專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒毒價(jià)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及狂犬病病毒毒價(jià)的測(cè)定方法，尤其是涉及一種細(xì)胞蝕斑測(cè)定狂犬病病 毒毒價(jià)的方法。
背景技術(shù)：
目前，狂犬病病毒毒價(jià)的測(cè)定方法普遍采用小鼠半數(shù)致死量(LD50)。LD50測(cè)定方 法需要用活體動(dòng)物，活體動(dòng)物的個(gè)體差異將會(huì)給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)很大的影響；而且LD50測(cè)定 周期長(zhǎng)，14日后才能判定結(jié)果，這樣勢(shì)必會(huì)延長(zhǎng)疫苗生產(chǎn)中半成品檢驗(yàn)周期。另外，細(xì)胞蝕斑法也是狂犬病病毒毒價(jià)測(cè)定的一種有效方法。病毒感染細(xì)胞后，通 過(guò)半固體或固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細(xì)胞向周邊擴(kuò)展。經(jīng)過(guò)幾個(gè)增 殖周期，便形成一個(gè)局限性病變區(qū)域，即病毒蝕斑。從理論上講，一個(gè)蝕斑就是由最初感染 細(xì)胞的一個(gè)病毒顆粒形成，因而可通過(guò)病毒顆粒計(jì)數(shù)測(cè)定毒價(jià)。通過(guò)用甲基纖維素或瓊脂 等介質(zhì)防止釋放的病毒顆粒在介質(zhì)中流動(dòng)，以便將蝕斑控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。為便于肉眼 觀察，常用結(jié)晶紫等染料染色，活細(xì)胞層染成深紫色，由于病變細(xì)胞不吸收染料，細(xì)胞板內(nèi) 圓形不著色的透明區(qū)域即為一個(gè)蝕斑單位。病毒懸液的滴度可以用每毫升蝕斑形成單位 (PFU/ml)來(lái)表示。在實(shí)際操作中，需要配置合適的介質(zhì)，有效地控制接種條件和反應(yīng)條件才 能獲得可靠的測(cè)定結(jié)果。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道狂犬病病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)周期為5 10日，蝕斑形成的時(shí)間依然較長(zhǎng)。 此外，蝕斑測(cè)定法存在對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格、操作步驟復(fù)雜、蝕斑不易形成或不能形成、再 現(xiàn)性差等缺點(diǎn)，到目前仍未形成標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒毒價(jià)的方 法，包括以下步驟1)將甲基纖維素與細(xì)胞維持液按照1 99 2 98的質(zhì)量比混合，使甲基纖維 素充分溶解，得到質(zhì)量百分比濃度為 2%的甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基；2)消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞后，用細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋?zhuān)玫郊?xì)胞密度為 lX105cells/ml 5X 105cells/ml 的細(xì)胞懸液；3)用細(xì)胞維持液以10倍系列稀釋待測(cè)定的狂犬病病毒液，得到IO4 IO8倍系列 稀釋梯度濃度狂犬病病毒液；4)將步驟2)所述細(xì)胞懸液與步驟3)所述狂犬病病毒液，以體積比9 1的比例加 入到細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，同時(shí)取步驟2)所述的細(xì)胞懸液與步驟1)所述的細(xì)胞維 持液，以體積比9 1的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)孔中作為陰性對(duì)照，置于36°C 38CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 12h，細(xì)胞貼壁后形成細(xì)胞層，棄去所述細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清 液，用磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞；5)在細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入步驟1)所述甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基Iml 2ml，作為覆蓋層，置于33°C 36°C，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 96h后，加入染色液染色，觀察細(xì)胞培養(yǎng) 板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)，以蝕斑數(shù)計(jì)算待測(cè)定的狂犬病病毒液的毒價(jià)。優(yōu)選地，本發(fā)明所述甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基中含有50 80mmol/L的HEPES。優(yōu)選地，本發(fā)明所述細(xì)胞維持液為含有50 100 μ g/ml DEAE-Dextran和3% (ν/ ν)的牛血清的MEM。優(yōu)選地，本發(fā)明所述細(xì)胞生長(zhǎng)液為含50 100 μ g/ml DEAE-Dextran和6% (ν/ν) 的牛血清的MEM。優(yōu)選地，本發(fā)明所述CO2培養(yǎng)箱中CO2體積含量為2% 10%。優(yōu)選地，本發(fā)明所 述染色液為0. 5% 1. 5% (w/v)的結(jié)晶紫、0.01% 0. (w/v)中性紅或0.5% 5% (w/v)碘液中任一種。技術(shù)效果本發(fā)明的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，采用單層細(xì)胞培養(yǎng)，具有對(duì)病毒 蝕斑反應(yīng)所特有的敏感性、重復(fù)性和特異性。其次，本發(fā)明采用的細(xì)胞維持液、細(xì)胞生長(zhǎng)液能夠促進(jìn)病毒與細(xì)胞吸附。而且在病 毒蝕斑的細(xì)胞生長(zhǎng)液與維持液中，均添加了 DEAE-Dextran，甲基纖維素培養(yǎng)基溶液中還添 加了 50 80mmol/L的HEPES，因此能夠大大加快蝕斑的形成，縮短了狂犬病毒檢測(cè)的周期。最后，甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基配制方法是將滅菌甲基纖維素粉末直接溶于維持液 中，制備方法簡(jiǎn)單。綜上所述，甲基纖維素培養(yǎng)基溶液中含有50 80mmol/L的HEPES，能夠加快蝕斑 的形成；此方法持續(xù)周期短，3 4日即可用肉眼判定結(jié)果，并且特異、敏感，重復(fù)性好，操作 簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)，易于推廣；解決了狂犬病病毒因無(wú)明顯細(xì)胞病變而不易測(cè)定的問(wèn)題，具有一定 應(yīng)用價(jià)值；既可用于病毒克隆，還可用于病毒的測(cè)定和中和抗體的檢測(cè)，給狂犬病病毒的研 究帶來(lái)了較大的方便。


圖1為蝕斑的肉眼觀察圖；
圖2為蝕斑的顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明試驗(yàn)了甲基纖維素與細(xì)胞維持液的比例采用1 99 2 98的質(zhì)量比， 優(yōu)選地，使用1 99的質(zhì)量比，得到質(zhì)量百分比濃度為的甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基。本發(fā)明試驗(yàn)了在細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入細(xì)胞懸液與狂犬病病毒液，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 12h，細(xì)胞貼壁后形成細(xì)胞層，優(yōu)選地，在細(xì)胞貼壁形成單層細(xì)胞層后，繼續(xù)下面的檢測(cè)步驟。本發(fā)明試驗(yàn)了甲基纖維素培養(yǎng)基中使用了 50 80mmol/L HEPES,優(yōu)選地，本發(fā)明 實(shí)施例中使用了 50mmol/L的HEPES，而且在培養(yǎng)初期在配制的覆蓋層中直接加入50mmol/L 的HEPES，不僅簡(jiǎn)化操作步驟，同時(shí)還可以使蝕斑形成時(shí)間進(jìn)一步提前。本發(fā)明試驗(yàn)了細(xì)胞生長(zhǎng)液和細(xì)胞維持液中加入50 100 μ g/ml DEAE-Dextran, 也可以促進(jìn)蝕斑形成，縮短觀察檢測(cè)時(shí)間。
本發(fā)明試驗(yàn)了 0. 5% 1. 5% (w/v)的結(jié)晶紫、0. 01 % 0. 1 % (w/v)中性紅或 0. 5% 5% (w/v)碘液三種不同的染色劑對(duì)培養(yǎng)3 4日的細(xì)胞進(jìn)行染色，均能形成清晰 蝕斑，優(yōu)選0. 5% 1. 5% (w/v)的結(jié)晶紫。本發(fā)明實(shí)施例中，病毒株為Flury-LEP毒株(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，菌種號(hào) AV2012)，其他本領(lǐng)域常用的病毒如Flury-HEP毒株、ERA毒株、CTN-I毒株和aG毒株等也可 用于本發(fā)明之方法進(jìn)行病毒含量測(cè)定。本發(fā)明實(shí)施例中，傳代細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞(幼倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞)，其他本領(lǐng)域常 用的傳代細(xì)胞如Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)、PK-2A細(xì)胞(豬腎細(xì)胞)、HamSter Kidney 細(xì)胞(地鼠腎細(xì)胞)和CEF細(xì)胞(雞胚成纖維細(xì)胞)等也可用于本發(fā)明之方法進(jìn)行病毒含
量測(cè)定。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1配制MEM基礎(chǔ)液取9. 6g MEM溶于1000ml水中，然后加入2. 2g NaHCO3，并用Imol/ L的HCl或NaOH調(diào)整pH值至7. 2，并加入DEAE-Dextran使其濃度為80 μ g/ml，無(wú)菌過(guò)濾后 作為IXMEM基礎(chǔ)液，不加血清的MEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)液。在1 XMEM基礎(chǔ)液中添加3%體積 百分比的牛血清作為細(xì)胞維持液；在IXMEM基礎(chǔ)液中添加6%體積百分比的牛血清作為細(xì) 胞生長(zhǎng)液；取部分維持液加入終濃度為50mmol/L的HEPES備用。該細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，包括以下步驟(1)將已滅菌的甲基纖維素與含有50mmol/L HEPES的維持液按照1 99質(zhì)量比 混合，4°C放置3日以上，使甲基纖維素充分溶解，得到質(zhì)量百分比濃度為的甲基纖維素 溶液，作為覆蓋層；臨用時(shí)于37°C水浴中預(yù)熱；(2)消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BHK-21細(xì)胞，用生長(zhǎng)液稀釋處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BHK-21 細(xì)胞，使細(xì)胞密度為2. 5X 105cells/ml，得到BHK-21細(xì)胞懸液；(3)用維持液以IO1UO2UO3UO4UO5UO^IO7UO8倍系列稀釋待測(cè)定的狂犬病病毒 液，得到梯度濃度狂犬病病毒液；(4)將所述細(xì)胞懸液按0. 9ml/孔加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中；(5)將所述梯度濃度狂犬病病毒液按0. Iml/孔加入到步驟(4)中得到的已含有細(xì) 胞懸液的細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2培養(yǎng)箱的CO2體積 含量為5%，溫度為37°C ；(6)6 12h細(xì)胞貼壁后，棄去所述細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，用摩爾濃度為 0. Olmol/L、pH值為7. 2的滅菌PBS沖洗一遍，直到死亡細(xì)胞完全脫落；然后每孔加入步驟 (1)所配制的質(zhì)量百分比濃度為1 %的甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基Irnl，作為覆蓋層，置于CO2培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，CO2培養(yǎng)箱的CO2體積含量為5%，溫度為35°C ；(7) 96h后棄去覆蓋層，并用濃度為0. Olmol/L.pH值為7. 2的滅菌PBS沖洗三遍， 直至將甲基纖維素沖洗干凈；然后每孔加入lml、l%質(zhì)量百分比的結(jié)晶紫溶液，室溫條件 (25°C)下染色20min后，用自來(lái)水緩緩沖洗15min，直至染色液沖洗干凈，晾干，肉眼觀察細(xì) 胞培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)；
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(8)陰性對(duì)照無(wú)蝕斑出現(xiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板，判為有效板，根據(jù)有效板的各培養(yǎng)孔的蝕 斑數(shù)、接種的待測(cè)定的狂犬病病毒液的用量及稀釋倍數(shù)計(jì)算出待測(cè)定的狂犬病病毒液的毒 價(jià)。圖1和圖2中箭頭所示分別為眼觀和顯微鏡下觀察的病毒蝕斑，圖1中Bl B5 對(duì)應(yīng)的稀釋度分別為待測(cè)狂犬病毒1X ΙΟ4、1 X 105、1 X 106、1 X IO7,1 X IO8稀釋倍數(shù)，每個(gè)稀 釋度4個(gè)孔重復(fù)。B3的4個(gè)孔蝕斑數(shù)分別是15、16、12、10，4個(gè)孔的蝕斑數(shù)均在8 30個(gè) 范圍之內(nèi)，因此B3所對(duì)應(yīng)1 X IO6為最適稀釋倍數(shù)，如前所述，ν (每孔接種的病毒體積)為 0. lml，根據(jù)公式計(jì)算A(PFU/ml) = (15+16+12+10)/4 X 106/0· 1 = 1. 33 X IO8 (PFU/ml)本發(fā)明所述的測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)、批間誤差小，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果批間誤差 小于logl0°_2，能夠?qū)崿F(xiàn)狂犬病病毒毒價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定，并且縮短了狂犬病疫苗生產(chǎn)中半成 品的檢驗(yàn)周期。批間誤差的計(jì)算方法是將同一待檢狂犬病病毒液，小量分裝，超低溫保存，分10 次試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)這一待檢毒樣，10次檢測(cè)的結(jié)果取對(duì)數(shù)，并計(jì)算10個(gè)樣本總體的標(biāo)準(zhǔn)偏差后 得到的數(shù)值。同一病毒液重復(fù)檢驗(yàn)10次，檢驗(yàn)結(jié)果用對(duì)數(shù)表示分別為8. 33,8. 42,8. 18,8. 24、 8. 02,8. 15,8. 35,8. 08,8. 33,8. 27，計(jì)算總體樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0. 12，即為 IoglO012o以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒毒價(jià)的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將甲基纖維素與細(xì)胞維持液按照1∶99～2∶98的質(zhì)量比混合，使甲基纖維素充分溶解，得到質(zhì)量百分比濃度為1％～2％的甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基；2)消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞后，用細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋?zhuān)玫郊?xì)胞密度為1×105cells/ml～5×105cells/ml的細(xì)胞懸液；3)用細(xì)胞維持液以10倍系列稀釋待測(cè)定的狂犬病病毒液，得到104～108倍系列稀釋梯度濃度狂犬病病毒液；4)將步驟2)所述細(xì)胞懸液與步驟3)所述狂犬病病毒液，以體積比9∶1的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，同時(shí)取步驟2)所述的細(xì)胞懸液與步驟1)所述的細(xì)胞維持液，以體積比9∶1的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)孔中作為陰性對(duì)照，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～12h，細(xì)胞貼壁后形成細(xì)胞單層，棄去所述細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，用磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞；5)在細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入步驟1)所述甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基1ml～2ml，作為覆蓋層，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72～96h后，加入染色液染色，觀察細(xì)胞培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)，以蝕斑數(shù)計(jì)算待測(cè)定狂犬病病毒液的毒價(jià)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步驟1) 中所述甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基中含有50 80mmol/L的HEPES。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步驟2) 中所述的細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞、Vero細(xì)胞、PK-2A細(xì)胞、Hamster Kidney細(xì)胞和CEF細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，其特征是步驟1)、3) 中所述的細(xì)胞維持液為含有50 100 μ g/mlDEAE-Dextran和3%體積百分比的牛血清的 MEM0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步驟2) 所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液為含50 100 μ g/ml DEAE-Dextran和6%體積百分比的牛血清的MEM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步驟4) 中細(xì)胞培養(yǎng)孔中細(xì)胞貼壁后形成單層細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步驟4)、 5)中的所述CO2培養(yǎng)箱中CO2體積含量為2% 10%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步驟4) 中所述培養(yǎng)溫度為36°C 38°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步驟5) 中所述培養(yǎng)溫度為33°C 36°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒的方法，其特征在于，步驟5) 中的染色劑為0. 5% 1. 5% w/v的結(jié)晶紫、0. 01% 0. 1% w/v中性紅或0. 5% 5% w/v 碘液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種細(xì)胞蝕斑快速測(cè)定狂犬病病毒毒價(jià)的方法，其包括以下步驟(1)配制甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基；(2)制得細(xì)胞懸液；(3)稀釋待測(cè)定的狂犬病病毒液，得到梯度濃度狂犬病病毒液；(4)將所述細(xì)胞懸液與狂犬病病毒液，以體積比9∶1的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(5)棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，將甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基加至培養(yǎng)孔中，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；(6)結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)，以蝕斑數(shù)計(jì)算待測(cè)定狂犬病病毒液的毒價(jià)。該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單，快速準(zhǔn)確，可控性強(qiáng)、批間誤差小，縮短了狂犬病病毒毒價(jià)的檢驗(yàn)周期。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101921877SQ20101027319
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進(jìn)忠, 張?jiān)S科 申請(qǐng)人:洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司