本發(fā)明屬于基因檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于檢測cyp2c19基因多態(tài)性的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：氯吡格雷(clopidogrel)，屬于噻吩吡啶類抗血小板藥物，第二代adp受體拮抗劑。氯吡格雷為無活性的藥物前體，需經(jīng)肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素p450酶系活化，其中約85％被酯化為無活性的代謝產(chǎn)物經(jīng)腸道代謝，僅有約15％氯吡格雷被活化生成具有活性的代謝產(chǎn)物發(fā)揮其抗血小板藥理作用。氯吡格雷是治療急性冠狀動脈綜合征和經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后抗栓的基礎(chǔ)藥物，但4％～30％患者在治療期間出現(xiàn)氯吡格雷療效下降，甚至出現(xiàn)氯吡格雷抵抗。氯吡格雷為前體藥，主要依賴于cyp2c19代謝生成活性代謝產(chǎn)物，發(fā)揮抗血小板療效。cyp2c19基因存在多態(tài)性，其酶有四種不同的代謝類型：快代謝型(rm，*1/*1)；超快代謝型(um，*17/*17)；中間代謝型(im，*1/*2，*1/*3，*17/*2，*17/*3)；慢代謝型(pm，*2/*2，*2/*3，*3/*3)。中國人群中14％為cyp2c19慢代謝型，常規(guī)劑量的氯吡格雷在慢代謝型患者中產(chǎn)生的活性代謝物減少，抑制血小板聚集作用下降，形成血栓風(fēng)險增加；而在超快代謝型患者中產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物增加，抑制血小板聚集作用增強(qiáng)，出血風(fēng)險增加。2010年美國fda修改的氯吡格雷說明書中黑框警示：cyp2c19基因型檢測結(jié)果應(yīng)作為醫(yī)生調(diào)整治療策略的參考，對于cyp2c19pm型患者，建議考慮調(diào)整治療方案或治療策略。人cyp2c19基因具有遺傳多態(tài)性，cyp2c19至少有36種等位基因，其中cyp2c19*2和cyp2c19*3占亞洲人群弱代謝表型的99％以上，cyp2c19*17是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有超快活性的基因分型。2010年fda提出黑框警告，明確建議醫(yī)生對將要服用氯吡格雷的患者進(jìn)行cyp2c19基因分型檢測，針對患者基因型實施個性化用藥。臨床研究表明，cyp2c19基因突變導(dǎo)致的弱代謝個體，栓塞重新形成的風(fēng)險增加，心腦血管事件的發(fā)生風(fēng)險增加，病死率升高。對于這類個體，需要增加氯吡格雷的劑量(負(fù)荷劑量為300mg或600mg)，以達(dá)到阻斷血小板聚集的效果。cyp2c19功能缺失性等位基因攜帶者的心血管事件和中風(fēng)的死亡率增加51％(12.1％vs.8.0％)。因此，cyp2c19基因多態(tài)性檢測對于氯吡格雷用藥有重要意義。而目前檢測cyp2c19基因多態(tài)性的核苷酸引物及方法準(zhǔn)確性和特異性較低，難以在臨床廣泛應(yīng)用。所以探索一種檢測cyp2c19基因多態(tài)性快速可靠的核苷酸引物組及方法已經(jīng)成為臨床實驗研究的熱點問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測cyp2c19基因多態(tài)性的組合物及其應(yīng)用，通過調(diào)整引物的配比、taq酶的用量和鎂離子的用量等，通過fam、hex、rox(修飾)三通道多重pcr反應(yīng)，并且將引物放置到一管內(nèi)分型檢測，提高檢測的簡便性和特異性，使得整個操作以及反應(yīng)過程簡單化。并在此基礎(chǔ)上，對探針進(jìn)行鎖核酸修飾和二級結(jié)構(gòu)修飾，增加探針的tm值，進(jìn)一步提高探針結(jié)合的特異性的，最后通過上述體系的調(diào)整，使得準(zhǔn)確性和特異性均能夠達(dá)到100％，最低檢測濃度能夠達(dá)到1ng/μl，解決了以往檢測cyp2c19基因多態(tài)性時準(zhǔn)確性和特異性較低的問題。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種用于檢測cyp2c19基因多態(tài)性的組合物，包括針對用于檢測待檢樣品中與cyp2c19基因相關(guān)的特異性目的基因的引物對和探針，包括：cyp2c19*2引物：cyp2c19*2基因正向引物(cyp2c19*2-f):attattgttttctcttagatat(seqidno.1)；cyp2c19*2基因反向引物(cyp2c19*2-r):tctccaaaatatcactttc(seqidno.2)；探針cyp2c19*2-gfp：fam-tgggttatttcccgggaaccca-bhq1(seqidno.3)；探針cyp2c19*2-afp：rox-gttattcccaggaacccataac-bhq2(seqidno.4)；cyp2c19*3引物對：cyp2c19*3基因正向引物(cyp2c19*3-f):ttaacttgatggaaaaa(seqidno.5)；cyp2c19*3基因反向引物(cyp2c19*3-r):gactgtaagtggtttct(seqidno.6)；探針cyp2c19*3-gf：fam-ttacaccccctggatccaggtaa-bhq1(seqidno.7)；探針cyp2c19*3-afp：rox-cttacccctgaatccaggtaag-bhq2(seqidno.8)；cyp2c19*17引物對：cyp2c19*17基因正向引物(cyp2c19*17-f)：actaatgtttggaagttgtt(seqidno.9)；cyp2c19*17基因反向引物(cyp2c19*17-r)：catagctggcagaactggg(seqidno.10)；探針cyp2c19*17-cfp:fam-acatttctcaaagcatctctgatgt-bhq1(seqidno.11)；探針cyp2c19*17-tfp:rox-caatctcaaagtatctctgatgtaag-bhq2(seqidno.12)；內(nèi)標(biāo)引物對：her2-f:tgcttggatctggcgcttttggca(seqidno.13)；her2-r:ccaaacactgcctccagctcttgcc(seqidno.14)；探針her2-fp:hex-agggccaggtcctggggtgggc-bhq1(seqidno.15)；其中對cyp2c19*2-gfp、cyp2c19*3-gf和cyp2c19*17-cfp的5’端進(jìn)行fam修飾，3’端進(jìn)行bhq1修飾；對cyp2c19*2-afp、cyp2c19*3-afp和cyp2c19*17-tfp的5’端進(jìn)行rox修飾，3’端進(jìn)行bhq2修飾；對her2-fp的5’端進(jìn)行hex修飾，3’端進(jìn)行bhq1修飾；在cyp2c19*2-gfp序列的第14位堿基g上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*2-afp序列的第10位堿基a上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*3-gf序列的第13位堿基g上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*3-afp序列的第11位堿基a上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*17-cfp序列的第14位堿基c上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*17-tfp序列的第12位堿基t上增加鎖核酸(lna)的修飾。優(yōu)選地，一人份加入量為：cyp2c19*2-f加入量0.1-0.3μl，cyp2c19*3-f加入量0.1-0.3μl，cyp2c19*17-f加入量0.1-0.3μl，cyp2c19*2-r加入量0.1-0.3μl，cyp2c19*3-r加入量0.1-0.3μl，cyp2c19*17-r加入量0.1-0.3μl，cyp2c19*2-gfp加入量0.01-0.2μl，cyp2c19*3-gf加入量0.01-0.2μl，cyp2c19*17-cfp加入量0.01-0.2μl，cyp2c19*2-afp加入量0.01-0.2μl，cyp2c19*3-afp加入量0.01-0.2μl，cyp2c19*17-tfp加入量0.01-0.2μl，her2-f加入量0.01-0.2μl，her2-r加入量0.01-0.2μl，her2-fp加入量0.01-0.2μl。本發(fā)明提供的一種用于檢測檢測cyp2c19基因多態(tài)性的試劑盒，所述試劑盒包括以上所述的用于檢測cyp2c19基因多態(tài)性的組合物。優(yōu)選地，所述試劑盒包括dna聚合酶(taq酶)、dntps、10×dna聚合酶buffer、udg酶和mg2+，一人份加入量為：dna聚合酶加入量0.1-0.4μl，dntps加入量1-3μl，10×dna聚合酶buffer加入量1-4μl，udg酶加入量0.01-0.2μl，mg2+加入量2-5μl。本發(fā)明提供的一種用于檢測cyp2c19基因多態(tài)性的試劑盒的樣本處理方法，包括：(1)提取樣本中的基因組dna，其中樣本可以選用全血樣本；(2)將提取之后的基因組dna進(jìn)行濃度測定，并將濃度稀釋至10-20ng/μl后，進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)；(3)根據(jù)pcr反應(yīng)之后的結(jié)果分析：根據(jù)pcr擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行判讀，得出cyp2c19各個位點的具體型別。優(yōu)選地，步驟(3)中的位點包括cyp2c19*2(g＞a)、cyp2c19*3(g＞a)和cyp2c19*17(c＞t)。優(yōu)選地，pcr反應(yīng)過程為：37℃下udg酶反應(yīng)2min，95℃預(yù)變性3min，94℃變性15s，60℃退火延伸35s，40個循環(huán)。本發(fā)明提供的一種用于檢測cyp2c19基因多態(tài)性的組合物及其應(yīng)用，具有如下有益效果：本發(fā)明采用這種技術(shù)進(jìn)行相關(guān)基因檢測，操作簡便、易于判讀，對儀器的要求不高，并且整個pcr過程采用全封閉形式，避免了交叉污染的可能，使結(jié)果更加精準(zhǔn)。本發(fā)明通過探針分型的技術(shù)手段實現(xiàn)在一管內(nèi)對snp(單核苷酸多態(tài)性)位點進(jìn)行同時檢測，提高檢測的簡便性，進(jìn)而達(dá)到將目的位點精準(zhǔn)有效的檢測。本發(fā)明通過設(shè)計鎖核酸和含有二級結(jié)構(gòu)的特異性探針和引物，能夠?qū)⒚總€位點的三個基因型別準(zhǔn)確區(qū)分，并且檢測最低濃度能夠達(dá)到1ng/μl。本發(fā)明通過調(diào)整引物的配比、taq酶的用量和鎂離子的用量等，提高整個試劑盒的準(zhǔn)確性和特異性，準(zhǔn)確性和特異性均能夠達(dá)到100％。本發(fā)明主要包括采用特異性的多重pcr-熒光探針法檢測cyp2c19基因的單核苷酸多態(tài)性g681a、g636a和c806t，用于判斷cyp2c19基因中多態(tài)性位點的分布，進(jìn)一步用于輔助氯吡格雷使用劑量的臨床診斷。附圖說明圖1為本實施例1中各檢測位點基因型的基因峰。具體實施方式為了使本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本發(fā)明提供的一種用于檢測cyp2c19基因多態(tài)性的組合物，包括針對用于檢測待檢樣品中與cyp2c19基因相關(guān)的特異性目的基因的引物對和探針，包括：cyp2c19*2引物：cyp2c19*2基因正向引物(cyp2c19*2-f):attattgttttctcttagatat；cyp2c19*2基因反向引物(cyp2c19*2-r):tctccaaaatatcactttc；探針cyp2c19*2-gfp：fam-tgggttatttcccgggaaccca-bhq1；探針cyp2c19*2-afp：rox-gttattcccaggaacccataac-bhq2；cyp2c19*3引物對：cyp2c19*3基因正向引物(cyp2c19*3-f):ttaacttgatggaaaaa；cyp2c19*3基因反向引物(cyp2c19*3-r):gactgtaagtggtttct；探針cyp2c19*3-gf：fam-ttacaccccctggatccaggtaa-bhq1；探針cyp2c19*3-afp：rox-cttacccctgaatccaggtaag-bhq2；cyp2c19*17引物對：cyp2c19*17基因正向引物(cyp2c19*17-f)：actaatgtttggaagttgtt；cyp2c19*17基因反向引物(cyp2c19*17-r)：catagctggcagaactggg；探針cyp2c19*17-cfp:fam-acatttctcaaagcatctctgatgt-bhq1；探針cyp2c19*17-tfp:rox-caatctcaaagtatctctgatgtaag-bhq2；內(nèi)標(biāo)引物對：her2-f:tgcttggatctggcgcttttggca；her2-r:ccaaacactgcctccagctcttgcc；探針her2-fp:hex-agggccaggtcctggggtgggc-bhq1；在cyp2c19*2-gfp序列的第14位堿基g上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*2-afp序列的第10位堿基a上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*3-gf序列的第13位堿基g上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*3-afp序列的第11位堿基a上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*17-cfp序列的第14位堿基c上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c19*17-tfp序列的第12位堿基t上增加鎖核酸(lna)的修飾。在引物合成的時候，按照合成單位的規(guī)定標(biāo)記待修飾堿基即可，合成單位就會知道采用lna的方式修飾此位點。實施例1：本發(fā)明在多重?zé)晒鈖cr的基礎(chǔ)上，配制成已經(jīng)預(yù)混好的檢測位點的引物組合物。直接可對提取完成的樣本進(jìn)行檢測，這樣使檢測步驟更為簡便。具體步驟如下：1)提取全血樣本中的基因組dna(采用商業(yè)化的外周血基因組dna提取試劑盒)。2)將提取之后的基因組dna進(jìn)行濃度測定，并將濃度稀釋至10-20ng/μl進(jìn)行后續(xù)的pcr反應(yīng)過程。3)反應(yīng)體系的成分組成：dntps、mg2+、dna聚合酶buffer、反轉(zhuǎn)錄buffer、基因的引物對、dna聚合酶等。4)pcr反應(yīng)條件：37℃下udg酶反應(yīng)2min；95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，60℃下退火延伸35s，40個循環(huán)。其中udg酶的加入防止體系中尿嘧啶的污染。5)pcr反應(yīng)體系的配制：pcr擴(kuò)增mix(12.5μl，其余用純化水補(bǔ)齊)pcr引物混合液體系(6.5μl，其余用純化水補(bǔ)齊)pcr擴(kuò)增體系pcr擴(kuò)增程序如下：第一擴(kuò)增階段：37℃udg酶反應(yīng)2min；第二擴(kuò)增階段：95℃預(yù)變性3min；第三擴(kuò)增階段：94℃變性15s，60℃退火延伸35s，40個循環(huán)。6)結(jié)果分析①每個樣本內(nèi)標(biāo)通道(hex)ct值應(yīng)≤35，且靶基因通道兩個擴(kuò)增反應(yīng)中至少其中一個ct＜38，(靶基因通道無擴(kuò)增曲線，ct值按40計算)滿足此條件后按表1判讀：②若樣本內(nèi)標(biāo)通道(hex)ct值＞35，建議重新提取標(biāo)本，再做檢測；③若樣品內(nèi)標(biāo)通道ct值≤35，且靶基因通道ct值均ct≥38，則檢測無效。表1結(jié)果判讀檢測名稱ct值結(jié)果判斷cyp2c19*2(g)ct＝ab-a≥5gg基因型cyp2c19*2(a)ct＝b|b-a|＜5ga基因型a-b≥5aa基因型cyp2c19*3(g)ct＝cd-c≥5gg基因型cyp2c19*3(a)ct＝d|d-c|＜5ga混合型c-d≥5aa基因型cyp2c19*17(c)ct＝ef-e≥5cc基因型cyp2c19*17(t)ct＝f|f-e|＜5ct基因型e-f≥5tt基因型7)成品試劑盒的性能驗證利用配置完成的成品試劑盒進(jìn)行產(chǎn)品特異性、最低檢測限檢測，產(chǎn)品試劑盒的特異性能夠達(dá)到100％，最低檢測濃度能到達(dá)到1ng/μl。收集全血樣本40例，利用上述成品試劑盒進(jìn)行特異性檢測，對照結(jié)果采用一代測序作比較，結(jié)果如下：從上述結(jié)果可以得出，本試劑盒的檢測準(zhǔn)確性達(dá)到100％，特異性也達(dá)到100％。利用本試劑盒對50ng/μl，25ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.5ng/μl的不同濃度樣本進(jìn)行檢測，本試劑盒最低檢測濃度能達(dá)到1ng/μl，因此，本試劑盒的檢測最低檢測濃度為1ng/μl。具體實施方式2：收集來自武漢同濟(jì)醫(yī)院的200例外周血對照樣本，利用上述的成品試劑盒進(jìn)行檢測。具體操作步驟如實施案例1所述。本文中應(yīng)用了具體個例對發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行了詳細(xì)闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離該發(fā)明構(gòu)思的前提下，所做的任何顯而易見的修改、等同替換或其他改進(jìn)，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司<120>一種用于檢測cyp2c19基因多態(tài)性的組合物及其應(yīng)用<130>p20170148<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1attattgttttctcttagatat22<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2tctccaaaatatcactttc19<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3tgggttatttcccgggaaccca22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4gttattcccaggaacccataac22<210>5<211>17<212>dna<213>人工序列<400>5ttaacttgatggaaaaa17<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列<400>6gactgtaagtggtttct17<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7ttacaccccctggatccaggtaa23<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8cttacccctgaatccaggtaag22<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9actaatgtttggaagttgtt20<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<400>10catagctggcagaactggg19<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<400>11acatttctcaaagcatctctgatgt25<210>12<211>26<212>dna<213>人工序列<400>12caatctcaaagtatctctgatgtaag26<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<400>13tgcttggatctggcgcttttggca24<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列<400>14ccaaacactgcctccagctcttgcc25<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列<400>15agggccaggtcctggggtgggc22當(dāng)前第1頁12