專利名稱：一種高通量的大豆轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高通量的大豆轉(zhuǎn)基因及篩選方法。
背景技術(shù)：
大豆是重要的油料作物，也是植物蛋白質(zhì)及油脂的重要來源。為了提高大豆抗病 蟲害及生理逆境的能力、改善大豆品質(zhì)、增加大豆產(chǎn)量，除了采用傳統(tǒng)的育種方法外，可通 過基因工程手段實(shí)現(xiàn)有目的的遺傳工程改良。大豆的遺傳轉(zhuǎn)化是研究大豆基因功能的關(guān) 鍵，但由于大豆的組織培養(yǎng)體系不夠完善，大豆組織對(duì)農(nóng)桿菌不敏感等原因，使大豆的遺傳 轉(zhuǎn)化難度大、效率低、至今成為世界性難題。探索大豆轉(zhuǎn)基因方法主要包括基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、電激法、PEG法、子房注射 法等，其中以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法為研究較多。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組培法，存在著遺傳轉(zhuǎn) 化操作繁瑣、成本高、工作量大、周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化率低，而且受到基因型依賴和菌株特異性的限 制；基因槍法操作簡(jiǎn)便、受體廣泛、一次可轉(zhuǎn)化多個(gè)細(xì)胞，但是由于基因整合頻率不高，轉(zhuǎn)化 基因拷貝數(shù)不穩(wěn)定，也受到基因型的限制，而且需要經(jīng)過繁瑣的組織培養(yǎng)體系才能得到再 生植株，特別是其昂貴的設(shè)施條件及實(shí)施成本限制了廣泛的推廣應(yīng)用。目前，大豆轉(zhuǎn)化的主 要障礙來自缺乏高效穩(wěn)定的組培技術(shù)體統(tǒng)，因此，創(chuàng)建高效簡(jiǎn)便的花粉管通道法轉(zhuǎn)化大豆 具有重要意義?；ǚ酃芡ǖ婪?pollen-tube pathway)是周光宇等(1978年)建立并在長(zhǎng)期科學(xué) 研究中發(fā)展起來的一種育種方法，目前已在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用?；驹硎腔ǘ涫诜酆螅ǚ?管通過珠心插入到胚囊中，外援基因沿著花粉管到達(dá)子房，整合到受精但未分化的合子細(xì) 胞中，此時(shí)合子細(xì)胞壁尚不完整，處于感受態(tài)，易使外援基因轉(zhuǎn)入。該方法無(wú)需建立外植體 的組培再生體系，在非離體的大豆活體花器官實(shí)施基因轉(zhuǎn)化，并通過對(duì)后代種子進(jìn)行篩選， 獲得轉(zhuǎn)化植株。該方法已在棉花中被廣泛應(yīng)用，在大豆(劉德璞等，申請(qǐng)?zhí)?9123707. 2)中 已有成功報(bào)道。但是上述大豆花粉管通道轉(zhuǎn)化方法中存在著兩大缺陷一是授粉后轉(zhuǎn)化前 需要進(jìn)行對(duì)每朵花序做一一切去柱頭處理的大量工作；二是通過繁瑣的幼胚組織培養(yǎng)途徑 篩選或?qū)κ斋@種子經(jīng)過初選、移植、再?gòu)?fù)選和分子鑒定等，其篩選程序繁瑣、效率低、工作量 大、篩選周期長(zhǎng)等低效技術(shù)問題。因此，難以滿足大規(guī)模高通量的基因轉(zhuǎn)化與篩選的實(shí)際應(yīng) 用要求。同時(shí)，剪去柱頭的繁瑣操作可能導(dǎo)致以下影響1、大豆是自花授粉植物，其授粉發(fā)育進(jìn)程并非同步。過早的切去柱頭會(huì)影響花粉 管的正常發(fā)育，影響授粉效率，降低胚珠受精機(jī)率，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率下降，同時(shí)影響DNA分子經(jīng) 花粉管通道進(jìn)入胚囊。2、由于大豆花的形態(tài)結(jié)構(gòu)特殊，花器中的柱頭微小，切柱頭的工作要求精細(xì)，操作 不當(dāng)容易引起子房受機(jī)械損傷，花粉管通道破壞，造成結(jié)實(shí)率降低，影響轉(zhuǎn)化率。3、柱頭組織微小，切柱頭的操作難度增加了繁瑣的工作量，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模高通 量的遺傳轉(zhuǎn)化與實(shí)際推廣應(yīng)用的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高通量大豆轉(zhuǎn)基因方法。該方法避免了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方 法中繁雜的組織培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)化效率低、周期長(zhǎng)、受基因型依賴等問題，同時(shí)解決了以往花 粉管通道轉(zhuǎn)化大豆方法中需要修剪大量花柱頭的操作，以及繁瑣的抗性篩選程序及較長(zhǎng)的 篩選周期等技術(shù)缺陷。本發(fā)明提供的大豆轉(zhuǎn)基因方法，包括如下步驟在大豆花的柱頭上滴加基因轉(zhuǎn)化 液，成熟后收獲種子。上述基因轉(zhuǎn)化液是含待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒懸浮液。進(jìn)一步，上述含待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)?？梢允菍⒋D(zhuǎn)基因插入含Bar基因的PGREEN載體 的多克隆位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒，具體可以是實(shí)施例中的PGREEN0229。上述基因轉(zhuǎn)化液是將待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒置于0. IXSSC緩沖液中，得到所述基因轉(zhuǎn) 化液，所述待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒在所述基因轉(zhuǎn)化液中含量50-100ug/ml，優(yōu)選是70ug/ml (也即 上述含待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒是以50-100ug/ml，優(yōu)選是70ug/ml的濃度定溶于0. IXSSC緩沖液 中的)。上述含待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒懸浮液滴加在所述柱頭的體積是5-8 μ 1。具體可以以在柱 頭上形成一最大液滴而不落下為最佳。上述大豆花選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、發(fā)育健壯的花蕾。上述花蕾的花冠高于花萼0_2mm。上述大豆花的柱頭上滴加基因轉(zhuǎn)化液的步驟進(jìn)行兩次，兩次間隔時(shí)間為2小時(shí)之 內(nèi)。上述方法還包括在所述收獲種子步驟之后進(jìn)行種子萌發(fā)得到轉(zhuǎn)基因大豆植株。上述方法還包括所述種子萌發(fā)后的篩選，所述篩選包括如下步驟在所述種子出 苗后從真葉完全展開至第1三出葉展開之前，在葉面上噴灑除草劑。上述除草劑是濃度為0. 8-1. 2%0 (體積濃度)的草胺磷水溶液，所述除草劑噴灑量 150毫升/平方米土，320棵/每平方土 ；所述葉面噴灑的次數(shù)為2次，2次間隔7天。進(jìn)一步，上述篩選還包括葉面噴灑除草劑后的分子生物學(xué)檢測(cè)，優(yōu)選是PCR檢測(cè)、 Southern blot檢測(cè)和/或Western blot檢測(cè)；所述PCR檢測(cè)的所用引物是序列表中序列 2和序列3。本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高、成本低，適用于大豆的大規(guī)?；蜣D(zhuǎn)化 與高通量篩選的方法。采用本發(fā)明提供的方法，不需要剪切柱頭，對(duì)已完成授粉的完整柱頭 頂端直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA，減少了大量花序組織的前處理操作；不經(jīng)過幼胚組織培養(yǎng)途徑的 繁瑣的篩選操作或?qū)ΨN植幼苗的初選、移植和復(fù)選等反復(fù)的篩選程序，而是直接對(duì)Tl代幼 苗實(shí)施抗性篩選和分子生物學(xué)鑒定，當(dāng)年可獲得Tl代陽(yáng)性植株的篩選結(jié)果。采用本方法對(duì) 大豆中品661進(jìn)行轉(zhuǎn)化和篩選，經(jīng)PCR鑒定，其平均轉(zhuǎn)化有效率達(dá)2. 7%。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)具體如下1、該轉(zhuǎn)化方法操作簡(jiǎn)便、效率高、易于推廣應(yīng)用，可用于實(shí)施大規(guī)模的基因轉(zhuǎn)化。 該方法通用性強(qiáng)，不受基因型影響，適合各種大豆品種及品系的基因轉(zhuǎn)化，而且成本低、流 程簡(jiǎn)單、周期短、工作量小，避免了目前常規(guī)轉(zhuǎn)化方法中所存在的組織培養(yǎng)、分化再生難于 解決的問題，同時(shí)在南方及大棚溫室等適宜的條件下可實(shí)現(xiàn)一年兩季的基因轉(zhuǎn)化工作。
4
2、該篩選方法操作流程簡(jiǎn)單、時(shí)間短、成本低，可用于實(shí)施高通量的篩選，而且篩 選抗性苗的陽(yáng)性率高，減少了分子檢測(cè)的工作量。3、充分利用大豆適宜的生長(zhǎng)季節(jié)實(shí)施轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因Tl代種子，可當(dāng)年直接種 植于土壤或溫室中抗性篩選與分子檢測(cè)，大大縮短了轉(zhuǎn)化及篩選周期。4、本方法避免了因剪切柱頭帶來的組織損傷，對(duì)Tl代種子的結(jié)實(shí)率及發(fā)芽率的 影響小。5、篩選鑒定出的陽(yáng)性苗無(wú)需煉苗和移苗，可繼續(xù)在原位生長(zhǎng)發(fā)育至收獲種子。


圖1 :PGreen-TriGLU 質(zhì)粒圖譜(A)及鑒定圖(B)。圖2 高通量法轉(zhuǎn)化大豆技術(shù)流程。圖3 大豆Tl代種子的抗性篩選，A 待篩選的Tl代大豆幼苗；B 大豆幼苗的除草 劑噴灑篩選；C和D 噴灑除草劑10天后的抗性大豆幼苗。圖4 =Tl代抗性幼苗的PCR鑒定。M=IOObp DNA Ladder ；P 質(zhì)粒DNA陽(yáng)性對(duì)照；N 水陰性對(duì)照；Lane2、5、6、7為PCR陽(yáng)性植株；Lanel、3、4為陰性植株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、獲得轉(zhuǎn)基因大豆一、基因轉(zhuǎn)化1、實(shí)驗(yàn)材料1)載體下述實(shí)施例中所用載體為pGREEN0229，可以從http://www. pgreen. ac.uk/a-ord-fr. htm網(wǎng)站購(gòu)置。產(chǎn)品編碼PBII0229 (nos-Bar LB)。其余的材料、試劑等， 均可從商業(yè)途徑得到。2) TriGLUC基因的克隆取幼嫩的栝樓葉組織(采集于北大校園)，利用Trizol法提取總RNA，并通過 常規(guī)方法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)合成cDNA。以TriGLUC_5和TriGLUC_3為引物(TriGLUC_5 CCTCCATGGCTCTTTTGCCG、TriGLUC-3 CTCTCAATTGAACTTGACTGG)，以栝樓cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)克隆得到TriGLUC基因全序列(序列表中序列 1)。合成cDNA具體步驟(1)在RNase-free的PCR管中加入下列組分，并混勻；2μ1 總 RNA(Iyg)3μ 1 lOpmol/μ 1 Oligo dT(16)11. 5μ 1 RNase-free Water(2)72°C，5min ;(3)冰上 2min ；(4)加入下列組分，并混勻；
5
5 μ 1 dNTP(10mM each)
2. 5 μ 1 5x M-MLV RT buffer
1 μ 1 M-MLV
共25 μ 1體系
(5)42°C，60min ；
PCR反應(yīng)體系為
GoTaq Flexi0. 125 μ
5XFlexi Buffer5. 0μ 1
MgCl2 (25 μ Μ)3. 0μ 1
cDNA模板2. 0μ 1
正向引物(TriGLUC-5)0. 5μ 1
反向引物(TriGLUC-3)0. 5μ 1
dNTPs1. 875 μ
ddH2012μ 1
反應(yīng)條件
權(quán)利要求
一種大豆轉(zhuǎn)基因方法，包括如下步驟在大豆花的柱頭上滴加基因轉(zhuǎn)化液，成熟后收獲種子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述基因轉(zhuǎn)化液是含待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒懸浮液。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述含待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒是將待轉(zhuǎn)基因插入 到含Bar基因的pGREEN載體的多克隆位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述基因轉(zhuǎn)化液是將待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒置于 0. IXSSC緩沖液中，得到所述基因轉(zhuǎn)化液，所述待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒在所述基因轉(zhuǎn)化液中含量 50-100ug/ml，優(yōu)選是 70ug/ml。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述含待轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒懸浮液滴 加在所述柱頭的體積是5-8 μ 1。
6.如權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述大豆花是花冠高于花萼0-2mm 的花蕾。
7.如權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述大豆花的柱頭上滴加基因轉(zhuǎn) 化液的步驟進(jìn)行兩次，兩次間隔時(shí)間為2小時(shí)之內(nèi)。
8.如權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括在所述收獲種子 步驟之后進(jìn)行種子萌發(fā)得到轉(zhuǎn)基因大豆植株；所述方法優(yōu)選還包括在所述種子萌發(fā)后的篩 選，所述篩選包括如下步驟在所述種子出苗后從真葉完全展開至第1三出葉展開之前，在 葉面上噴灑除草劑。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述除草劑是濃度為0.8-1. 2%0 (體積濃 度)的草胺磷水溶液；所述除草劑噴灑量150毫升/平方米土，每平方土種植320棵苗；所 述葉面噴灑的次數(shù)為2次，2次間隔7天。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述篩選還包括葉面噴灑除草劑后的 分子生物學(xué)檢測(cè)，優(yōu)選是PCR檢測(cè)、Southern blot檢測(cè)和/或Western blot檢測(cè)；所述 PCR檢測(cè)的所用引物是序列表中序列2和序列3。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高通量大豆轉(zhuǎn)基因方法。該方法，包括如下步驟在大豆花的柱頭上滴加基因轉(zhuǎn)化液，成熟后收獲種子。本方法避免了因剪切柱頭帶來的組織損傷，對(duì)T1代種子的結(jié)實(shí)率及發(fā)芽率的影響小。本發(fā)明提供的方法還包括篩選，該篩選包括如下步驟在所述種子出苗后從真葉完全展開至第1三出葉展開之前，在葉面上噴灑除草劑；進(jìn)一步篩選可以包括分子生物學(xué)檢測(cè)，上述篩選方法操作流程簡(jiǎn)單、時(shí)間短、成本低，可用于實(shí)施高通量的篩選，而且篩選抗性苗的陽(yáng)性率高，減少了分子檢測(cè)的工作量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101948869SQ20101027311
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者于祥春, 付力文, 任姣, 何善平, 安成才, 張起濤, 楊揚(yáng), 滑瑞, 鄔倩, 黃萍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)