技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)：
：

戊型肝炎(hepatitive)是由戊型肝炎病毒(hepatitisevirus,hev)引發(fā)的一種嚴重危害人類健康的急性傳染病。近年來，戊型肝炎發(fā)病的絕對數(shù)和發(fā)病率均呈連續(xù)、快速增長態(tài)勢。因此，提高戊型肝炎的診斷和治療水平，具有重要的意義。目前，戊型肝炎的診斷方法很多，例如病毒的分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗、聚合酶鏈式反應(yīng)等。其中，聚合酶鏈式反應(yīng)(polymeasechainreaction(pcr)在理論和應(yīng)用上取得了突破性的進展，受到業(yè)內(nèi)的高度重視?？墒?，由于戊型肝炎病毒基因類型比較復雜，在應(yīng)用pcr方法時，引物設(shè)計難度較大，包括引物探針的序列設(shè)計與選擇、引物/探針用量、鎂離子用量、反應(yīng)條件和陰/陽性對照品等多項技術(shù)參數(shù)尚缺乏成熟的技術(shù)信息，因而還沒有形成適應(yīng)范圍大、操作簡便、準確可靠的實時檢測試劑盒，限制了該方法的推廣和普及。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：hev-f1：5’-gtgcttttgcctatgctg-3’(如seqidno.1所示)，hev-r1：5’-ggttggttggatgaatatagg-3’(如seqidno.2所示)。以基因iii型戊型肝炎病毒序列(genebank登陸號為：ku513561.1)為模板，擴增的目的片段的序列如seqidno.10所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下所示：hev-p1：5’-agaatcaaccctgtcacc-3’(如seqidno.3所示)，探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

所述的熒光報告基團優(yōu)選為fam，所述的熒光淬滅基團優(yōu)選為bhq-1。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有上述的檢測引物和/或檢測探針的檢測試劑盒。

優(yōu)選，所述的檢測試劑盒包括10×buffer、25mmmgcl2、10mmdntpmix、rt-pcrmix(百泰克)、檢測引物hev-f1和hev-r1、檢測探針hev-p1、depc-ddh2o、陰性對照品和陽性對照品。

所述的陰性對照品優(yōu)選為depc-ddh2o。

所述的陽性對照品優(yōu)選為攜帶如seqidno.10所示序列的質(zhì)粒。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：提取待測樣本總rna作為模板，使用上述的檢測引物hev-f1和hev-r1以及檢測探針hev-p1，與實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增用的反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶、rnaseinhibitor和taqdna聚合酶混合形成擴增反應(yīng)體系，進行實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)探針標記的熒光報告基團記錄的熒光信號，讀取并記錄待測樣品的ct值，按照建立的判斷標準，判斷樣品中是否含有戊型肝炎病毒。

所述的待測樣品可以為飲用水、食品或糞便等。

所述的實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增，其反應(yīng)條件優(yōu)選為：45℃10min；95℃15min；95℃，15s，60℃1min，40個循環(huán)；60℃時進行熒光采集。結(jié)果判斷標準：以實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測擴增曲線指數(shù)期明顯，且ct<39為陽性判定原則，如果擴增曲線指數(shù)期明顯且ct<37可直接判定為陽性，如果ct值在37～39之間判斷為可疑，需要加大模板量進行重復實驗，若出現(xiàn)指數(shù)期明顯的擴增曲線方可判定為陽性，否則為陰性。

本發(fā)明針對戊型肝炎病毒，設(shè)計和篩選了特異性檢測引物、探針以及含有該檢測引物和探針的檢測試劑盒和利用該檢測試劑盒通過實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增，進而確認待測樣品中是否含有戊型肝炎病毒的檢測方法。本發(fā)明的檢測試劑盒和檢測方法對戊型肝炎病毒的各個基因型都能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測，具有特異性強、靈敏度高、適應(yīng)范圍廣、操作簡便快捷、檢測結(jié)果準確可靠、檢測時間短的優(yōu)點，靈敏度達到1×10³copies/ml，解決了傳統(tǒng)檢測方法耗時長、靈敏度低等問題，特別適合大規(guī)模樣品的快速檢測，為傳染源調(diào)查、傳播環(huán)境、病毒來源等工作奠定基礎(chǔ)。

附圖說明：

圖1是戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖；引物為hev-f1和hev-r1，探針為hev-p1。

圖2是戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖；引物為hev-f2和hev-r2，探針為hev-p2。

圖3是戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖；引物為hev-f3和hev-r3，探針為hev-p3。

圖4是不同濃度探針的戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖。

圖5是不同濃度mg²⁺的戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖。

圖6是延伸溫度為58℃時戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖。

圖7是延伸溫度為60℃時戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖。

圖8是延伸溫度為62℃時戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖。

圖9是戊型肝炎病毒靈敏度試驗實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖。

圖10是戊型肝炎病毒特異性試驗實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增曲線圖。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

本發(fā)明以hev-ⅲ型(genebank登陸號為：ku513561.1)的orf2基因序列為參考設(shè)計特異性引物和探針，orf2基因具有種屬特異性(鑒別hev的特異性)、又有保守性(與1234亞型分型無關(guān)，4個亞型的序列一致)，因此，設(shè)計的引物和探針可以實現(xiàn)對hev各個亞型的檢測。探針的5’端標記有熒光報告基團fam，探針的3’端標記有熒光淬滅基團bhq-1(見表1)。

表1檢測引物和檢測探針

戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr的反應(yīng)體系見表2。

表2實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系

戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測試劑盒的反應(yīng)條件為：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(熒光采集)，40cycles。試劑盒內(nèi)陽性對照品為攜帶如seqidno.10所示序列的質(zhì)粒，陰性對照品為depc-ddh2o。

實施例1：

1.檢測探針與檢測引物的設(shè)計與選擇

1.1檢測引物與檢測探針的設(shè)計

1.1.1檢測引物和檢測探針設(shè)計原則

根據(jù)taqman熒光探針pcr檢測方法，確定了以下引物和探針設(shè)計原則：

(1)引物和探針的長度：每條引物長度為18～25個堿基，熒光探針長度為20～30個堿基。

(2)引物和探針中g(shù)c％要求在30％～70％，且熒光探針的tm值應(yīng)高于引物的tm值5℃以上。

(3)引物和探針自身、引物和探針之間的3'端盡可能避免堿基配對。

(4)引物和探針自身、引物和探針之間盡可能避免6對以上的連續(xù)堿基配對。

(5)選用的引物和探針要求設(shè)計在靶基因中的保守區(qū)，和其它物種無交叉反應(yīng)。探針位于一對引物之間的區(qū)域。

1.1.2引物和探針的設(shè)計

遵循上述設(shè)計原則，對基因iii型戊型肝炎病毒序列(genebank登陸號為：ku513561.1)結(jié)合其它基因型戊型肝炎病毒序列進行分析，針對病原體設(shè)計三組引物和探針。探針的5’端標記有熒光報告基團fam，3’端標記有熒光淬滅基團bhq-1。

將設(shè)計的引物和探針分別命名為：引物hev-f1(如seqidno.1所示)和hev-r1(如seqidno.2所示)及對應(yīng)的探針hev-p1(如seqidno.3所示)。引物hev-f2(如seqidno.4所示)和hev-r2(如seqidno.5所示)及對應(yīng)的探針hev-p2(如seqidno.6所示)。引物hev-f3(如seqidno.7所示)和hev-r3(如seqidno.8所示)及對應(yīng)的探針hev-p3(如seqidno.9所示)。

1.2陽性對照品的建立

本發(fā)明的陽性對照品為化學合成的含目的擴增片段序列的質(zhì)粒。

將合成的質(zhì)粒分別命名為hev-z1(攜帶有以hev-f2和hev-r2作為引物，基因iii型戊型肝炎病毒作為模板擴增的如seqidno.10所示的序列、hev-z2(含有以hev-f2和hev-r2作為引物，基因iii型戊型肝炎病毒作為模板擴增的目的擴增片段)、hev-z3(含有以hev-f3和hev-r3作為引物，基因iii型戊型肝炎病毒作為模板擴增的目的擴增片段)。

將濃度為1×10¹²copies/ml的質(zhì)粒hev-z1、hev-z2和hev-z3分別稀釋100000倍，分別得到濃度為1×10⁷copies/ml的質(zhì)粒hev-z1、hev-z2和hev-z3，然后分別進行10倍梯度稀釋，得到質(zhì)粒濃度為1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的陽性對照品。

1.3引物和探針的選擇

用步驟1.1.2設(shè)計的三組引物和對應(yīng)的探針對稀釋好的對應(yīng)的陽性對照品進行實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增。具體為：以hev-f1和hev-r1作為引物，hev-p1作為探針，梯度稀釋的質(zhì)粒hev-z1作為模板進行實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增；以hev-f2和hev-r2作為引物，hev-p2作為探針，梯度稀釋的質(zhì)粒hev-z2作為模板進行實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增；以hev-f3和hev-r3作為引物，hev-p3作為探針，梯度稀釋的質(zhì)粒hev-z3作為模板進行實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增。確定最佳引物/探針組。

1.3.1檢測樣本

取步驟1.2中梯度稀釋的3組質(zhì)粒分別作為各自對應(yīng)的引物/探針的檢測樣本(模板)。

1.3.2pcr反應(yīng)體系

根據(jù)實驗室以往的研究經(jīng)驗，將pcr反應(yīng)體系配置為25μl體系，其反應(yīng)體系見表3：

表3實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系

a：分組

共3組，即3組不同的引物/探針組合，每組檢測4個對應(yīng)梯度稀釋的陽性對照品，每個檢測做2個復孔。

組1：以hev-f1和hev-r1作為引物，hev-p1為探針，濃度為1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1質(zhì)粒作為模板。

組2：以hev-f2和hev-r2作為引物，hev-p2為探針，濃度為1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z2質(zhì)粒作為模板。

組3：以hev-f3和hev-r3作為引物，hev-p3為探針，濃度為1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z3質(zhì)粒作為模板。

b：實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)條件設(shè)置

根據(jù)試驗以往研究經(jīng)驗，將實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)條件設(shè)置為：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(熒光采集)，40cycles。

1.3.3檢測結(jié)果

表4戊型肝炎病毒檢測結(jié)果

注：“+”表示檢測結(jié)果為陽性，“-”表示檢測結(jié)果為陰性。

由檢測結(jié)果(表4)和擴增曲線圖(圖1～圖3)可知，本實施例設(shè)計的3組引物及對應(yīng)的探針，均符合要求，且引物hev-f1/hev-r1以及探針hev-p1的檢測靈敏度最高，為最優(yōu)組合。

2.實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.1引物/探針用量研究

將步驟1.3中確定的最優(yōu)引物/探針組合(引物hev-f1/hev-r1以及探針hev-p1)分別作為引物和探針，以hev-z1質(zhì)粒作為模板來確定反應(yīng)體系中引物/探針的用量。

2.1.1引物/探針用量

1)引物/探針用量分組

根據(jù)實驗室以往的研究經(jīng)驗，設(shè)置3組，分別為：

組1：引物hev-f1/hev-r1各0.5μl；探針hev-z10.2μl。

組2：引物hev-f1/hev-r1各0.5μl；探針hev-z10.1μl。

組3：引物hev-f1/hev-r1各0.5μl；探針hev-z10.05μl。

2)反應(yīng)體系設(shè)置

根據(jù)實驗室以往的研究經(jīng)驗，pcr反應(yīng)體系配置為25μl體系，3組的反應(yīng)體系設(shè)置見表5。

表53組實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系

2.1.2檢測樣本

以hev-f1和hev-r1為引物，hev-p1為探針，取步驟1.2中制備的梯度稀釋的濃度為1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1質(zhì)粒作為檢測樣本(模板)。每組樣本重復2次。

2.1.3反應(yīng)條件

根據(jù)試驗以往研究經(jīng)驗，將pcr反應(yīng)條件設(shè)置為：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(熒光采集)，40cycles。

2.1.4檢測結(jié)果及擴增曲線

表6檢測結(jié)果

由上述檢測結(jié)果(表6)和擴增曲線圖(圖4)可以看出：只有組2的各樣本檢測陽性率均為100％，組2的引物/探針用量為本發(fā)明試劑盒內(nèi)的引物/探針的最佳用量。

2.1.5結(jié)論

根據(jù)以上的研究結(jié)果，確定引物和探針用量分別為：各引物在反應(yīng)體系中的終濃度為0.4μm；探針在體系中的終濃度為0.08μm。

2.2鎂離子用量研究

按照步驟2.1中確定的引物/探針的用量來確定最佳的鎂離子用量。

2.2.1鎂離子用量

1)鎂離子用量分組

根據(jù)實驗室以往的研究經(jīng)驗，設(shè)置3組，分別為：組1：mg²⁺在反應(yīng)體系中的終濃度為3mm。組2：mg²⁺在反應(yīng)體系中的終濃度為2.5mm。組3：mg²⁺在反應(yīng)體系中的終濃度為2mm。

2)反應(yīng)體系設(shè)置

表73組實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系

2.2.2檢測樣本

以hev-f1和hev-r1為引物，hev-p1為探針，取步驟1.2中的梯度稀釋的濃度為1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1質(zhì)粒作為檢測樣本(模板)。每組樣本重復2次。

2.2.3反應(yīng)條件

根據(jù)試驗以往研究經(jīng)驗，將pcr反應(yīng)條件設(shè)置為：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(熒光采集)，40cycles。

2.2.4檢測結(jié)果及擴增曲線

表8檢測結(jié)果

由上述檢測結(jié)果(表8)和擴增曲線圖(圖8)可以看出：組1和組2各樣本檢測陽性率均為100％。但是mg²⁺濃度過高時，可能會影響其特異性，因此我們選擇mg²⁺濃度較低的組2作為最佳的鎂離子濃度。

2.2.5結(jié)論

根據(jù)以上的研究結(jié)果，確定鎂離子在反應(yīng)體系中的終濃度為2.5μm。

2.3反應(yīng)條件研究

按照步驟2.1中確定的引物/探針用量和步驟2.2中確定的鎂離子用量來確定最佳的反應(yīng)條件。

2.3.1反應(yīng)條件分組：

反應(yīng)條件1：45℃10min；95℃15min；95℃15s，58℃1min(熒光采集)，40cycles。

反應(yīng)條件2：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(熒光采集)，40cycles。

反應(yīng)條件3：45℃10min；95℃15min；95℃15s，62℃1min(熒光采集)，40cycles。

2.3.2檢測樣本

以hev-f1和hev-r1為引物，hev-p1為探針，取步驟1.2中制備的梯度稀釋的濃度為1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1質(zhì)粒作為檢測樣本(模板)。

2.3.3pcr反應(yīng)體系設(shè)置

根據(jù)步驟2.1和2.2確定的最佳引物/探針用量及鎂離子用量，pcr反應(yīng)體系設(shè)置見表9。

表9實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系

2.3.4檢測結(jié)果及擴增曲線

表10檢測結(jié)果

注：“+”表示檢測結(jié)果為陽性，“-”表示檢測結(jié)果為陰性。

由上述檢測結(jié)果(表10)和擴增曲線圖(圖6～8)可以看出：反應(yīng)條件2中全部樣品檢測均為陽性，因此我們選擇反應(yīng)條件2的反應(yīng)參數(shù)作為檢測試劑盒的反應(yīng)條件。

2.4試劑盒內(nèi)陰性、陽性對照品研究

確定試劑盒內(nèi)的陰性、陽性對照品，保證結(jié)果真實可靠。

2.4.1陽性對照品

1)樣品：將濃度為1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1質(zhì)粒等體積混合作為陽性對照品。

2)分組：共2組，每組每個樣本做2個重復。組1：正常組：正常反應(yīng)混合液，即現(xiàn)配制的反應(yīng)混合液(不加模板)。組2：模擬失控組：反應(yīng)混合液失效或效能下降，即反應(yīng)混合液(不加模板)37℃放置7天。

2.4.2陰性對照品

1)樣品：陰性對照品(depc-ddh2o)1份。

2)分組：共2組，每組每個樣本做2個重復。組1：正常組：正常反應(yīng)混合液，即現(xiàn)配制的反應(yīng)混合液(不加模板)。組2：模擬失控組：正常反應(yīng)混合液(不加模板)，取1μl陽性對照品加入到反應(yīng)混合液中。

2.4.3反應(yīng)體系及條件設(shè)置

2.4.3.1根據(jù)步驟2.1和2.2確定的最佳引物/探針用量及鎂離子用量，反應(yīng)體系設(shè)置見表11。

表11實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系

2.4.3.2pcr反應(yīng)條件設(shè)置：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(熒光采集)，40cycles。

2.4.4pcr檢測

用正常組和模擬失控組的pcr反應(yīng)體系，檢測陽性對照品和陰性對照品。

2.4.5檢測結(jié)果

2.4.5.1陽性對照品檢測結(jié)果

表12陽性對照品檢測結(jié)果

注：“+”表示檢測結(jié)果為陽性，“-”表示檢測結(jié)果為陰性。

2.4.5.2陰性對照品檢測結(jié)果

表13陰性對照品檢測結(jié)果

注：“+”表示檢測結(jié)果為陽性，“-”表示檢測結(jié)果為陰性。

2.4.5.3結(jié)論

從上述的表12和表13數(shù)據(jù)可知，模擬失控組的結(jié)果都是不正常的，而模擬失控組的抽提試劑或檢測試劑的確是配制不正確，因此說明這種質(zhì)量檢驗方法可以監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。

產(chǎn)品中的質(zhì)控方法用陽性對照品和陰性對照來監(jiān)控結(jié)果的可靠性，意義如下：

(1)陽性對照品可以監(jiān)控試劑的有效性以及操作的正確性等；

(2)陰性對照可以監(jiān)控試劑、模板、環(huán)境等的陽性污染。

3試劑盒性能研究

3.1靈敏度實驗

3.1.1陽性質(zhì)粒稀釋

經(jīng)計算，hev-z1質(zhì)粒原液的dna拷貝數(shù)濃度為1×10¹²copies/ml。將原液分別按表14進行稀釋。

表14質(zhì)粒濃度

3.1.2分組

以稀釋好的陽性質(zhì)粒為檢測樣本(模板)，每個濃度樣本重復2次。

3.1.3反應(yīng)體系

表16實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系

3.1.4反應(yīng)條件

45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(熒光采集)，40cycles。

3.1.5檢測結(jié)果及擴增曲線

表17檢測結(jié)果

由上述檢測結(jié)果(表17)和擴增曲線圖(圖9)可以看出：樣本濃度為1×10³copies/ml時，陽性檢出率為100％；當樣本濃度為5×10²copies/ml時，樣本陽性率為0％。因此，我們選擇1×10³copies/ml作為本發(fā)明的戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測試劑盒的分析靈敏度。

3.2特異性實驗

以hev-f1/hev-r1作為引物，hev-p1作為探針，分別對基因i型、ii型、iii型和iv型戊型肝炎病毒及豬瘟病毒(csfv)、豬流感病毒(siv)、煙草花葉病毒和流感病毒進行實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增，每種樣本重復2次。

3.2.1反應(yīng)體系

表18實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系

3.2.2反應(yīng)條件

45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(熒光采集)，40cycles。

3.2.3檢測結(jié)果及擴增曲線

表19檢測結(jié)果

由上述檢測結(jié)果(表19)和擴增曲線圖(圖10)可以看出：基因i型、ii型、iii型和iv型戊型肝炎病毒的檢測結(jié)果均為陽性，豬瘟病毒(csfv)、豬流感病毒(siv)、煙草花葉病毒和流感病毒的檢測結(jié)果均為陰性，說明本發(fā)明的檢測試劑盒能夠同時檢測四種不同基因型戊型肝炎病毒，且具有高度的特異性。

4.研制總結(jié)

通過對引物/探針的序列設(shè)計與選擇、引物探針用量、鎂離子用量、反應(yīng)條件和陰/陽性對照品等的研究，確定了本發(fā)明的戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測試劑盒的最佳引物/探針組、擴增體系和反應(yīng)條件，并對其進行了分析靈敏度和特異性的分析。

4.1引物和探針的設(shè)計與選擇：通過生物信息學分析及實驗驗證，最終戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測試劑盒最終的引物/探針，具體序列見表1。

4.2反應(yīng)體系

4.2.1對試劑盒主要反應(yīng)體系中的引物/探針用量、鎂離子用量的研究，確定了最終的反應(yīng)體系(見表20)。

表20實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系

4.2.2通過反應(yīng)條件的研究，確定本試劑盒的最終反應(yīng)條件為：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(熒光采集)，40cycles。

4.2.3通過對試劑盒內(nèi)陰性、陽性對照品的研究，確定了試劑盒內(nèi)的質(zhì)控品設(shè)置：陽性對照品為攜帶如seqidno.10所示序列的質(zhì)粒；陰性對照品為depc-ddh2o。

5.試劑盒靈敏度和特異性性能評估

經(jīng)研究，確定本試劑盒的分析靈敏度為1×10³copies/ml，且具有很好的特異性。

序列表

<110>廣州機場出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心

<120>戊型肝炎病毒實時熒光逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法

<160>10

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtgcttttgcctatgctg18

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggttggttggatgaatatagg21

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agaatcaaccctgtcacc18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gcccggtcagccgtctgg18

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtgaccgggttgattctcag20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cggttccggcggtggtttct20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gaatgctcagcaggataagggt22

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

agctcggaggacagaaaaagg21

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ccgcatgacatcgacctcggg21

<210>10

<211>148

<212>dna

<213>基因iii型戊型肝炎病毒

<400>10

gtgcttttgcctatgctgcccgcgccaccggccggtcagccgactggccgccgtcgtggg60

cggcgcagcggcagtgccggcagtggtttctggggtgacagggttgattctcagcccttc120

gccctcccctatattcatccaaccaacc148