專利名稱：一種新型狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus, RV)引起的一種人獸共患傳染病，一旦發(fā)病，病死率幾乎100%。發(fā)生狂犬病暴露時(shí)需要及時(shí)進(jìn)行狂犬病暴露后處置，主要包括接種狂犬病疫苗和注射狂犬病免疫球蛋白制劑，使機(jī)體產(chǎn)生或獲得狂犬病病毒中和抗體，從而阻止病毒入侵機(jī)體。國內(nèi)人用狂犬病疫苗生產(chǎn)企業(yè)普遍應(yīng)用的狂犬病病毒疫苗株為PV、CTNl、aG，然而國內(nèi)對這些疫苗株抗原性和保護(hù)性的研究資料并不充分，原因在于狂犬病病毒野毒株的分離、培養(yǎng)需要在BSL-3級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并且國內(nèi)分離的狂犬病病毒野毒株數(shù)量有限，限制了疫苗接種后野毒攻擊試驗(yàn)的開展范圍。依據(jù)疫苗株和野毒株核酸和氨基酸序列相似性來推導(dǎo)抗原性相似是目前較通用的做法，然而，大量抗狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白單克隆抗體結(jié)合試驗(yàn)提示狂犬病病毒野毒株和疫苗株在抗原性方面存在差異，僅依靠序列相似性來推導(dǎo)抗原相似性的做法并不妥當(dāng)。建立一種行之有效的模型在體外試驗(yàn)水平評估人用狂犬病病毒疫苗株免疫對野毒株的保護(hù)效果有一定意義。快速突光灶抑制試驗(yàn)(rapidfluorescent focus inhibition test,RFFIT)是世界衛(wèi)生組織(World Health Organisation,WHO)推薦的狂犬病病毒中和抗體體外檢測方法之一，該方法是在細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上進(jìn)行的微量中和試驗(yàn)，一個(gè)流程可在24h內(nèi)完成，在96孔板上進(jìn)行適合大批量樣品檢測，通常用于評價(jià)疫苗接種后機(jī)體對狂犬病病毒的中和能力。考慮到攻擊病毒為野毒株時(shí)需要BSL-3級實(shí)驗(yàn)室并且野毒株數(shù)量有限，如果可以采用狂犬病病毒野毒株的模擬病毒(即狂犬病病毒假病毒)作為攻擊病毒，那么一方面可以擴(kuò)大驗(yàn)證范圍，另一方面有可能降低實(shí)驗(yàn)所要求生物安全級別。發(fā)明內(nèi)容:假病毒包裝系統(tǒng)主要有:以鼠類白血病病毒(murine leukemia virus, MLV)為基礎(chǔ)構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝組份；以慢病毒(Ientivirus)，如HIV-1，為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體和包裝組份。以慢病毒載體為基礎(chǔ)的假病毒不同于以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為基礎(chǔ)的假病毒，對分裂期和非分裂期細(xì)胞均具有感染能力。利用假病毒模擬病毒包膜糖蛋白活性使一些沒有敏感培養(yǎng)細(xì)胞系的病毒(如HCV)的中和抗體檢測成為可能，也使一些生物安全級別要求較高的病毒(如HIV)的中和抗體檢測可以在BSL-2級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。關(guān)于制備狂犬病病毒假病毒進(jìn)行狂犬病相關(guān)研究的報(bào)道非常有限和缺乏系統(tǒng)性。為了克服目前狂犬病病毒研究的上述局限性，本發(fā)明利用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體平臺(tái)構(gòu)建狂犬病病毒假病毒，并在此基礎(chǔ)上摸索將狂犬病病毒假病毒應(yīng)用于狂犬病病毒中和抗體評價(jià)、狂犬病病毒中和性單克隆抗體抗原表位篩選、抗狂犬病病毒藥物(進(jìn)入或融合抑制劑)高通量篩選、新型狂犬病疫苗制備，形成一套全新的狂犬病病毒假病毒構(gòu)建、制備及應(yīng)用技術(shù)體系。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種新型狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，包括含有狂犬病病毒糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒所共同構(gòu)成的載體系統(tǒng)以及宿主細(xì)胞，將載體系統(tǒng)中的穿梭質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，即可在培養(yǎng)上清中獲得狂犬病病毒假病毒。如上述技術(shù)方案所述狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，其中，所采用的pVRC-RVG系列穿梭質(zhì)粒為分別含有狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11、疫苗株P(guān)V、CTNU aG的糖蛋白基因序列并能表達(dá)相應(yīng)蛋白的質(zhì)粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG, pVRC-CTNIG、pVRC-aGG。如上述技術(shù)方案所述狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，其中，優(yōu)選采用慢病毒雙質(zhì)粒系統(tǒng)，慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)亦可采用。如上述技術(shù)方案所述狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，其中，其所述輔助質(zhì)粒分別為慢病毒雙質(zhì)粒系統(tǒng)的PNL4-3.GFP/Luc.R_E_，慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)的pCS_CG+pCMV A R8.2以及逆轉(zhuǎn)錄病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)的pMLV-gagpol+pMLV-EGFP。如上述技術(shù)方案所述狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，其中，所優(yōu)選采用的宿主細(xì)胞為293FT細(xì)胞。 新型狂犬病病毒假病毒的制備方法，包括如下步驟:a、采用pVRC載體構(gòu)建含有狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11、疫苗株P(guān)V、CTNUaG糖蛋白基因的 pVRC-RVG 系列穿梭質(zhì)粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG, pVRC-CTNIG、pVRC-aGG ；b、與優(yōu)選采用的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；C、培養(yǎng)宿主細(xì)胞；d、從培養(yǎng)上清中分離獲得假病毒。如上述技術(shù)方案所述新型狂犬病病毒假病毒的制備方法，其中，所述pVRC-RVG系列穿梭質(zhì)粒中，CVS-1l糖蛋白基因(GenBank ID:GQ918139)、PV糖蛋白基因(GenBankID JX276550)、CTN-1 糖蛋白基因(GenBank ID:HQ317918)、aG 糖蛋白基因(GenBank ID:L04522)為首次應(yīng)用于狂犬病病毒假病毒制備，所述宿主細(xì)胞為293FT細(xì)胞。應(yīng)用狂犬病病毒假病毒進(jìn)行狂犬病病毒中和抗體評價(jià)，中和性單克隆抗體抗原表位篩選,抗病毒藥物的高通量篩選以及疫苗制備。具體的技術(shù)方案如下:構(gòu)建狂犬病病毒新型假病毒載體、制備狂犬病病毒假病毒顆粒進(jìn)行狂犬病相關(guān)研究的技術(shù)體系，包括下述步驟:1、狂犬病病毒新型假病毒系統(tǒng)的構(gòu)建，包括如下步驟:(I)、穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建:依據(jù)狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11、疫苗株P(guān)V、CTNUaG糖蛋白基因和載體PVRC8301質(zhì)粒(美國國立衛(wèi)生研究院疫苗研究中心Gary J.Nable教授惠贈(zèng))多克隆位點(diǎn)區(qū)序列設(shè)計(jì)引物(CVSG-P1/CVSG-P2、PVG-P1/PVG-P2、CTNG-P1/CTNG-P2、aGG-Pl/aGG-P2)并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，在上游引物序列中引入Xba I的酶切序列，在下游引物中引入Bgl II的酶切序列，引物序列如下:CVSG-Pl(SEQ ID NO:1):5' -tatgctctagagcatggttcctcaggttcttttgtttg-31CVSG-P2(SEQ ID NO:2):5' -tatgaagatcttctcacagtctgatctcacctccac-31
PVG-Pl(SEQ ID NO:3):5' -tatgctctagagcatggttcctcaggctctcctg-3'PVG-P2(SEQ ID NO:4):5' -tatgaagatcttctcacagtccggtctc-31CTNG-Pl(SEQ ID NO:5):5' -tatgctctagagcatgattcctcaagctctgttgtttg-31CTNG-P2(SEQ ID NO:6):5' -tatgaagatcttcttacagcttggtctcacctccgc-31aGG-Pl (SEQ ID NO:7):5' -tatgctctagagcatggttcctcaagctcttttgcttg-31aGG_P2 (SEQ ID NO:8):5' -tatgaagatcttctcacagttcagtcacacccccaa-3'從CVS-11、PV、CTNl、aG細(xì)胞培養(yǎng)上清提取總RNA，采用invitrogen公司Superscript II逆轉(zhuǎn)錄 試劑盒構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄cDNA文庫。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，PCR擴(kuò)增CVS-11, PV、CTNU aG 糖蛋白基因，CVSG-PI/CVSG-P2, PVG-P1/PVG-P2、CTNG-P1/CTNG-P2、aGG-Pl/aGG-P2 成對引物PCR反應(yīng)條件相同，94°C 3min ；94°C 40sec，54°C 50sec，72°C 2min,共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物凝膠回收產(chǎn)物和PVRC8301載體質(zhì)粒稀釋至適宜濃度，采用限制性核酸內(nèi)切酶Xba I和Bgl II進(jìn)行酶切，37°C 2h，酶切后的PCR產(chǎn)物和pVRC8301載體以T4DNA連接酶在4°C下過夜連接，分別構(gòu)建攜帶CVS-1l糖蛋白基因(GenBank ID:GQ918139)、PV糖蛋白基因(GenBank ID JX276550)、CTN_1 糖蛋白基因(GenBank ID:HQ317918)、aG 糖蛋白基因(GenBank ID:L04522)的穿梭質(zhì)粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTNIG、pVRC-aGG (為表達(dá)方便，后文統(tǒng)一以pVRC-RVG代替)。(2)、狂犬病病毒假病毒包裝系統(tǒng)的選擇:依據(jù)容易獲得、代表性好、操作便捷、經(jīng)驗(yàn)成熟的原則，從實(shí)驗(yàn)室載體庫中選擇“PNL4-3.GFP/Luc.R_E_+pVRC-RVG”慢病毒雙質(zhì)粒系統(tǒng)(pNL4_3.GFP/Luc.R-E-由美國 NIH AIDS Research&Reference Reagent Program 免費(fèi)提供)、“pCS-CG+pCMV A R8.2+pVRC-RVG” 慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)(pCS_CG 與 pC MV A R8.2 購自美國invitrogen公司)、“pMLV-gagpol+pMLV_EGFP+pVRC-RVG”逆轉(zhuǎn)錄病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)(pMLV-gagpol與pMLV-EGFP由法國巴斯德研究所Jacob Francois教授免費(fèi)提供)用于狂犬病病毒假病毒包裝。其中PNL4-3.GFP/Luc.R-E-雙質(zhì)粒慢病毒載體系統(tǒng)操作最便捷，該載體以編碼HIV-1原病毒(provirus)的全長質(zhì)粒pNL4_3為基礎(chǔ)，將GFP/Luc基因插入NEF基因讀碼框內(nèi)(5'端酶切位點(diǎn)NotI，3'端酶切位點(diǎn)XhoI)，并通過ENV和VPR基因5'端的移碼突變使得ENV和VPR蛋白缺陷，需要外源膜蛋白基因共轉(zhuǎn)染才能包裝出子代假病毒顆粒，通過改變膜蛋白基因可產(chǎn)生不同特征的假病毒顆粒。(3)、轉(zhuǎn)染試劑的選擇:選擇 Fugene HD、Nanojuice、Lipofectamine2000 三種轉(zhuǎn)染試劑，比較不同轉(zhuǎn)染試劑對狂犬病病毒假病毒包裝效率的影響。上述技術(shù)方案中所述方法，其中，所述穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建中狂犬病病毒株選擇原則為兼顧國內(nèi)主流疫苗株(PV、CTNl、aG)和標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株(CVS-1l)，以便對比不同疫苗株免疫后機(jī)體中和抗體對標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株的中和能力；所述轉(zhuǎn)染試劑篩選過程為:取I u gpMLV-EGFP 質(zhì)粒，分別米用 Fugene HD> Nanojuice、Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染 293FT 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后觀察熒光顯色293FT細(xì)胞比例，判定不同轉(zhuǎn)染試劑對pMLV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的影響。2、狂犬病病毒假病毒顆粒的制備和敏感細(xì)胞系的選擇，包括如下步驟:(I)、如上采用pVRC8301載體構(gòu)建含有狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11、疫苗株P(guān)V、CTNU aG 糖蛋白基因的 pVRC-RVG 系列穿梭質(zhì)粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTNIG、pVRC-aGG ；(2)、與優(yōu)選采用的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；(3)、培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(4)、從培養(yǎng)上清中分離獲得假病毒；(5)、假病毒敏感細(xì)胞系的選擇:以狂犬病病毒CVS-1l假病毒感染293FT、MNA、BHK-21、BSR、Hu7-CD81、A549細(xì)胞，對比不同細(xì)胞系對狂犬病病毒CVS-1l假病毒的敏感性。本技術(shù)方案中輔助質(zhì)粒為“pNL4-3.GFP/Luc.R-E-”、“pCS_CG+pCMV A R8.2”或“pMLV-gagpol+pMLV-EGFP”。上述技術(shù)方案中所述方法，其中，所述新型狂犬病病毒假病毒的制備方法過程為:將選定 的三個(gè)載體系統(tǒng)的各質(zhì)粒按照分別按照PNL4-3.GFP/Luc.R-E-: pVRC-RVG = I: 1.5、pCS-CG: pCMV A R8.2: pVRC-RVG = I: I: 1.5 以及pMLV-gagpol: pMLV-EGFP: pVRC-RVG = I: I: 1.5 的比例共轉(zhuǎn)染 293FT 細(xì)胞，48h 后收獲上清，2000g離心5min，取上清分裝凍存，上清中含有狂犬病病毒假病毒顆粒；所述敏感細(xì)胞系篩選過程為:將 293FT、MNA、BHK-21、BSR、Hu7-CD81、A549 細(xì)胞分別以 5，000-10, 000個(gè)細(xì)胞/孔平行接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以同一批制備的狂犬病病毒CVS-1l假病毒平行感染，72h后熒光顯微鏡下觀察，對比不同細(xì)胞系對狂犬病病毒CVS-1l假病毒的敏感性。3、狂犬病病毒假病毒在狂犬病相關(guān)研究中的應(yīng)用，可能包括狂犬病病毒中和抗體評價(jià)、狂犬病病毒中和性單克隆抗體抗原表位篩選、抗狂犬病病毒藥物高通量篩選、新型狂犬病疫苗制備。其中，狂犬病病毒CVS-1l假病毒應(yīng)用于狂犬病病毒中和抗體評價(jià)是核心，為狂犬病病毒假病毒其它應(yīng)用的基礎(chǔ)和必備工作?？袢〔《綜VS-1l假病毒用于狂犬病病毒中和抗體評價(jià)，包括如下步驟:(I)、驗(yàn)證血清樣品的選擇:共20份人血清樣品，為5位狂犬疫苗接種者在接種前的本底血清以及免疫后7d、14d、45d采集的系列血清；(2)、以狂犬病病毒假病毒進(jìn)行狂犬病毒中和抗體檢測:以狂犬病病毒假病毒取代原型狂犬病病毒進(jìn)行RFFIT，摸索適宜的狂犬病病毒假病毒中和用量、感染細(xì)胞系種類、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、結(jié)果判讀方式；(3)、結(jié)果比較:所有人血清樣品以狂犬病病毒假病毒進(jìn)行RFFIT的檢測結(jié)果和以狂犬病病毒進(jìn)行RFFIT的檢測結(jié)果比較，驗(yàn)證檢測結(jié)果之間的一致性。上述技術(shù)方案中所述方法，其中，所述狂犬病病毒假病毒用于狂犬病病毒中和抗體評價(jià)的過程為:待測人血清樣品做系列1: 3倍比稀釋，37°C與狂犬病病毒假病毒共孵育lh，加入MNA細(xì)胞，72h后熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)各孔的熒光顯色細(xì)胞比例，或用Bright Glo熒光素酶檢測試劑裂解細(xì)胞，GL0MAX96微孔板發(fā)光檢測儀讀數(shù)，套用RFFIT結(jié)果計(jì)算公式求取中和抗體效價(jià)。上述技術(shù)方案中所述方法，其中，所述采用“pNL4-3.GFP/Luc.R_E_+pVRC-RVG”慢病毒雙質(zhì)粒系統(tǒng)可以高效包裝國內(nèi)主流狂犬病病毒疫苗株和標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株的假病毒顆粒，適于進(jìn)行狂犬病病毒中和抗體評價(jià)，為狂犬病病毒假病毒應(yīng)用于狂犬病病毒中和性單克隆抗體抗原表位篩選、抗狂犬病病毒藥物高通量篩選、新型狂犬病疫苗制備奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明系統(tǒng)構(gòu)建了多個(gè)狂犬病病毒新型假病毒載體，成功制備了狂犬病病毒假病毒顆粒，該模型有四大優(yōu)勢:一是，即便沒有分離到相應(yīng)狂犬病病毒株也可以模擬研究其糖蛋白抗原性；二是，可以單因素研究外界相關(guān)因子對狂犬病病毒糖蛋白的作用，排除了狂犬病病毒其它結(jié)構(gòu)蛋白的影響；三是，狂犬病病毒假病毒滴度較高，濃縮和純化易于進(jìn)行，提供了潛在的制備狂犬病疫苗的技術(shù)儲(chǔ)備；四是，對于狂犬病病毒野毒株進(jìn)行模擬可以降低實(shí)驗(yàn)操作的生物安全級別，便于對狂犬病病毒中和性單克隆抗體進(jìn)行中和反應(yīng)譜和抗原表位鑒定。本發(fā)明系統(tǒng)地探索了將狂犬病病毒假病毒應(yīng)用于狂犬病病毒中和抗體評價(jià)，為將狂犬病病毒假病毒應(yīng)用于狂犬病病毒中和性單克隆抗體抗原表位篩選、抗狂犬病病毒藥物高通量篩選、新型狂犬病疫苗制備奠定了基礎(chǔ)。


:1、圖1 為 pNL4-3.GFP/Luc.R-E_+pVRC_CSVG 包裝過程圖；2、圖 2 為 pCS-CG+pCMV A R8.2+pVRC-CSVG 包裝過程圖；3、圖 3 為 pMLV-gagpol+pMLV-EGFP+pVRC-CSVG 包裝過程
4、圖4為Fugene HD對pMLV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞的效果圖(200 X)；5、圖5為Nanojuice對pMLV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞的效果圖(200 X)；6、圖 6 為 Lipofectamine2000 對 pMLV-EGFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293FT 細(xì)胞的效果圖(200X)；7、圖7為A549細(xì)胞系對狂犬病病毒假病毒的感染效果圖(200X)；8、圖8為BHK-21細(xì)胞系對狂犬病病毒假病毒的感染效果圖(200X)；9、圖9為BSR細(xì)胞系對狂犬病病毒假病毒的感染效果圖(200 X)；10、圖10為293FT細(xì)胞系對狂犬病病毒假病毒的感染效果圖(200 X)；11、圖11為HU7-OT81細(xì)胞系對狂犬病病毒假病毒的感染效果圖(200 X)；12、圖12為MNA細(xì)胞系對狂犬病病毒假病毒的感染效果圖(200 X)；13、圖13為5名狂犬病疫苗接種者系列血清狂犬病病毒中和抗體評價(jià)。
具體實(shí)施方式
:為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1:一、狂犬病病毒新型假病毒系統(tǒng)的構(gòu)建1、穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建(I)、目的基因片段的擴(kuò)增:以狂犬病病毒CVS-11、PV、CTNl、aG分別感染BHK-21細(xì)胞，感染后72h常規(guī)Tizol法提取核酸；采用invitrogen公司Superscript II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄cDNA文庫；以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以CVSG-P1/CVSG-P2、PVG-P1/PVG-P2、CTNG-PI/CTNG-P2、aGG_Pl/aGG_P2為引物(引物序列見序列表中SEQ ID NO:1 8)分別擴(kuò)增CVS-1U PV、CTNU aG糖蛋白基因，PCR反應(yīng)條件統(tǒng)一為94°C 3min ；94°C 40sec,54°C 50sec，72°C 2min，共 35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lOmin。(2)、攜帶目的基因的pVRC8301載體的構(gòu)建:PCR產(chǎn)物凝膠回收產(chǎn)物和pVRC8301載體質(zhì)粒稀釋至適宜濃度，采用限制性核酸內(nèi)切酶Xba I和Bgl II進(jìn)行酶切，37°C 2h，酶切后的PCR產(chǎn)物和pVRC8301載體以T4DNA連接酶在4°C下過夜連接，分別構(gòu)建攜帶CVS-1l糖蛋白基因(GenBank ID:GQ918139)、PV 糖蛋白基因(GenBank ID JX276550)、CTN-1糖蛋白基因(GenBank ID:HQ317918)、aG糖蛋白基因(GenBankID:L04522)的穿梭質(zhì)粒pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTNIG、pVRC-aGG (為表達(dá)方便，后文統(tǒng)一以 pVRC-RVG 代替)。2、狂犬病病毒假病毒包裝系統(tǒng)的選擇選擇“pNL4_3.GFP/Luc.R-E-+pVRC-RVG” 慢病毒雙質(zhì)粒系統(tǒng)、“pCS-CG+pCMV A R8.2+pVRC-RVG”慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)、“pMLV-gagpol+pMLV-EGFP+pVRC-RVG”逆轉(zhuǎn)錄病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)用于狂犬病病毒假病毒包裝，以pVRC-CSVG為例的“pNL4-3.GFP/Luc.R-E-+pVRC-CSVG” 慢病毒雙質(zhì)粒系統(tǒng)、“pCS-CG+pCMV A R8.2+pVRC-CSVG” 慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)和“pMLV-gagpoI+pMLV-EGFP+pVRC-CSVG”逆轉(zhuǎn)錄病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)的包裝過程見圖1-圖 3。3、轉(zhuǎn)染試劑的選擇取I ii gpMLV-EGFP 質(zhì)粒，分別米用 Fugene HD > Nano juice、Lipof ectamine2000 轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，轉(zhuǎn)然后觀察熒光顯色293FT細(xì)胞比例，判定不同轉(zhuǎn)染試劑對pMLV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果顯示3種轉(zhuǎn)染試劑都顯示良好的轉(zhuǎn)染效果，如圖4-圖6所示，，圖4為Fugene HD對pMLV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞的效果圖，圖5為Nanojuice對pMLV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞的效果圖，圖6為Lipofectamine2000對pMLV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞的效果圖，后續(xù)實(shí)驗(yàn)常規(guī)采用Lipofectamine2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。二、狂犬病病毒假病毒顆粒的制備和敏感細(xì)胞系的選擇1、狂犬病病毒假病毒顆粒的制備以Lipofectamine2000作為轉(zhuǎn)染試劑,將選定載體系統(tǒng)的各質(zhì)粒按照膜蛋白質(zhì)粒:包裝質(zhì)粒:穿梭質(zhì)粒比例1:1: 1.5共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察熒光顯色293FT細(xì)胞比例，48h收獲上清，2000g離心5min，取上清分裝凍存。2、狂犬病病毒假病毒敏感細(xì)胞系的選擇將293FT、MNA、BHK-21、BSR、Hu7_CD81、A549 細(xì)胞分別以 5，000-10，000 個(gè)細(xì)
胞/孔平行接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞長至80 %滿時(shí)可用。將“pNL4-3.GFP/Luc.R-E-+pVRC-RVG”慢病毒雙質(zhì)粒系統(tǒng)包被的同一批CVS-1I假病毒進(jìn)行系列1: 2倍比稀釋，每個(gè)稀釋度每種細(xì)胞平行感染2孔，72h后熒光顯微鏡下觀察，對比不同細(xì)胞系對CVS-1l假病毒的敏感性。結(jié)果顯示293FT、MNA、Hu7-⑶81細(xì)胞系對CVS-1l假病毒敏感，結(jié)果如圖7-圖12所示，其中圖7-12分別為A549、BHK-21、BSR、293FT、Hu7-CD81和MNA6種細(xì)胞系對狂犬病病毒假病毒的感染效果圖，其中MNA為已知的對狂犬病病毒敏感的細(xì)胞系，CVS-1l假病毒1: 16稀釋度顯示MNA細(xì)胞80%感染，可以確定為進(jìn)行狂犬病病毒中和抗體RFFIT檢測的中和病毒用量。三、狂犬病病毒假病毒應(yīng)用研究的技術(shù)基礎(chǔ)=CVS-1l假病毒用于RFFIT1、采用CVS-1l假病毒進(jìn)行RFFIT實(shí)驗(yàn)流程的建立在傳統(tǒng)RFFIT基礎(chǔ)上，采用CVS-1l 假病毒進(jìn)行RFFIT的方法為:將待測血清樣品做系列1: 3倍比稀釋，37°C與1: 16稀釋的0^-11假病毒共孵育111，加入1^^，7211后熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)各孔的熒光顯色細(xì)胞比例，或用Bright Glo熒光素酶檢測試劑裂解細(xì)胞，GL0MAX96微孔板發(fā)光檢測儀讀數(shù)，結(jié)果見表1，套用RFFIT結(jié)果計(jì)算公式求取中和抗體效價(jià)。表1GL0MAX96微孔板發(fā)光檢測儀讀數(shù)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種新型狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，包括含有狂犬病病毒糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒所共同構(gòu)成的載體系統(tǒng)以及宿主細(xì)胞，將載體系統(tǒng)中的穿梭質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，即可在培養(yǎng)上清中獲得狂犬病病毒假病毒。
2.如權(quán)利要求1所述狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，其特征在于，所采用的pVRC-RVG系列穿梭質(zhì)粒為分別含有狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11、疫苗株P(guān)V、CTNl、aG的糖蛋白基因序列并能表達(dá)相應(yīng)蛋白的質(zhì)粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG, pVRC-CTNIG、pVRC-aGG。
3.如權(quán)利要求1所述狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，其特征在于，優(yōu)選采用慢病毒雙質(zhì)粒系統(tǒng)，慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)亦可采用。
4.如權(quán)利要求1所述狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，其特征在于，其所述輔助質(zhì)粒分別為慢病毒雙質(zhì)粒系統(tǒng)的PNL4-3.GFP/Luc.R-E-,慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)的pCS_CG+pCMV A R8.2以及逆轉(zhuǎn)錄病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)的pMLV-gagpol+pMLV-EGFP。
5.如權(quán)利要求1所述狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)，其特征在于，所優(yōu)選采用的宿主細(xì)胞為293FT細(xì)胞。
6.新型狂犬病病毒假病毒的制備方法，包括如下步驟: a、采用pVRC載體構(gòu)建含有狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11、疫苗株P(guān)V、CTN1、aG糖蛋白基因的 pVRC-RVG 系列穿梭質(zhì)粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG, pVRC-CTNIG、pVRC-aGG ； b、與優(yōu)選采用的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞； C、培養(yǎng)宿主細(xì)胞； d、從培養(yǎng)上清中分離獲得假病毒。
7.如權(quán)利要求6所述新型狂犬病病毒假病毒的制備方法，其特征在于，所述pVRC-RVG系列穿梭質(zhì)粒中，CVS-1l糖蛋白基因(GenBank ID:GQ918139)、PV糖蛋白基因(GenBankID JX276550)、CTN-1 糖蛋白基因(GenBank ID:HQ317918)、aG 糖蛋白基因(GenBank ID:L04522)為首次應(yīng)用于狂犬病病毒假病毒制備，所述宿主細(xì)胞為293FT細(xì)胞。
8.應(yīng)用狂犬病病毒假病毒進(jìn)行狂犬病病毒中和抗體評價(jià)，中和性單克隆抗體抗原表位篩選，抗病毒藥物的高通量篩選以及疫苗制備。
全文摘要
一種新型狂犬病病毒假病毒系統(tǒng)及其制備與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括含有狂犬病病毒糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒所共同構(gòu)成的載體系統(tǒng)以及宿主細(xì)胞，將載體系統(tǒng)中的穿梭質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，即可在培養(yǎng)上清中獲得狂犬病病毒假病毒。本發(fā)明可應(yīng)用于狂犬病病毒中和抗體評價(jià)、狂犬病病毒中和性單克隆抗體抗原表位篩選、抗狂犬病病毒藥物的高通量篩選、新型狂犬病疫苗制備，為一套全新的狂犬病病毒假病毒構(gòu)建、制備及應(yīng)用技術(shù)體系。
文檔編號C12N7/04GK103173495SQ201310058190
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月25日
發(fā)明者譚文杰, 鄧瑤, 呂新軍, 唐青 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所