專利名稱：一種細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及狂犬病病毒毒價的測定方法，尤其是涉及一種細胞蝕斑快速滴定狂犬 病病毒的方法。
背景技術：
目前，狂犬病病毒毒價的測定方法普遍采用小鼠半數(shù)致死量(LD50)。LD50測定方 法需要用活體動物，活體動物的個體差異將會給檢測結果帶來很大的影響；而且LD50測定 周期長，14日后才能判定結果，這樣勢必會延長疫苗生產(chǎn)中半成品檢驗周期。另外，細胞蝕斑法也是狂犬病病毒毒價測定的一種有效方法。病毒感染細胞后，通 過半固體或固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細胞向周邊擴展。經(jīng)過幾個增 殖周期，便形成一個局限性病變區(qū)域，即病毒 蝕斑。從理論上講，一個蝕斑就是由最初感染 細胞的一個病毒顆粒形成，因而可通過病毒顆粒計數(shù)測定毒價。通過用甲基纖維素或瓊脂 等介質(zhì)防止釋放的病毒顆粒在介質(zhì)中流動，以便將蝕斑控制在適當?shù)姆秶鷥?nèi)。為便于肉眼 觀察，常用結晶紫等染料染色，活細胞層染成深紫色，由于病變細胞不吸收染料，細胞板內(nèi) 圓形不著色的透明區(qū)域即為一個蝕斑單位。病毒懸液的滴度可以以每毫升蝕斑形成單位 (PFU/ml)來表示。在實際操作中，需要配置合適的介質(zhì)，有效地控制接種條件和反應條件才 能獲得可靠的測定結果。雖然國內(nèi)外已有學者在雞胚成纖維細胞、豬腎細胞(PK-2A細胞)、倉鼠腎細胞 (BHK-21細胞)和非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)上建立了狂犬病病毒蝕斑方法，但由于這些 蝕斑測定法對實驗條件要求嚴格、操作步驟復雜，并且蝕斑不易形成，有的甚至不能形成， 再現(xiàn)性差等，到目前仍未形成標準的檢測方法。此外，國內(nèi)外已報道狂犬病病毒蝕斑實驗周 期為5 10日，蝕斑形成的時間依然較長。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述現(xiàn)有技術的諸多不足之處，本發(fā)明的目的是提供一種細胞蝕斑快速滴 定狂犬病病毒的方法，其操作簡單，快速準確，縮短了狂犬病病毒毒價的檢驗周期，并且克 服了活體動物個體差異而帶來的檢測誤差較大的問題。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術方案—種細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其包括以下步驟(1)、將已滅菌的甲基纖維素與維持液按照1 99 2 98的質(zhì)量比混合，2°C 8°C放置使甲基纖維素充分溶解，得到質(zhì)量百分比濃度為 2%的甲基纖維素溶液，作 為覆蓋層；(2)、消化處于對數(shù)生長期的BHK-21細胞，用生長液稀釋處于對數(shù)生長期的 BHK-21細胞，使細胞密度為IX IO5個/毫升 5X105個/毫升，得到BHK-21細胞懸液；(3)、用維持液IO4 IO8倍系列稀釋待測定的狂犬病病毒液，得到梯度濃度狂犬病 病毒液；
(4)、將所述細胞懸液按0. 9ml/孔加入到細胞培養(yǎng)板中；(5)、將所述梯度濃度狂犬病病毒液按0. Iml/孔加入到步驟(4)中得到的含有細 胞懸液的細胞培養(yǎng)板中，同時設置陰性對照，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(6)、6 12h細胞貼壁后，棄去所述細胞培養(yǎng)板中的上清液，用摩爾濃度為
0.Olmol/L、pH值為7. 2 7. 4的滅菌磷酸鹽緩沖液沖洗，直到死細胞完全脫落；然后每孔 加入步驟(1)所配制的質(zhì)量百分比濃度為 2%的甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基Iml 2ml， 作為覆蓋層，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(7)、72 96h后棄去覆蓋層，并用摩爾濃度為0. 01mol/L、pH值為7. 2 7. 4的滅 菌磷酸鹽緩沖液沖洗，直至將甲基纖維素沖洗干凈；然后每孔加入200μ 1 2ml、0. 5%
1.5%質(zhì)量百分比的結晶紫溶液，室溫染色15 20min后，用自來水緩緩沖洗，直至染色液 沖洗干凈，晾干，觀察細胞培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)；(8)、陰性對照無蝕斑出現(xiàn)的細胞培養(yǎng)板，判為有效板，根據(jù)有效板的各培養(yǎng)孔的 蝕斑數(shù)、接種的待測定的狂犬病病毒液的用量及稀釋倍數(shù)計算出待測定的狂犬病病毒液的毒價。所述質(zhì)量百分比濃度為 2%的甲基纖維素溶液中含有終濃度為50 IOOmmol/L 的 HEPES。步驟(1)、(3)中使用的維持液為含有終濃度為50 lOOug/ml的 DEAE-Dextran (二乙胺乙基葡聚糖)和3 %體積百分比的胎牛血清的MEM (Minimum Essential Medium)。步驟(2)中使用的生長液為終濃度為含有50 100ug/ml的DEAE-Dextran和6% 體積百分比的胎牛血清的MEM。所述細胞培養(yǎng)板為24孔板。步驟(5)、(6)中，所述CO2培養(yǎng)箱中CO2體積含量為2% 10%，較佳的體積含量5%。步驟(5)中，培養(yǎng)溫度為36°C 38°C，較佳的培養(yǎng)溫度為37°C。步驟(6)中，培養(yǎng)溫度為33°C 36°C，較佳的培養(yǎng)溫度為35°C。步驟(8)中，待測定的狂犬病病毒液的毒價的計算方法，以Iml狂犬病病毒液中所 含的蝕斑形成單位的數(shù)目來表示，計算公式為A = aXb/v;其中，A 每毫升病毒中蝕斑形成 單位的數(shù)目；a 最適稀釋倍數(shù)平均每孔中出現(xiàn)的蝕斑數(shù)；b 狂犬病病毒稀釋倍數(shù)；ν 每孔 接種的病毒體積。所述最適稀釋倍數(shù)為蝕斑清晰，蝕斑數(shù)在8 30個范圍的稀釋倍數(shù)。由于采用如上所述的技術方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)越性該細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，采用BHK-21單層細胞培養(yǎng)，具有病毒蝕 斑方法所共有的敏感性，重復性和特異性；甲基纖維素溶液配制方法是將滅菌甲基纖維素 粉末直接溶于維持液中，制備方法簡單，溶液配制容易；甲基纖維素溶液中含有終濃度為 50 lOOmmol/L的HEPES，能夠加快蝕斑的形成；采用的維持液、生長液能夠促進病毒與細 胞吸附，促進蝕斑的形成；此方法持續(xù)周期短，3 4日即可用肉眼判定結果，并且特異、敏 感，重復性好，操作簡便，經(jīng)濟，易于推廣；解決了狂犬病病毒因無明顯細胞病變而不易滴定 的問題，具有一定應用價值；既可用于病毒克隆，還可用于病毒的滴定和中和抗體的檢測，給狂犬病病毒的研究帶來了較大的方便。


圖1是蝕斑眼觀狀態(tài)；圖2是顯微鏡下觀察到的蝕斑狀態(tài)。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但以下實施例并不用于限制本 發(fā)明的范圍。配置MEM培養(yǎng)液，并加入DEAE-Dextran使其終濃度為50 100ug/ml，無菌過濾作 為基礎液。在基礎液中添加3%體積百分比的胎牛血清作為維持液；在基礎液中添加6%體 積百分比的胎牛血清作為生長液；取部分維持液加入終濃度為50mmol/L的HEPES。消化液 為含0. 05%質(zhì)量百分比的胰酶和0. 02%質(zhì)量百分比的EDTA-2Na。該細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，包括以下步驟(1)、將已滅菌的甲基纖維素與維持液按照1 99質(zhì)量比混合，4°C放置3日以上， 使甲基纖維素充分溶解，得到質(zhì)量百分比濃度為的甲基纖維素溶液，作為覆蓋層；臨用 時于37°C水浴中預熱；(2)、消化處于對數(shù)生長期的BHK-21細胞，用生長液稀釋處于對數(shù)生長期的 BHK-21細胞，使細胞密度為1 5X IO5個/毫升，得到BHK-21細胞懸液；(3)、用維持液以IOiUO2UO3UO4UO^ 106、107、108倍系列稀釋待測定的狂犬病病
毒液，得到梯度濃度狂犬病病毒液；(4)、將所述細胞懸液按0. 9ml/孔加入到細胞培養(yǎng)板中；(5)、將所述梯度濃度狂犬病病毒液按0. Iml/孔加入到步驟(4)中得到的已含有 細胞懸液的細胞培養(yǎng)板中，同時設置陰性對照，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2培養(yǎng)箱的CO2體 積含量為5%，溫度為37°C ；(6)、6 12h細胞貼壁后，棄去所述細胞培養(yǎng)板中的上清液，用摩爾濃度為 0. 01mol/L、pH值為7. 2的滅菌PBS沖洗一遍，直到死細胞完全脫落；然后每孔加入步驟(1) 所配制的質(zhì)量百分比濃度為的甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基lml，作為覆蓋層，置于CO2培養(yǎng) 箱中繼續(xù)培養(yǎng)，CO2培養(yǎng)箱的CO2體積含量為5%，溫度為35°C ；(7)、96h后棄去覆蓋層，并用摩爾濃度為0. 01mol/L、pH值為7. 2的滅菌PBS沖洗 三遍，直至將甲基纖維素沖洗干凈；然后每孔加入lml、l%質(zhì)量百分比的結晶紫溶液，室溫 條件(25°C )下染色15 20min后，用自來水緩緩沖洗15min，直至染色液沖洗干凈，晾干， 肉眼觀察細胞培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)；圖1和圖2分別為眼觀和顯微鏡下觀察的蝕斑 狀態(tài)；(8)、陰性對照無蝕斑出現(xiàn)的細胞培養(yǎng)板，判為有效板，根據(jù)有效板的各培養(yǎng)孔的 蝕斑數(shù)、接種的待測定的狂犬病病毒液的用量及稀釋倍數(shù)計算出待測定的狂犬病病毒液的毒價。病毒蝕斑形成單位的毒價(PFU/ml) = aXb/v ；a 最適稀釋倍數(shù)平均每孔中出現(xiàn)的蝕斑數(shù)；b 病毒稀釋倍數(shù)；ν 每孔接種的病毒體積。
所述最適稀釋倍數(shù)為蝕斑清晰，蝕斑數(shù)在8 30個范圍的稀釋倍數(shù)。實例圖1中Bl B5對應的稀釋度分別為待測狂犬病毒1 X 104、1 X 105、1 X 106、 1 X 107、1 X IO8稀釋倍數(shù)，每個稀釋度4個孔重復。B3的4個孔蝕斑數(shù)分別是15、16、12、 10，4個孔的蝕斑數(shù)均在8 30個范圍之內(nèi)，因此B3所對應1 X IO6為最適稀釋倍數(shù)，如前 所述，ν(每孔接種的病毒體積)為0. 1ml，根據(jù)計算得到病毒蝕斑形成單位的毒價=(15+16+12+10)/4X106/0. 1 = 1. 33X IO8(PFU/ml)本發(fā)明所述的滴定方法操作簡單、可控性強、批間誤差小，根據(jù)實驗結果批間誤差 小于logl0°_2，能夠?qū)崿F(xiàn)狂犬病病毒毒價的標準化測定，并且縮短了狂犬病疫苗生產(chǎn)中半成 品的檢驗周期。批間誤差的計算方法是將同一待檢狂犬病病毒液，小量分裝，超低溫保存，分10 次試驗來檢測這一待檢毒樣，10次檢測的結果取對數(shù)，并計算10個樣本總體的標準偏差后 得到的數(shù)值。
,8. 42,8. 18,8. 24、 8. 02,8. 15,8. 35,8. 08,8. 33,8. 27，計算總體樣本標準偏差為 0. 12，即為 LoglO012o
權利要求
一種細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是其包括以下步驟(1)、將已滅菌的甲基纖維素與維持液按照1∶99～2∶98的質(zhì)量比混合，2℃～8℃放置使甲基纖維素充分溶解，得到質(zhì)量百分比濃度為1％～2％的甲基纖維素溶液，作為覆蓋層；(2)、消化處于對數(shù)生長期的BHK-21細胞，用生長液稀釋處于對數(shù)生長期的BHK-21細胞，使細胞密度為1×105個/毫升～5×105個/毫升，得到BHK-21細胞懸液；(3)、用維持液104～108倍系列稀釋待測定的狂犬病病毒液，得到梯度濃度狂犬病病毒液；(4)、將所述細胞懸液按0.9ml/孔加入到細胞培養(yǎng)板中；(5)、將所述梯度濃度狂犬病病毒液按0.1ml/孔加入到步驟(4)中得到的含有細胞懸液的細胞培養(yǎng)板中，同時設置陰性對照，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(6)、6～12h細胞貼壁后，棄去所述細胞培養(yǎng)板中的上清液，用摩爾濃度為0.01mol/L、pH值為7.2～7.4的滅菌磷酸鹽緩沖液沖洗，直到死細胞完全脫落；然后每孔加入步驟(1)所配制的質(zhì)量百分比濃度為1％～2％的甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基1ml～2ml，作為覆蓋層，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(7)、72～96h后棄去覆蓋層，并用摩爾濃度為0.01mol/L、pH值為7.2～7.4的滅菌磷酸鹽緩沖液沖洗，直至將甲基纖維素沖洗干凈；然后每孔加入200μl～2ml、0.5％～1.5％質(zhì)量百分比的結晶紫溶液，室溫染色15～20min后，用自來水緩緩沖洗，直至染色液沖洗干凈，晾干，觀察細胞培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)；(8)、陰性對照無蝕斑出現(xiàn)的細胞培養(yǎng)板，判為有效板，根據(jù)有效板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)、接種的待測定的狂犬病病毒液的用量及稀釋倍數(shù)計算出待測定的狂犬病病毒液的毒價。
2.根據(jù)權利要求1所述的細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是甲基纖維 素溶液中含有終濃度為50 100mmol/L的HEPES。
3.根據(jù)權利要求1所述的細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是步驟(1)、 (3)中使用的維持液為含有終濃度為50 100ug/ml的DEAE-Dextran和3%體積百分比的 胎牛血清的MEM。
4.根據(jù)權利要求1所述的細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是步驟(2) 中使用的生長液為含有終濃度為50 100ug/ml的DEAE-Dextran和6%體積百分比的胎牛 血清的MEM。
5.根據(jù)權利要求1所述的細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是所述細胞 培養(yǎng)板為24孔板。
6.根據(jù)權利要求1所述的細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是步驟(5)、 (6)中，所述0)2培養(yǎng)箱中C02體積含量為2% 10%。
7.根據(jù)權利要求1所述的細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是步驟(5) 中，培養(yǎng)溫度為36°C 38 °C。
8.根據(jù)權利要求1所述的細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是步驟(6) 中，培養(yǎng)溫度為33°C 36°C。
9.根據(jù)權利要求1所述的細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是步驟(8)中，待測定的狂犬病病毒液的毒價的計算方法，以1ml狂犬病病毒液中所含的蝕斑形成單 位的數(shù)目來表示，計算公式為A = aXb/v;其中，A 每毫升病毒中蝕斑形成單位的數(shù)目； a 最適稀釋倍數(shù)平均每孔中出現(xiàn)的蝕斑數(shù)；b 狂犬病病毒稀釋倍數(shù)；v 每孔接種的病毒體 積。
10.根據(jù)權利要求1所述的細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是所述最適 稀釋倍數(shù)為蝕斑清晰，蝕斑數(shù)在8 30個范圍的稀釋倍數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種細胞蝕斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其包括以下步驟(1)配置甲基纖維素溶液；(2)制得細胞懸液；(3)稀釋待測定的狂犬病毒液，得到梯度濃度狂犬病病毒液；(4)將所述的細胞懸液加入細胞培養(yǎng)板中；(5)將所述梯度濃度狂犬病病毒液加入到步驟(4)中得到的細胞培養(yǎng)板中，同時設置陰性對照，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(6)棄去細胞培養(yǎng)板中的上清液，將甲基纖維素溶液加至培養(yǎng)孔中，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；(7)結晶紫染色，觀察細胞培養(yǎng)板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)；(8)計算毒價。該滴定方法操作簡單，快速準確，可控性強、批間誤差小，縮短了狂犬病病毒毒價的檢驗周期。
文檔編號C12Q1/02GK101831509SQ20101018619
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權日2010年5月31日
發(fā)明者喬榮岑, 習向鋒, 孫進忠, 張海洋, 張許科, 李三, 王進產(chǎn), 陶家權 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司