專利名稱：基于微流控技術(shù)的兩步構(gòu)建三維神經(jīng)干細(xì)胞模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微加工技術(shù)與組織工程領(lǐng)域，涉及一種應(yīng)用微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)體外構(gòu)建神經(jīng)干細(xì)胞三維細(xì)胞模型的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)體外培養(yǎng)方式主要分為懸浮培養(yǎng)法和單層培養(yǎng)法。懸浮培養(yǎng)的NSCs在體外以“神經(jīng)球”(neurospheres)形式生長,大量的NSCs以及其所分化的子細(xì)胞共同存在于神經(jīng)球內(nèi)部。隨著神經(jīng)球的不斷增大，營養(yǎng)物質(zhì)向神經(jīng)球內(nèi)部的傳遞會(huì)出現(xiàn)困難，造成處于內(nèi)部核心的細(xì)胞大量凋零、壞死，甚至出現(xiàn)中空的現(xiàn)象。單層培養(yǎng)法在NSCs的形態(tài)特征、生長特點(diǎn)、以及其分化成的神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特性方面的相關(guān)研究中均發(fā)揮了重要的作用。但是越來越多的實(shí)驗(yàn)證明在二維條件下培養(yǎng)的細(xì)胞無法真正體現(xiàn)其在體內(nèi)的生物學(xué)特性與功能。單層貼壁生長的細(xì)胞，因缺少立體支架，只能向二維發(fā)展，因此，存在于細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間相互關(guān)系都被同化。這樣的生長模式與細(xì)胞體內(nèi)的生長狀況相去甚遠(yuǎn)。細(xì)胞三維培養(yǎng)方法就是想要利用三維生物支架來培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞呈空間立體方式生長，建立細(xì)胞與生物支架的三維空間復(fù)合體。這種培養(yǎng)方式更接近于體內(nèi)細(xì)部的生長模式，容易形成類似體內(nèi)組織的有生物活性的結(jié)構(gòu)。目前，體外構(gòu)建NSCs來源的三維類神經(jīng)組織的研究，在國內(nèi)外還處于實(shí)驗(yàn)探索階段，沒有標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方法。微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是近年來新興的一種基于微流體技術(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)平臺。正是由于微流體技術(shù)對于微量流體的精確控制和操縱能力，并且依據(jù)該技術(shù)構(gòu)建的平臺具有多種單元技術(shù)靈活組合、整體可控和規(guī)模集成的特點(diǎn)，因此，可更精準(zhǔn)地模擬體內(nèi)的物理與化學(xué)信號，從而提供一個(gè)與人體微環(huán)境相似的，穩(wěn)定可控的細(xì)胞與組織的培養(yǎng)環(huán)境。本發(fā)明將微加工技術(shù)與組織工程技術(shù)有機(jī)的結(jié)合起來，建立起一套微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，采用兩步培養(yǎng) 法在微流控芯片上構(gòu)建了 NSCs三維模型。與已有的三維NSCs芯片相比，兩步法建立的NSCs三維模型，操作簡便，重復(fù)性好，成功率高；芯片便于倒置顯微鏡下觀察檢測；便于對細(xì)胞代謝產(chǎn)物進(jìn)行取樣分析。有望應(yīng)用于新型神經(jīng)類藥物的毒性甄別與篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了.一種基于微流控技術(shù)的兩步構(gòu)建三維神經(jīng)干細(xì)胞模型的方法，是以終濃度0.5mg/ml的鼠尾I型膠原水凝膠作為三維支架，將其與20 μ m左右的“神經(jīng)球”混合均勻后，接種到聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片上由若干微柱構(gòu)成的特定細(xì)胞培養(yǎng)池中，待細(xì)胞-膠原復(fù)合物凝固之后，采用兩步培養(yǎng)法，即培養(yǎng)初期向細(xì)胞培養(yǎng)室中注入促使神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)基，待神經(jīng)干細(xì)胞在膠原水凝膠中形成直徑為50-100 μ m團(tuán)簇后，改用條件培養(yǎng)基，使細(xì)胞由團(tuán)簇中向三維空間遷移，相鄰的細(xì)胞團(tuán)簇內(nèi)的細(xì)胞相遇，相互連接，形成一個(gè)與神經(jīng)組織相類似的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)，并利用可自動(dòng)操控的微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對此三維復(fù)合物進(jìn)行了連續(xù)培養(yǎng)，并進(jìn)行了初步的研究和評價(jià)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:(I)以鼠尾I型膠原水凝膠作為三維支架，將其與不小于20 μ m的“神經(jīng)球”混合均勻后，接種到PDMS微流控芯片上由若干微柱構(gòu)成的細(xì)胞培養(yǎng)池中，待細(xì)胞-膠原復(fù)合物凝固后，采用以下的兩步培養(yǎng)法:第一步，培養(yǎng)初期以I μ 1/min的流速向細(xì)胞培養(yǎng)池中注入促使NSCs擴(kuò)增培養(yǎng)基，待NSCs在膠原水凝膠中形成直徑為50-100 μ m團(tuán)簇；第二步，將擴(kuò)增培養(yǎng)基更換為條件培養(yǎng)基，流速不變，使細(xì)胞由團(tuán)簇中向三維空間遷移，相鄰的細(xì)胞團(tuán)簇內(nèi)的細(xì)胞相遇，相互連接，形成一個(gè)與神經(jīng)組織相類似的三維復(fù)合模型結(jié)構(gòu)，并利用可自動(dòng)操控的微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對三維復(fù)合物進(jìn)行了連續(xù)培養(yǎng)。所述的鼠尾I型膠原的最終濃度為0.5mg/mlo所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基通過正交試驗(yàn)確定營養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)NSCs體外擴(kuò)增，并保持其生物學(xué)特性的培養(yǎng)基，是DMEM、F12和RPM1-1640以1:1:1比例混合，添加生長因子EGF20ng/ml、bFGF10ng/ml、血清白蛋白2mg/ml、l%荷爾蒙添加劑N2和1/1000脂類，培養(yǎng)基中主要的營養(yǎng)成分為葡萄糖4.2mg/ml、谷氨酰胺0.44mg/ml。所述的條件培養(yǎng)基是適合NSCs及其子細(xì)胞群體生長的培養(yǎng)基，是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基Neurobasal 中添加 2%B_27、10ng/ml BD NF> 10ng/ml bFGF。本發(fā)明的方法建立的NSCs三維生長的微流控培養(yǎng)系統(tǒng)，該微流控培養(yǎng)系統(tǒng)包括裝有培養(yǎng)液進(jìn)出管的無菌培養(yǎng)皿、微量注射泵和收集管。無菌培養(yǎng)皿用于放置微流控芯片，無菌培養(yǎng)皿的上蓋與微流控芯片的進(jìn)液室和廢液池相對應(yīng)的位置有兩個(gè)孔，用于安插芯片的培養(yǎng)液進(jìn)出管；與進(jìn)液室相連的進(jìn)液管在無菌培養(yǎng)皿的上蓋下方、靠近上蓋的位置設(shè)置有一個(gè)微型無菌濾器；芯片完成細(xì)胞-膠原混合物接種后，在芯片四周的培養(yǎng)皿中注入無菌水；再將培養(yǎng)皿內(nèi)側(cè)的培養(yǎng)液進(jìn)出管分別通過微型三通與芯片上的兩個(gè)進(jìn)液室和兩個(gè)廢液池相連接后，將含有芯片的培養(yǎng)皿置于二氧化碳培養(yǎng)箱中。用于定時(shí)定量補(bǔ)充培養(yǎng)基的微量注射泵是通過無菌的連通管將微量注射泵與芯片的進(jìn)液管相連，調(diào)控流速，對芯片上的NSCs三維細(xì)胞模型進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)；用于培養(yǎng)物樣品采集的收集管由芯片廢液池引出的導(dǎo)管末端與一個(gè)1.5ml的離心管相連組成，便于收集由細(xì)胞培養(yǎng)室中流出的廢液。本發(fā)明的效果和益處是，建立了適合神經(jīng)干細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的微流控系統(tǒng)，該系統(tǒng)可視、透氣，可精確調(diào)控，其自動(dòng)化的操作不但節(jié)約大量人工勞動(dòng)，同時(shí)為細(xì)胞提供了一個(gè)與體內(nèi)相似的穩(wěn)定的代謝環(huán)境；采用兩步培養(yǎng)法，使用本研究篩選確定的神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基在微流控芯片上構(gòu)建了神經(jīng)干細(xì)胞三維培養(yǎng)模型；該模型在倒置顯微鏡下觀察有良好的三維細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光化學(xué)的檢測結(jié)果顯示了神經(jīng)干細(xì)胞及其分化的子細(xì)胞的特征表型；整個(gè)培養(yǎng)體系為微升體積，大大縮減了各種昂貴的細(xì)胞生長因子、免疫熒光抗體、細(xì)胞的荷爾蒙添加劑的使用量，降低了細(xì)胞培養(yǎng)成本；該方法重復(fù)性好，可同時(shí)構(gòu)建多組試驗(yàn)樣品，有望成為新型藥物篩選或環(huán)境毒素監(jiān)測的神經(jīng)組織替代物。


圖1是微流控芯片整體設(shè)計(jì)示意圖。圖中:I左細(xì)胞進(jìn)樣孔，2右細(xì)胞進(jìn)樣孔；3培養(yǎng)基注入口 ；4廢液池口 ；5細(xì)胞培養(yǎng)室。圖2是細(xì)胞培養(yǎng)室的局部結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是芯片掩膜設(shè)計(jì)圖。圖4是應(yīng)用于NSCs三維培養(yǎng)的微流控芯片外觀照片。圖5是利用改性的模具澆注的PDMS微柱顯微鏡照片。圖6是采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基擴(kuò)增得到的細(xì)胞免疫熒光檢測顯示呈nestin陽性圖片。圖7 (A)是優(yōu)化培養(yǎng)基擴(kuò)增得到的NSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后的GFAP免疫熒光染色陽性圖片。圖7 (B)是優(yōu)化培養(yǎng)基擴(kuò)增得到的NSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后的β -tubilin III免疫熒光染色陽性圖片。圖7 (C)是優(yōu)化培養(yǎng)基擴(kuò)增得到的NSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后的RIP免疫熒光染色陽性圖片。圖8 (A)是NSCs接種到芯片48h在擴(kuò)增培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)圖。圖8 (B)是更換為條件培養(yǎng)基后48h NSCs的生長狀態(tài)圖。圖8 (C)是更換培養(yǎng)基后96h mNSCs的生長狀態(tài)圖。圖8 (D)是靜態(tài)三 維培養(yǎng)的NSCs更換培養(yǎng)基96h后生長狀態(tài)圖(對照組)。圖8 (E)是靜態(tài)二維貼壁培養(yǎng)96h的NSCs的生長狀態(tài)圖(對照組)。圖9 (A)是芯片中生長的三維NSCs免疫熒光染色后MAP-2/DAPI的陽性表達(dá)圖。圖9 (B)是芯片中生長的三維NSCs免疫熒光染色后GFAP/DAPI的陽性表達(dá)圖。圖9(C)是芯片中生長的三維NSCs免疫熒光染色后Nestin/DAPI的陽性表達(dá)圖。圖10是三維培養(yǎng)的微流控系統(tǒng)示意圖。圖11是不同培養(yǎng)條件下的乳酸含量的變化示意圖。圖12是不同培養(yǎng)條件下的谷氨酰胺含量的變化示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1適用于神經(jīng)干細(xì)胞三維培養(yǎng)的微流控芯片的設(shè)計(jì)與制作1、微流控芯片的設(shè)計(jì)為了能給NSCs-膠原復(fù)合物的生長提供一個(gè)良好的微環(huán)境，本研究設(shè)計(jì)了一種適合NSCs-膠原復(fù)合物體外生長的微流體芯片，芯片整體設(shè)計(jì)如圖1所示:圖中I為左細(xì)胞進(jìn)樣孔，直徑為2mm ；2為右細(xì)胞進(jìn)樣孔，直徑為3mm ；3為廢液出口，直徑為3mm ；4為細(xì)胞培養(yǎng)室。細(xì)胞培養(yǎng)室的長度為200mm，寬度為1mm，深度為150 μ m。其內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖2所示:培養(yǎng)室側(cè)壁是由數(shù)個(gè)長100 μ m，寬50 μ m的微柱構(gòu)成的柵欄狀結(jié)構(gòu)，每個(gè)微柱間隔20 μ m。細(xì)胞進(jìn)樣孔與培養(yǎng)室之間為寬400 μ m的進(jìn)樣通道。細(xì)胞培養(yǎng)室兩側(cè)為寬500 μ m側(cè)通道，用來輸送培養(yǎng)基或其他調(diào)控細(xì)胞生長的化學(xué)成分。此芯片的工作原理是將NSCs-膠原的混合液通過細(xì)胞進(jìn)樣口進(jìn)入芯片培養(yǎng)室中，微柱陣列起到攔截作用，以確保細(xì)胞與膠原存留在培養(yǎng)室中。待NSCs-膠原凝膠凝固后，利用微量注射泵將培養(yǎng)基注入芯片的側(cè)通道，培養(yǎng)基通過微柱陣列的空隙滲透到三維復(fù)合物中，為細(xì)胞的生長提供養(yǎng)分；同時(shí)，細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物也擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基的流動(dòng)，最終被帶到廢液口排出。2、芯片模具的設(shè)計(jì)與制作本實(shí)驗(yàn)芯片的加工與制作將采用具有透光性、透氣性及良好的生物相容性的聚合物材料聚二甲基娃氧燒(polydimethylsiloxane, PDMS),通過模具燒注的方法使PDMS成形。首先進(jìn)行模具的設(shè)計(jì)制作。模具采用4寸硅片通過光刻工藝和干法刻蝕來完成。光刻所需的掩膜設(shè)計(jì)如圖3所示，由深圳清溢光電股份有限公司完成鉻板掩膜的制作，模具制作流程如下:(1)硅片清洗:濃硫酸煮沸，待冷卻后用去離子水沖洗；然后用I號硅片標(biāo)準(zhǔn)清洗液(體積比:去離子水:雙氧水:氨水=5:2:1)煮沸，冷卻后再用去離子水沖洗；用2號硅片標(biāo)準(zhǔn)清洗液(體積比:去離子水:雙氧水:鹽酸=8:2:1)煮沸，冷卻后用去離子水清洗，烘干備用。(2)硅片氧化:氧化爐中濕法氧化3小時(shí)，溫度1180°C，烘箱保存?zhèn)溆谩?3)甩膠:選用BP212正膠，采用中科院微電子中心研究部生產(chǎn)的KW5-型臺式勻膠機(jī)進(jìn)行甩膠，參數(shù)為低速500rpm，4秒，高速2600rpm，30秒。(4)前烘:采用烘板加熱至85°C，保持30min。(5)曝光:采用德國SUSS光刻機(jī)，紫外光強(qiáng)4.7mW/cm2，將掩膜與硅片上膠層緊貼，曝光50s。(6)顯影:采用0.125M的NaOH溶液作為顯影液，顯影28s。(7)后烘:烘板加熱至85°C，保持40min。(8)干刻Si02層:干刻工藝采用法國產(chǎn)AMS-100刻蝕設(shè)備來完成，刻蝕氣體為C4F8,刻蝕6分，上電極2800W，下電極300W。(9)干刻S1:刻蝕氣體為SF6與C4F8交替進(jìn)氣，25分鐘，上電極2800W，下電極40W?？涛g深度在150 μ m。(10)去膠、去氧化層:去膠采用丙酮溶液浸泡，然后依次用無水乙醇，去離子水清洗干凈。采用HF = H2O=1:10 (V:V)溶液去氧化層，模具制作完成。3、PDMS芯片的制作模具制作完成后就可以進(jìn)行PDMS芯片的制作。以10:1 (v:v)的比例將PDMS母液與固化劑混合攪拌均勻，澆注于模具上，抽真空使得PDMS完全脫氣，直到PDMS中沒有氣泡為止。將澆注好的模具放入烘箱中升溫至80°C，烘兩個(gè)小時(shí)，這時(shí)PDMS已經(jīng)完全固化，然后將固化好的PDMS從模具上剝離下來，完成芯片的制作。4、PDMS芯片的封裝PDMS芯片完成后，需要對芯片進(jìn)行封裝。采用K1050X型等離子去膠機(jī)，在15W功率下對待鍵合的PDMS表面和玻璃基片的表面進(jìn)行氧等離子體處理50s，隨即將處理好的表面緊貼確?；ハ嘟佑|的表面之間沒有氣泡存在，放入烘箱中100°C烘2分鐘，冷卻即可。這樣，完整的芯片制作完成。5、芯片外觀本發(fā)明制作的芯片以生物相容性好、可透氣及透明可視的PDMS為原材料，經(jīng)過模具澆注的方式成型，最后通過氧等離子處理后，與載玻片鍵合封接，芯片外觀如圖4所示。其中細(xì)胞培養(yǎng)池的尺寸為20mmXlmmX0.15mm (長寬高)，小柱子的尺寸為100ymX50ymX150ym (長寬高)，小柱子間的空隙為20 μ m，其特征顯微鏡下可見圖5。實(shí)施例2NSCs體外無血清擴(kuò)增培養(yǎng)基的篩選本實(shí)施例旨在實(shí)現(xiàn)無血清培養(yǎng)條件下，NSCs在體外的大量擴(kuò)增，進(jìn)而為構(gòu)建NSCs三維模型提供充足的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)選用DMEM/F12/RPMI1640 (1:1:1, V:V:V)的混合培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在常用的添加劑中選取4種關(guān)鍵組分:葡萄糖(Glucose)，谷氨酰胺(Glutamine)，脂類(Lipids)，牛血清白蛋白(BSA)，建立4因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，來確定這4種組分在擴(kuò)增培養(yǎng)基中的最佳添加劑量及其對NSCs的擴(kuò)增效果。正交實(shí)驗(yàn)分為9組，在24孔培養(yǎng)板上進(jìn)行，每組選取3孔進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來自于小鼠E14前腦的第3代NSCs，以5X 104cellS/ml的密度接種到含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的孔板中。為防止蒸發(fā)，將培養(yǎng)板置于經(jīng)過滅菌的濕盒中，然后將培養(yǎng)板連同濕盒一同放置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。每天跟蹤細(xì)胞的生長情況，同時(shí)輕輕搖晃孔板防止神經(jīng)球貼壁。培養(yǎng)期間不作換液處理，細(xì)胞經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)5 6天后，用臺盤蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。表I四因素三水平正交試驗(yàn)表
權(quán)利要求
1.一種基于微流控技術(shù)的兩步構(gòu)建三維神經(jīng)干細(xì)胞模型的方法，其特征包括以下步驟， (I)以鼠尾I型膠原水凝膠作為三維支架，將其與不小于20 μ m的“神經(jīng)球”混合均勻后，接種到PDMS微流控芯片上由若干微柱構(gòu)成的細(xì)胞培養(yǎng)池中，待細(xì)胞-膠原復(fù)合物凝固后，采用以下的兩步培養(yǎng)法: 第一步，培養(yǎng)初期以1μ Ι/min的流速向細(xì)胞培養(yǎng)池中注入促使NSCs擴(kuò)增培養(yǎng)基，待NSCs在膠原水凝膠中形成直徑為50-100 μ m團(tuán)簇； 第二步，將擴(kuò)增培養(yǎng)基更換為條件培養(yǎng)基，流速不變，使細(xì)胞由團(tuán)簇中向三維空間遷移，相鄰的細(xì)胞團(tuán)簇內(nèi)的細(xì)胞相遇，相互連接，形成一個(gè)與神經(jīng)組織相類似的三維復(fù)合模型結(jié)構(gòu)，并利用可自動(dòng)操控的微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對三維復(fù)合物進(jìn)行了連續(xù)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是所述的鼠尾I型膠原的最終濃度為0.5mg/ml ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增培養(yǎng)基是通過正交試驗(yàn)確定營養(yǎng)成分的，能夠促進(jìn)NSCs體外擴(kuò)增，并保持其生物學(xué)特性的培養(yǎng)基，是DMEM、F12和RPM1-1640以1:1:1比例混合，添加生長因子EGF20ng/ml、bFGF10ng/ml、血清白蛋白2mg/ml、l%荷爾蒙添加劑N2和1/1000脂類，培養(yǎng)基中主要的營養(yǎng)成分為葡萄糖4.2mg/ml、谷氨酰胺 0.44mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于，所述的條件培養(yǎng)基是適合NSCs及其子細(xì)胞群體生長的培養(yǎng)基，是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基Neurobasal中添加2%B_27、10ng/ml BDNFUOng/ml bFGF。
5.按照權(quán)利要求1 4的方法建立的NSCs三維生長的微流控培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，該微流控培養(yǎng)系統(tǒng)包括裝有培養(yǎng)液進(jìn)出管的無菌培養(yǎng)皿、微量注射泵和收集管: (1)無菌培養(yǎng)皿用于放置微流控芯片，無菌培養(yǎng)皿的上蓋與微流控芯片的進(jìn)液室和廢液池相對應(yīng)的位置有兩個(gè)孔，用于安插芯片的培養(yǎng)液進(jìn)出管；與進(jìn)液室相連的進(jìn)液管在無菌培養(yǎng)皿的上蓋下方、靠近上蓋的位置設(shè)置有一個(gè)微型無菌濾器；芯片完成細(xì)胞-膠原混合物接種后，在芯片四周的培養(yǎng)皿中注入無菌水；再將培養(yǎng)皿內(nèi)側(cè)的培養(yǎng)液進(jìn)出管分別通過微型三通與芯片上的兩個(gè)進(jìn)液室和兩個(gè)廢液池相連接后，將含有芯片的培養(yǎng)皿置于二氧化碳培養(yǎng)箱中； (2)用于定時(shí)定量補(bǔ)充培養(yǎng)基的微量注射泵:通過無菌的連通管將微量注射泵與芯片的進(jìn)液管相連，調(diào)控流速，對芯片上的NSCs三維細(xì)胞模型進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)； (3)用于培養(yǎng)物樣品采集的收集管:由芯片廢液池引出的導(dǎo)管末端與一個(gè)1.5ml的離心管相連，便于收集由細(xì)胞培養(yǎng)室中流出的廢液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于微流控技術(shù)的兩步構(gòu)建三維神經(jīng)干細(xì)胞模型的方法，其特征是以鼠尾I型膠原作為三維支架，以微柱陣列式微流控芯片為培養(yǎng)平臺，采用兩步培養(yǎng)法，即培養(yǎng)初期向細(xì)胞培養(yǎng)室中注入促使神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)基，后期改用適合神經(jīng)干細(xì)胞及其子細(xì)胞生長的條件培養(yǎng)基，通過模擬體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生不同階段的微環(huán)境，形成一個(gè)與神經(jīng)組織相類似的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)。本發(fā)明建立的方法重復(fù)性好，可同時(shí)構(gòu)建多組試驗(yàn)樣品；所采用的微流控培養(yǎng)體系為微升體積，并可精確調(diào)控，大大縮減了細(xì)胞培養(yǎng)過程各種昂貴的細(xì)胞生長因子、免疫熒光抗體、細(xì)胞的荷爾蒙添加劑的使用量，降低了細(xì)胞培養(yǎng)成本。因此有望成為新型藥物篩選或環(huán)境毒素監(jiān)測的神經(jīng)組織替代物。
文檔編號C12M3/00GK103146650SQ201310057768
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月23日
發(fā)明者劉軍山, 葛丹, 劉天慶, 馬學(xué)虎, 劉沖 申請人:大連理工大學(xué)