專(zhuān)利名稱(chēng)：一種大腸桿菌生物膜檢測(cè)方法-96孔半定量法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌生物膜檢測(cè)方法-96孔半定量法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌生物膜(Bacterial biofilm, BF)是相對(duì)于單個(gè)分散的浮游狀態(tài)的細(xì)菌(planktonic cells)生存形式而言的一種獨(dú)特的細(xì)菌生存形式。Costerton等將其定義為:附著于有生命或無(wú)生命物體的表面，被細(xì)菌分泌的胞外黏質(zhì)包裹的，具有高度組織化的細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)。BF是細(xì)菌在表面生活時(shí)采取的一種生長(zhǎng)方式，它是細(xì)菌的一種本能，某一菌株能否形成BF，是與其所處的環(huán)境密切相關(guān)的，如環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、滲透壓、pH、鐵離子濃度和氧化還原電位等因素，其中，營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)BF的形成具有重要作用。生物膜是附著在固體表面的微生物群體，這些細(xì)胞鑲嵌在多聚物的外表面，展現(xiàn)出許多表型的改變，當(dāng)細(xì)菌受到各種壓力，如極端的營(yíng)養(yǎng)缺乏或過(guò)剩，低PH值，高滲透壓，氧化，抗菌劑和抗生素等，大量的細(xì)菌為了對(duì)抗不利的環(huán)境，通過(guò)自身合成的水合多聚物粘附在固體表面，以同著的方式生長(zhǎng)從而形成生物膜，這是細(xì)菌所具有的一種非常重要的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制。生物膜的形成涉及到幾個(gè)明顯的階段，包括:起始的附著、細(xì)胞與細(xì)胞之間的吸附與增殖、生物膜的成熟、及最后細(xì)菌的脫離過(guò)程等四個(gè)階段。能形成生物膜相關(guān)感染的細(xì)菌，主要包括革蘭氏陽(yáng)性的腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌和革蘭氏陰性的大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、沙門(mén)氏菌和銅綠假單胞菌等。生物膜與人類(lèi)的 生產(chǎn)生活關(guān)系非常密切，一方面它可以黏附雜質(zhì)，清潔污水，可作為污水處理的優(yōu)良載體；另一方面，致病細(xì)菌不僅可直接在人體組織及器官的表面形成生物膜，引起諸如牙周病、慢性支氣管炎、敗血病、肺部感染和心內(nèi)膜炎等難治疾病，而且可在植入人體內(nèi)的醫(yī)療裝置(如隱型眼鏡、人工關(guān)節(jié)和心臟人工瓣膜等)的表面形成生物膜，從而導(dǎo)致一系列的感染并發(fā)癥。據(jù)估計(jì)，大約65%的人類(lèi)細(xì)菌性感染是由細(xì)菌生物膜引起的。由于生物膜有較強(qiáng)的耐藥性，難以控制，往往引起嚴(yán)重的感染生物膜的研究一直是微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中的熱點(diǎn)問(wèn)題。大腸桿菌能否形成生物膜與細(xì)菌粘附結(jié)構(gòu)(P菌毛、I型菌毛、F9菌毛)、細(xì)菌毒性物質(zhì)如溶血素、細(xì)胞壞死因子，細(xì)胞毒力因子、及鐵載體有關(guān)系。毒力因子在細(xì)胞粘附、殺傷宿主細(xì)胞及細(xì)菌所生存的環(huán)境因素中等方面密切相關(guān)。大腸桿菌能在口腔、尿道、生殖道、腸道等形成生物膜，引起反復(fù)感染。目前對(duì)細(xì)菌生物膜形成能力的測(cè)定通常采用半定量的方法，其中包括試管法、微孔法、Robbin氏法和利用特異性抗體的western blot檢測(cè)等方法。微孔法也為實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的方法，因其可較高通量的儀器檢測(cè)染色值而適用于大量細(xì)菌生物膜形成的比較和篩選。目前的半定量法具有可比性差，重復(fù)性低，不易觀察、不易操作等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種大腸桿菌生物膜檢測(cè)方法-96孔半定量法，所述方法以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)將其復(fù)蘇、活化，常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、測(cè)定0D600、釋稀OD600nm值至0.01、上96孔板、37°C培養(yǎng)、洗板、固定、染色、溶解、測(cè)定等步驟，得到大腸桿菌生物膜陽(yáng)性。該方法具有可比性強(qiáng)，重復(fù)性高，易操作等優(yōu)點(diǎn)。可用于大批量大腸桿菌生物膜的篩選工作。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用以下方案:96孔半定量法。包括以下步驟:(I)復(fù)蘇菌株:從-70°C冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L菌液接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，于37°C過(guò)夜震蕩培養(yǎng)。(2)固化菌株:將菌液接種于麥康凱固體培養(yǎng)基中。置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。(3)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期:從麥康凱培養(yǎng)基中挑取紅色單菌落，接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37°C恒溫振蕩培養(yǎng)16h。再按1: 100倍稀釋:取培養(yǎng)的菌液50 μ L于新鮮的5mL LB試管液體培養(yǎng)基上，于37°C緩慢震蕩4.5h，保證細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。(4)稀釋菌數(shù):測(cè)OD6tltlnm，用滅菌的M9培養(yǎng)基將所測(cè)OD6tltol值稀釋至0.01。(5)上96孔板:取200 μ L稀釋至0.01菌液加入96孔U型平底板中，用Μ9液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。于37 °C恒溫箱中分別培養(yǎng)8h，24h，32h，48h和72h。(6)洗板:將培養(yǎng)好的96孔U型平底板從恒溫箱中取出，棄菌液。用I % PBS緩沖液洗三次，棄洗液，拍干。(7)固定:將甲醇放入96孔U型平底板中固定15min,晾干。(8)染色:用1%結(jié)晶紫溶液加入板中，染色5min，自來(lái)水緩慢沖洗多次,晾干,觀察板底部有無(wú)生物膜形成。(9)溶解和測(cè)定0D600:用33%的冰醋酸加于96孔:板中，待生物膜完全溶解后，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中測(cè)定OD6tltol,測(cè)定OD6tltol值減去空白對(duì)照孔的OD6tltol值大于等于0.12則可為生物膜陽(yáng)性。本發(fā)明所述所述結(jié)晶紫購(gòu)置Baso產(chǎn)品，使用濃度為1% ；LB培養(yǎng)基、5xM9培養(yǎng)基為BD Falcon產(chǎn)品，使用濃度為Ix M9 ;所用96孔板為(3599)購(gòu)自Corning Costar產(chǎn)品；所用甲醇為分析醇。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀為PowerWave XS美國(guó)生產(chǎn)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明基于大腸桿菌生物膜形成能力及形成過(guò)程作比較，形成的96孔半定量法具有可比性強(qiáng)，重復(fù)性高，易觀察、易操作等優(yōu)點(diǎn)?？擅黠@獲得大腸桿菌生物膜生長(zhǎng)曲線(xiàn)。


:圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的大腸桿菌生物膜檢測(cè)方法-96孔半定量法的流程圖；圖2:本發(fā)明實(shí)施例提供的23株大腸桿菌生物膜生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖3:本發(fā)明實(shí)施例提供的7號(hào)菌在不同(時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基)條件下生物膜形成的結(jié)果圖4:本發(fā)明實(shí)施例提供的13-2號(hào)菌在不同(時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基)條件下生物膜形成的結(jié)果圖5:本發(fā)明實(shí)施例提供的號(hào)菌在兩種不同96孔板上生物膜形成的結(jié)果 圖6:本發(fā)明實(shí)施例提供的13-2號(hào)菌在兩種不同96孔板上生物膜形成的結(jié)果
圖7本發(fā)明實(shí)施例提供的生物膜在進(jìn)口 96孔板生長(zhǎng)情況。圖8本發(fā)明實(shí)施例提供的生物膜在國(guó)產(chǎn)96孔板生長(zhǎng)情況。分別選取兩株大腸桿菌(7號(hào)和13-2號(hào))進(jìn)行、不同96孔板、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)基的條件下對(duì)大腸桿菌生物膜形成能力的比較實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施方式
:下面通過(guò)實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述:實(shí)施案例1:取(7號(hào)和13-2號(hào)大腸桿菌)甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L于5mL LB中，在37°C的搖箱中搖16h,在麥康凱瓊脂基上活化。挑取麥康凱培養(yǎng)基上的單菌落，接種于5mL LB中，在37°C振搖16h。取培養(yǎng)好的細(xì)菌50 μ L于5mL LB中，在37°C震搖 4.5h，測(cè) 0D_，實(shí)驗(yàn)分組:(一)用M9培養(yǎng)基將所測(cè)OD值稀釋至0.01。(二)用LB培養(yǎng)基將所測(cè)OD值稀釋至0.01(三)用TSB培養(yǎng)基將所測(cè)OD值稀釋至0.01取96孔板進(jìn)行上板，每孔加200 μ L稀釋的菌液，重復(fù)6孔，分別用所稀釋培養(yǎng)基(Μ9、LB、TSB)做空 白對(duì)照。37°C培養(yǎng)不同時(shí)間8h、24h、48h、72h。將培養(yǎng)好的96孔U型平底板從恒溫箱中取出，棄菌液。用1\ 85洗3次，甲醇固定1511^11，拍干后，加入1(^/1結(jié)晶紫染色5min，自來(lái)水沖洗后拍干，加入Φ =33%冰醋酸溶解，半小時(shí)后測(cè)D0_，測(cè)定值減去空白對(duì)照值大于0.12為生物膜陽(yáng)性。實(shí)施案例2:取(7號(hào)和13-2號(hào)大腸桿菌)甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L于5mL LB中，在37°C的搖箱中搖16h,在麥康凱瓊脂基上活化。挑取麥康凱培養(yǎng)基上的單菌落，接種于5mL LB中，在37°C振搖16h。取培養(yǎng)好的細(xì)菌50 μ L于5mL LB中，在37°C震搖 4.5h，測(cè) OD600,實(shí)驗(yàn)分組:(一)用M9培養(yǎng)基將所測(cè)OD值稀釋至0.01。(二)用LB培養(yǎng)基將所測(cè)OD值稀釋至0.01(三)用TSB培養(yǎng)基將所測(cè)OD值稀釋至0.01取96孔板，每孔加200 μ L稀釋的菌液，重復(fù)6孔，分別用所稀釋培養(yǎng)基(Μ9、LB、TSB)做空白對(duì)照。30°C培養(yǎng)不同時(shí)間8h、24h、48h、72h。將培養(yǎng)好的96孔U型平底板從恒溫箱中取出，棄菌液。用IXPBS洗3次，甲醇固定15min，拍干后，加入10g/L結(jié)晶紫染色5min,自來(lái)水沖洗后拍干，加入Φ = 33%冰醋酸溶解，半小時(shí)后測(cè)D0_，測(cè)定值減去空白對(duì)照值大于0.12為生物膜陽(yáng)性。圖3:為7號(hào)菌在不同(時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基)條件下生物膜形成的結(jié)果圖4:為13-2號(hào)菌在不同(時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基)條件下生物膜形成的結(jié)果由圖3和圖4可知:7號(hào)菌和13-2號(hào)菌形成生物膜的能力強(qiáng)的培養(yǎng)條件:(1)37°C優(yōu)于30°C (2)M9培養(yǎng)基中優(yōu)于LB和TSB培養(yǎng)基。兩株實(shí)驗(yàn)菌株均在8h出現(xiàn)初黏附、24_48h之間出現(xiàn)黏附與增長(zhǎng)、48h生物膜呈現(xiàn)成熟期，72h出現(xiàn)脫落。由此得出:實(shí)驗(yàn)菌株生物膜的培養(yǎng)條件:在37°C、M9培養(yǎng)基、培養(yǎng)24_48h實(shí)施案例3:取(7號(hào)和13-2號(hào)大腸桿菌)甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L于5mL LB中，在37°C的搖箱中搖16h,在麥康凱瓊脂基上活化。挑取麥康凱培養(yǎng)基上的單菌落，接種于5mL LB中，在37°C振搖16h。取培養(yǎng)好的細(xì)菌50 μ L于5mL LB中，在37°C震搖4.5h，測(cè)0D_，用M9培養(yǎng)基將所測(cè)OD值稀釋至0.01。 實(shí)驗(yàn)分組:(一)Corning Costar生產(chǎn)U型96孔板(3599) ( 二 )上海生產(chǎn)U型96孔板(WHB)每孔加200 μ L稀釋的菌液 ，重復(fù)6孔，分別用所稀釋培養(yǎng)基(Μ9、LB、TSB)做空白對(duì)照。37°C培養(yǎng)不同時(shí)間8h、24h、48h、72h。將培養(yǎng)好的96孔U型平底板從恒溫箱中取出，棄菌液。用1\ 83洗3次，甲醇固定1511^11，拍干后，加入1(^/1結(jié)晶紫染色51^11，自來(lái)水沖洗后拍干，加入Φ = 33%冰醋酸溶解，半小時(shí)后測(cè)D O6tltl，測(cè)定值減去空白對(duì)照值大于
0.12為生物膜陽(yáng)性。圖5:7號(hào)菌在兩種不同96孔板上生物膜形成的結(jié)果；圖6:13_2號(hào)菌在兩種不同96孔板上生物膜形成的結(jié)果。由圖5、6可以得出:7號(hào)菌和13-2號(hào)菌形成生物膜的能力強(qiáng)的培養(yǎng)板:(I)Corning Costar生產(chǎn)U型96孔板(3599)優(yōu)于上海生產(chǎn)U型96孔板(WHB)。圖7為生物膜在進(jìn)口 96孔板生長(zhǎng)情況。圖8為生物膜在國(guó)產(chǎn)96孔板生長(zhǎng)情況。生物膜在96孔板生長(zhǎng)情況(I)通過(guò)眼觀發(fā)現(xiàn):進(jìn)口 96孔U型平底板所形成的生物膜比國(guó)產(chǎn)進(jìn)口 96孔U型平底板形成的生物膜厚而均勻；(2)通過(guò)OD6tltol值的測(cè)定:進(jìn)口96孔U型平底板OD6。值大于國(guó)產(chǎn)96孔U型平底板。由此可知:實(shí)驗(yàn)所用的大腸桿菌生物膜在進(jìn)口 96孔U型平底板生長(zhǎng)良好。綜合圖1、2、3、4.5.6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出:實(shí)驗(yàn)菌株生物膜的培養(yǎng)的最佳條件:在Corning Costar生產(chǎn)U型96孔板、37°C、M9培養(yǎng)基、培養(yǎng)24_48h實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯。實(shí)施案例4取臨床分離的大腸桿菌121甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L于5mL LB中，在37°C的搖箱中搖16h，在麥康凱瓊脂基上活化。挑取麥康凱培養(yǎng)基上的單菌落，接種于5mL LB中，在37°C振搖16h。取培養(yǎng)好的細(xì)菌50 μ L于5mL LB中，在37°C震搖4.5h，測(cè)OD600,用M9培養(yǎng)基將所測(cè)OD值稀釋至0.01。取Corning Costar生產(chǎn)U型96孔板，每孔加200 μ L稀釋的菌液，重復(fù)6孔，分別用所稀釋培養(yǎng)基(Μ9)做空白對(duì)照。37°C培養(yǎng)不同時(shí)間8h、24h、48h、72h。將培養(yǎng)好的96孔U型平底板從恒溫箱中取出，棄菌液。用I XPBS洗3次，甲醇固定15min,拍干后,加入10g/L結(jié)晶紫染色5min,自來(lái)水沖洗后拍干，加入Φ = 33%冰醋酸溶解，半小時(shí)后測(cè)D O 6( ，測(cè)定值減去空白對(duì)照值大于0.12為生物膜陽(yáng)性。經(jīng)用該方法篩選的得到23株大腸桿菌生物膜陽(yáng)性菌株，陽(yáng)性率為19.01 %，生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2.
從圖2可以看出:23株大腸桿菌中，大多數(shù)大腸桿菌生物膜OD6tltol值呈先上升后下降的趨勢(shì)。在8h生物膜出現(xiàn)黏附、24-48h生物膜形成成熟、72h出現(xiàn)脫落。本發(fā)明的一種提供一種大腸桿菌生物膜檢測(cè)方法-96孔半定量法，已經(jīng)通過(guò)具體的實(shí)例進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借鑒本發(fā)明內(nèi)容，適當(dāng)改變?cè)?、工藝條件等環(huán)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒(méi)有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō) 是顯而易見(jiàn)的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)大腸桿菌生物膜檢測(cè)方法-96孔半定量法，其特征在于，包括以下步驟: (1)從_70°C冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100μ L菌液接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，于37°C過(guò)夜震蕩培養(yǎng)； (2)將菌液接種于麥康凱固體培養(yǎng)基中，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h； (3)從麥康凱培養(yǎng)基中挑取紅色單菌落，接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37°C恒溫振蕩培養(yǎng)16h ； (4)按I: 100倍稀釋:取培養(yǎng)的菌液50 μ L于新鮮的5mL LB試管液體培養(yǎng)基上，于37°C緩慢震蕩4.5h，保證細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； (5)測(cè)OD6tltlnm(6)用滅菌的M9培養(yǎng)基將所測(cè)OD6tltlnm值稀釋至0.01 ; (6)取200μ L稀釋至0.01菌液加入96孔U型平底板中，用Μ9液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于37°C恒溫箱中分別培養(yǎng)24-48h ； (7)將培養(yǎng)好的96孔U型平底板從恒溫箱中取出，棄菌液； (8)用I% PBS緩 沖液洗96孔U型平底板，重復(fù)三次，棄洗液，拍干； (9)將甲醇放入96孔U型平底板中固定15min，倒出并晾干； (10))將I%結(jié)晶紫溶液加入96孔U型平底板中，染色5min，自來(lái)水緩慢沖洗多次，晾干，觀察板底部有無(wú)生物膜形成； (11)用33%的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待細(xì)菌生物膜完全溶解后，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中測(cè)定OD6tltlnm，測(cè)定OD6tltlnm值減去空白對(duì)照孔的OD6tltol值大于等于0.12則可判定其為生物膜陽(yáng)性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述結(jié)晶紫使用濃度為1%;LB培養(yǎng)基、5xM9培養(yǎng)基使用濃度為Ix M9 ;所用96孔板為3599 ;所用甲醇為分析醇。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將甘油保存的菌株接種于LB培養(yǎng)基，37°C過(guò)夜震蕩培養(yǎng)后再接種于麥康凱固體培養(yǎng)基中，其目的是固定、活化細(xì)菌和獲得單菌落，保證實(shí)驗(yàn)菌體是單菌落。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用滅菌的M9培養(yǎng)基將所測(cè)OD6tltlnm值稀釋至0.01 ;所用M9培養(yǎng)基作為大腸桿菌生物膜的培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述96孔板37°C恒溫箱中分別培養(yǎng)8h，24h，32h，48h和72h，觀察生物膜的形成狀態(tài)，主要是觀察大腸桿菌在隨著培養(yǎng)時(shí)間的不同，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗后，生物膜形成能力的強(qiáng)弱；在371:更接近大腸桿菌形成生物膜機(jī)體的環(huán)境溫度。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述所用的96孔板的U型進(jìn)行了特殊處理，更有利結(jié)合具有離子基團(tuán)或疏水位點(diǎn)的生物大分子或者其它介質(zhì)，有利于細(xì)菌粘附，有利生物膜的黏附。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述所用甲醇作為生物膜的固定液。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中測(cè)定生物膜的OD為600nm，其測(cè)定OD6tltlnm值減去空白對(duì)照孔的OD6tltol值大于等于0.12則可判定其為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種針對(duì)大腸桿菌生物膜檢測(cè)方法-96孔半定量法，所述方法以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)將其復(fù)蘇、活化，常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、測(cè)定OD600、釋稀OD600nm值至0.01、上96孔板、37℃培養(yǎng)、洗板、固定、染色、溶解、測(cè)定等步驟，得到大腸桿菌生物膜陽(yáng)性。該方法具有可比性強(qiáng)，重復(fù)性高，易操作等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜诖笈看竽c桿菌生物膜的篩選工作。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK103215339SQ20131005744
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者喻華英, 閆石磊 申請(qǐng)人:塔里木大學(xué)