檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的引物、探針及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的引物、探針及方法，屬于生物檢測(cè)、生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，采用的技術(shù)方案是，提供一種檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的方法及該方法所用的用于瘧原蟲(chóng)基因序列PCR擴(kuò)增的通用引物SEQIDNo：1-2及用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的探針SEQIDNo：3-6。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：（1）本發(fā)明提供的用于瘧原蟲(chóng)特異基因序列PCR擴(kuò)增的通用引物及特異性核酸探針，靈敏度高，準(zhǔn)確性好；（2）采用不對(duì)稱(chēng)PCR法結(jié)合液相芯片技術(shù)，增加生物標(biāo)記單鏈的產(chǎn)量以提高PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)有特異性核酸探針的微球的雜交結(jié)合效率，高通量測(cè)試，特異性及靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，能夠?qū)Ο懺x(chóng)進(jìn)行快速的檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的引物、探針及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)、生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種能夠快速和準(zhǔn)確地檢測(cè)/鑒定瘧疾寄生蟲(chóng)的引物、特異性核酸探針及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]瘧疾是嚴(yán)重危害人體健康的寄生蟲(chóng)病，遍及全球90多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，使世界人口的41%受到威脅。同艾滋病、結(jié)核一起被世界衛(wèi)生組織列為對(duì)人類(lèi)健康威脅最嚴(yán)重的三大傳染病之一。瘧原蟲(chóng)種類(lèi)繁多，寄生于人類(lèi)的瘧原蟲(chóng)有4種，且其引起的臨床表現(xiàn)癥狀都類(lèi)似:一般有間歇性發(fā)冷、發(fā)熱、出汗，有時(shí)會(huì)引起脾腫大和貧血；重癥患者可引起腦、肝、腎等臟器損害，并可引起循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、甚至多系統(tǒng)功能衰竭。
[0003]在對(duì)上述瘧原蟲(chóng)檢測(cè)方面，目前常規(guī)應(yīng)用的檢測(cè)手段如血涂片檢查、免疫學(xué)方法以及核酸檢測(cè)方法如PCR、多重PCR和基于Taqman探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法等。但這些方法或多或少存在一些缺陷:如血涂片檢查方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且當(dāng)原蟲(chóng)密度< 50個(gè)原蟲(chóng)/μ I血液時(shí)鏡檢就難以查到，容易漏診。另外鏡檢的靈敏度、特異性主要受鏡檢人員水平的影響很大。而用免疫層析技術(shù)快速簡(jiǎn)便，但試劑成本略高，有些組合理論上也難以鑒別蟲(chóng)種或是否混合感染，還可能存在抗原抗體間的交叉反應(yīng)而干擾檢測(cè)，不利于疾病的早期診斷；在核酸檢測(cè)方法方面，PCR、多重PCR方法及基于Taqman探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法等的靈敏度高，特異性好，適合于快速檢測(cè)鑒定，但這些方法大多基于單一反應(yīng)或少數(shù)重?cái)?shù)的多重反應(yīng)的檢測(cè)，在對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)每一個(gè)樣本的數(shù)十種指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和排除時(shí)，需要耗費(fèi)大量的勞動(dòng)和 成本。
[0004]對(duì)于分子實(shí)驗(yàn)室中大量樣本的常規(guī)檢測(cè)，研究者正致力于開(kāi)發(fā)和建設(shè)以多重快速檢測(cè)為目標(biāo)的檢測(cè)平臺(tái)，典型的高通量多重分析技術(shù)包括生物芯片、毛細(xì)電泳和質(zhì)譜等，由于其能在同一反應(yīng)容器中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)核酸序列，因此在節(jié)約時(shí)間、勞動(dòng)和成本方面更具有優(yōu)勢(shì)，是高通量、特異、可靠、快速和經(jīng)濟(jì)的核酸檢測(cè)方法。
[0005]基于微球的液相芯片技術(shù)，提供了一個(gè)新的應(yīng)用面廣泛的高通量核酸檢測(cè)平臺(tái)。它包含有直徑5.6 μ m的聚苯乙烯微球，其內(nèi)部染有兩種可以進(jìn)行光譜區(qū)分的熒光染料。精確控制兩種熒光染料的量，可獲得具有特異熒光編碼的100種不同微球組。每種微球表面都可以修飾上不同的反應(yīng)物。因?yàn)榭梢愿鶕?jù)微球的特異熒光編碼來(lái)區(qū)分不同的微球組，所以可以將它們混合在一起，在同一個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)檢測(cè)高達(dá)100種不同的分析物。在報(bào)告分子上還耦合有第三種熒光用于定量分析發(fā)生于微球表面的生物分子間的相互作用。微球在高速液流中經(jīng)由液相芯片分析儀的兩個(gè)獨(dú)立激光進(jìn)行分別檢測(cè)。一個(gè)635nm、10mW的紅色二極管激光激發(fā)微球上的兩種熒光，另一個(gè)532nm、13mff的釔鋁石榴石(YAG)激光激發(fā)結(jié)合在微球表面的報(bào)告分子的熒光(R-藻紅蛋白，Alexa532,或Cy3)。高速數(shù)字信號(hào)處理器根據(jù)熒光編碼地址對(duì)微球進(jìn)行分類(lèi)并定量微球表面的反應(yīng)。每秒檢測(cè)數(shù)千個(gè)微球的能力使該分析系統(tǒng)可以在數(shù)秒內(nèi)對(duì)同一反應(yīng)容器中的每個(gè)樣品同時(shí)分析和報(bào)告高達(dá)100個(gè)不同的反應(yīng)。與其它檢測(cè)方法相比，基于液相芯片技術(shù)的檢測(cè)平臺(tái)具有以下優(yōu)點(diǎn):需標(biāo)本量少、高通量檢測(cè)；高速度、低成本；靈敏度高、有重復(fù)性好、線性范圍廣、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。采用多重PCR聯(lián)合液相芯片技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確的對(duì)呼吸道病毒進(jìn)行檢測(cè)。
[0006]綜上所述，采用多重PCR技術(shù)聯(lián)合液相芯片技術(shù)，對(duì)四種瘧原蟲(chóng)進(jìn)行多重檢測(cè)，不失為一種直觀、準(zhǔn)確、快速、適合早期診斷且低成本的檢測(cè)手段。然而，現(xiàn)有的檢測(cè)試劑盒或提供的引物、探針，或特異性和靈敏性較低，或存在假陽(yáng)性結(jié)果，或檢測(cè)步驟繁瑣、檢測(cè)條件設(shè)置復(fù)雜，或勞動(dòng)成本較高，因此，設(shè)計(jì)檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度及特異性高的方法及特異性及靈敏度高、且有利于實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置的引物、探針，對(duì)提高檢測(cè)瘧原蟲(chóng)及其種類(lèi)的方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和實(shí)用性有重要意義，成為目前一直需要改進(jìn)的問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的引物、探針及方法，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)合核酸雜交技術(shù)，進(jìn)一步利用多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)合液相芯片技術(shù)來(lái)檢測(cè)四種瘧原蟲(chóng)。
[0008]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明首先提供用于瘧原蟲(chóng)基因序列PCR擴(kuò)增的通用引物，所述引物包括SEQ ID No:1所示的上游引物序列PU-F2和SEQ ID No:2所示的下游引物序列PU-R2組成的引物對(duì)。
[0009]上述用于瘧原蟲(chóng)基因序列PCR擴(kuò)增的通用引物，選用的引物對(duì)擴(kuò)增四種瘧原蟲(chóng)特異序列都有很聞的靈敏度，提聞了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
[0010]本發(fā)明還提供用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的探針，所述探針包括如下 Ξ.至?中的至少一種:
用于檢測(cè)間日瘧原蟲(chóng)的探針PV-PF2，其序列為SEQ ID NO:3所示；
藝用于檢測(cè)三日瘧原蟲(chóng)的探針PM-PF2，其序列為SEQ ID NO:4所示；
I用于檢測(cè)卵形瘧原蟲(chóng)的探針P0-PF2，其序列為SEQ ID NO:5所示；
?用于檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)的探針PF-PF2，其序列為SEQ ID NO:6所示。
[0011]上述探針?lè)謩e針對(duì)四種瘧原蟲(chóng)的特異性核酸序列，堿基成分合理，具有比較均一的Tm值，探針與PCR產(chǎn)物的雜交溫度條件基本一致，有利于同一溫度下雜交的同步性，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
[0012]最后，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的方法，所述方法包括如下步驟，
1)合成上述引物及探針，并對(duì)探針?lè)謩e進(jìn)行標(biāo)記；
2)提取待測(cè)樣品DNA，以步驟I)所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與步驟I)中合成的探針雜交，得雜交產(chǎn)物；
4)檢測(cè)雜交信號(hào)并分析結(jié)果。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟I)合成引物后，對(duì)每對(duì)引物中的下游引物在5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；所述對(duì)探針的標(biāo)記為對(duì)所有探針在5’端進(jìn)行胺基化修飾，連接C12鄰接臂序列，并與相應(yīng)熒光編碼的微球偶聯(lián)，然后將偶聯(lián)有不同探針的微球充分混合，制成探針微球組；所述步驟3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交后，對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行抗鏈霉素藻紅蛋白(英文全稱(chēng)Streptavidin-R-phycoerythrin,縮寫(xiě)SA-PE)標(biāo)記，得微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE的復(fù)合物；所述步驟4)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)采用液相芯片系統(tǒng)。[0014]更優(yōu)選的，所述步驟I)探針微球組中偶聯(lián)有不同探針的微球個(gè)數(shù)相等。
[0015]所述步驟4)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)采用Bio-Plex? 200檢測(cè)系統(tǒng)。
[0016]上述方法中，I)首先合成SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的用于四種瘧原蟲(chóng)特異基因序列PCR擴(kuò)增的的通用引物；同時(shí)根據(jù)檢測(cè)目的對(duì)應(yīng)合成用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的探針，即如要檢測(cè)間日瘧原蟲(chóng)，則合成用于檢測(cè)間日瘧原蟲(chóng)的探針PV-PF2，其序列為SEQ ID NO:
3所示；如要檢測(cè)四種瘧原蟲(chóng),則合成SEQ ID NO:3-6所示的4種探針。合成完畢后對(duì)不同種類(lèi)探針?lè)謩e進(jìn)行標(biāo)記以便于區(qū)分和檢測(cè)；2)提取待測(cè)樣品DNA采用本領(lǐng)域常用技術(shù)手段，以上述通用引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得擴(kuò)增產(chǎn)物；3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針在設(shè)定條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)；4)根據(jù)探針的標(biāo)記檢測(cè)雜交產(chǎn)物的雜交信號(hào)以獲得結(jié)果并分析。
[0017]基于上述方法，本發(fā)明優(yōu)選多重不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增結(jié)合液相芯片技術(shù)以檢測(cè)瘧原蟲(chóng)。以檢測(cè)四種瘧原蟲(chóng)為例，具體步驟如下:1)合成SEQ ID No:1-2所示用于瘧原蟲(chóng)基因序列PCR擴(kuò)增的通用引物、及SEQ ID No:3-6所示用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的探針序列，其中，用于瘧原蟲(chóng)基因序列PCR擴(kuò)增的通用引物中所有下游引物序列在5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記，對(duì)探針的標(biāo)記具體為對(duì)所有探針在5’端均進(jìn)行胺基化修飾且連接C12鄰接臂序列，然后與相應(yīng)熒光編碼的微球偶聯(lián)，將偶聯(lián)有不同探針的微球等個(gè)數(shù)混合制成探針微球組；
2)提取待測(cè)樣本DNA，以SEQ ID No:1_2所示的通用引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；優(yōu)選的，擴(kuò)增體系中所加入下游引物的濃度為上游引物濃度的3-6倍，以增加生物標(biāo)記單鏈的產(chǎn)量；3)將步驟2)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針微球組在設(shè)定條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，得雜交產(chǎn)物，進(jìn)一步對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行抗鏈霉素藻紅蛋白(英文全稱(chēng)Streptavidin-R-phycoer ythrin,縮寫(xiě)SA-PE)標(biāo)記，形成微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE的復(fù)合物；上述所稱(chēng)的雜交是指PCR產(chǎn)物變性后與偶聯(lián)有不同探針的微球組充分混合，并在一定的溫度條件下進(jìn)行核酸單鏈間互補(bǔ)配對(duì)雜交的過(guò)程；4)取微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE復(fù)合物以液相芯片系統(tǒng)，優(yōu)選Bio-Plex? 200檢測(cè)其雜交信號(hào)，并根據(jù)本發(fā)明所提供標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果分析及判定。本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:(I)本發(fā)明提供的用于瘧原蟲(chóng)基因序列PCR擴(kuò)增的通用引物及用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的探針，靈敏度高，準(zhǔn)確性好；(2)本發(fā)明的方法采用不對(duì)稱(chēng)PCR法結(jié)合液相芯片技術(shù)，增加生物標(biāo)記單鏈的產(chǎn)量以提高PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)有特異性核酸探針的微球的雜交結(jié)合效率，高通量測(cè)試，特異性及靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，能夠?qū)Ο懺x(chóng)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑、及所合成的引物和探針序列等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020]實(shí)施例1:引物、探針序列的設(shè)計(jì)及合成
從Genebank中搜索瘧原蟲(chóng)病原體靶基因SSUrRNA的序列，運(yùn)用相關(guān)生物信息學(xué)軟件進(jìn)行同源性分析和BLAST序列分析，篩出高度保守區(qū)域，針對(duì)保守序列采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5進(jìn)行引物及探針的設(shè)計(jì)；引物及探針設(shè)計(jì)完畢后使用NCBI BLAST進(jìn)行特異性的檢驗(yàn)，并使用Primer premier 5檢測(cè)是否有發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者二聚體形成，結(jié)果表明設(shè)計(jì)探針滿(mǎn)足特異性要求，且不會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者二聚體。所設(shè)計(jì)的引物、探針序列見(jiàn)表1。
[0021]表1用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的引物及探針__
【權(quán)利要求】
1.用于瘧原蟲(chóng)基因序列PCR擴(kuò)增的通用引物，其特征在于所述引物包括SEQID No:l所示的上游引物序列PU-F2和SEQ ID No:2所示的下游引物序列PU-R2組成的引物對(duì)。
2.用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的探針，其特征在于所述探針包括如下 X至3:中的至少一種: I:用于檢測(cè)間日瘧原蟲(chóng)的探針PV-PF2，其序列為SEQ ID NO:3所示； I用于檢測(cè)三日瘧原蟲(chóng)的探針PM-PF2，其序列為SEQ ID NO:4所示；..S:用于檢測(cè)卵形瘧原蟲(chóng)的探針P0-PF2，其序列為SEQ ID NO: 5所示；.1用于檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)的探針PF-PF2，其序列為SEQ ID NO:6所示。
3.—種檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟， 1)合成權(quán)利要求1所述引物及權(quán)利要求2所述探針，并對(duì)探針?lè)謩e進(jìn)行標(biāo)記； 2)提取待測(cè)樣品DNA，以步驟I)所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與步驟I)中合成的探針雜交，得雜交產(chǎn)物； 4)檢測(cè)雜交信號(hào)并分析結(jié)果。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的方法，其特征在于: 所述步驟I)合成引物后，對(duì)每對(duì)引物中的下游引物在5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；所述對(duì)探針的標(biāo)記為對(duì)所有探針在5’端進(jìn)行胺基化修飾，連接C12鄰接臂序列，并與相應(yīng)熒光編碼的微球偶聯(lián)，然后將偶聯(lián)有不同探針的微球混合，制成探針微球組； 所述步驟3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交后，對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行SA-PE標(biāo)記，得微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE的復(fù)合物； 所述步驟4)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)采用液相芯片系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的方法，其特征在于:所述步驟I)探針微球組中偶聯(lián)有不同 探針的微球個(gè)數(shù)相等。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的方法，其特征在于:所述步驟4)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)采用Bio-Plex? 200檢測(cè)系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103911447SQ201410131820
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】閆冀煥, 李云, 史玲莉, 滑娜, 沈軍, 吳志茹, 蘭景, 李薇, 付曉昀 申請(qǐng)人:河北國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心