專利名稱：一種利用轉(zhuǎn)大豆gtpchi和adcs基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法。
背景技術(shù)：
葉酸(folates)是四氫葉酸(THF)及其衍生物的總稱，是一類水溶性B族維生素，又稱為維生素B9、維生素BI I、維生素M，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖12所示。其中，THF由三部分組成一個(gè)喋啶環(huán)(2-氨基-4-羥基-6-甲基喋啶)，對(duì)氨基苯·甲酸pABA，和多聚谷氨酸(poly-Glu)(l-8fGluX連接)，又名喋酰谷氨酸。不同氧化狀態(tài)的一碳單位，例如甲基，亞甲基，次亞甲基，甲?；?，連接到喋啶環(huán)的N5、pABA的NlO或橋連兩者從而形成四氫葉酸(THF)、5_甲基THF、5-甲酰THF、5，10-亞甲基THF多種葉酸衍生物。THF及其衍生物作為一碳單位的供體和受體，是介導(dǎo)一碳單位轉(zhuǎn)移反應(yīng)的重要因素。植物和微生物可以從頭合成葉酸從而滿足自身需求，而人類及動(dòng)物則不能合成葉酸，只能通過飲食來獲取。食用植物中除菠菜、豆類和椰菜等其葉酸的含量相對(duì)較高外，其他食物如糧食作物、蔬菜水果等的葉酸含量都很低，遠(yuǎn)不能滿足人體對(duì)葉酸的需求量。一般正常人葉酸的需要量為200 400 μ g/d，世界衛(wèi)生組織建議成人至少為200 μ g/d，孕婦和乳母為400 μ g/d。葉酸是維持生物體正常生命過程所必需的一類有機(jī)物質(zhì)，它對(duì)人體的重要營養(yǎng)作用早在1948年即已得到證實(shí)。人類(或其他動(dòng)物)如缺乏葉酸可引起巨紅細(xì)胞性貧血以及白細(xì)胞減少癥，并會(huì)增加心血管疾病及癌癥的發(fā)病率；葉酸對(duì)孕婦尤為重要，如在懷孕頭3個(gè)月內(nèi)缺乏葉酸，可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷，從而增加脊柱裂、無腦畸形的發(fā)生率，在懷孕的前6周內(nèi)若葉酸攝入不足，嬰兒患無腦及脊柱裂畸形的可能性會(huì)增加4倍，其次，孕婦經(jīng)常補(bǔ)充葉酸，可防止新生兒體重過輕、早產(chǎn)以及嬰兒腭裂(兔唇)等先天性畸形；葉酸與維生素B12共同促進(jìn)紅細(xì)胞的生成和成熟，是制造紅血球不可缺少的物質(zhì)；而且葉酸在體內(nèi)參與DNA、氨基酸、泛酸等的合成；葉酸可提供大量游離碳離子，供給制造神經(jīng)末稍和構(gòu)成傳遞神經(jīng)沖動(dòng)的重要化學(xué)物質(zhì)原料，來保證人體神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。臨床上還發(fā)現(xiàn)葉酸具有抗腫瘤、促進(jìn)嬰幼兒的神經(jīng)細(xì)胞與腦細(xì)胞發(fā)育及輔助治療精神分裂癥等作用。葉酸缺乏的現(xiàn)象在全球普遍存在，尤其在經(jīng)濟(jì)水平和生活水平較低的發(fā)展中國家和不發(fā)達(dá)國家。據(jù)調(diào)查顯示，在發(fā)展中國家每年因葉酸缺乏而導(dǎo)致的嬰兒出生缺陷至少有20萬例，因葉酸缺乏而引起孕婦貧血的病例至少有1000萬。目前美國和一些西方國家采取在食品中添加人工合成葉酸制劑的政策來滿足人類需求，而這很難在食品加工業(yè)系統(tǒng)不健全、人口分布不平衡、經(jīng)濟(jì)條件有限的發(fā)展中國家實(shí)行，同時(shí)長期服用人工合成的葉酸是否會(huì)對(duì)人體帶來不良副作用也很令人擔(dān)憂。隨著生物技術(shù)的日益發(fā)展，通過基因工程的手段改造葉酸合成代謝途徑來提高食物中葉酸含量具有很大的吸引力和極其重要的意義。
植物體內(nèi)葉酸的生物合成已經(jīng)研究的較為清楚，合成部位涉及到3個(gè)不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即質(zhì)體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)，分為三個(gè)分支，其分支圖如圖13所示。其中，蝶呤部分是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以GTP為前體合成，對(duì)氨基苯甲酸的合成是以分支酸為前體在質(zhì)體內(nèi)合成，蝶呤和對(duì)氨基酸甲酸運(yùn)輸?shù)骄€粒體參與合成葉酸。在此過程中，有兩個(gè)關(guān)鍵酶，包括在蝶呤分支中，第一步反應(yīng)中的GTP環(huán)化酶I (GTP cyclohydrolase I，GTPCHI)，能夠催化GTP形成二氫新蝶呤三磷酸(DHNTP)，以及在pABA合成途徑的第一步反應(yīng)中的氨基脫氧分支酸合成酶(ADCS)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)這兩種葉酸關(guān)鍵酶在植物中的共表達(dá)可以有效提高植物中的葉酸含量。Rocio I等(2007)在研究中發(fā)現(xiàn)擬南芥GTPCHI過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄中，葉酸含量高的果實(shí)中對(duì)氨基苯甲酸消耗殆盡，所以得出適當(dāng)提高蝶呤的合成可增加組織中葉酸的含量。PABA的不足使得葉酸含量僅提高了 2倍，推測在轉(zhuǎn)GTPCHI基因的植株中補(bǔ)充PABA則能進(jìn)一步提高葉酸含量。之后，他們將過量表達(dá)PABA和過 量表達(dá)蝶呤的植株雜交，使這兩個(gè)性狀結(jié)合后，其成熟果實(shí)中葉酸含量提高了約25倍。這說明在番茄中GTPCHI和ADCS的共同作用對(duì)葉酸的合成很重要。大豆中葉酸的含量較高，大豆的GTPCHI和ADCS對(duì)葉酸的合成是否存在協(xié)同增效還沒有報(bào)道。將大豆的GTPCHI和ADCS共表達(dá)，為進(jìn)行作物蔬菜等的轉(zhuǎn)化，提高糧食作物蔬菜中葉酸的含量，從而滿足人類的日常需求，降低新生兒的出生缺陷，增強(qiáng)抵抗力，預(yù)防心血管疾病、癌癥的發(fā)生等具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的一種利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，包括將上述兩種大豆基因=GmGTPCHI基因和GmADCS基因轉(zhuǎn)入植物并共表達(dá)的步驟，其中，大豆GmGTPCHI基因的⑶S序列如SEQ ID No. I所示，大豆GmADCS基因的⑶S序列如SEQ ID No. 2所示。根據(jù)本發(fā)明的利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其中，將大豆GTPCHI和ADCS基因共表達(dá)的方法如下方法(I)分別構(gòu)建大豆GTPCHI和ADCS基因的表達(dá)載體，然后導(dǎo)入目的植物中，共表達(dá)；或方法(2)構(gòu)建大豆GTPCHI和ADCS基因串聯(lián)的共表達(dá)載體，然后導(dǎo)入目的植物中，共表達(dá)。具體地，對(duì)于方法(I)，可以將大豆的GmGTPCHI和GmADCS基因的⑶S分別構(gòu)建到植物過表達(dá)載體，并分別侵染到植物中，其中，選用GmGTPCHI侵染的陽性轉(zhuǎn)基因植株做父本，GmADCS侵染的陽性轉(zhuǎn)基因植株做母本，進(jìn)行雜交得到獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，用RT-PCR技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)基因雜交植株中目的基因的表達(dá)水平，并測定這些植株中的葉酸含量，結(jié)果表明，比GmGTPCHI和GmADCS單獨(dú)侵染的植株均有明顯提高，比野生型提高了 2. 5 4. 5倍?；蛘撸鶕?jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于方法(2)，可以將大豆GmGTPCHI和GmADCS分別由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，串聯(lián)到pCAMBIA3301載體上，侵染植物，將收獲的種子在抗性培養(yǎng)基上篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植株。用RT-PCR技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)基因植物中目的基因的表達(dá)水平，并測定這些植株中的葉酸含量，發(fā)現(xiàn)比GmGTPCHI和GmADCS單獨(dú)侵染的植株均有明顯提高，比野生型提高了 3 4. 5倍。因此，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，將大豆的葉酸合成關(guān)鍵酶GTPCHI和ADCS在其它植物中共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)酶共同作用可顯著提高擬南芥的葉酸含量，這為進(jìn)行作物蔬菜水果等的轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，人類可通過飲食直接獲得天然的葉酸，解決葉酸攝入缺乏的現(xiàn)象，并克服了長期服用葉酸片劑帶來的不良副作用。


圖I為雜交陽性轉(zhuǎn)基因植株的基因型鑒定。所示為PCR擴(kuò)增的部分電泳圖，其中
4、5、6、7、8、10、11 為轉(zhuǎn)入 GmGTPCHI 基因的植株，1、2 、4、5、6、7、8、9、11、12 為轉(zhuǎn)入 GmADCS 基因的植株。圖2為雜交陽性轉(zhuǎn)基因植株中GmGTPCHI、GmADCS表達(dá)水平檢測。野生型擬南芥(WT)為陰性對(duì)照，在轉(zhuǎn)基因陽性植株中均檢測到目的基因的表達(dá)，表達(dá)量在不同植株中存
在差異。圖3為雜交植株葉酸含量分析。WT野生型為對(duì)照，GTPCHI為單獨(dú)轉(zhuǎn)入GmGTPCHI的植株，ADCS為單獨(dú)轉(zhuǎn)入GmADCS的植株，GA1-GA6為雜交株系。圖4為GmGTPCHI和GmADCS同時(shí)克隆到pCAMBIA1301的載體圖示。圖5為串聯(lián)載體侵染野生型擬南芥植株基因型鑒定。其中Cl、C2、C4、C6、C7、C8為陽性轉(zhuǎn)基因植株。圖6為串聯(lián)載體陽性轉(zhuǎn)基因植株基因GmGTPCHI、GmADCS表達(dá)水平分析。野生型擬南芥(WT)為陰性對(duì)照，在轉(zhuǎn)基因陽性植株中均檢測到目的基因的表達(dá)，且表達(dá)量在不同植株中存在差異。圖7為串聯(lián)載體陽性轉(zhuǎn)基因植株葉酸含量分析。圖8為轉(zhuǎn)GmGTPCHI基因植株基因型鑒定，1-13為GmGTPCHI侵染后的擬南芥植株，1、3、5-11、13為陽性轉(zhuǎn)基因植株。圖9為轉(zhuǎn)GmGTPCHI基因植株葉酸含量的測定結(jié)果，具體地，是測定兩種主要的葉酸存在形式5-甲基THF和5-甲酰THF的含量之和。圖10為轉(zhuǎn)基因植株基因型的鑒定，其中1_4、6、7、10-12為陽性轉(zhuǎn)基因植株。圖11為轉(zhuǎn)基因植株中pABA含量的測定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株pABA含量比野生型有所提聞。
圖12為葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖13為植物體內(nèi)葉酸的生物合成分支圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。實(shí)施例I、GmGTPCHI基因的克隆及表達(dá)I、獲得大豆GTPCHI基因的EST序列
由于來源于不同物種的GTPCHI基因應(yīng)該具有一定程度的同源性，或存在保守的結(jié)構(gòu)域。為此，將擬南芥的GTPCHI基因的⑶S序列與大豆的EST序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，獲得大豆GTPCHI基因的EST序列。2、PCR擴(kuò)增得到GmGTPCHI基因片段及其序列分析取大豆葉片lOOmg，采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)DNase I處理后，檢測RNA純度和濃度，取I U g用反轉(zhuǎn)錄試劑盒First strand cDNA systhesis (購自Fermentas)獲得cDNA。以大豆GTPCHI基因的EST序列為模板設(shè)計(jì)引物，以大豆cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。獲得約700bp條帶，測序?yàn)榇蠖笹TPCHI的片段序列，分別將序列與5’端的EST和3’端EST序列在Vector NTI中進(jìn)行組裝拼接。以GTPCHI-3FW、GTPCHI_7RV為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見表1)，得到1400bp左右的產(chǎn)物，將這些片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收，分別連到P-EASY-Tl載體(購自全式金公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選和菌落PCR獲得陽性克隆。經(jīng)測序分析，得到1380bp目的片段，命名為GmGTPCHI。3、5’和3’ RACE獲得GmGTPCHI基因的全長 以上述得到的序列GmGTPCHI為模板，分別設(shè)計(jì)5’ RACE和3’ RACE引物，分別命名為GmGTPCHI5’RACE，GmGTPCHI5’RACE nest,GmGTPCHI3JRACE,GmGTPCHI3JRACE nest (引物序列見表I)。采用Trizol法提取大豆葉片總RNA,根據(jù)geneRACE試劑盒(購自invitrogen)的說明書上的方法得到5’和3’ RACE的cDNA，以5’和3’ RACE的cDNA為模板，用上述的5’ RACE和3’ RACE引物，分別進(jìn)行巢式PCR。將PCR獲得條帶回收并連接p_EASY_Tl載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果與網(wǎng)站公布的GmGTPCHI UTR序列一致。經(jīng)序列分析得到大豆葉酸關(guān)鍵酶基因GmGTPCHI完整的CDS序列1380bp。表I大豆GTPCHI基因克隆引物序列
一引物名稱序列5’-3’
GTPCHI3-FWATGGAGCATTTGGGTCAGTATG
GTPCHI7RVTCAAAGAGATGTAGCATTTGG
GmGTPCHIS5RACECCTTCGC ACTTTGCTTGTAACCTC
GmGTPCHIS5RACE nest GTGGTGTCTTTATAATGCCTTCCCTG GmGTPCHD 5RACEGTGATAGTGGTGGTGGAAGC AAGTC
GmGTPCHD ;RACE nest GACCTTGCTGCAAGAACCTCGTTTC4、轉(zhuǎn)GmGTPCHI基因擬南芥葉酸含量的鑒定將大豆的GmGTPCHI的⑶S序列構(gòu)建到植物表達(dá)載體pH2GW7上，由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，得到重組載體pH2GW7-GmGTPCHI。將載體電擊轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌LBA4404，挑取酶切鑒定正確的克隆，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花沾法侵染野生型擬南芥，收獲的種子記為Ttl代。Ttl代種子首先在1/2MS+潮霉素B (25mg/L)的抗性培養(yǎng)基上篩選，獲得13株陽性綠苗(記為T1代)，并移入溫室中培養(yǎng)20天，分別取葉片提取DNA，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株，其中1、3、5-11、13為陽性轉(zhuǎn)基因植株(如圖8所示)。利用高效液相色譜測定法檢測這些轉(zhuǎn)基因陽性植株中的葉酸含量，主要是檢測5-甲基THF和5-甲酰THF這兩種主要的葉酸衍生物含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GmGTPCHI轉(zhuǎn)基因植株比野生型提高了 I. 6 2倍(如圖9所示)O
實(shí)施例2、GmADCS基因的克隆及表達(dá)I、獲得大豆ADCS基因的EST序列將擬南芥的ADCS基因的⑶S序列與大豆的EST序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，獲得大豆GTPCHI基因的EST序列。2、PCR擴(kuò)增得到GmADCS基因片段及其序列分析取大豆葉片lOOmg，采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)DNase I處理后，檢測RNA純度和濃度，取I U g用反轉(zhuǎn)錄試劑盒First strand cDNA systhesis (購自Fermentas)獲得cDNA。以大豆ADCS基因的EST序列為模板設(shè)計(jì)引物，以大豆cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。獲得約1300bp條帶，片段回收后連p-EASY-Tl載體，挑取8個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序，與3’EST進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)克隆的測序結(jié)果一致且與3’ EST匹配，大小為1352bp。將獲得的1352bp序列與已經(jīng)公布的大豆基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與大豆10號(hào)染色體的一段序列一致性很高，且其預(yù)測的⑶S序列2304bp，根據(jù)預(yù)測的⑶S序列設(shè)計(jì)引物ADCSMF和ADCSMR(引物序列見·表2)，PCR擴(kuò)增得到GmADCS基因的大部分⑶S序列2296bp。3、5’和3’ RACE獲得GmADCS基因的全長Trizol法提取大豆葉片提取總RNA,經(jīng)DNase I處理后，取5 μ g,根據(jù)geneRACE試劑盒(購自invitrogen)的方法獲得cDNA。根據(jù)已獲得序列5’端260bp處設(shè)計(jì)引物ADCS5’RACE，180bp處設(shè)計(jì)引物ADCS5, RACE nest (引物序列見表2)。之后做巢式PCR。電泳檢測得到SOObp左右的片段，片段回收后連p-EASY-Tl載體，經(jīng)測序分析，在已知序列的基礎(chǔ)上獲得483bp的5’端序列和218bp5’ UTR序列。根據(jù)已獲得序列3’末端300bp處設(shè)計(jì)引物ADCS 3’RACE，159bp處設(shè)計(jì)引物ADCS 3’RACEnest (引物序列見表2)。之后做巢式PCR，電泳檢測得到400bp左右的片段，片段回收后連p-EASY-Tl載體，經(jīng)測序分析，獲得252bp大豆的3’UTR序列。將獲得的序列進(jìn)行拼接，經(jīng)分析最終得到完整的GmADCS基因序列，根據(jù)克隆得到的序列設(shè)計(jì)克隆GmADCS基因CDS全長的引物ADCSIOFLFI和ADCSIORI (弓丨物序列見表2)，PCR并對(duì)產(chǎn)物測序，得到⑶S序列2784bp。表2GmADCS基因克隆引物序列
"引物名稱序列5’-3’
ADCSMF GCATTTGTCTTCAGCTGTTG ADCSMR CTAAGC AAAATGCATCACAG ADCS5，RACE CCTCTGTGTCATTC AACC ACTGTG ADCS5，RACE nest GACGGTTCGATTTCACACCACACTC ADCS 3，RACE CCTGGTGGTTCAATGACAGGTGCAC ADCS 3 5RACE nest CAGTCATTGTACACGAGGGTGAAG ADCS IOFLFI ATGAATTCGTCTCTGCGTTTG ADCS10R1_CTAAGC AAAATGCATCACAGC_4、轉(zhuǎn)GmADCS基因擬南芥的獲得及其葉酸合成前體pABA含量的測定將GmADCS的⑶S序列構(gòu)建到植物過表達(dá)載體pCAMBIA1302的酶切位點(diǎn)Nco I和Pml I之間，由花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)得到重組表達(dá)載體pCAMBIA1302-GmADCS。將上述重組載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，挑取酶切鑒定正確的克隆，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花沾法侵染野生型擬南芥，收獲的種子記為Ttl代。Ttl代種子首先在1/2MS+潮霉素B (25mg/L)的抗性培養(yǎng)基上篩選，獲得13株陽性綠苗(記為T1代)，并移入溫室中培養(yǎng)20天，分別取葉片提取DNA，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株，侵染的植株中1-4、6.、7、10-12為轉(zhuǎn)基因陽性植株(如圖10所示)。利用高效液相色譜法(HPLC)檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株中的葉酸合成前體pABA含量，發(fā)現(xiàn)比野生型提高I. 2 2倍(如圖11)。實(shí)施例3、雙基因雜交植株的獲得及其葉酸含量的測定將大豆的GmGTPCHI和GmADCS的⑶S序列分別構(gòu)建到植物過表達(dá)載體，均由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。其中，大豆GmGTPCHI的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)重組到PH2GW7，大豆葉酸合成關(guān)鍵酶基因GmADCS的⑶S序列構(gòu)建到植物過表達(dá)載體PCAMBIA1302的酶切位點(diǎn)Nco I和Pml I之間，得到重組表達(dá)載體pCAMBIA1302_GmADCS。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花沾法侵染野生型擬南芥。將獲得的轉(zhuǎn)入GmGTPCHI的Ttl代陽性擬南芥植株GI-G4做父本，將獲得的轉(zhuǎn)入GmADCS的TO代陽性擬南芥植株A1-5做母本，進(jìn)行了如下的雜交組合Glx Al，GlxA2, G2xA3, G2xA4，G3xA2，G4xA5，雜交后的種莢分別單獨(dú)收獲(見表3)。種子在溫室中培養(yǎng)20天，分別取葉片提取DNA。設(shè)計(jì)GmGTPCHI和GmADCS基因特異引物(表4)，以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下
IOxTaq buffer2ul
dNTPs (2.5mM each) 2ul 引物 Fw (IOuM)Iul
引物 Rv (IOuM)Iul
DNA 模板(10ng/ul) 2ul Taq 酶(5U/ul)0.2ul
ddH20補(bǔ)足至 20ulPCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，Taq酶72°C擴(kuò)增30s，35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物I %瓊脂糖電泳檢測，得到400bp左右的片段為目的條帶。圖I所示為PCR擴(kuò)增的部分電泳圖，其中4、5、6、7、8、10、11為轉(zhuǎn)入GmGTPCHI基因的植株，1、2、4、
5、6、7、8、9、11、12為轉(zhuǎn)入GmADCS基因的植株，因此，4、5、6、7、8、11為同時(shí)轉(zhuǎn)入兩個(gè)目的基因的植株。進(jìn)一步用RNA Trizol法提取了上述同時(shí)轉(zhuǎn)入兩個(gè)目的基因植株的總RNA，經(jīng)DNase I處理后,取I μ g，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)的方法獲得cDNA作模板,用表4中所示的基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測GmGTPCHI和GmADCS的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)野生型里均檢測不到兩個(gè)基因的表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因植株中可檢測到基因的顯著表達(dá)，且不同株系間基因的表達(dá)存在差異，圖2為部分檢測的電泳圖。分別把641、642、643、644、645、6八6的后代中鑒定為雙基因轉(zhuǎn)入的植株取生長30天的葉片，提取葉酸，用高效液相色譜法分析葉酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型相比，單獨(dú)轉(zhuǎn)入GmGTPCHI的葉酸含量提高了 I. 5倍，單獨(dú)轉(zhuǎn)入GmADCS的植株葉酸含量沒有變化，雜交植株葉酸含量比野生型提高了 2. 5 4. 5倍(圖3)。
表3進(jìn)行雜交獲得的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系。
權(quán)利要求
1.一種利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括將含有大豆GTPCHI和ADCS基因的過表達(dá)載體共同導(dǎo)入目的植物中、通過兩種基因的共表達(dá)提高植物的葉酸含量的步驟， 其中，所述GTPCHI基因的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；所述ADCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，將大豆GTPCHI和ADCS基因共表達(dá)的方法如下 方法⑴分別構(gòu)建大豆GTPCHI和ADCS基因的表達(dá)載體，然后導(dǎo)入目的植物中，共表達(dá)；或 方法(2)構(gòu)建大豆GTPCHI和ADCS基因串聯(lián)的共表達(dá)載體，然后導(dǎo)入目的植物中，共表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，對(duì)于方法(I)，將大豆GTPCHI和ADCS基因分別構(gòu)建植物表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)染到不同植株中，選用大豆GTPCHI基因侵染的陽性轉(zhuǎn)基因植株做父本，選用大豆ADCS基因侵染的陽性轉(zhuǎn)基因植株做母本，將父本與母本進(jìn)行雜交獲得雙基因雜交植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，對(duì)于方法(2)，將大豆GTPCHI和ADCS基因串聯(lián)在表達(dá)載體PCAMBIA1301載體上，將載體轉(zhuǎn)染到植株，將收獲的種子在抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的大豆葉酸合成關(guān)鍵酶GTPCHI基因序列如SEQ ID No.1所示，ADCS基因序列如SEQ ID No.2所示。轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因植株中葉酸的含量，因此，本發(fā)明可以作為一種生產(chǎn)高含量葉酸轉(zhuǎn)基因植物的方法，人類可通過飲食這類植物直接獲得天然的葉酸，解決葉酸攝入缺乏的現(xiàn)象，并克服了長期服用葉酸片劑帶來的不良副作用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102899349SQ20111021651
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者張春義, 梁秋菊, 范云六 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所