本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種檢測雞wnt9a基因表達(dá)量的試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

基因表達(dá)是指細(xì)胞在生命過程中，把儲存在dna序列中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成有生物活性的蛋白質(zhì)分子的過程?；虮磉_(dá)規(guī)律的研究，可以了解到目的基因在不同組織器官中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步分析該基因的功能提供幫助。雖然在基因表達(dá)過程中還有翻譯和翻譯后的加工過程，但是mrna是轉(zhuǎn)錄起始在基因表達(dá)的基本控制點，因此基因mrna表達(dá)水平的測定能夠較好的反應(yīng)基因表達(dá)水平和生物學(xué)功能的強(qiáng)弱。本課題組前期轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，在生長速度快慢的兩種不同京海黃雞個體中，wnt9a基因為腿肌組織中的差異表達(dá)基因。wnt9a基因為wnt家族成員之一，wnt家族通過分泌性蛋白wnts作用于多種不同受體從而轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的細(xì)胞內(nèi)信號通路，wnts可通過激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路來調(diào)控多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、存活、遷移能力和細(xì)胞極性等，因此該家族每一個成員缺一不可。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測雞wnt9a基因表達(dá)量的試劑盒，該試劑盒可對雞wnt9a基因表達(dá)量進(jìn)行測定，研究wnt9a基因在雞各種組織中的表達(dá)規(guī)律。

本發(fā)明的原理是：提取京海黃雞組織總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna。利用設(shè)計的擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因的特異引物進(jìn)行熒光定量pcr。結(jié)果表明目的基因和內(nèi)參基因的溶解曲線上只有單峰的存在，說明引物的特異性良好，三對引物都沒有非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的形成，可用于熒光定量pcr。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，目的基因和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率基本一致，即擴(kuò)增效率基本一致，可運用2^-△△ct方法對相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

本發(fā)明公開了用于上述方法的試劑盒，該試劑盒由特異性引物、2×濃度的premix試劑、50×濃度的roxreferencedyeii和滅菌水組成，其中所述的特異性引物的序列如seqidno.1和seqidno.2，seqidno.3和seqidno.4，seqidno.5和seqidno.6所示。

提取待測樣本的組織總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，利用該試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr，運用2^-△△ct方法對相對表達(dá)量進(jìn)行分析,具體計算公式:△△ct＝(待測組目的基因平均ct值－待測組看家基因平均ct值)-(對照組目的基因平均ct值－對照組看家基因平均ct值)。其中，ct值(初始循環(huán)數(shù))為熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閩值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

一種檢測雞wnt9a基因表達(dá)量的方法，是提取待測樣本的組織總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr，運用2^-△△ct方法對相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

用本發(fā)明的試劑盒選擇的檢測方法簡單快捷，可對雞wnt9a基因表達(dá)量進(jìn)行測定，研究wnt9a基因在雞各種組織中的表達(dá)規(guī)律。

附圖說明

圖1組織總rna的提取結(jié)果。圖中m指的是markerdl2000；1、2、3和4分別是心、肝、脾和肺組織rna；bp表示堿基對數(shù)。

圖2是wnt9a基因的溶解曲線。

圖3是β-actin基因的溶解曲線。

圖4是gapdh基因的溶解曲線。

圖5是wnt9a基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6是β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7是gapdh基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

實施例1

1.待測組織rna的提取和反轉(zhuǎn)錄

實驗采用來自京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司的飼養(yǎng)管理水平一致的京海黃雞。選取3只12周齡體重相近的母雞進(jìn)行屠宰，采集心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌、卵巢組織樣，rnawait樣品保存液浸潤后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄體系為40ul(冰上配制)，具體操作為，在0.2m1的pcr管中加入5×primescriptrtmastermix(perfectrealtime)8u1，加入約2000ng量的rna模板(根據(jù)已經(jīng)提取的各組織rna濃度計算)，加入rnasefreedh20補(bǔ)全至40u1.

將加好試劑的pcr管瞬時離心后放在pcr儀上進(jìn)行反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄條件如下：

37℃15min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))

85℃5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))

4℃

所得產(chǎn)物即為cdna，-20℃保存?zhèn)溆?/p>

3.引物設(shè)計和pcr擴(kuò)增

3.1引物的設(shè)計

本實驗用于熒光定量的目的基因wnt9a引物根據(jù)genbank中的基因序列(登錄號：nc_006809.4)和mrna序列(登錄號：nm_204981.2)跨內(nèi)含子設(shè)計，內(nèi)參基因β-actin引物根據(jù)genbank中的基因序列(登錄號：x00182)和mrna序列(登錄號：l081565)跨內(nèi)含子設(shè)計，內(nèi)參基因gapdh引物根據(jù)genbank中的基因序列(登錄號：nc_006088.4)和mrna序列(登錄號：nm_204305.1)跨內(nèi)含子設(shè)計。擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為136bbp，169bp和85bp。引物序列如下：

wnt9a:f:5’-ggaagcccaacaaggacctg-3’(seqidno.1)

r:5’-accgtggcacttacaggttg-3’(seqidno.2)

β-actin:f:5’-cagccatctttcttgggtat-3’(seqidno.3)

r:5’-ctgtgatctccttctgcatcc-3’(seqidno.4)

gapdh:f:5’-aggcgagatggtgaaagtcg-3’(seqidno.5)

r:5’-gactttgccagagaggacgg-3’(seqidno.6)

3.2試劑盒的組成

序列如seqidno.1和seqidno.2，seqidno.3和seqidno.4以及seqidno.5和seqidno.6的特異性引物、2×濃度的premix試劑即2×濃度的sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)、50×濃度的roxreferencedyeii和滅菌水，各組分的份量如下：

seqidno.1：40μl

seqidno.2：40μl

seqidno.3：40μl

seqidno.4：40μl

seqidno.5：40μl

seqidno.6：40μl

2×濃度的sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)：3ml

50×濃度的roxreferencedyeii：120μl

滅菌水：3ml

3.3熒光定量pcr擴(kuò)增

反應(yīng)液的配制在冰上進(jìn)行，每個樣本設(shè)三個重復(fù)。

熒光定量pcr擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，40個循環(huán)；為分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，pcr擴(kuò)增結(jié)束后采集多個信息點進(jìn)行溶解曲線分析，程序為：95℃15s，60℃1min；95℃15s。結(jié)果表明目的基因和內(nèi)參基因的溶解曲線上只有單峰的存在(圖2，圖3和圖4)，說明引物的特異性良好，兩對引物都沒有非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的形成，可用于熒光定量pcr。

3.4目的基因和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將目的基因和內(nèi)參基因的cdna按照10倍梯度稀釋，稀釋成4個梯度，以稀釋的cdna為模板進(jìn)行熒光定量pcr制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。目的基因wnt9a基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝-3.244x+24.555，擬合度r²＝0.998，擴(kuò)增效率eff＝103.363％；內(nèi)參基因β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝-3.303x+26.636，擬合度r²＝0.998，擴(kuò)增效率eff＝100.804％；內(nèi)參基因gapdh基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝-3.338x+24.328，擬合度r²＝0.999，擴(kuò)增效率eff＝99.354％。目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5，圖6和圖7。由上可知目的基因和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率基本一致，擴(kuò)增效率基本一致，可以運用2^-△△ct方法分析wnt9a基因的相對表達(dá)量。

3.5wnt9a基因在京海黃雞母雞各組織中的表達(dá)差異

以12周齡京海黃雞母雞為素材，選取心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌、卵巢的組織樣，提取rna反轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行熒光定量試驗，各個組織中wnt9a基因相對表達(dá)量見表1。由表可知，wnt9a基因在腎臟中的表達(dá)豐度最高，其次為肝、肺、腿肌、心、胸肌、脾臟、卵巢。該試劑盒可用于檢測雞wnt9a基因在各種組織中的表達(dá)量，進(jìn)而研究基因的功能。

表1京海黃各個組織中wnt9a基因的相對表達(dá)量

*表示以卵巢組織中wnt9a基因相對表達(dá)量為內(nèi)對照。

sequencelisting

<110>揚州大學(xué)

<120>一種檢測雞wnt9a基因表達(dá)量的試劑盒及檢測方法

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<213>人工序列

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