狂犬病病毒ctn雞胚細(xì)胞適應(yīng)株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株，其微生物保藏號為：CGMCC?No.6510；本發(fā)明還提供了所述的狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株在制備狂犬病病毒滅活疫苗中的用途。狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株具有新的堿基和氨基酸序列，能在CEC上產(chǎn)生高病毒滴度，具有較高的免疫原性，可用于生產(chǎn)狂犬病疫苗、制備抗RV抗體以及檢測RV抗體效價(jià)等；本發(fā)明還測定了該毒株的5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白及全基因序列；此外本發(fā)明還提供了RV?CTNCEC25株的滅活原疫苗，具有良好的免疫保護(hù)性，其效力可達(dá)到當(dāng)前市售疫苗水平，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。
【專利說明】狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及一種新的狂犬病病毒株，具體涉及一種狂犬病病毒雞胚細(xì)胞適應(yīng)株。
【背景技術(shù)】
[0002]狂犬病病毒(Rabies virus, RV)是高度嗜神經(jīng)病毒，為彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssavirus genus)中不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，能引起人獸共患的世界性傳染病一狂犬病。據(jù)報(bào)道全世界每年因狂犬病的死亡人數(shù)約有
5.5萬例，實(shí)際死亡人數(shù)應(yīng)明顯高于該統(tǒng)計(jì)數(shù)字(http://www.worldrabiesday.0rg/)。目前除日本、英國、夏威夷等少數(shù)國家和地區(qū)沒有狂犬病發(fā)生以外，該病呈世界性流行，其中亞洲和非洲是人狂犬病發(fā)生最嚴(yán)重的地區(qū)，占全世界死亡總?cè)藬?shù)的99%。在正式報(bào)告狂犬病的國家中，印度每年有3萬人以上死于狂犬病，居首位；我國近20年每年統(tǒng)計(jì)到的死亡人數(shù)超過 3000 例，居第二位(Yunpeng wang et al., 2012.Journal of AppliedVirology.1:10-19)。目前狗仍然是人狂犬病的最重要的宿主。
[0003]RV基因組大小約12kb，由3'端至5'端依次排列著5個(gè)RV結(jié)構(gòu)蛋白基因，分別編碼五種已知的結(jié)構(gòu)蛋白:核蛋白(N)、憐蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和依賴RNA的RNA多聚酶(L)。N蛋白在RV復(fù)制過程中與RNA結(jié)合成核糖核酸蛋白(RNP) ;L蛋白和磷蛋白與RNP緊密相連呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，確?；蚪M在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄和復(fù)制；M蛋白是一種連接蛋白，為RV5種結(jié)構(gòu)蛋白中變異較大的蛋白質(zhì)之一，其占據(jù)了核衣殼和外殼之間的位置，并將兩者連接一起；G蛋白是RV中唯一暴露在病毒粒子表面和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的蛋白，其羧基端插入RNP中，負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞表面的受體的結(jié)合。
[0004]G蛋白由G基因編碼，共有1675個(gè)核苷酸，編碼524個(gè)氨基酸。G蛋白是RV的主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,`保護(hù)機(jī)體抵抗RV的感染(Wiktor et al.，1973.J.1mmunol.110:269-276 ；Cox et al.,1977.1nfect.1mmun.16:754-759 ；Perrin et al.，1985.Vaccine.3:325-332) 0當(dāng)前無論人用還是獸用狂犬病疫苗，其效價(jià)主要取決于疫苗制劑中G蛋白的含量。G蛋白上至少存在3個(gè)中和抗體結(jié)合位點(diǎn):抗原位點(diǎn)III (antigen III,G III)、抗原位點(diǎn) II (antigen II, G II)及次要抗原位點(diǎn) I (antigen I, G I),其中 G II位于34-200氨基酸區(qū)段，G III位于330-357位氨基酸區(qū)段(Tordo N., 1996.Laboratorytechniques in rabies.4th ed.WHO:28_49)。G II和GIII不但是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的抗原表位，而且也是G蛋白折疊和運(yùn)輸?shù)谋匦璨糠?。研究表明G蛋白抗原性變化主要是由G II位點(diǎn)上34-42位、147位、184位、198-200位氨基酸以及GIII位點(diǎn)上330-340位氨基酸的替換引起(Benmansour etal., 1991.J.virol.65:4198-4203)。G 蛋白上單一氨基酸的改變就能改變RV的抗原性。Irie等用單克隆抗體研究RV G蛋白上的I個(gè)構(gòu)象表位時(shí)發(fā)現(xiàn),第36位蘇氨酸被脯氨酸替換形成的突變株丟失了這一抗原表位，單克隆抗體不能中和該突變株；第39位絲氨酸被蘇氨酸替換形成的突變株雖能與單克隆抗體結(jié)合，但其空間構(gòu)象發(fā)生了改變，單克隆抗體也不能中和突變株(Irie T et al., 2002.Microbiol.1mmunol.46:449-461 )0其他研究者利用抗G II抗原位點(diǎn)的單克隆抗體研究G蛋白的抗原性也得到過類似的結(jié)果。G蛋白的結(jié)構(gòu)與RV毒力有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RV G糖蛋白膜外區(qū)330位的賴氨酸和333位的精氨酸分別被天門冬氨酸和甲硫氨酸取代會明顯降低糖蛋白和神經(jīng)瘤細(xì)胞之間的相互作用，且形成的雙突變RV株對成年小鼠沒有致病性。其他研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)G蛋白的第333位精氨酸被異亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或甘氨酸替換，不管以何種劑量、何種途徑感染小鼠，該突變毒株均無致病性(Dietzschold B.et al., 1983.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，80:70-74 ；Seif et al.，1985.J.Virol.53:926-934 ;Tuffereau et al.，1989.Virology,172:206-212 ；Ito H.et al.，1994.Microbiol.1mmunol.38:479-482:CoulonP et al.，1998.J.Virol.72:272-274 ;Mutsuyo Takayama-1to M.et al.,2006.Virusresearch, 119:208-215)。此外G蛋白的第164-303位氨基酸與RV對成年鼠的致死性作用有關(guān)，其中第242、255、268位氨基酸能增強(qiáng)RV的毒力。最新的研究發(fā)現(xiàn)，無致病性毒株的第194位天冬酰胺被賴氨酸替換，能增強(qiáng)RV突變株的傳播，提高RV突變株的毒力(Takayama-1to M.et al.，2004.J.Neurovirol.10:131-135)。
[0005]由于RV是嗜神經(jīng)性病毒，幾乎對所有哺乳動物的神經(jīng)組織都具有侵染性。世界上首次試用的狂犬病疫苗就是用RV感染兔脊髓研制的，以后經(jīng)兔腦、小鼠腦、羊腦等動物神經(jīng)組織培養(yǎng)，制備疫苗。但由于該類疫苗存在嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)且效力低而被WHO停用(林放濤等.1992.狂犬病學(xué).203-221 ；Meslin F.X.et al., 1996.Laboratory techniques inrabies.4thed.WH0.223-313)。1956年Vienchange及其同事首次將RV在原代小鼠腎細(xì)胞上培養(yǎng)成功。2年后Kissling等將RV街毒株和固定毒株在原代地鼠腎細(xì)胞中傳代(KissingP.E.et al., 1958.Proc.Soc Exp Biol Med.98:223-225)。20 世紀(jì) 60 年代以后用細(xì)胞制備疫苗有了很大發(fā)展，人們開始利用各種細(xì)胞來大規(guī)模生產(chǎn)狂犬病疫苗，特別是人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)疫苗(HDCV)的研制(Wiktor et al., 1964.J Immunol.93:353-366)。由于不存在神經(jīng)元組織，與之前的腦組織疫苗相比，組織培養(yǎng)疫苗不僅更安全，而且更有效。目前已批準(zhǔn)若干種組織培養(yǎng)疫苗，其具有與HDCV相當(dāng)?shù)寞熜Ш桶踩?。例如純化雞胚細(xì)胞疫苗(PCEC) (Barth etal., 1984.J Biol Stand.12:29-64;Schgal et al., 1993.J.Commun.Dis.27:36-43)和純化 vero 細(xì)胞狂犬病疫苗(PVRV) (Suntharasamal et al., 1986.Lancet.2:129—131)。
[0006]RV CTN-1株是WHO和我國有關(guān)部門批準(zhǔn)用于狂犬病疫苗生產(chǎn)的毒株，由中國食品藥品檢定研究院建株和保存。20世紀(jì)80年代李宏玲等將RV CTN-1株在vero細(xì)胞中培養(yǎng)進(jìn)行適應(yīng)傳代，得到較高滴度的RV vero細(xì)胞適應(yīng)株，可用于疫苗生產(chǎn)(李宏玲等.1989.生物制品學(xué)雜志.2:22-25)。董關(guān)木等進(jìn)一步證實(shí)CTN-1株可在vero細(xì)胞內(nèi)快速適應(yīng)，滴度可到7.0logLD5cZml以上，并可多次收獲病毒培養(yǎng)液(董關(guān)木等.1995.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展.23:82-85)。目前已有多家生產(chǎn)單位應(yīng)用RV CTN-1株生產(chǎn)vero細(xì)胞疫苗并取得生產(chǎn)文號和投產(chǎn)(俞永新.2008.狂犬病和狂犬病疫苗.第二版.中國醫(yī)藥科技出版社.207-209)。但veix)細(xì)胞基質(zhì)為永生性傳代細(xì)胞系，因此有必要檢測終產(chǎn)品中的細(xì)胞殘留DNA (Ref.歐洲藥典.2004 ;中國藥典.2010)，因?yàn)槠淇赡芫哂袀鬟f潛伏病毒和其他物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。WHO也規(guī)定人用制品的殘留DNA劑量應(yīng)不超過IOng (WHO Expert Committee on BiologicalStandardition.Recommendations inactivated rabies vaccine for human use producedin cell substrates and embryonated eggs.Genava.WH0.2005)。[0007]Rudolph Barth等人(US4115195)描述了生產(chǎn)狂犬病疫苗的過程，其中多種RV毒株均可利用雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblast cells, CEC)制備狂犬病疫苗,如VPll株、Pasteur株、PM株、Flury LEP和Flury HEP。他們在專利中具體提供了利用 RV 固定株 VPl1、Flury LEP 和 Flury HEP 感染 CEC 的實(shí)例。PATEL Pradip Maganlal和 PATEL Pankaj Ramanbhai (PCT/IN2008/000262)描述了 Pitman moore 株(Wistar 株P(guān)M-HDCS\1503-3M)適應(yīng)于CEC，所得到的病毒株產(chǎn)量高且生產(chǎn)時(shí)間短，易于成規(guī)模生產(chǎn)。1984年底我國的陳道民和林放濤擇用Flury (LEP)株68代雞胚固定毒(獸用活疫苗株)適應(yīng)到CEC培植人用狂犬病疫苗株，初步獲得一株既能使用CEC又具有與a G株(3)免疫原性相仿的狂犬病雞胚細(xì)胞適應(yīng)株一武漢(Wuhan)34株(陳道民等.1988.中國人壽共患病雜志.4:28-30)，但未見到有關(guān)該適應(yīng)毒株進(jìn)一步的報(bào)道。王遠(yuǎn)征等人也嘗試將RV aG株在CEC上進(jìn)行傳代適應(yīng)，得到滴度可達(dá)7.0logLD5cZml的毒株，但該病毒株是否已完全適應(yīng)于CEC尚不確定(王遠(yuǎn)征等.2012.中國生物制品學(xué)雜志.25:669-671)。迄今為止，還沒有文獻(xiàn)提及使CTN-1株適用于CEC。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種可在CEC上快速增殖，病毒滴度高、免疫原性好，但對成年小鼠的致病力大大減弱的狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株；用狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株生產(chǎn)狂犬病疫苗，不僅免疫原性和保護(hù)效果良好，而且在安全性方面更可靠，是生產(chǎn)狂犬病疫苗的理想毒株；此外狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株具有良好的免疫保護(hù)性，可作為免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體水平,用以制備高質(zhì)量的抗RV抗體。
[0009]本發(fā)明提供了一種狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株，其微生物保藏號為:CGMCCN0.6510 ;本發(fā)明還提供了所述的狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株在制備狂犬病病毒滅活疫苗中的用途。
[0010]總體來說，本發(fā)明具有以下特點(diǎn):`[0011]第一方面，本發(fā)明提供了一種新的RV毒株，命名為RV CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株即RVCTNCEC25株。該毒株具有新的堿基和氨基酸序列，能在CEC上產(chǎn)生高病毒滴度，具有較高的免疫原性，可用于生產(chǎn)狂犬病疫苗、制備抗RV抗體以及檢測RV抗體效價(jià)等。
[0012]第二方面，本發(fā)明測定了該毒株的5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白及全基因序列。本發(fā)明人利用分子生物學(xué)的方法，對該毒株的5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因以及全基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與母本CTN-1株相比，5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白均有不同程度的變異，其中G蛋白變異最大。在G蛋白編碼序列的7個(gè)變異的核苷酸中,6個(gè)位于G蛋白的編碼序列區(qū)域(Coding sequences,⑶S),它們分別是 3812 位(A — G)、4371 位(G — A)、4538 位(G — A)、4635 位(C — A)、4636 位(A — G)和 4826 位(T — C)，對應(yīng)的氨基酸分別是 147 位(Lys — Glu),333 位(Arg — Gin)、389 位(Glu-Lys)、421 位(Pro — Gln)和 485 位(Ser — Pro)。另外 5251 位核苷酸(C — A)位于G蛋白的link sequence區(qū)域，不影響G蛋白的氨基酸序列。
[0013]第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了 RV CTNCEC25株的滅活原疫苗。用本發(fā)明的RVCTNCEC25 株毒種按照 MOI (multiple of infection,MOI )=0.001 ~0.05FFU/ 細(xì)胞的量接種CEC懸液，充分混懸后，置于33~35°C、5%C02培養(yǎng)，待80%以上的細(xì)胞病變即可收獲病毒液。然后按照滅活劑與病毒液1:4000 (v/v)的比例加入丙內(nèi)酯滅活制備原疫苗，用于免疫12~14g的小鼠，分別進(jìn)行免疫原性檢查和效力測試。結(jié)果表明該毒株具有良好的免疫保護(hù)性，其效力可達(dá)到當(dāng)前市售疫苗水平，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1顯示RV CTNCEC25株的傳代歷史。
[0015]圖2顯示RV CTNCEC25株接種原代雞胚成纖維細(xì)胞后的細(xì)胞形態(tài)。
[0016]圖3顯示RV CTNCEC25株的特異性熒光。
[0017]圖4顯示RV CTNCEC25株全基因測序所用的引物。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下多次涉及CEC的制備、細(xì)胞突光灶轉(zhuǎn)化單位實(shí)驗(yàn)(Fluorescence Focus UnitsAssay, FFU)和磷酸鹽緩沖液(PBS)的制備，其具體操作分別如下所示:
[0019](I)原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEC)的制備
[0020]選用產(chǎn)出一周以內(nèi)、形態(tài)正常、蛋殼厚薄均勻一致、無裂紋、蛋白濃稠的種蛋，放入38 土 1°C、相對濕度60 土 20%的孵蛋器內(nèi)進(jìn)行孵育，用檢卵燈觀察是否為受精卵及其活力。選用9~11日齡、雞胚發(fā)育正常、可見清晰的血管及活動的雞胚。用0.2% (m/v)的新潔爾滅溶液浸泡5分鐘后撈出，氣室向上置于蛋托上，然后用2%碘酊(m/v)和75%酒精(v/v)消毒后移入超凈臺內(nèi)。用無菌鑷子取出雞胚，放入盛有IXHanks溶液的平皿內(nèi)。去除雞胚的頭、內(nèi)臟，放入滅 菌廣口瓶內(nèi)，用無菌剪剪切成I~3mm3的組織塊，按照每枚雞胚5~8ml的量加入預(yù)熱至37°C的0.1% (m/v)胰酶溶液，置于37°C水浴箱內(nèi)消化15~30分鐘，加入50~300ml細(xì)胞生長液(以199培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加終濃度為5~10% (v/v)的牛血清，199培養(yǎng)基可購自北京清大天一科技有限公司，型號為M199MD505)，用無菌細(xì)胞吹打管吹打分散細(xì)胞得到細(xì)胞懸液，取1.0ml細(xì)胞懸液經(jīng)10倍稀釋后與等體積0.4% (m/v)臺盼藍(lán)混合均勻后，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞密度調(diào)整為0.8~1.4X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。
[0021](2)PBS (ρΗ7.4)的制備
[0022]稱取8.0g氯化鈉，0.2g氯化鉀，0.27g磷酸氫二鉀，1.42g磷酸二氫鈉，加入800ml注射用水充分?jǐn)嚢杌靹?，然后加?8%的濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容至1000ml。經(jīng)121 °C、15分鐘滅菌后，室溫保存?zhèn)溆谩?br> [0023](3) FFU檢測病毒滴度
[0024]①將待測病毒樣品用PBS先進(jìn)行10倍系列稀釋，再進(jìn)行3倍系列稀釋。然后取
50μ I稀釋后的病毒液接種50 μ I細(xì)胞密度為IXlO6個(gè)細(xì)胞/ml的BSR細(xì)胞(來源于中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所)。混合均勻后置于37°C，5%C02培養(yǎng)24小時(shí)。
[0025]②丙酮固定及染色
[0026]a.24小時(shí)后，倒棄上清液，用PBS洗滌一遍。
[0027]b.每孔加入50 μ 180% (v/v)冷丙酮，置于_20°C固定30分鐘。
[0028]c.每孔加入50μ1 FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒抗體(Millipore公司，Cat? N0.5100)，置于37°C孵育30分鐘。
[0029]d.用PBS洗滌三遍，甩干，每孔加入50 μ 180% (v/v)甘油，直接置于熒光顯微鏡下觀察每個(gè)稀釋度的熒光灶數(shù)目。
[0030]e.取> 10個(gè)和< 10個(gè)熒光灶的相鄰兩孔稀釋度的數(shù)據(jù)按照下列公式計(jì)算結(jié)果。待測樣品滴度(lg FFU/ml)=lg{[(高稀釋度的熒光平均數(shù)X3+低稀釋度的熒光平均數(shù))]/2X低稀釋倍數(shù)X 1000/50}
[0031]表1
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株，其微生物保藏號為:CGMCC N0.6510。
2.權(quán)利要求1所述的狂犬病病毒CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株在制備狂犬病病毒滅活疫苗中的用途。
【文檔編號】C12R1/93GK103865889SQ201410132141
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】王春華, 郭采平, 羅姍, 劉永娣, 李慧, 丁玉江, 容偉華, 周蘭貞, 周維, 宋清爽, 黃偉榮, 田華, 朱士茂, 張信 申請人:深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司