專利名稱：：一種多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：:本發(fā)明涉及一種多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌的篩選方法，主要用于已獲得的植物根際促生細(xì)菌的馴化，通過馴化獲得具有植物防病促生能力的多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌。
背景技術(shù)：
：:農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大的作用，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，如果不使用農(nóng)藥，全世界每年因病蟲草害造成的損失約占農(nóng)作物總產(chǎn)量的36%，年損失高達(dá)1250億美元(CooperandDobson,2007；EddlestonandBateman,2007)。農(nóng)藥的使用保證了農(nóng)業(yè)的穩(wěn)產(chǎn)豐收和人類的食物供應(yīng)。有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphoruspesticide,OPs)是當(dāng)今農(nóng)藥的主要類別，具有經(jīng)濟(jì)、高效、方便等特點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外廣泛生產(chǎn)和使用的農(nóng)藥產(chǎn)品。但農(nóng)藥的大量使用對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了很大的破壞性。農(nóng)藥利用率僅為10%20%，其余80%90%最終將進(jìn)入土壤環(huán)境，致使土壤中的農(nóng)藥殘留嚴(yán)重，殘留的農(nóng)藥隨著食物鏈上升，最終危害人類健康(Carvalho，2006;Costaetal.，2008)。在世界上許多國(guó)家和地區(qū)，尤其是發(fā)展中國(guó)家，由于有機(jī)磷農(nóng)藥的持續(xù)大量使用已經(jīng)對(duì)區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的污染，在肉、奶制品、谷物、蔬菜和水果等產(chǎn)品中都不同程度檢測(cè)到能夠抑制乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能紊亂，誘發(fā)免疫系統(tǒng)疾病，致使人中毒死亡的有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全世界發(fā)生300萬例有機(jī)磷農(nóng)藥中毒事件，造成20萬人死亡。為此，自20世紀(jì)80年代末以來，世界上許多研究機(jī)構(gòu)都致力于探索有機(jī)磷農(nóng)藥污染環(huán)境的生物修復(fù)技術(shù)，并于1991年3月在美國(guó)圣地亞哥召開了第一屆“原位與就地生物修復(fù)”國(guó)際會(huì)議，這一會(huì)議的召開，標(biāo)志著以生物修復(fù)為核心的環(huán)境生物技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)全新的發(fā)展時(shí)期。環(huán)境修復(fù)技術(shù)中，生物修復(fù)技術(shù)被公認(rèn)為是效果好、見效快、簡(jiǎn)便易行、安全、廉價(jià)和環(huán)境友好、無二次污染的方法，已成為環(huán)境科學(xué)的研究熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。常說的土壤生物修復(fù)技術(shù)主要就是指微生物修復(fù)。利用微生物修復(fù)土壤農(nóng)藥污染的主要原理是微生物利用有機(jī)農(nóng)藥作為碳源、氮源與磷源，將復(fù)雜有毒的農(nóng)藥化合物分解成簡(jiǎn)單無毒的化合物，或者徹底分解為C02、H2O,NH3和Cl—，從而降低農(nóng)藥在土壤中的殘留量及毒性(MansourandGad,2010;康紀(jì)婦，2010)。獲得降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物的途徑有很多，最常用的是從受到有機(jī)磷農(nóng)藥嚴(yán)重污染的土壤中分離篩選出能降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌種。定向培育法是近年來常用的一種方法，即在特定的土壤中人為的多次施用農(nóng)藥，馴化出能降解這種農(nóng)藥的微生物，再通過富集培養(yǎng)，從中分離篩選能高效降解這種農(nóng)藥的菌株(趙宇蕾，2009;康紀(jì)婷，2010)。這種單一功能菌的純化篩選，只根據(jù)所需的功能要求從自然界中分離、純化，得到目的單一的菌株。這種篩選方法有其不足之處，一是在土壤中人為施用農(nóng)藥，使得其他菌株不能生存，導(dǎo)致目標(biāo)菌株失去了與自然條件下長(zhǎng)期處于協(xié)同關(guān)系的其它菌共存的機(jī)會(huì)，雖然目標(biāo)菌株的目標(biāo)功能有所強(qiáng)化，但功能單一；二是單一菌的純化使其對(duì)生長(zhǎng)條件的適應(yīng)范圍越來越狹窄，對(duì)發(fā)酵條件要求高，發(fā)酵成本昂貴；三是單一功能菌孤立生長(zhǎng)，容易受到其它菌的污染和抑制，重新施入土壤后，難以生長(zhǎng)繁殖和發(fā)揮功能。已分離的有機(jī)磷農(nóng)藥污染土壤生物修復(fù)的微生物中，以細(xì)菌和真菌為主(FoxandMendz,2006;郭子武，2008;Al_QurainyandAbdel-Megeed,2009；Forlanietal.,2011),細(xì)菌主要包括:假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、黃單胞桿菌屬(Xanthamonus)、固瘤細(xì)菌屬(Azotomonus)、硫桿菌屬(Thiobacillus)等,其中假單胞菌屬的菌株最活躍,對(duì)多種有機(jī)磷農(nóng)藥具有降解作用。真菌主要包括:曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Pinicielium)、木霉屬(Trichoderma)、酵母菌(Saccharomyces)等。細(xì)菌由于其生理生化的多種適應(yīng)能力以及容易誘發(fā)突變菌株，在降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物中占有重要地位，因此對(duì)細(xì)菌的研究比較全面和深入。植物根圍存在著大量微生物，自由生活在土壤或附生于植物根的一類可促進(jìn)植物生長(zhǎng)及其對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害微生物的有益菌類統(tǒng)稱為植物根際促生菌(PlantGrowth-PromotingRhizobacteria,簡(jiǎn)稱PGPR)。PGPR的作用機(jī)制為通過定殖于植物根系，優(yōu)先占領(lǐng)根際，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生IAA等生長(zhǎng)激素，加速土壤磷、鐵等養(yǎng)素循環(huán)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育；提高植物對(duì)病原菌和環(huán)境脅迫的抗性和忍耐力；通過抑制拮抗根際的病原菌來保護(hù)植物，往往產(chǎn)生抗生素、鐵載體、HCN、水楊酸，誘導(dǎo)ISR等抗性因子，幫助植物抵抗多種病原菌的侵害(Compantetal.,2010;康貽軍等,2010)。由于PGPR具有改良土壤、改善作物品質(zhì)、減少化肥和農(nóng)藥施用量、降低植物病害、提高作物產(chǎn)量等作用，因此，其自身及與菌根真菌的協(xié)同作用在農(nóng)林牧業(yè)、食品安全、環(huán)境保護(hù)等方面具有重大應(yīng)用潛勢(shì)和價(jià)值。作為一類重要的植物根際促生菌，嗜鐵細(xì)菌在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和防治植物病害方面都發(fā)揮了很大的作用。研究證實(shí)嗜鐵菌產(chǎn)生的嗜鐵素可與植物根際病原微生物爭(zhēng)奪有限的鐵營(yíng)養(yǎng)，從而抑制病原微生物生長(zhǎng)繁殖，起到生物防治作用；同時(shí)植物可以利用微生物產(chǎn)生的嗜鐵素螯合的鐵，從而改善植物的鐵營(yíng)養(yǎng)，防治土壤植物缺鐵失綠癥的發(fā)生，促進(jìn)植物生長(zhǎng)(MiethkeandMarahiel，2007;余賢美，2009)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)嗜鐵菌的篩選，嗜鐵菌的防病促生效果及其機(jī)理，以及嗜鐵素合成相關(guān)基因等方面進(jìn)行了廣泛的研究。在土壤污染生物修復(fù)過程中，土壤、植物與微生物間相互作用，微生物可通過促進(jìn)植物生長(zhǎng)、為植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或產(chǎn)生抗性代謝產(chǎn)物控制植物病害等方式，加快土壤污染植物修復(fù)的效率，增強(qiáng)修復(fù)效果。但是，迄今為止，植物根際促生菌(楊蓉等，2012;郭長(zhǎng)虹等，2012)和用于有機(jī)磷農(nóng)藥污染土壤生物修復(fù)的微生物(彭霞薇等，2011;姜健等2012)是分開篩選研究的，即使發(fā)現(xiàn)某菌株具有營(yíng)養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的功能(吳皓瓊等，2012)，但并沒有涉及同時(shí)具有這幾種功能的菌株的具體篩選方法。主要參考文獻(xiàn):郭子武.筍用竹林地有機(jī)農(nóng)藥污染土壤微生物修復(fù)機(jī)理研究.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院博士學(xué)位論文，2008.姜健，楊寶靈，范方，王冰，溫小紅，劉淼.2012.利用紫花苜蓿-有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌聯(lián)合修復(fù)有機(jī)磷農(nóng)藥污染土壤的方法.發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?CN102755991A?？导o(jì)婷.有機(jī)磷農(nóng)藥草甘膦降解菌的篩選、分離及其鑒定.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010.康貽軍，程潔，梅麗娟，等.植物根際促生菌作用機(jī)制研究進(jìn)展.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，21(I):232-238.彭霞薇，姜丹，荊夢(mèng)，安曉宇，楊建州，白志輝.2011.—株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的芽孢桿菌及其菌劑的生產(chǎn)方法.發(fā)明專利號(hào):CN101705201B.吳皓瓊，牛彥波，曹亞彬，郭立姝，殷博.2012.—種具有營(yíng)養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌.發(fā)明專利號(hào):CN101787354B.楊蓉，侯敏，詹發(fā)強(qiáng)，張慧濤，侯新強(qiáng)，龍宣杞，崔衛(wèi)東，林瑞峰，2012.—種蠟狀芽孢桿菌及其作為植物根際促生菌的應(yīng)用.發(fā)明專利號(hào):CN102321554B.余賢美.海南島橡膠根際嗜鐵細(xì)菌B.SiibtiliSCAS15篩選及嗜鐵素基因dhbC克隆、表達(dá)與功能分析.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2009.趙宇蕾.聯(lián)苯菊酯降解菌的篩選鑒定、降解特性及應(yīng)用研究.西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009.Al-QurainyF，Abdel-MegeedA.PhytoremediationanddetoxificationoftwoorganophosphoruspesticidesresiduesinRiyadharea.WorldApplSciJ，2009，6:987-998.CarvalhoFP.Agriculture,pesticides,foodsecurityandfoodsafety.EnvironSciPolicy，2006，9:685-692.CompantS，ClementC，SessitschA.Plantgrowth-promotingbacteriai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發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明就是針對(duì)上述問題，提供一種篩選具有植物根際促生菌特征的有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌的方法，使之具有防治植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的多重功能。本發(fā)明所提供的篩選具有防治植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和降解有機(jī)磷農(nóng)藥多功能菌株的方法，具體步驟如下:I)菌株活化:挑取冷凍保藏的菌液，接種到LB液體培養(yǎng)基中，于3037°C、150200r/min下振蕩培養(yǎng)2448小時(shí)，然后在固體培養(yǎng)基平板上劃線，3037°C條件下培養(yǎng)過夜，挑取單菌落再次劃線培養(yǎng)，活化好的菌株置于4°C冰箱保存?zhèn)溆?，同時(shí)每隔2個(gè)月重新劃線培養(yǎng)，以保證菌株的正常存活繁殖能力。LB培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨(Tryptone)IOg/L酵母提取物(Yeastextract)5g/L氯化鈉(NaCl)IOg/LpH值7.0固體培養(yǎng)基:每IOOOmL培養(yǎng)基中添加1720g瓊脂粉。2)菌株馴化:在常用液體細(xì)菌培養(yǎng)基，如LB液體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中添加有機(jī)磷農(nóng)藥，農(nóng)藥濃度從50mg/L，100mg/L,200mg/L,逐漸遞增，根據(jù)菌株對(duì)不同農(nóng)藥的耐受能力，設(shè)定不同的初始農(nóng)藥濃度以及遞增幅度。將菌株接種于含有有機(jī)磷農(nóng)藥的液體培養(yǎng)基中，于3037°C，150200r/min條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)48h，生長(zhǎng)正常的菌株，再接種到含有更高濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，如此逐漸增加有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度，經(jīng)馴化獲得對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有較高耐受性的菌株。3)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解檢測(cè):根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥種類的不同，通過相應(yīng)的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)方法，檢測(cè)菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解作用。4)最佳降解條件的篩選:以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，制備菌懸液，按一定的接種量接種到含有有機(jī)磷農(nóng)藥(從初始濃度到最高耐受濃度按一定的梯度設(shè)置濃度)的LB液體培養(yǎng)基中，3037°C,150200r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12h,24h,36h,48h,60h和72h時(shí)測(cè)定菌株生長(zhǎng)情況及對(duì)毒死蜱的降解情況，選出最適降解時(shí)間和最適降解濃度。在此基礎(chǔ)上，研究溫度、振蕩速率、初始PH值、接種量、培養(yǎng)基種類、以及碳源、氮源和無機(jī)鹽種類等因素對(duì)降解率的影響，篩選菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的最佳降解條件。5)模擬田間修復(fù)效果測(cè)定:通過盆缽試驗(yàn)，研究菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥污染土壤的修復(fù)效果。制備接種菌懸液，接種到經(jīng)121°C滅菌的土壤中，使得土壤中細(xì)菌的數(shù)量達(dá)到106cfu/g土，以添加有機(jī)磷農(nóng)藥而不接種細(xì)菌的滅菌土壤為對(duì)照，定期測(cè)定土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留含量，計(jì)算降解率，分析菌株對(duì)土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的降解效果，以此研究菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥污染土壤的生物修復(fù)潛能。本發(fā)明的有益效果:通常，篩選植物根際促生菌均是通過分離篩選拮抗菌或植物內(nèi)生菌，然后通過溫室盆栽試驗(yàn)研究其對(duì)植物的生長(zhǎng)促進(jìn)作用及對(duì)病害的防治效果。而真正施用到田間，因土壤微生物、土壤理化性質(zhì)、土壤中的農(nóng)藥殘留等各種生物與非生物因素的影響，所獲得的效果遠(yuǎn)不如盆栽試驗(yàn)。除了防病促生作用有所降低之外，還有可能由于土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留，而所獲得的菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥沒有降解能力，因而菌株在施入土壤之后無法生存繁殖，從而喪失了防病促生的作用。本發(fā)明方法得到的多功能菌株，由于同時(shí)具有防病促生及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的功能，能夠長(zhǎng)期保持防病促生功能和降解有機(jī)磷農(nóng)藥能力的穩(wěn)定性，不會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)代數(shù)的增加而削弱其各種功能；而且由于其功能的多樣性，施入土壤后易于生存繁殖，從而更好的發(fā)揮其植物防病促生作用和降解有機(jī)磷農(nóng)藥的功能；另外，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，減少成本，省時(shí)省力。因此，本發(fā)明方法在多功能菌株的篩選及有機(jī)磷農(nóng)藥污染土壤的微生物修復(fù)等領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊的應(yīng)用前景。:圖1表示盆缽試驗(yàn)中不同時(shí)期甜椒苗的株高。圖2表示吸光度對(duì)磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3表不Bs-15菌株對(duì)草甘膦的降解曲線。圖4表示不同初始濃度對(duì)Bs-15菌株降解草甘膦活性的影響。圖5表示不同溫度對(duì)Bs-15菌株降解草甘膦活性的影響。圖6表示不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)Bs-15菌株降解草甘膦活性的影響。圖7表示不同初始pH值對(duì)Bs-15菌株降解草甘膦活性的影響。圖8表示不同接種量對(duì)Bs-15菌株降解草甘膦活性的影響。圖9表示Bs-15菌株降解草甘膦培養(yǎng)基中碳源的優(yōu)化。圖10表示Bs-15菌株降解草甘膦培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化。圖1I表不Bs-15菌株降解草甘膦培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的優(yōu)化。圖12表示Bs-15對(duì)草甘膦的模擬田間修復(fù)效果。圖13表示CAS17在CAS檢測(cè)平板上產(chǎn)生的嗜鐵圈。A:CAS17；B:對(duì)照；C:CAS空白平板。圖14表示CAS17的生長(zhǎng)曲線及對(duì)毒死蜱的降解曲線。圖15表示不同初始濃度對(duì)CAS17降解毒死蜱活性的影響。圖16表示不同環(huán)境溫度對(duì)CAS17降解毒死蜱活性的影響。圖17表示不同振蕩速度對(duì)CAS17降解毒死蜱活性的影響。圖18表示不同初始pH值對(duì)CAS17降解毒死蜱活性的影響。圖19表示不同接種量對(duì)CAS17降解毒死蜱活性的影響。圖20表示不同碳源對(duì)CAS17降解毒死蜱活性的影響。圖21表示不同氮源對(duì)CAS17降解毒死蜱活性的影響。圖22表示不同無機(jī)鹽對(duì)CAS17降解毒死蜱活性的影響。圖23表示CAS17對(duì)毒死蜱的模擬田間修復(fù)效果。圖24表示基于16SrDNA序列構(gòu)建的CAS17系統(tǒng)進(jìn)化樹。具體實(shí)施方式:以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)手段，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。培養(yǎng)基的制備:1)LB液體培養(yǎng)基(ρΗ7.0)的制備:將IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化鈉和雙蒸水混勻，并用雙蒸水定容到IOOOmL,用氫氧化鈉調(diào)pH值到7.0，分裝后于121°C滅菌20mino2)LB固體培養(yǎng)基(pH7.0)的制備:將IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化鈉、1720g瓊脂粉和雙蒸水混勻，并用雙蒸水定容到IOOOmL,用氫氧化鈉調(diào)pH值到7.0,分裝后于121°C滅菌20min。3)改良MM培養(yǎng)基的制備:40mmol/L3-(N-嗎啉代)丙磺酸鈉(用KOH調(diào)ρΗ7.4)，2mmo/LK3PO4(ρΗ7.0)，葡萄糖2%(ff/V)，(NH4)2S042.0g/L,MgSO4.7H200.2g/L，檸檬酸鈉.2H201.0g/L,谷氨酸鉀1.0g/L,色氨酸8.0mg/L,3.0nmoI/L鑰酸銨，400nmol/LH3BO3,30nmol/LCoCl2,lOnmol/LCuSO4,1OnmoI/LZnSO4,80nmol/LMnCl2。將上述物質(zhì)溶解混勻后定容至IOOOmL,分裝后于121°C滅菌20min。4)PDA液體培養(yǎng)基的制備:稱取馬鈴薯200g，洗凈去皮切成小塊，煮爛過濾取濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂粉1520g，定容至IOOOmL,自然pH值，分裝后于121V滅菌20mino5)Hogland營(yíng)養(yǎng)液的制備:lmmol/LKH2PO4,Smmol/T,KNO3,Smmol/T,Ca(NO3)2,2mmol/LMgSO4,2.86g/LH3BO3,1.81g/LMnCl2.4H20,0.22g/LZnSO4.7H20,0.08g/LCuSO4.5H20，0.02g/LH2MoO4.H2O,將上述物質(zhì)溶解混勻定容至lOOOmL，分裝后于121°C滅菌20min。6)CAS檢測(cè)平板的制作:A.CAS藍(lán)色檢測(cè)液的制作溶液A:將0.07g的CAS(ChromeazurolS)溶于50mL去離子水中，再加入10mT,1mmol/I,的FeCl3溶液(含有10mmol/I,的HCl)；溶液B:將0.06g的HDTMA(Hexadecyltrimethylammoniumbromide)溶于40mL去離子水；溶液C:將A溶液沿著燒杯壁緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動(dòng)，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到溶液C=CAS藍(lán)色檢測(cè)液。121°C滅菌20min。B.通用CAS檢測(cè)平板制作先配制好lmmol/L的CaCl2溶液、lmmol/L的MgS04.7H20溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15min單獨(dú)滅菌)；再分別取2mLlmmol/L的CaCl2溶液、2mLlmmol/L的MgS04.7H20溶液、6mL10%的酸水解酪蛋白溶液，加入生物緩沖液Pipes(sigma)，調(diào)pH6.87.0。去離子水定容到lOOOmL。加入20g瓊脂粉，分裝后于121°C，滅菌1520min。固體培養(yǎng)基滅菌后，溫度降低到60°C時(shí)，以5mLCAS藍(lán)色檢測(cè)液/每IOOmLCAS培養(yǎng)基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻后倒平板。注意不要產(chǎn)生氣泡，以免影響平板檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1:嗜鐵細(xì)菌枯草芽孢桿菌Bs-15對(duì)草甘膦的降解一、嗜鐵細(xì)菌B.subtilisBs-15的防病促生作用B.subtilisBs-15(原編號(hào)為CAS15)篩選自橡膠樹根際土壤，具有較強(qiáng)的產(chǎn)嗜鐵素能力，對(duì)稻瘟病菌，芋疫病菌，西瓜枯萎病菌，辣椒枯萎病菌，西番蓮莖基腐病菌、芒果炭疽病菌，瓜果腐霉等植物病原菌有較強(qiáng)的抑制作用余賢美，鄭服叢，林超，等。土壤產(chǎn)嗜鐵素拮抗細(xì)菌CAS15的分離鑒定。植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2009，36(2):129_135。采用盆缽試驗(yàn)，研究了嗜鐵細(xì)菌B.subtilisBs-15對(duì)甜椒枯萎病的生防效果及對(duì)甜椒生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。這部分內(nèi)容已發(fā)表余賢美，周廣芳，辛力?？莶菅挎邨U菌Bs-15產(chǎn)嗜鐵素條件及其對(duì)甜椒的防病促生效應(yīng)，農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12(2):135-141，在此細(xì)述，僅用于說明其防病促生作用。UB.subtilisBs_15接種物的制備將B.subtilisBs-15接種到改良MM培養(yǎng)基中，于28°C下培養(yǎng)24h，用10mmol/L的無菌硫酸鎂溶液制備成菌懸液。將菌懸液與盆裝沙土混合物(經(jīng)121°C滅菌20min，隔24h再滅菌I次，共2次)混勻，使沙土中的菌體密度約為7X106cfu/g。用于系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)的接種物的制備:將菌懸液與滑石粉按體積質(zhì)量比1:1的比例混勻，使菌體密度為5X107cfu/g。2、辣椒枯萎病菌接種物的制備將辣椒枯萎病菌(FusariumoxysporumSchl.f.sp)接種于PDA液體培養(yǎng)基中，于22°C條件下培養(yǎng)14d，過濾除去菌絲體。于8000r/min下離心20min，取上清液，重懸于lOmmol/L的無菌硫酸鎂溶液，獲得分生孢子懸浮液，將其與沙土混合物(12:5，V/V)混勻使其密度為3.75X105cfu/g。接種后的土壤裝到聚乙烯袋中，20°C放置35d，使病原菌定殖于土壤中。用于系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)的接種物的制備與上述方法類似，不同的是，將辣椒枯萎病菌與泥炭-沙混合物(I:1，V/V)混勻，使其密度為3X104cfu/g。3>B.subtilisBs_15對(duì)甜椒枯萎病的抑制作用采用盆缽?fù)寥郎餃y(cè)定法，研究菌株Bs-15對(duì)甜椒枯萎病的抑制作用。將甜椒枯萎病菌侵染土壤、Bs-15侵染土壤、滅菌土和河沙混勻，使每克沙土中含有IO4個(gè)辣椒枯萎病菌分生孢子，Bs-15菌體密度為106cfu/g。以不加Bs-15侵染土壤的混合沙土為對(duì)照。每盆裝750g制備好的混合沙土，播10顆甜椒種子，共9盆，置于20°C、相對(duì)濕度為70%、光周期為16h的溫室中培養(yǎng)。每周澆水I次及施用I次Hogland營(yíng)養(yǎng)液。為研究鐵離子的影響，在Hogland營(yíng)養(yǎng)液中加入lOymol/LFe-EDDHA(乙二胺二鄰羥苯基大乙酸鐵鈉)。約28d后，測(cè)定其發(fā)病率。每個(gè)處理重復(fù)3次。甜椒枯萎病抑制效果通過以下公式計(jì)算:抑制率(％)=(對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對(duì)照發(fā)病率X100%4、B.subtilisBs_15的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性將10顆甜椒種子播種于空白沙子中，5d后，將幼苗移栽到礦物纖維容器，使其根系位于2個(gè)容器。將Bs-15接種于底層根系根尖部位，2d后將枯萎病菌接種于根系莖基部。在整個(gè)試驗(yàn)過程中將Bs-15與枯萎病菌保持隔離，以消除生防菌株與病原菌的直接相互作用。將盆缽置于20°C、相對(duì)濕度為70%、光周期為16h的溫室中培養(yǎng)。每周燒I次去離子水。移栽后20d，記錄發(fā)病率。每個(gè)處理重復(fù)3次。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照，兩種處理均顯著降低了甜椒苗枯萎病的發(fā)病率(表I)。當(dāng)Bs-15與枯萎病菌同時(shí)接種時(shí)，發(fā)病率為40%，比對(duì)照降低了32%，防效為44.4%;而在施用Bs-15后2d再接種枯萎病菌，并用礦物纖維隔離的處理方式，發(fā)病率僅為31%，比對(duì)照降低了41%，防效達(dá)到56.94%。該結(jié)果說明Bs-15可能通過產(chǎn)生系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性從而增強(qiáng)了對(duì)甜椒枯萎病的抑制效果。為研究鐵離子的影響，在Hogland營(yíng)養(yǎng)液中加入ΙΟμπιοΙ/LFe-EDDHA0結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐵離子顯著降低了Bs-15對(duì)甜椒枯萎病的抑制效果，同時(shí)接種與隔離處理的抑制率分別僅為12.50%和23.43%。表I盆缽試驗(yàn)中Bs-15對(duì)甜椒枯萎病的抑制效果*權(quán)利要求1.一種多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌的篩選方法，其特征在于:在已有篩選自土壤的植物根際促生細(xì)菌菌株的基礎(chǔ)上，通過改良的定向培育法，即在培養(yǎng)基中添加農(nóng)藥，對(duì)已有菌株進(jìn)行馴化篩選，獲得同時(shí)具有植物防病促生能力的多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌菌株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌的篩選方法，其特征在于:在常用細(xì)菌培養(yǎng)基(如LB培養(yǎng)基)中添加有機(jī)磷農(nóng)藥，農(nóng)藥濃度為50mg/L，100mg/L,200mg/L，400mg/L,800mg/L,2000mg/L,以及更高的濃度。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:在馴化過程中，將能夠在含有較低濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的培養(yǎng)基中生存繁殖的菌株接種于含有更高濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的培養(yǎng)基中，逐步提高培養(yǎng)基中有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度，以期獲得菌株對(duì)更高濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的耐受性。4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于:由于不同菌株對(duì)不同有機(jī)磷農(nóng)藥的耐受性不同，用于菌株馴化的初始農(nóng)藥濃度、農(nóng)藥濃度增加的幅度和梯度，以及菌株對(duì)不同有機(jī)磷農(nóng)藥的最高耐受濃度會(huì)有所不同。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌的篩選方法，其特征在于:經(jīng)過馴化的菌株，除了具有原有的植物根際促生細(xì)菌的特征之外，還具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥的能力。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:通過同一菌株對(duì)不同有機(jī)磷農(nóng)藥的先后馴化，可使菌株獲得降解多種有機(jī)磷農(nóng)藥的能力。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:本方法可用于具有單一功能的植物根際促生細(xì)菌，如解磷細(xì)菌、嗜鐵細(xì)菌等菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的馴化，從而獲得多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌菌株。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:本方法可用于具有多種機(jī)制的植物根際促生細(xì)菌，如同時(shí)具有產(chǎn)生抗生素、嗜鐵素、IAA、溶磷、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等機(jī)制的植物根際促生細(xì)菌的馴化，從而獲得具有多種防病促生機(jī)制的多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌菌株。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌的篩選方法，其特征在于:本方法可用于其他來源的生防菌(如分離自發(fā)病區(qū)病情較輕的植株的拮抗菌、植物內(nèi)生生防菌等)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的馴化，從而獲得具有生防作用的多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌菌株。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9所述的方法，其特征在于:本方法亦可擴(kuò)展用于篩選具有防病促生效果的多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解真菌或放線菌菌株。全文摘要本發(fā)明公開了一種多功能有機(jī)磷農(nóng)藥降解細(xì)菌的篩選方法。該方法由如下步驟組成1)植物根際促生細(xì)菌的活化或篩選；2)菌株的馴化；3)菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解活性；4)環(huán)境因子對(duì)菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥能力的影響以及條件的優(yōu)化；5)通過盆缽試驗(yàn)，研究菌株對(duì)土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的降解效果，從而分析菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥污染土壤的生物修復(fù)潛能。本方法得到的菌株將能夠長(zhǎng)期保持防病促生功能和降解有機(jī)磷農(nóng)藥能力的穩(wěn)定性；而且由于其功能的多樣性，施入土壤后易于生存繁殖，從而更好的發(fā)揮其功能；另外，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，減少成本，省時(shí)省力。因此，本發(fā)明方法在多功能菌株的篩選及有機(jī)磷農(nóng)藥污染土壤的微生物修復(fù)等領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N1/36GK103146632SQ201310057458公開日2013年6月12日申請(qǐng)日期2013年2月6日優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日發(fā)明者余賢美,艾呈祥,于婷,董慶龍,安淼,王海榮,劉嘉芬申請(qǐng)人:山東省果樹研究所