一種降低醬油中氨基甲酸乙酯前體物質的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降低醬油中氨基甲酸乙酯前體物質的方法，屬于微生物生產利用領域。本發(fā)明將嗜鹽四聯(lián)球菌在成曲與鹽水混合時接種，使嗜鹽四聯(lián)球菌濃度達到106～107CFU/mL，成功降低了醬油中氨基甲酸乙酯前體物質--瓜氨酸的含量。并且在加入菌量為106CFU/mL大大提高了醬油中的游離氨基酸含量。本發(fā)明提供的方法具有良好的工業(yè)應用價值。
【專利說明】一種降低醬油中氨基甲酸乙酯前體物質的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種降低醬油中氨基甲酸乙酯前體物質的方法，屬于微生物生產利用領域。
【背景技術】
[0002]氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)被世界衛(wèi)生組織歸為2A類致癌物質，與丙烯胺同等危險。它能夠導致肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等嚴重性腫瘤疾病。氨基甲酸乙酯廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，包括酒類、醬油等食品。此前中國醬油中的氯丙醇超標而被歐盟禁購的事件引起軒然大波。如今醬油中的氨基甲酸乙酯引起了國際的廣泛關注，而國內對醬油中氨基甲酸乙酯的降低方法未見報道。對此我國的醬油行業(yè)應該吸取由于某些品種的醬油中氯丙醇超標引起廣泛關注而帶來的被動局面的教訓，及早地開展研究，突破國際市場對我國調味品出口筑起的技術壁壘。
[0003]醬油中氨基甲酸乙酯前體物質主要有乙醇、瓜氨酸、尿素。對中國南方一家醬油廠的日式醬油研究結果表明:發(fā)酵終點時原油中乙醇含量為2.5%、瓜氨酸含量為2.2g/L、尿素為57mg/L。通過底物反應實驗得知，乙醇和瓜氨酸是醬油中EC的主要前提物質。本研究采用在醬油發(fā)酵過程中加入一株嗜鹽四聯(lián)球菌降解瓜氨酸，從而降低醬油中氨基甲酸乙酯的前體物質。嗜鹽四聯(lián)球菌是食品安全菌。在醬油發(fā)酵過程中加入它會大大提升醬油風味，縮短生產周期。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種降低醬油中氨基甲酸乙酯前體物質的方法，是在醬油釀造過程中添加嗜鹽四聯(lián)球菌，降解醬油釀造過程中氨基甲酸乙酯的主要前體物質——瓜氨酸的含量。
[0005]所述嗜鹽四聯(lián)球菌是在成曲拌鹽水時接入，使混曲中的嗜鹽四聯(lián)球菌達到IO6?107CFU/mL。
[0006]所述嗜鹽四聯(lián)球菌優(yōu)選嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcus halophilus) BBE R23,保藏編號為CCTCC N0:M2013480，保藏日期為2013年10月20日，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國武漢武漢大學。
[0007]所述方法的具體步驟為:(I)制曲:脫脂大豆與炒麥浸泡8h，121°C滅菌5min，降溫至80°C放氣。按比例接入麩皮、面粉，大豆、炒麥、麩皮、面粉的質量比為20:15:1: 1，同時接入米曲霉孢子，接種量為8xl09個/g，恒溫箱中30°C培養(yǎng)，6-8h翻曲一次，培養(yǎng)46-48h后，曲變成嫩綠色，制曲完成。(2)發(fā)酵:成曲與20% (w/v)鹽水以體積比為1:1.7的比例混合，并接種嗜鹽四聯(lián)球菌，控溫10_15°C，發(fā)酵第7天接種107CFU/mL魯氏酵母，發(fā)酵第14天接種107CFU/mL魯氏酵母，常溫發(fā)酵，第80天結束發(fā)酵。
[0008]本發(fā)明在醬油制作過程中加入一株嗜鹽四聯(lián)球菌，相比未接種嗜鹽四聯(lián)球菌，醬油中EC的重要前體物質瓜氨酸的含量減少了 98%。而且增加了醬油中的游離氨基酸含量， 為將來工廠化降低醬油中EC含量同時提高醬油營養(yǎng)價值打下堅實基礎。
【具體實施方式】
[0009]EC含量的測定方法:
[0010]樣品處理:將以ImL超純水配制的含尿素、乙醇、瓜氨酸的95°C 30min熱反應后的樣品液，用0.22 μ m濾頭過濾。
[0011]GC 條件:Agilent DB_WAX30mX 0.25mmX 0.25 μ m 毛細管柱；進樣 口溫度:230°C，柱室溫度:初始溫度60°C (5min)，以3.5°C /min程序升溫至150°C (保持2min)，以10°C /min,升到220°C (保持IOmin);載氣:高純氦氣，柱前壓80kPa,流速lmL/min,不分流,進樣2uL0
[0012]MS條件:接口溫度:220°C ;電離方式:EI ;電子能量:70Ev ;電子源溫度230°C，四級桿溫度150°C ;調諧方式:標準調諧；SIM模式；定量離子62 ;定性離子74，89 ;外標法定量。
[0013]EC標準曲線制作:用超純水將EC標樣配制成40 μ g/L、60 μ g/L、80 μ g/L、100yg/L。用GC-MS檢測，在以EC濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標制作標準曲線。Υ=1662.76χ-18902.71，R2=0.997。
[0014]醬油中瓜氨酸含量的檢測:
[0015]樣品預處理:取ImL醬油樣品，加入25mL容量瓶中。用5%(w/v)的三氯乙酸定容至25mL,放在超聲儀上超脫IOmin后，放置5min (防止過熱)，再超脫lOmin。靜置30min,玻璃棒混勻后在慮紙上過濾。取ImL樣品經過0.22 μ m慮頭過濾后進樣檢測。
[0016]檢測條件:安捷倫液相色譜儀Agilent-1100 (美國安捷倫公司)；分析方法:采用鄰二甲苯(0PA)、9-忽甲基氯甲酸酯(FMOC)進行柱前衍生；色譜柱:0DS HYPERS IL(250mmX4.6mmX5 μ m);柱溫:40°C ;流速:1.0ml/min ;紫外檢測器:激發(fā)波長338nm、接收波長 262nm(Pro, Hypro)。
[0017]流動相A相:稱取8.0g結晶乙酸鈉于IOOOmL燒杯中，加入IOOOmL水攪拌至所有結晶水溶解，再加入225uL三乙胺，攪拌并滴加5%的醋酸，將pH調到7.20±0.05 ;加入5μ L四氫呋喃，混合后備用。流動相B液:稱取12.0g結晶乙酸鈉于800mL燒杯中，加入400mL攪拌至所有結晶溶解，滴加5%醋酸將pH調到7.20±0.05，將此溶液加入800mL乙腈和800mL甲醇，混合后備用。梯度洗脫程序見表I。
[0018]表I氨基酸分析梯度洗脫表
[0019]
【權利要求】
1.一種降低醬油中氨基甲酸乙酯前體物質的方法，其特征在于，是在醬油釀造過程中接種嗜鹽四聯(lián)球菌，減少氨基甲酸乙酯瓜氨酸的產生；所述嗜鹽四聯(lián)球菌是在成曲與鹽水混合時接入，使醬醪中嗜鹽四聯(lián)球菌達到IO6?107CFU/mL。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗜鹽四聯(lián)球菌是嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcus halophilus) BBE R23，保藏編號為 CCTCC N0:M2013480。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，具體步驟為:(I)制曲:脫脂大豆與炒麥經浸泡、滅菌、降溫后，加入麩皮、面粉，并接種米曲霉孢子，在30°C恒溫培養(yǎng)，待曲變成嫩綠色，制曲完成；(2)發(fā)酵:成曲拌鹽水時接種嗜鹽四聯(lián)球菌，控溫10-15°C，發(fā)酵第7天接種107CFU/mL魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),發(fā)酵第14天再接種魯氏酵母IO7CFU/mL，常溫發(fā)酵，第80天結束發(fā)酵。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，具體步驟為:(I)制曲:脫脂大豆與炒麥浸泡8h，121°C滅菌5min，降溫至80°C放氣，按比例加入麩皮、面粉，大豆、炒麥、麩皮、面粉的質量比為20:15:1:1，同時接入米曲霉孢子，接種量為SxlO9個/g，30°C恒溫箱中培養(yǎng)，6-8h翻曲一次，培養(yǎng)46-48h，曲變成嫩綠色，制曲完成；(2)發(fā)酵:成曲與20%(w/v)鹽水以體積比為1:1.7的比例混合，并接種嗜鹽四聯(lián)球菌，控溫10-15°C，發(fā)酵第7天接種IO7CFU/mL魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),發(fā)酵第14天再接種魯氏酵母107CFU/mL,常溫發(fā)酵，第80天結束發(fā)酵。
【文檔編號】A23L1/238GK103907801SQ201410132103
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權日:2014年4月2日
【發(fā)明者】陳堅, 方芳, 楊希飛, 廖淡宜, 堵國成 申請人:江南大學