讀框用下劃線表示(SEQIDNO:16)。圖7D示出了1091號(hào)構(gòu)建體的示意圖。[0052]圖8A示出了顯示G蛋白VLP制備物的考馬斯染色的SDS-PAGE(預(yù)制的4~12%，來(lái)自BioRad)。l)Rab-VLP制備物，2)分子量標(biāo)志物。圖8B示出了在用具有或沒(méi)有佐劑(鋁膠(Alhydrogel)(Alhy))之0.1mlNG-VLP(天然G蛋白VLP)疫苗的三次給藥(DO、D7和D28)肌內(nèi)(1.m.)免疫接種的小鼠的組(5只/組)中中和抗體(IU/ml)的應(yīng)答。在第44天(第三次給藥后16天)，取得血液樣品。使用的測(cè)試方法:RFFIT試驗(yàn)(快速熒光聚焦抑制試驗(yàn)(rapidfluorescentfocusinhibitiontest)):使用對(duì)于每只動(dòng)物獲得的各自值計(jì)算幾何平均滴度(GeometricMeanTiter，GMT)，并且標(biāo)出陽(yáng)性響應(yīng)者。柱表示具有95%Cl的GMT。在所有處理組之間進(jìn)行Anova，報(bào)道了沒(méi)有統(tǒng)計(jì)上顯著差異。[0053]發(fā)明詳述[0054]以下是對(duì)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的描述。[0055]本發(fā)明涉及包含一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的病毒樣顆粒(VLP)，和在植物中產(chǎn)生狂犬病VLP的方法?？袢LP可包含一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白，例如一種或更多種糖蛋白、一種或更多種基質(zhì)蛋白、或二者。VLP不包含來(lái)自植物病毒的病毒蛋白質(zhì)。[0056]本發(fā)明部分地提供了在植物中產(chǎn)生狂犬病病毒樣顆粒(VLP)的方法。本方法可包括將包含調(diào)節(jié)區(qū)和一種或多于一種擴(kuò)增元件的核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，所述調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可操作地相連接。然后，在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或所述植物的一部分，從而產(chǎn)生所述VLP。[0057]天然狂犬病結(jié)構(gòu)病毒蛋白(也稱(chēng)為天然狂犬病結(jié)構(gòu)病毒蛋白質(zhì))可以指分離自狂犬病病毒的全部或一部分天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白序列，所述病毒以任何天然存在的或變體的狂犬病病毒株或分離物存在。因此，術(shù)語(yǔ)天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白等包括在病毒生命周期期間通過(guò)突變所產(chǎn)生的或響應(yīng)于選擇壓力(例如，藥物治療、宿主細(xì)胞嗜性(tropism)或感染性的擴(kuò)張，等)所產(chǎn)生的天然存在的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白序列變體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員領(lǐng)會(huì)的，這種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白序列及其變體還可以使用重組技術(shù)產(chǎn)生。天然狂犬病結(jié)構(gòu)病毒蛋白不包括嵌合蛋白，其中例如跨膜結(jié)構(gòu)域和/或胞質(zhì)尾區(qū)被與天然狂犬病結(jié)構(gòu)病毒蛋白相關(guān)的異源性跨膜結(jié)構(gòu)域和/或胞質(zhì)尾區(qū)替代。[0058]天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的非限制性實(shí)例為狂犬病糖蛋白(G)蛋白質(zhì)、G蛋白片段、基質(zhì)(M)蛋白、M蛋白片段、或者其組合。根據(jù)本發(fā)明可使用的G蛋白或G蛋白片段的非限制性實(shí)例包括來(lái)自狂犬病ERA株的那些G蛋白。G蛋白的實(shí)例(不認(rèn)為這是限制性的)為SEQIDNO:14的氨基酸序列中所述。另外，天然狂犬病結(jié)構(gòu)病毒蛋白可包含SEQIDNO:14中所述的序列，或者與其具有至少約90~100%序列相似性的序列，包括這些范圍內(nèi)的任何百分相似性，例如與其具有91、92、93、94、95、96、97、98、99%序列相似性。[0059]可通過(guò)使用采用BLAST(基本局部比對(duì)搜索工具)2.0算法的BLASTP和TBLASTN程序來(lái)計(jì)算氨基酸序列相似性或同一性。用于計(jì)算氨基酸序列相似性或同一性的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并且ALTSCHUL等(1990，JMol.Biol.215:403-410)和ALTSCHUL等(1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402)描述了BLAST算法的使用。[0060]天然結(jié)構(gòu)病毒蛋白可以以單體、二聚體、三聚體或其組合而存在。三聚體為由三個(gè)通常為非共價(jià)連接的蛋白質(zhì)形成的大分子復(fù)合物。不希望受理論限制，蛋白質(zhì)的三聚化結(jié)構(gòu)域可能對(duì)于此類(lèi)三聚體的形成是重要的。因此，病毒蛋白或其片段可包含三聚化結(jié)構(gòu)域。[0061]“基質(zhì)蛋白”(也稱(chēng)為病毒核心蛋白)，意指組織并維持病毒體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。病毒基質(zhì)蛋白一般直接與細(xì)胞膜相互作用并且可參與出芽過(guò)程。病毒核心蛋白是組成核衣殼之一部分的蛋白質(zhì)并且通常直接與病毒核酸相締合。病毒基質(zhì)或核心蛋白的實(shí)例為狂犬病M蛋白、流感M1、RSVM和逆轉(zhuǎn)錄病毒gag蛋白。如本文中描述的可以使用的基質(zhì)蛋白的實(shí)例包括但不限于狂犬病M蛋白?？梢耘c本發(fā)明一起使用的序列的非限制性實(shí)例包括來(lái)自狂犬病病毒ERA株的M蛋白。示例性M蛋白由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列組成。另外，天然狂犬病結(jié)構(gòu)病毒蛋白可包含SEQIDNO:6所述的序列或者與其具有至少約90~100%序列相似性的序列，包括在這些范圍內(nèi)的任何百分相似性，如與其有91、92、93、94、95、96、97、98、99%序列相似性。[0062]水泡性口炎病毒(彈狀病毒如狂犬病)和單純皰疫病毒(皰疫病毒如水痘帶狀皰疹病毒)二者均以VSP4依賴(lài)性方式出芽(Taylor等J.Virol81:13631-13639，2007；Crump等，J.Virol81:7380-7387,2007)?由于VSP4與基質(zhì)蛋白的晚期結(jié)構(gòu)域(latedomain)相互作用，這表明基質(zhì)蛋白對(duì)于出芽以及作為推論對(duì)于VLP產(chǎn)生是必需的。然而，如本文中所述，可在具有或沒(méi)有基質(zhì)蛋白共表達(dá)的情況下在植物內(nèi)產(chǎn)生天然狂犬病VLP。因此，根據(jù)本發(fā)明，在植物中由病毒來(lái)源的天然結(jié)構(gòu)蛋白所產(chǎn)生的天然狂犬病VLP可以包含或可以不包含病毒基質(zhì)(或病毒核心)蛋白。[0063]本發(fā)明還提供了在植物中產(chǎn)生狂犬病病毒樣蛋白質(zhì)VLP的方法，其中將編碼天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如狂犬病G蛋白)的核酸(第一核酸)與編碼病毒基質(zhì)蛋白(例如但不限于狂犬病基質(zhì)蛋白)的第二核酸共表達(dá)。核酸和第二核酸可在同一步驟中引入植物，或者可先后引入植物。[0064]如以下更詳細(xì)地描述，可在植物中通過(guò)表達(dá)編碼一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如狂犬病G蛋白)的核酸(第一核酸)來(lái)產(chǎn)生VLP。編碼基質(zhì)蛋白(例如但不限于狂犬病基質(zhì)蛋白)的第二核酸可在植物中共表達(dá)。核酸和第二核酸可在同一步驟中引入植物，或者可先后引入植物。核酸和第二核酸可以以瞬時(shí)方式或以穩(wěn)定方式引入植物。[0065]另外，可用基質(zhì)蛋白(例如但不限于狂犬病基質(zhì)蛋白)(第二核酸)轉(zhuǎn)化表達(dá)編碼一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如狂犬病G蛋白)之第一核酸的植物，使得第一和第二核酸二者在所述植物中共表達(dá)。或者，可用編碼一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如狂犬病G蛋白)的第一核酸轉(zhuǎn)化表達(dá)基質(zhì)蛋白(例如但不限于狂犬病基質(zhì)蛋白)(第二核酸)的植物，使得第一和第二核酸二者在植物中共表達(dá)。[0066]此外，表達(dá)編碼一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如狂犬病G蛋白)之第一核酸的第一植物可以與編碼基質(zhì)蛋白(例如，但不限于，狂犬病基質(zhì)蛋白)之第二核酸的第二植物雜交，以產(chǎn)生共表達(dá)分別編碼天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白和基質(zhì)蛋白的第一和第二核酸的子代植物。[0067]本發(fā)明還提供了在植物中產(chǎn)生狂犬病病毒VLP的方法，其涉及將編碼一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的一種或更多種核酸和一種或多于一種擴(kuò)增元件引入植物或植物的一部分中，其中所述一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白與在植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接。之后，在允許表達(dá)所述一種或更多種核酸的條件下孵育所述植物或所述植物的一部分，從而產(chǎn)生狂犬病病毒VLP。一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以是一種或更多種狂犬病G蛋白、所述G蛋白片段、一種或更多種M蛋白、所述M蛋白片段、或者其組合。[0068]本發(fā)明還提供了VLP，其包含一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如但不限于一種或更多種狂犬病病毒糖蛋白)、一種或更多種基質(zhì)蛋白，或二者。VLP可通過(guò)如本發(fā)明提供的方法產(chǎn)生。[0069]術(shù)語(yǔ)“病毒樣顆粒”(VLP)或者“病毒樣顆?！被颉癡LP”指自裝配并且包含一種或更多種結(jié)構(gòu)蛋白如天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如但不限于狂犬病G蛋白)的結(jié)構(gòu)。VLP通常在形態(tài)上和抗原性上與感染中產(chǎn)生的病毒體類(lèi)似，但是缺乏足以復(fù)制的遺傳信息，因此是非感染性的?？稍诤线m的宿主細(xì)胞(包括植物宿主細(xì)胞)中產(chǎn)生VLP。從宿主細(xì)胞提取之后，在合適的條件下分離并進(jìn)一步純化后，VLP可作為完整結(jié)構(gòu)來(lái)純化。[0070]可例如通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(dynamiclightscattering,DLS)或電子顯微鏡(electronmicroscope,EM)技術(shù)測(cè)量的以上所限定VLP的大小(即直徑)通常為40至300nm或它們之間的任意大小。在一些實(shí)施方案中，完整VLP結(jié)構(gòu)的大小可以是約40nm至約300nm，或它們之間的任意大小，例如50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、lOOnm、llOnm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm或280nm，或者它們之間的任意大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，完整VLP結(jié)構(gòu)的大小可以是約170nm至約200nm,或它們之間的任意大小，例如175nm、180nm、185nm、190nm、195nm,或它們之間的任意大小。[0071]本發(fā)明還提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列編碼一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白并且與植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)可操作地相連接。另外，一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白可與一種或多于一種擴(kuò)增元件可操作地相連接。一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以是例如一種或更多種狂犬病G蛋白、一種或更多種M蛋白、或二者。[0072]本發(fā)明中所涉及的核酸序列可與如果在嚴(yán)格雜交條件下與本文中限定的一種或多于一種核苷酸序列或該核酸序列之互補(bǔ)序列相雜交的序列或該序列之互補(bǔ)序列“基本同源”或“基本類(lèi)似”。當(dāng)在整個(gè)核苷酸序列的限定長(zhǎng)度上有至少約70%或70至100%或者其間任意量如70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%或其間任意量的核苷酸匹配時(shí)，序列為“基本同源”、“基本類(lèi)似”，前提是這樣的同源序列展現(xiàn)出本文中所述序列或所編碼產(chǎn)物的一種或多于一種的特性。蛋白質(zhì)的正確折疊對(duì)于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、多聚體形成、VLP形成和功能可以是重要的。蛋白質(zhì)折疊可受一個(gè)或更多個(gè)因素影響，包括但不限于蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)相對(duì)豐度，細(xì)胞內(nèi)擁擠程度(degreeofintracellularcrowding),可與折疊的、部分折疊的或未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合或瞬時(shí)締合(transientlyassociated)的輔因子的可用性。[0073]可使用例如在DNASIS(使用例如但不限于以下參數(shù):GAP罰分為5，頂部對(duì)角的#為5，固定GAP罰分為10，K串(k-tuple)為2，浮動(dòng)缺口(floatinggap)為10，并且窗口大小為5)內(nèi)提供的核苷酸序列比較程序來(lái)確定此類(lèi)序列相似性。然而，用于比較的比對(duì)序列的其他方法為本領(lǐng)域中公知的，例如Smith&Waterman(1981,Adv.App1.Math.2:482)、Needleman&ffunsch(J.Mol.Biol.48:443,1970)>Pearson&Lipman(1988,Proc.Nat11.Acad.Sc1.USA85:2444)的算法，以及通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST，可通過(guò)HIN獲得。)，或者通過(guò)手工比對(duì)和目視檢查(參見(jiàn)，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編1995增刊)，或者在嚴(yán)格條件下使用Southern或Northern雜交(參見(jiàn)Maniatis等，inMolecularCloning(ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,1982)。優(yōu)選地,基本同源的序列在整個(gè)分子之限定長(zhǎng)度上展現(xiàn)出至少約80%和最優(yōu)選至少約90%的序列相似性。[0074]一種這樣的嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)實(shí)例可以是在65°C下于4XSSC中雜交過(guò)夜(約16~20小時(shí))，然后在65°C下于0.1XSSC中洗滌I小時(shí)，或在65°C下于0.1XSSC中洗滌兩次(每次20或30分鐘)?；蛘撸粋€(gè)示例性的嚴(yán)格雜交條件可以是在42°C下于50%甲酰胺、4XSSC中過(guò)夜(16~20小時(shí))，然后在65°C下于0.1XSSC中洗滌I小時(shí)，或在65°C下于0.1XSSC中洗滌2次(每次20或30分鐘或者過(guò)夜(16~20小時(shí)))，或者在65°C下于Church水性磷酸鹽緩沖液(7%SDS；0.5MNaPO4緩沖液(pH7.2)；10mMEDTA)中雜交，在50°C下于0.1XSSC、0.1%SDS中洗滌2次(每次20或30分鐘)，或者對(duì)于獨(dú)特序列區(qū)域在65°C下于2XSSC、0.1%SDS中洗滌2次(每次20或30分鐘)。[0075]編碼天然狂犬病結(jié)構(gòu)多肽或天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸可被描述為“狂犬病核酸”、“狂犬病核苷酸序列”、“天然狂犬病核酸”或“天然狂犬病核苷酸序列”。例如(不認(rèn)為這是限制性的)，包含一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白或天然狂犬病結(jié)構(gòu)多肽的病毒樣顆?？杀幻枋鰹椤翱袢LP”或“天然狂犬病VLP”。[0076]天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白或多肽可包含與該多肽或蛋白質(zhì)之其余部分相同或異源的信號(hào)肽。術(shù)語(yǔ)“信號(hào)肽”為本領(lǐng)域中公知的并且通常指通常見(jiàn)于多肽的N-端的短(約5~30個(gè)氨基酸)氨基酸序列，其可指導(dǎo)新翻譯之多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至特定細(xì)胞器或有助于多肽鏈之特定區(qū)域(相對(duì)于其他)的定位。作為非限制性實(shí)例，信號(hào)肽可靶向蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)和/或有助于新生多肽之近N-端結(jié)構(gòu)域相對(duì)于膜錨定結(jié)構(gòu)域的定位，以有助于成熟蛋白質(zhì)(例如(不認(rèn)為這是限制性的)天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白)的切割和折疊。[0077]信號(hào)肽(signalpeptide,SP)可以是蛋白質(zhì)或病毒蛋白質(zhì)原有的，或者信號(hào)肽可相對(duì)于被表達(dá)之蛋白質(zhì)或病毒蛋白質(zhì)的一級(jí)序列是異源的。例如，天然狂犬病G蛋白或天然狂犬病M蛋白的天然信號(hào)肽可用于在植物系統(tǒng)中表達(dá)天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白。[0078]信號(hào)肽也可以是非天然的，例如來(lái)自蛋白質(zhì)、病毒蛋白質(zhì)或非病毒蛋白的病毒天然結(jié)構(gòu)蛋白，或者來(lái)自植物、動(dòng)物或細(xì)菌多肽?？墒褂玫男盘?hào)肽的非限制性實(shí)例為苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(alfalfaproteindisulfideisomerase)(PDISP;登錄號(hào)Z11499的第32~103位核苷酸)。[0079]因此，本發(fā)明提供了包含天然或非天然信號(hào)肽的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白以及編碼此類(lèi)狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸。[0080]擴(kuò)增元件[0081]可在包含基于病毒的(DNA或RNA)表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白或多肽，該表達(dá)系統(tǒng)有例如但不限于基于豇豆花葉病毒屬的表達(dá)盒和基于雙粒病毒組的擴(kuò)增元件。[0082]本文中描述的表達(dá)系統(tǒng)可包含基于雙分體病毒(bipartitevirus)或具有二分基因組(bipartitegenome)之病毒的表達(dá)盒。例如，雙分體病毒可以為5[豆花葉病毒科(Comoviridae)。5[豆花葉病毒科的屬包括5[豆花葉病毒屬(Comovirus)、線蟲(chóng)傳多面體病毒屬(Nepovirus)、蠶豆病毒屬(Fabavirus)、樓桃挫葉病毒屬(Cheravirus)和溫州蜜柑矮縮病毒屬(Sadwavirus)。5[豆花葉病毒屬包括5[豆花葉病毒(Cowpeamosaicvirus,CPMV)、虹曰.重型花葉病毒(Cowpeaseveremosaicvirus,CPSMV)、南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus,SqMV)、紅三葉草斑駁病毒(Redclovermottlevirus,RCMV)、菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus,BPMV)、蕪菁環(huán)斑病毒(Turnipringspotvirus,TuRSV)、香豆真花葉病毒(Broadbeantruemosaicvirus,BBtMV)、香豆染色病毒(Broadbeanstainvirus,BBSV)、蘿卜花葉病毒(Radishmosaicvirus,RaMV)。包含可用于本發(fā)明多個(gè)方面之增強(qiáng)子元件的豇豆花葉病毒屬RNA-2序列的實(shí)例包括但不限于:CPMVRNA-2(GenBank登錄號(hào)NC_003550)、RCMVRNA-2(GenBank登錄號(hào)NC_003738)、BPMVRNA-2(GenBank登錄號(hào)NC_003495)、CPSMVRNA-2(GenBank登錄號(hào)NC_003544)、SqMVRNA-2(GenBank登錄號(hào)NC_003800)、TuRSVRNA-2(GenBank登錄號(hào)NC_013219.1)、BBtMVRNA-2(GenBank登錄號(hào)⑶810904)、BBSVRNA2(GenBank登錄號(hào)FJ028650)、RaMV(GenBank登錄號(hào)NC_003800)。[0083]雙分體豇豆花葉病毒屬的RNA基因組的片段被稱(chēng)為RNA-1和RNA_2。RNA-1編碼涉及復(fù)制的蛋白質(zhì)，而RNA-2編碼細(xì)胞至細(xì)胞移動(dòng)所必需的蛋白質(zhì)和兩種衣殼蛋白。可使用任何合適的基于豇豆花葉病毒屬的盒包括CPMV、CPSMV,SqMV,RCMV或BPMV，例如表達(dá)盒可基于CPMV。[0084]“表達(dá)盒”指這樣的核苷酸序列，其包含受控于在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄目的核酸的適當(dāng)啟動(dòng)子或其他調(diào)節(jié)元件控制并與其可操作地相連接的目的核酸。[0085]表達(dá)系統(tǒng)還可包含來(lái)自雙粒病毒組的擴(kuò)增元件，例如來(lái)自菜豆黃矮病毒(beanyellowdwarfvirus,BeYDV)的擴(kuò)增元件。BeYDV屬于適于雙子葉植物的玉米線條病毒屬(Mastrevirus)。BeYDV為具有單鏈環(huán)狀DNA基因組的單組分并且可通過(guò)滾環(huán)機(jī)制進(jìn)行復(fù)制以達(dá)到非常高的拷貝數(shù)。源自BeYDV的DNA復(fù)制子載體系統(tǒng)已經(jīng)用于在植物中迅速高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。[0086]本文中使用的短語(yǔ)“擴(kuò)增元件”指包含雙粒病毒組基因組之一種或更多種長(zhǎng)基因間區(qū)(longintergenicregion)或長(zhǎng)基因間隔重復(fù)(longintergenicrepeat)(LIR)的至少一部分的核酸區(qū)段。本文中使用的“長(zhǎng)基因間區(qū)”或“長(zhǎng)基因間隔重復(fù)”指包含能夠通過(guò)雙粒病毒組Rep蛋白質(zhì)介導(dǎo)切除和復(fù)制的rep結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)基因間區(qū)的區(qū)域。在一些方面中，包含一個(gè)或更多個(gè)LIR的核酸區(qū)段還可包含雙粒病毒組基因組的短基因間區(qū)(shortintergenicregion,SIR)或小基因間區(qū)(smallintergenicregion,SIR)。本文中使用的“短基因間區(qū)”或“小基因間區(qū)”指互補(bǔ)鏈(玉米線條病毒屬的短IR(SIR))。本文中可使用任何合適的雙粒病毒組來(lái)源的擴(kuò)增元件。參見(jiàn)，例如，W02000/20557；W02010/025285；ZhangX.等(2005,BiotechnologyandBioengineering,第93卷，271-279),HuangZ.等(2009,BiotechnologyandBioengineering,第103卷，706-714),HuangZ.等(2009，BiotechnologyandBioengineering,第106卷，9-17);其通過(guò)引用并入本文。如果多于一個(gè)LIR(例如兩個(gè)LIR)用于構(gòu)建體，那么啟動(dòng)子、CMPV-HT區(qū)域和目的核酸序列以及終止子在兩個(gè)LIR之間。另外,擴(kuò)增元件可以例如來(lái)源于Halley-Stott等(2007)ArchivesofVirology152:1237-1240中公開(kāi)的以GenBank登錄號(hào)DQ458791儲(chǔ)存的序列，其通過(guò)引用并入本文。包含LIR的核酸區(qū)段為核苷酸2401至2566與I至128連接。包含SIR的核酸區(qū)段為核苷酸1154至1212。[0087]如本文中描述地，菜豆黃矮病毒(BeYDV)來(lái)源的載體和R印/R印A供應(yīng)的載體通過(guò)農(nóng)桿菌滲入本塞姆氏煙草葉的共遞送導(dǎo)致了高效的復(fù)制子擴(kuò)增和穩(wěn)健的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。[0088]可以在分開(kāi)的載體上包含基于豇豆花葉病毒屬的表達(dá)盒和雙粒病毒組來(lái)源的擴(kuò)增元件，或者組分部件可包含在一個(gè)載體中。如果使用兩個(gè)載體，那么可將第一和第二載體同時(shí)或分開(kāi)引入植物細(xì)胞中。[0089]病毒復(fù)制酶也可以包含在本文中描述的表達(dá)系統(tǒng)中，以提高目的核酸的表達(dá)。復(fù)制酶的非限制性實(shí)例為編碼BeYDVRep和R印A的BeYDV復(fù)制酶(pREPllO)(C2/C1；Huang等，2009,Biotechnol.Bioeng.103,706-714;其通過(guò)引用并入本文)。在Halley-Stott等(2007)ArchivesofVirologyl52:1237-1240中公開(kāi)了以GenBank登錄號(hào)DQ458791儲(chǔ)存的復(fù)制酶的另一個(gè)非限制性實(shí)例，其通過(guò)引用并入本文。包含Cl:C2基因的核酸區(qū)段為核苷酸1310至2400。[0090]“共表達(dá)”意指兩種或多于兩種核苷酸序列在植物內(nèi)以及在植物的同一組織內(nèi)大致同時(shí)表達(dá)。然而，核苷酸序列不必嚴(yán)格地同時(shí)表達(dá)。而是說(shuō)，兩種或更多種核苷酸序列的表達(dá)使得所編碼產(chǎn)物有機(jī)會(huì)相互作用。可使用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)兩種或多于兩種的核苷酸序列，其中所述兩種或更多種序列大致同時(shí)在這兩種序列表達(dá)的條件下被引入植物內(nèi)?；蛘撸梢杂靡运矔r(shí)方式引入平臺(tái)植物的編碼目的蛋白質(zhì)(例如天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白)的額外序列以穩(wěn)定方式轉(zhuǎn)化包含核苷酸序列之一的平臺(tái)植物。[0091]伴侶[0092]所表達(dá)的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的正確折疊對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、多聚體形成、VLP形成、天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的功能和天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白通過(guò)抗體的識(shí)別等特征可以是重要的。蛋白質(zhì)的折疊和積累可受一個(gè)或更多個(gè)因素影響，包括但不限于:蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)相對(duì)豐度，細(xì)胞內(nèi)擁擠程度，細(xì)胞區(qū)室中的pH，可與折疊的、部分折疊的或未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合或瞬時(shí)締合的輔因子的可用性，一種或更多種伴侶蛋白的存在，等。[0093]熱休克蛋白(heatshockprotein,Hsp)或應(yīng)激蛋白是伴侶蛋白的實(shí)例,其可參與多種細(xì)胞過(guò)程，包括蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、防止錯(cuò)誤折疊、防止蛋白質(zhì)凝集、蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配和解裝配、蛋白質(zhì)折疊、以及蛋白質(zhì)解聚。此類(lèi)伴侶蛋白的實(shí)例包括但不限于Hsp60、Hsp65、Hsp70、Hsp90、HsplOO、Hsp20_30、HsplO、Hsp100-200、HsplOO、Hsp90、Lon、TF55、FKBP、親環(huán)蛋白(cyclophilin)、ClpP、GrpE、泛素、鈣聯(lián)接蛋白(calnexin)和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(參見(jiàn)例如Macario,A.J.L，ColdSpringHarborLaboratoryRes.25:59-70.1995；Parsell,D.A.&Lindquist，S.Ann.Rev.Genet.27:437-496(1993);美國(guó)專(zhuān)利N0.5，232，833)。如本文中所述，伴侶蛋白(例如但不限于Hsp40和Hsp70)可用于確?？袢〔《镜鞍踪|(zhì)的折疊。[0094]Hsp70的實(shí)例包括來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Hsp72和Hsc73、來(lái)自細(xì)菌(特別是分枝桿菌，例如麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)(例如卡介苗(Bacille-CalmetteGuerin):本文中稱(chēng)為Hsp71))的DnaK。來(lái)自大腸桿菌、酵母和其他原核生物的DnaK,以及來(lái)自真核生物(例如擬南芥(A.thaliana))的BiP和Grp78(Lin等,2001(CellStressandChaperones6:201-208))。Hsp70的一個(gè)具體實(shí)例是擬南芥Hsp70(由Genbankref:AY120747.1編碼)。Hsp70能夠特異性地結(jié)合ATP以及未折疊多肽和肽，從而參與蛋白質(zhì)折疊和解折疊以及參與蛋白質(zhì)復(fù)合物的裝配和解裝配。[0095]Hsp40的實(shí)例包括來(lái)自原核生物(例如大腸桿菌和分枝桿菌)的DnaJ以及來(lái)自真核生物(例如苜猜)的HSJl、HDJl和Hsp40(Frugis等，1999.PlantMolecularBiology40:397-408)。Hsp40的一個(gè)具體實(shí)例是紫花苜猜(M.sativa)MsJl(Genbankref:AJ000995.1)。Hsp40在蛋白質(zhì)折疊、耐熱性和DNA復(fù)制等細(xì)胞活動(dòng)中作為分子伴侶而發(fā)揮作用。[0096]在各Hsp中，Hsp70及其輔伴侶分子(co-chaperone)Hsp40參與在合成完成前穩(wěn)定翻譯和新合成的多肽。不希望受理論限制，Hsp40與未折疊(新生或新轉(zhuǎn)移的)多肽的疏水補(bǔ)丁(hydrophobicpatch)相結(jié)合，因而有利于Hsp70_ATP復(fù)合物與該多肽的相互作用。ATP水解導(dǎo)致多肽、Hsp70和ADP之間形成穩(wěn)定的復(fù)合物并釋放Hsp40。Hsp70-ADP復(fù)合物與多肽之疏水補(bǔ)丁的締合阻止所述復(fù)合物與其他疏水補(bǔ)丁的相互作用，并防止不正確折疊以及與其他蛋白質(zhì)形成凝集體(綜述見(jiàn)于Hartl，F(xiàn)U.1996.Nature381:571-579)。[0097]天然伴侶蛋白能夠有利于低水平重組蛋白質(zhì)的正確折疊，然而當(dāng)表達(dá)水平提高時(shí)，大量的天然伴侶蛋白可變?yōu)橄拗埔蛩亍＝?jīng)農(nóng)桿菌滲入之葉中天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的高水平表達(dá)可導(dǎo)致天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白在胞質(zhì)溶膠中累積，而與一種或多于一種伴侶蛋白(例如Hsp70、Hsp40或者Hsp70及Hsp40二者)的共表達(dá)可降低錯(cuò)誤折疊或凝集之蛋白質(zhì)的水平，并提高蛋白質(zhì)(其展現(xiàn)出允許發(fā)生病毒樣顆粒形成的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)特征)的數(shù)目。[0098]因此，本發(fā)明還提供了在植物中產(chǎn)生狂犬病VLP的方法，其中將編碼天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的第一核酸與編碼伴侶蛋白的第二核酸共表達(dá)。第一和第二核酸可在同一步驟中引入植物，或者可先后引入植物。[0099]調(diào)節(jié)元件[0100]在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)區(qū)”、“調(diào)節(jié)元件”或“啟動(dòng)子”意指反映通常(但不總是)位于基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)上游的一部分核酸，其可由DNA或RNA或者DNA和RNA二者構(gòu)成。當(dāng)調(diào)節(jié)區(qū)有活性并與目的基因可操作地締合或可操作地相連接時(shí)，可導(dǎo)致所述目的基因的表達(dá)。調(diào)節(jié)元件能夠介導(dǎo)器官特異性，或控制發(fā)育基因活化或時(shí)序基因的活化?！罢{(diào)節(jié)區(qū)”可包括啟動(dòng)子元件、展現(xiàn)出基礎(chǔ)啟動(dòng)子活性的核心啟動(dòng)子元件、可響應(yīng)于外部刺激而誘導(dǎo)的元件、介導(dǎo)啟動(dòng)子活性的元件(例如負(fù)調(diào)節(jié)元件或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。本文中使用的“調(diào)節(jié)區(qū)”還可包括轉(zhuǎn)錄后有活性的元件，例如調(diào)芐基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件例如翻譯和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯和轉(zhuǎn)錄抑制子、上游活化序列、以及mRNA不穩(wěn)定性決定子(mRNAinstabilitydeterminant)。這后幾種元件中的幾種可位于編碼區(qū)附近。[0101]在本公開(kāi)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”或“調(diào)節(jié)區(qū)”通常是指一般(但不總是)位于結(jié)構(gòu)基因的編碼序列上游(5，)的DNA序列，其通過(guò)提供對(duì)RNA聚合酶和/或轉(zhuǎn)錄所需其他因子的識(shí)別來(lái)控制編碼區(qū)在特定位點(diǎn)起始表達(dá)。然而，應(yīng)理解，位于內(nèi)含子內(nèi)或序列3’端的其他核苷酸序列也可有助于調(diào)節(jié)目的編碼區(qū)的表達(dá)。提供對(duì)RNA聚合酶或其他轉(zhuǎn)錄因子之識(shí)別以確保在特定位點(diǎn)起始的調(diào)節(jié)元件的一個(gè)實(shí)例是啟動(dòng)子元件。大多數(shù)(但不是全部)真核生物啟動(dòng)子元件含有TATA盒，其是由腺苷和胸苷核苷酸堿基對(duì)構(gòu)成的保守核酸序列，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25個(gè)堿基對(duì)處。啟動(dòng)子元件包含負(fù)責(zé)起始轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)啟動(dòng)子元件以及修飾基因表達(dá)的其他調(diào)節(jié)元件(如上文所列舉)。[0102]存在數(shù)種類(lèi)型的調(diào)節(jié)區(qū)，包括受發(fā)育調(diào)節(jié)的、誘導(dǎo)型的或組成型的調(diào)節(jié)區(qū)。受發(fā)育調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)區(qū)或?qū)λ刂苹虻牟町惐磉_(dá)進(jìn)行控制的調(diào)節(jié)區(qū)在特定器官或器官之組織內(nèi)、在該器官或組織的發(fā)育期間的特定時(shí)間被活化。然而，受發(fā)育調(diào)節(jié)的一些調(diào)節(jié)區(qū)也可偏好性地在某些器官或組織內(nèi)在特定發(fā)育階段有活性，它們還可以以受發(fā)育調(diào)節(jié)的方式有活性，或在植物內(nèi)的其他器官或組織中有基礎(chǔ)水平的活性。組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)的實(shí)例(例如參見(jiàn)特異性調(diào)節(jié)區(qū))包括油菜籽蛋白(napin)啟動(dòng)子和十字花科蛋白(cruciferin)啟動(dòng)子(Rask等，1998，J.PlantPhysiol.152:595-599；Bilodeau等，1994，PlantCelll4:125-130)。葉特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(參見(jiàn)US7，125，978，其通過(guò)引用并入本文)。[0103]誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)是能夠響應(yīng)于誘導(dǎo)物而直接或間接活化一種或更多種DNA序列或基因之轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)。當(dāng)不存在誘導(dǎo)物時(shí)，DNA序列或基因?qū)⒉粫?huì)被轉(zhuǎn)錄。通常，特異性地結(jié)合誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)以活化轉(zhuǎn)錄的蛋白因子可以以無(wú)活性形式存在，然后通過(guò)誘導(dǎo)物直接或間接地轉(zhuǎn)化成活性形式。然而，也可以不存在蛋白因子。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)劑，例如蛋白質(zhì)、代謝物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類(lèi)化合物；或者通過(guò)加熱、冷卻、鹽或毒性元素直接施加的生理應(yīng)激,或通過(guò)病原體或致病物(diseaseagent)(例如病毒)的作用間接產(chǎn)生的生理應(yīng)激。可通過(guò)向細(xì)胞或植物外部施加誘導(dǎo)物(例如通過(guò)噴霧、澆水、加熱或類(lèi)似方法)使含有誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)的植物細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)物。誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件可源自植物基因或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk，LR.P.，1998，TrendsPlantSc1.3，352-358;其通過(guò)引用并入本文)?？赡艿恼T導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz，C.，1997，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48,89-108;其通過(guò)引用并入本文)、類(lèi)固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Aoyama.T.Chua,N.H.，1997，Plantl.2，397-404;其通過(guò)引用并入本文)和乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Salter,M.G,等，1998,PlantlOurnal16,127-132；Caddick,Μ.X.,etal,1998,NatureBiotech.16,177-180,其通過(guò)引用并入本文)、細(xì)胞分裂素(cytokinin)誘導(dǎo)型IB6和CKIl基因(Brandstatter,1.和K.1eber,1.1.，1998,PlantCelllO,1009-1019；Kakimoto,T.，1996，Science274,982-985;其通過(guò)引用并入本文)以及生長(zhǎng)素(auxin)誘導(dǎo)型元件DR5(Ulmasov，T.，等，1997，PlantCell9，1963-1971;其通過(guò)引用并入本文)。[0104]組成型調(diào)節(jié)區(qū)指導(dǎo)基因在整個(gè)植物的各部分中表達(dá)，以及在整個(gè)植物發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)。已知的組成型調(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括與如下相關(guān)的啟動(dòng)子:CaMV35S轉(zhuǎn)錄物(Odell等，1985，Nature,313:810-812)、稻肌動(dòng)蛋白I(Zhang等，1991，PlantCell,3:1155-1165)、肌動(dòng)蛋白2(An等，1996，PlantJ.，10:107-121)或tms2(U.S.5，428，147，其通過(guò)引用并入本文)以及磷酸丙糖異構(gòu)酶I(Xu等，1994，PlantPhysiol.106:459-467)基因、玉米泛素I基因(Cornejo等，1993,PlantMol.Biol.29:637-646)、擬南芥泛素I和6基因(Holtorf等，1995，PlantMol.Biol.29:637-646)以及煙草翻譯起始因子4A基因(Mandel等，1995，PlantMol.Biol.29:995-1004)。[0105]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“組成型”不一定是指受組成型調(diào)節(jié)區(qū)控制的基因在所有細(xì)胞類(lèi)型中以相同水平表達(dá)，而是指所述基因在很多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)，但是常常觀察到不同的豐度。組成型調(diào)節(jié)元件可與另一些序列偶聯(lián)以進(jìn)一步增強(qiáng)與其可操作地相連接之核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，CMPV-HT系統(tǒng)源自紅豆花葉病毒(cowpeamosaicvirus,CPMV)的非翻譯區(qū)，并表明增強(qiáng)相關(guān)編碼序列的翻譯?！疤烊弧币庵负怂峄虬被嵝蛄惺翘烊坏模颉耙吧汀??！翱刹僮鞯叵噙B接”意指特定序列(例如目的調(diào)節(jié)元件和編碼區(qū))直接或間接地相互作用以實(shí)現(xiàn)預(yù)期功能(例如介導(dǎo)或調(diào)芐基因表達(dá))。可操作地相連接之序列的相互作用可例如通過(guò)與所述可操作地相連接之序列相互作用的蛋白質(zhì)來(lái)介導(dǎo)。[0106]本發(fā)明還提供了從細(xì)胞的質(zhì)膜獲得脂質(zhì)包膜的VLP，所述細(xì)胞中表達(dá)VLP。例如，如果一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白在基于植物的系統(tǒng)中表達(dá)，那么所得VLP可從該植物細(xì)胞的質(zhì)膜獲得脂質(zhì)包膜。[0107]通常，術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)”指脂溶性的(親脂性的)天然分子。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，在植物中產(chǎn)生的VLP可與植物來(lái)源的脂質(zhì)復(fù)合。植物來(lái)源的脂質(zhì)可以是脂雙層形式，并且還可包含圍繞VLP的包膜。植物來(lái)源的脂質(zhì)可包含產(chǎn)生VLP之植物的質(zhì)膜的脂質(zhì)組分，包括磷脂、甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯，以及脂溶性固醇或包含固醇的代謝物。實(shí)例包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、鞘糖脂、植物固醇或其組合。植物來(lái)源的脂質(zhì)可作為替代地稱(chēng)為“植物脂質(zhì)”。植物固醇的實(shí)例包括菜油固醇(campesterol)、豆固醇(stigmasterol)、麥角固醇(ergosterol)、菜子固醇(brassicasterol)>Δ-7-豆固醇、Δ-7-燕麥固醇(delta-7-avenasterol)、胡蘿卜固醇(daunosterol)、谷固醇(sitosterol)、24_甲基膽固醇、膽固醇或β_谷固醇(參見(jiàn)，例如Mongrand等,2004)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解,細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)組成可隨細(xì)胞或獲得細(xì)胞之生物或物種的培養(yǎng)或生長(zhǎng)條件而不同。通常，β_谷固醇是最大量的植物固醇。[0108]細(xì)胞膜通常包含脂質(zhì)雙層以及多種功能的蛋白質(zhì)。在脂雙層中可發(fā)現(xiàn)局部集中的特定脂質(zhì)，稱(chēng)為“脂質(zhì)筏(lipidraft)”。這些脂質(zhì)筏微結(jié)構(gòu)域可富含鞘脂和固醇。不希望受理論限制，脂質(zhì)筏可在胞吞和胞吐作用、病毒或其他感染性病原體的進(jìn)入或逸出(egress)、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、與細(xì)胞或生物體的其他結(jié)構(gòu)組分(例如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì))相互作用中具有重要作用。[0109]在植物內(nèi)產(chǎn)生的VLP可誘導(dǎo)包含植物特異性N-聚糖的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此，本發(fā)明還提供了包含具有植物特異性N-聚糖之天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的VLP。[0110]此外，植物中N-聚糖的修飾是已知的(參見(jiàn)例如U.S.60/944，344;其通過(guò)引用并入本文)，并且可產(chǎn)生具有經(jīng)修飾N-聚糖的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白?？色@得包含經(jīng)修飾糖基化模式(例如巖藻糖基化降低、木糖基化降低、或巖藻糖基化和木糖基化二者均減少)之N-聚糖的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白，或者可獲得具有經(jīng)修飾糖基化模式的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白，其中蛋白質(zhì)缺少巖藻糖基化、木糖基化或二者皆缺少，并包含提高的半乳糖基化。此外，與表達(dá)天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的野生型植物相比，翻譯后修飾的調(diào)節(jié)(例如添加末端半乳糖)可導(dǎo)致所表達(dá)天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的巖藻糖基化和木糖基化降低。[0111]例如(但不視為限制)，合成具有經(jīng)修飾糖基化模式的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白可通過(guò)使天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白與編碼β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)(例如但不限于哺乳動(dòng)物GalT或人GalT，但是也可以使用其他來(lái)源的GalT)的核苷酸序列一起共表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。還可將GalT的催化結(jié)構(gòu)域與N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(GNTl)的CTS結(jié)構(gòu)域(即胞質(zhì)尾區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、主干區(qū)(stemregion))相融合以產(chǎn)生GNTl-GalT雜交酶(hybridenzyme),并且所述雜交酶可與天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白共表達(dá)。天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白還可與編碼N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(GnT-1II)(例如但不限于哺乳動(dòng)物GnT-1II或人GnT-1II，還可使用其他來(lái)源的GnT-1II)的核苷酸序列一起共表達(dá)。另外，還可使用包含與GnT-1II相融合之GNTl的CTS的GNTl-GnT-1II雜交酶。[0112]因此，本發(fā)明還提供了包含具有經(jīng)修飾N-聚糖的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的VLP。[0113]不希望受理論限制，天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白上存在植物N-聚糖可通過(guò)促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞與天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)合來(lái)刺激免疫應(yīng)答。Saint-jore-Dupas等(2007)已提出使用植物N-聚糖來(lái)刺激免疫應(yīng)答。此外，VLP的構(gòu)象對(duì)于抗原的呈遞可以是有利的，并且當(dāng)與植物來(lái)源的脂質(zhì)層復(fù)合時(shí)增強(qiáng)VLP的佐劑作用。[0114]可使用任何合適的方法(例如蔗糖梯度或尺寸排阻色譜)來(lái)檢測(cè)VLP的存在?？赏ㄟ^(guò)例如電子顯微鏡或通過(guò)尺寸排阻色譜來(lái)評(píng)估VLP的結(jié)構(gòu)和大小。[0115]對(duì)于尺寸排阻色譜而言，可通過(guò)以下方法從植物組織提取總可溶性蛋白質(zhì):將冷凍粉碎的植物材料的樣品在提取緩沖液中勻漿(Polytron)，并通過(guò)離心除去不溶性的物質(zhì)。用冰冷的丙酮或PEG進(jìn)行沉淀也可以是有益的。對(duì)可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，并將提取物通過(guò)Sephacryl?柱(例如Sephacryl?S500柱)。BlueDextran2000可用作校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施色譜之后，可通過(guò)免疫印跡進(jìn)一步分析級(jí)分以確定級(jí)分的蛋白質(zhì)全量(complement)。[0116]經(jīng)分離的級(jí)分可以是例如上清液(如果離心、沉降或沉淀)或?yàn)V液(如果過(guò)濾)，并且富含蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(例如花結(jié)樣結(jié)構(gòu)(rosette-likestructure)或更高級(jí)更高分子量的顆粒如VLP)。還可通過(guò)例如額外的離心步驟、沉淀、色譜步驟(例如，尺寸排阻、離子交換、親和色譜)切向流過(guò)濾(tangentialflowfiltration)或其組合來(lái)處理經(jīng)分離的級(jí)分以對(duì)蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純化、濃縮或其組合。可通過(guò)例如非變性PAGE或SDS-PAGE、使用適當(dāng)檢測(cè)抗體的Western分析、毛細(xì)管電泳、電子顯微鏡或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的任何其他方法來(lái)確證經(jīng)純化的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的存在。[0117]圖3A和3B示出了包含VLP之植物提取物的尺寸排阻色譜分析的洗脫譜。在這種情況中，在級(jí)分8至約11中洗脫出包含天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的VLP，從約級(jí)分12至約14洗脫出花結(jié)和高分子量結(jié)構(gòu)，以及在來(lái)自約15至約17的級(jí)分中洗脫出低分子量或可溶性形式的天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白。[0118]可使用任何合適的方法(例如化學(xué)或生物化學(xué)提取)純化或提取VLP。VLP對(duì)干燥、加熱、pH、表面活性劑和去污劑相對(duì)敏感。因此，可用于使用這樣的方法:使產(chǎn)量最大化、使具有細(xì)胞蛋白質(zhì)之VLP級(jí)分的污染最小化、維持蛋白質(zhì)或VLP和(需要時(shí))締合脂質(zhì)包膜或膜的完整性的方法，使細(xì)胞壁松動(dòng)以釋放蛋白質(zhì)或VLP的方法。例如，可使用產(chǎn)生原生質(zhì)體/原生質(zhì)球的方法(參見(jiàn)例如W02011/035422，其通過(guò)引用并入本文)以獲得本文中描述的VLP。盡可能減小或消除使用去污劑或表面活性劑(例如SDS或TritonX-100)可對(duì)提高VLP提取的產(chǎn)率有益。隨后，可通過(guò)例如電子顯微鏡或通過(guò)如上所述尺寸排阻色譜來(lái)評(píng)估VLP的結(jié)構(gòu)和大小。[0119]本發(fā)明的一種或多于一種或更多種基因構(gòu)建體可在由本發(fā)明的核苷酸序列、構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化的任意合適的植物宿主中表達(dá)。合適宿主的實(shí)例包括但不限于農(nóng)作物，包括苜猜、油菜、蕓苔屬(Brassicaspp.)、玉米、煙草屬(Nicotianaspp.)、苜猜、馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、稻、大豆、小麥、大麥、向日葵和棉花等。[0120]本發(fā)明的一種或更多種基因構(gòu)建體還可包含3’非翻譯區(qū)。3’非翻譯區(qū)是指這樣的基因部分，其包含含有多腺苷酸化信號(hào)和能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)之任意其他調(diào)節(jié)信號(hào)的DNA區(qū)段。多腺苷酸化信號(hào)的特征一般在于向mRNA前體的3’端添加聚腺苷酸鏈(polyadenylicacidtrack)。多腺苷酸化信號(hào)常通過(guò)存在與典型形式5’AATAAA-3’的同源性來(lái)識(shí)別，但是也會(huì)出現(xiàn)變異。合適的3’區(qū)的非限制性實(shí)例是含有以下基因之多腺苷酸化信號(hào)的3’經(jīng)轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū):農(nóng)桿菌(Agrobacterium)腫瘤誘導(dǎo)(tumorinducing,Ti)質(zhì)?；?例如胭脂氨酸合成酶(nopalinesynthase,N0S)基因)、植物基因(例如大豆貯藏蛋白基因)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞單位的基因(ssRUBISCO;US4，962，028；其通過(guò)引用并入本文)、在US7，125，978(其通過(guò)引用并入本文)中描述的用于調(diào)節(jié)質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)的啟動(dòng)子。[0121]需要時(shí)，本發(fā)明的一種或更多種基因構(gòu)建體還可包含另外的增強(qiáng)子(翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。增強(qiáng)子可位于轉(zhuǎn)錄序列的5'或3'。增強(qiáng)子區(qū)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可包括ATG起始密碼子、鄰近序列等。如果存在，起始密碼子可在編碼序列的閱讀框內(nèi)(“框內(nèi)”)，以提供經(jīng)轉(zhuǎn)錄序列的正確翻譯。[0122]可使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等將本發(fā)明的構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞中。此類(lèi)技術(shù)的綜述參見(jiàn)例如Weissbach和Weissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademyPress,紐約VIII,421-463頁(yè)(1988)；Geierson和Corey,PlantMolecularBiology,第2版(1988)；以及Miki和Iyer,FundamentalsofGeneTransferinPlants.PlantMetabolism,第2版，DT.Dennis,DHTurpin,DDLefebrve,DBLayzell(編)，Addisonffesly,LangmansLtd.London,561-579頁(yè)(1997)。其他的方法包括直接DNA攝入、使用脂質(zhì)體、電穿孔(例如使用原生質(zhì)體)、顯微注射、微粒(microprojectile)或晶須(whisker)、以及真空滲入(vacuuminfiltration)。參見(jiàn)例如Bilang等(GenelOO:247-250(1991))、Scheid等(Mol.Gen.Genet.228:104-112,1991)、Guerche等(PlantScience52:111-116,1987)、Neuhause等(Theor.ApplGenet.75:30-36,1987)、Klein等，Nature327:70-73(1987)、Howell等(Science208:1265，1980)、Horsch等(Science227:1229-1231,1985)、DeBlock等，PlantPhysiology91:694-701，1989)，MethodsforPlantMolecularBiology(ffeissbach和Weissbach編，AcademicPressInc.,1988)、MethodsinPlantMolecularBiology(Schuler和Zielinski編，AcademicPressInc.,1989)、Liu和Lomonossoff(J.VirolMeth,105:343-348,2002);美國(guó)專(zhuān)利N0.4，945，050；5,036,006;和5，100，792，1995年5月10日提交的序列號(hào)為08/438，666的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)和1992年9月25日提交的序列號(hào)為07/951，715的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng))(所有這些文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文)。[0123]如下文所述，可使用瞬時(shí)表達(dá)法表達(dá)本發(fā)明的構(gòu)建體(參見(jiàn)Liu和Lomonossoff,2002,JournalofVirologicalMethods,105:343-348;其通過(guò)引用并入本文)?；蛘?，可使用基于真空的瞬時(shí)表達(dá)法，如Kapila等，1997(其通過(guò)引用并入本文)所述。這些方法可包括例如但不限于農(nóng)桿菌接種法或農(nóng)桿菌滲入法、注射器滲入法，然而，還可使用其他瞬時(shí)方法，如上所述。使用農(nóng)桿菌接種法、農(nóng)桿菌滲入法或注射器滲入法時(shí)，包含期望核酸的農(nóng)桿菌混合物進(jìn)入組織(例如葉、植物的地上部分(包括莖、葉和花)、植物的其他部分(莖、根、花)或整個(gè)植株)的細(xì)胞間隙中。穿過(guò)表皮后，農(nóng)桿菌感染細(xì)胞并將t-DNA拷貝轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。t-DNA以附加體形式轉(zhuǎn)錄并且其mRNA被翻譯，導(dǎo)致在感染細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白，然而，t-DNA在細(xì)胞核內(nèi)的這種傳遞是瞬時(shí)的。[0124]為了幫助鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，可進(jìn)一步處理本發(fā)明的構(gòu)建體以使其包含植物選擇標(biāo)記。可用的選擇標(biāo)記包括提供針對(duì)化學(xué)品(例如抗生素，如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素；或除草劑，如草丁膦(phosphinothrycin)、草甘膦(glyphosate)、氯磺隆(chlorosulfuron)等)之抗性的酶。類(lèi)似地,可使用產(chǎn)生可通過(guò)顏色變化進(jìn)行鑒別之化合物的酶(例如GUS(β-葡萄糖醛酸酶))或產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的酶(螢光素酶或GFP)。[0125]作為本發(fā)明的一部分，還考慮含有本發(fā)明的基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或種子。從植物細(xì)胞再生完整植物的方法也是本領(lǐng)域中已知的。通常,將經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，該培養(yǎng)基可含有選擇劑(例如抗生素)，其中使用選擇標(biāo)記以有利于鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。愈傷組織(callus)—旦形成，可根據(jù)已知的方法采用適當(dāng)?shù)闹参锛に貋?lái)促進(jìn)芽的形成，并將芽移至生根培養(yǎng)基(rootingmedium)中用于植物的再生。然后，通過(guò)種子或利用營(yíng)養(yǎng)繁殖(vegetativepropagation)技術(shù),該植物可反復(fù)用于形成子代。還可不使用組織培養(yǎng)物來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。[0126]本發(fā)明包括核苷酸序列:[0127]表1.序列識(shí)別碼的列表。[0128]【權(quán)利要求】1.在植物中產(chǎn)生狂犬病病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括:a)將包含調(diào)節(jié)區(qū)的核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，所述調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可操作地相連接，b)在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或所述植物的一部分，從而產(chǎn)生所述狂犬病VLP。2.在植物中產(chǎn)生狂犬病病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括:a)提供植物或所述植物的一部分，其包含含有調(diào)節(jié)區(qū)的核酸，所述調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列可操作地相連接，b)在允許表達(dá)所述核酸的條件下孵育所述植物或所述植物的一部分，從而產(chǎn)生所述狂犬病VLP。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述核苷酸序列還編碼、包含或者既編碼又包含一種或多于一種擴(kuò)增兀件。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述一種或多于一種擴(kuò)增元件為雙粒病毒組擴(kuò)增元件。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述一種或多于一種雙粒病毒組擴(kuò)增元件選自菜豆黃矮病毒長(zhǎng)基因間區(qū)(BeYDVLIR)和BeYDV短基因間區(qū)(BeYDVSIR)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將包含第二調(diào)節(jié)區(qū)的第二核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，并且當(dāng)在步驟b)中孵育所述植物或所述植物的一部分時(shí)表達(dá)所述第二核酸，所述第二調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼基質(zhì)蛋白或其片段的第二核苷酸序列可操作地相連接。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述植物或所述植物的一部分還包含含有第二調(diào)節(jié)區(qū)的第二核酸，并且當(dāng)在步驟b)中孵育所述植物或所述植物的一部分時(shí)表達(dá)所述第二核酸，所述第二調(diào)節(jié)區(qū)在所述植物中有活性并且與編碼基質(zhì)蛋白或其片段的第二核苷酸序列可操作地相連接。8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、6和7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白為狂犬病糖蛋白(G)或所述狂犬病G蛋白的片段。9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述基質(zhì)蛋白為狂犬病基質(zhì)蛋白(M)或所述M蛋白的片段。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述引入步驟(步驟a)中，所述核酸在所述植物中瞬時(shí)表達(dá)。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述引入步驟(步驟a)中，所述核酸在所述植物中穩(wěn)定表達(dá)。12.根據(jù)權(quán)利要求1、2、6和7中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括以下步驟:c)收獲所述植物，以及d)提取所述VLP。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述VLP的大小為40至300nm。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述VLP通過(guò)生物化學(xué)提取進(jìn)行提取。15.植物來(lái)源的VLP，其包含一種或更多種天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白或其片段。16.VLP，其由根據(jù)權(quán)利要求1、2、6和7中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的VLP，其還包含來(lái)自植物的一種或多于一種脂質(zhì)。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的VLP，其中一種或更多種病毒蛋白質(zhì)包含植物特異性N-聚糖或經(jīng)修飾N-聚糖。19.組合物，其包含用于在對(duì)象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述之VLP和可藥用載體。20.在對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)狂犬病病毒感染之免疫的方法，其包括施用根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述組合物經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用于對(duì)象。22.多克隆抗體，其使用如權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所描述的VLP來(lái)制備。23.植物物質(zhì)，其包含由根據(jù)權(quán)利要求1、2、6和7中任一項(xiàng)所述之方法產(chǎn)生的VLP。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物物質(zhì)，其用于在對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)狂犬病病毒感染的免疫。25.食物補(bǔ)充劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求24所述的植物物質(zhì)。26.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法，其還包括引入另外的核酸序列，所述另外的核酸序列編碼沉默抑制子、雙粒病毒組復(fù)制酶或二者。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述沉默抑制子和所述雙粒病毒組復(fù)制酶由引入到所述植物或所述植物的一部分中的兩種不同的另外的核酸序列編碼。28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的方法，其中所述沉默抑制子選自HcPio和pl9。29.根據(jù)權(quán)利要求1、2、6和7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白與SEQIDNO:14具有至少90%的序列同一性。30.根據(jù)權(quán)利要求1、2、6和7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述天然狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白具有如SEQIDNO:14所不的氣基酸序列。31.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述基質(zhì)病毒蛋白與SEQIDNO:6具有至少90%的序列同一性。32.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述基質(zhì)病毒蛋白具有如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。33.根據(jù)權(quán)利要求1、2、6和7中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含所述調(diào)節(jié)區(qū)的所述核酸序列還與一種或多于一種豇豆花葉病毒屬增強(qiáng)子可操作地相連接。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述一種或多于一種豇豆花葉病毒屬增強(qiáng)子是豇豆花葉病毒屬UTR。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述豇豆花葉病毒屬UTR是豇豆花葉病毒(CPMV)UTR。36.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述VLP不包含病毒基質(zhì)或核心蛋白?！疚臋n編號(hào)】C12N7/00GK103998601SQ201280034638【公開(kāi)日】2014年8月20日申請(qǐng)日期:2012年6月13日優(yōu)先權(quán)日:2011年6月13日【發(fā)明者】馬克-安德烈·德奧斯特,皮埃爾-奧列弗·拉瓦,路易斯-菲利普·韋齊納,馬農(nóng)·科圖雷申請(qǐng)人:麥迪卡格公司