專利名稱：一種致病微生物快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種致病微生物快速檢測試劑品。
背景技術(shù)：
近年來，重大食品安全事件頻發(fā)，引起人們的高度重視。要從根本上解決食品安全問題，就必須對食品的生產(chǎn)、加工、流通和銷售等各環(huán)節(jié)實(shí)施全程管理和監(jiān)控，這就需要大量能夠滿足這一要求的快速、方便、準(zhǔn)確、靈敏的食品安全分析檢測技術(shù)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，食品安全快速分析檢測方法在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方面的作用越來越重要。從長遠(yuǎn)發(fā)展來看，免疫學(xué)、分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)與自動化等學(xué)科的發(fā)展極大地推動了食品安全分析檢測方法向更靈敏更便捷的方向發(fā)展，建立高效的食品安全快速分析檢測方法，對食品生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售過程中的質(zhì)量控制具有十分重要的意義；同時一旦發(fā)生食源性致病微生物中毒事件，也需要在最短時間內(nèi)完成檢測以制定科學(xué)合理的治療方案，贏得治療時間。這些快速分析檢測技術(shù)的推廣應(yīng)用，不僅是對傳統(tǒng)的食品安全分析檢測技術(shù)的一個改進(jìn)和提高，也使食品質(zhì)量安全有了進(jìn)一步的保證，從而推動食品工業(yè)更加健康、快速地向前發(fā)展，不斷滿足人民提高健康水平的需要。目前現(xiàn)有的一些食源性致病菌快速檢測技術(shù)大多是利用免疫學(xué)方法，該方法儀器操作簡單、檢測速度快、靈敏度較高、特異性較好且樣品所需量少，但也存在著如致病菌單克隆抗體難以制備、使用多抗易產(chǎn)生交叉反應(yīng)出現(xiàn)假陽性以及一次只能檢測一種或幾種致病菌等缺點(diǎn)和不足。因此，目前還需要開發(fā)可快速地、高效地檢測致病菌的新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種致病微生物快速檢測方法以及試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供一種微生物快速檢測方法，所述的方法包括(1)針對待檢測的1-50種(較佳地2-30種，如10種、15種、20種)微生物，分別確定特異性靶基因；(2)根據(jù)步驟(1)確定的每一靶基因，分別確定其特異性的一對內(nèi)側(cè)引物(正向內(nèi)側(cè)引物(Fi)與反向內(nèi)側(cè)引物(Ri))和一對外側(cè)引物(正向外側(cè)引物(Fo)與反向外側(cè)引物 (Ro))，所述內(nèi)側(cè)引物的序列既能與相應(yīng)的靶基因部分互補(bǔ)，又能與相應(yīng)的超級引物部分互補(bǔ)(即正向內(nèi)側(cè)引物與正向超級引物部分互補(bǔ)，反向內(nèi)側(cè)引物與反向超級引物部分互補(bǔ))； 所述的超級引物為一引物對，正向超級引物序列如SEQ ID NO :1所示，反向超級引物序列如 SEQ ID NO :2所示；混合上述引物，得到引物混合物；(3)以待測樣品為PCR模板，以步驟⑵的引物混合物為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到 PCR擴(kuò)增體系；(4)在步驟⑶的PCR擴(kuò)增體系中加入帶有可檢測信號的探針，所述的探針能特異性地與對應(yīng)的靶基因互補(bǔ)，并且針對不同的靶基因可檢測信號不同；
(5)鑒定可檢測信號，從而確定微生物的種類。在一個優(yōu)選例中，所述的微生物是致病菌(不包括病毒)。在另一優(yōu)選例中，所述的反向超級引物的5’端帶有一可識別信號；較佳地為生物素標(biāo)記。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，正向超級引物的量(條數(shù))是每一靶基因?qū)?yīng)的引物的3-10倍；較佳地為4-6倍；更佳地為5倍，反向超級引物的量(條數(shù))是每一靶基因?qū)?yīng)的引物的10-50倍；較佳地為10-30倍；更佳地為20倍。在另一優(yōu)選例中，反向超級引物的量是正向超級引物的4倍。在另一優(yōu)選例中，所述的微生物靶基因及其對應(yīng)的引物和探針如下單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)誘導(dǎo)肌動蛋白組裝前體蛋白基因，引物如SEQ ID NO 8-11所示，探針如SEQ ID NO 12所示；志賀氏菌(Shigella)侵襲性質(zhì)粒H抗原基因，引物如SEQ ID NO :13_16所示，探針如SEQ ID NO :17所示；沙門氏菌(Salmonella)侵襲蛋白A基因，引物如SEQ ID NO :18-21所示，探針如 SEQ ID NO 22 所示；變形桿菌(Bacillusproleus)F 型 ATP 酶 β 亞基基因，引物如 SEQ ID NO :23-26 所示，探針如SEQ ID NO 27所示；蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)腸毒素T基因，引物如SEQ ID N0:33_36所示， 探針如SEQ ID NO :37所示；大腸桿菌ETEC(Escherichia coll ETEC)不耐熱腸毒素AB亞單位基因，引物如 SEQ ID NO 43-46 所示，探針如 SEQ ID NO 47 所示；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)熱穩(wěn)定性核酸酶基因，引物如SEQ ID NO 53-56所示，探針如SEQ ID NO 57所示；空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)促旋酶A亞基基因，引物如SEQ IDNO :63-66 所示，探針如SEQ ID NO 67所示；大腸桿菌0157 (Escherichia coll 0157) 0_抗原特異性基因，引物如SEQ IDNO 73-76所示，探針如SEQ ID NO 77所示；結(jié)腸彎曲桿菌(Campylobacter. Coli)含鐵細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因，引物如SEQ ID NO 83-86所示，探針如SEQ ID NO 87所示；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)黏附侵襲蛋白基因，引物如SEQ ID NO 88-91 所示，探針如 SEQ ID NO 92 所示；霍亂弧菌(Vibrio cholerae)溶血素蛋白A基因，引物如SEQ ID N0:93_96所示， 探針如SEQ ID NO 97所示；或副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticu)耐熱溶血毒素基因，引物如SEQID NO 98-101所示，探針如SEQ ID NO :102所示。在另一優(yōu)選例中，同時檢測多種微生物時，針對多種微生物的靶基因的引物混合后用于PCR反應(yīng)。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，PCR反應(yīng)過程如下(&)90-99°〇進(jìn)行15士2111士11;
(b) 90-99°C 進(jìn)行 30 士 3sec — 50-65 °C進(jìn)行 2 士0. 5min — 72°C 進(jìn)行 60 士 5sec ；共 10-30個循環(huán)(較佳地12-20個循環(huán))；(c)90_99°C進(jìn)行 30士3sec —65_72°C進(jìn)行 90士5sec ；共 3-20 個循環(huán)(較佳地 5-8 個循環(huán))；(d)90-"°C進(jìn)行 2O 士 2sec — 50_65°C進(jìn)行 2O 士 2sec — 72°C進(jìn)行 3Osec ；共 25_4δ 個循環(huán)(較佳30-40個循環(huán))；(e)72°C，3±0.5min。在另一優(yōu)選例中，步驟中，所述的可檢測信號是熒光微球；較佳地為納米熒光微球。在本發(fā)明的另一方面，提供一種微生物快速檢測試劑組合，所述的試劑組合包括超級引物，所述的超級引物為一引物對，正向超級引物序列如SEQ ID NO 1所示， 反向超級引物序列如SEQ ID NO 2所示；針對待檢測的1-50種微生物靶基因的引物，對應(yīng)于任一靶基因的引物包括一對內(nèi)側(cè)引物和一對外側(cè)引物，所述內(nèi)側(cè)引物的序列既能與相應(yīng)的靶基因部分互補(bǔ)，又能與相應(yīng)的超級引物部分互補(bǔ)(即正向內(nèi)側(cè)引物與正向超級引物部分互補(bǔ)，即反向內(nèi)側(cè)引物與反向超級引物部分互補(bǔ))；以及針對待檢測的1-50種微生物靶基因的探針，所述的探針能特異性地與對應(yīng)的靶基因互補(bǔ)且?guī)в锌蓹z測信號，并且針對不同的靶基因可檢測信號不同。在一個優(yōu)選例中，針對待檢測的微生物靶基因的引物和探針選自對應(yīng)于單增李斯特菌誘導(dǎo)肌動蛋白組裝前體蛋白基因的引物和探針，其中引物如 SEQ ID NO 8-11 所示，探針如 SEQ ID NO 12 所示；對應(yīng)于志賀氏菌侵襲性質(zhì)粒H抗原基因的引物和探針，其中引物如SEQ IDNO 13-16所示，探針如SEQ ID NO 17所示；對應(yīng)于沙門氏菌侵襲蛋白A基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID N0:18_21所示，探針如SEQ ID NO 22所示；對應(yīng)于變形桿菌F型ATP酶β亞基基因的引物和探針，其中引物如SEQ IDNO 23-26所示，探針如SEQ ID NO 27所示；對應(yīng)于蠟樣芽孢桿菌腸毒素T基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO :33-36 所示，探針如SEQ ID NO 37所示；對應(yīng)于大腸桿菌ETEC不耐熱腸毒素AB亞單位基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO 43-46 所示，探針如 SEQ ID NO 47 所示；對應(yīng)于金黃色葡萄球菌熱穩(wěn)定性核酸酶基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO 53-56所示，探針如SEQ ID NO 57所示；對應(yīng)于空腸彎曲桿菌促旋酶A亞基基因的引物和探針，其中引物如SEQ IDNO 63-66所示，探針如SEQ ID NO 67所示；對應(yīng)于大腸桿菌01570-抗原特異性基因的引物和探針，其中引物如SEQID NO 73-76所示，探針如SEQ ID NO 77所示；對應(yīng)于結(jié)腸彎曲桿菌含鐵細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因的引物和探針，其中引物如SEQ
7ID NO 83-86 所示，探針如 SEQ ID NO 87 所示；對應(yīng)于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌黏附侵襲蛋白基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO 88-91所示，探針如SEQ ID NO 92所示；對應(yīng)于霍亂弧菌溶血素蛋白A基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO :93-96 所示，探針如SEQ ID NO 97所示；或?qū)?yīng)于副溶血性弧菌耐熱溶血毒素基因的引物和探針，其中引物如SEQ IDNO 98-101所示，探針如SEQ ID NO :102所示。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的試劑組合的用途，用于制備檢測微生物的試劑
品.ο在本發(fā)明的另一方面，提供一種微生物快速檢測試劑盒，含有容器；以及分裝于容器中的所述的試劑組合。在一個優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有熒光微球，顯色試劑，DNA聚合酶，稀釋劑，使用說明書等。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、多重PCR嵌套引物擴(kuò)增過程示意圖。圖2、食源性致病菌多重PCR檢測流程示意圖。
具體實(shí)施例方式為了克服當(dāng)前食品安全分析檢測技術(shù)和設(shè)備存在的缺陷，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次開發(fā)出一種新型的致病菌快速檢測方法以及配套的試劑或試劑盒，所述方法和試劑能夠在很短的時間內(nèi)檢測到多種致病菌，具有操作簡便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低廉、樣品所需量少、可高通量、適合現(xiàn)場篩查等特點(diǎn)。微生物及靶基因本發(fā)明所述的“微生物”可以是各種存在于食品中的微生物，較佳地是指對于人體或動物體有害的菌，即致病菌。較佳地，所述微生物不包括病毒。本發(fā)明所述的“靶基因(或稱為目的基因)”是指特異地存在于對應(yīng)的待測微生物的基因，也即所述的靶基因是其對應(yīng)的微生物所特有的，某一靶基因的存在特定地指向該微生物的存在。當(dāng)檢測混合體系中存在的靶基因從而確定微生物的存在情況時，靶基因的選擇是較為重要的，要考慮到不引起非特異性結(jié)合(會降低檢測的準(zhǔn)確率)。本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，針對需要檢測的微生物，找到了具有代表性且不致于造成非特異性結(jié)合的靶基因。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的致病菌及其對應(yīng)的靶基因如下所示致病菌靶基因單增李斯特菌(Listeria monocytogenes) 誘導(dǎo)朋動蛋白組Mf體蛋白基因(βΜ ；志賀氏菌(Shigella)侵襲性質(zhì)粒H抗原基因(ipaH)；
沙門氏菌(Salmonella)侵襲蛋白A基因(invA)；變形桿菌(Bacillusproleus)F 型 ATP 酶 β 亞基基因(atpD)；蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)腸毒素T基因(bceT)；大腸桿菌ETEC(Escherichia coli ETEC) 不耐熱腸毒素AB亞單位基因Oile AB)；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus) 熱穩(wěn)定性核酸酶基因(nuc)；空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)促旋酶 A 亞基(gyrA)；大腸桿菌0157 (Escherichia coli 0157) 0-抗原特異性(rfl^)；結(jié)腸彎曲桿菌(Campylobacter. Coli)含鐵細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(⑶此)；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia黏附侵襲蛋白(ail)；enterocolitica;霍亂弧菌(Vibriocholerae)溶血素蛋白 A(hlyA)；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticu) 耐熱溶血毒素(tlh)。較佳地，所述的靶基因可選自以上的ー種或多種。具體根據(jù)所需檢測出的微生物 的種類來進(jìn)行選擇。檢測試劑和試劑盒針對所需檢測出的微生物的靶基因，來設(shè)計(jì)合適的擴(kuò)增引物以及探針。引物和探 針的設(shè)計(jì)方法可參照現(xiàn)有的技木。然而，由于需要同時檢測多種微生物的靶基因，PCR反應(yīng) 體系復(fù)雜，因此設(shè)計(jì)引物的時候，還需要考慮減少非特異性結(jié)合的發(fā)生機(jī)率以及良好的擴(kuò) 增效果。在本發(fā)明中，在同一 PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上引物，可同時擴(kuò)增出多個核酸 片段，從而高效地測定多個靶基因。針對擬測定的食源性致病菌的靶基因，為每個靶點(diǎn)設(shè) 計(jì)兩對巢式多重PCR特異性引物(即內(nèi)側(cè)引物Fi/Ri和外側(cè)引物R)/Ro)，用于擴(kuò)增特定細(xì) 菌的靶基因(目的基因)，參照圖1。在PCR檢測體系中，特異性引物的添加量極低，僅在 剛開始的幾個循環(huán)中用來擴(kuò)增靶點(diǎn)，該引物帶有標(biāo)簽序列(可與超級引物部分互補(bǔ))，可被 超級引物識別。所述的部分互補(bǔ)是指正向內(nèi)側(cè)引物與正向超級引物之間有20-100% (較 佳地30-80%，如40%、50%、60% )的序列是互補(bǔ)的，反向內(nèi)側(cè)引物與反向超級引物之間有 20-100% (較佳地30-80%，如40%、50%、60% )的序列是互補(bǔ)的。針對特異性引物攜帯的標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)超級引物(正向超級引物和反向超級引 物)。在反應(yīng)體系中，加入足夠滿足指數(shù)級擴(kuò)增的超級引物，該引物能在特異性引物開始擴(kuò) 增幾個循環(huán)以后快速識別標(biāo)簽序列，進(jìn)ー步批量擴(kuò)增目的片段。對于每種致病菌使用的超 級引物在序列上均相同，從而大大減少檢測結(jié)果的背景干擾，提高檢測靈敏度。由于超級引 物就ー對序列，因此可知當(dāng)檢測多種靶基因吋，多個靶基因?qū)?yīng)的各正向內(nèi)側(cè)引物有一段 序列是相同的。通過反復(fù)試驗(yàn)，本發(fā)明人找到了理想的超級引物，針對每ー靶基因的引物以及探 針，如表2中所列。所述的超級引物、靶基因引物和探針組成了檢測微生物的試劑組合。較佳地，所述的反向超級引物還攜帶一可識別信號，用于相對定量地確定樣本中 所含多種微生物之間的數(shù)量關(guān)系。更佳地，所述的可識別信號為生物素標(biāo)記。更佳地，所述 的可識別信號位于反向超級引物的5’端。本發(fā)明還提供了檢測微生物的試劑盒，含有容器；以及分裝于容器中的所述的試劑組合。優(yōu)選地，為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員使用，所述的試劑盒中還含有用于微生物培養(yǎng)、 DNA抽提、PCR擴(kuò)增或信號檢測等操作的試劑；例如熒光微球，顯色試劑，DNA聚合酶，稀釋劑，培養(yǎng)基等。此外，所述的試劑盒中還含有使用說明書等。檢測方法本發(fā)明提供了針對同一樣品體系快速高效地檢測或鑒定多種微生物的方法。本發(fā)明中，除非另外說明，所述的“樣品”是廣義的，其可以是任何需要從中鑒定出是否存在微生物的物質(zhì)或體系，如可以是但不限于各種液體或固態(tài)食品、藥品、體液、組織， 該樣品還可以是哺乳動物(包括人)的分泌物或排泄物，如嘔吐物、糞便、唾液、尿液等。本發(fā)明的方法基于待檢測的微生物中是否存在某一靶基因來鑒定。因此，待測樣品需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理以使細(xì)胞釋放出靶基因，從而使得靶基因可被識別。使得細(xì)胞釋放出靶基因的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，常規(guī)地可采用裂解細(xì)胞的方法。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，可通過沸水浴處理樣品，使得微生物釋放出靶基因的核酸。通常而言， 針對革蘭氏陰性菌，用煮沸的方法即可破解細(xì)胞；而對革蘭氏陽性菌，則還需要添加玻璃珠，并劇烈振蕩才可破解細(xì)胞。本發(fā)明的檢測方法可以同時檢測多種微生物，可以根據(jù)需求進(jìn)行不同微生物的拆分和組合。一般是1-50種，較佳地2-30種，如10種、15種、20種。較佳地，檢測選自大腸桿菌0157、結(jié)腸彎曲桿菌、大腸桿菌ETEC、沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、空腸彎曲桿菌、變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎、耶爾森菌的一種或多種微生物；較佳地，同時檢測上述微生物。針對每一種微生物確定至少一種特異性的靶基因，根據(jù)每一靶基因來分別設(shè)計(jì)引物，當(dāng)用于擴(kuò)增時將所有的靶基因引物合并，并與超級引物合并，用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。超級引物的量是足夠多的，以大批量地?cái)U(kuò)增目的片段。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，相對于每一靶基因，超級引物的量(條數(shù))是每一靶基因?qū)?yīng)的引物的3-10倍，較佳地為4-6 倍，更佳地為5倍。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，反向超級引物的量是正向超級引物的4倍，這樣可有效減少引物之間的競爭，從而提高檢測的靈敏度，降低因背景干擾造成的影響。本發(fā)明的方法還提供了較佳的PCR反應(yīng)條件，共分5個分步驟，包括(a) 90-990C 進(jìn)行 15 士 2min ； (b) 90-99 "C 進(jìn)行 30 士 3sec — 50-65 °C 進(jìn)行 2 士0. 5min — 72 °C 進(jìn)行 60士5sec ；共 10-30 個循環(huán)；(c) 90-99°C進(jìn)行 30士3sec — 65_72°C進(jìn)行 90士5sec ；共 3-20 個循環(huán)；(d)90-99°C進(jìn)行 20士2sec — 50_65°C進(jìn)行 20士2sec — 72°C進(jìn)行 30sec ；共 25-45 個循環(huán)；(e)72°C，3 士0.5min。利用該反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增效率高且非特異性結(jié)合少。在結(jié)束了 PCR擴(kuò)增后，對獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，以定性或定量地確定靶基因的存在情況。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在PCR擴(kuò)增體系中加入帶有可檢測信號的探針，所述的探針能特異性地與對應(yīng)的靶基因互補(bǔ)，并且針對不同的靶基因可檢測信號不同；通過鑒定可檢測信號，從而確定微生物的種類。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的可檢測信號是熒光微球，較佳地為納米熒光微球。 熒光微球可以是多種色彩編碼的，針對于每一種探針設(shè)定一種具有獨(dú)特色彩編碼的熒光微球，從而通過顯色區(qū)分出該探針?biāo)鶎?yīng)的靶基因。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于多方面的檢測用途，包括但不限于檢測食品藥品中的微生物；檢測哺乳動物(包括人)的分泌物，如嘔吐物、糞便、唾液、尿液等中是否存在微生物。 較佳地，本發(fā)明的方法用于檢測食品藥品中的微生物和食源性中毒中的微生物，可應(yīng)用于食品安全管理的各個流通環(huán)節(jié)的微生物檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)高效性，可在同一 PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病原微生物或?qū)Χ鄠€目的基因進(jìn)行分型。并且，多種微生物在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，操作步驟簡單，消耗時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以前常用的檢測技術(shù)，可大大節(jié)約檢測成本。(2)系統(tǒng)性，本發(fā)明的方法適宜于成群病原體的檢測，如腸道致病性細(xì)菌和無芽孢
厭氧菌。(3)準(zhǔn)確性，本發(fā)明優(yōu)化了各種反應(yīng)條件，避免了復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，大大提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。(4)本發(fā)明的檢測方法對設(shè)備要求低，特別符合臨床實(shí)際需要。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。材料與方法菌種實(shí)施例中所檢測的13種食源性致病菌菌株名稱及菌號的詳細(xì)情況如表1。表權(quán)利要求
1.一種微生物快速檢測方法，其特征在于，所述的方法包括(1)針對待檢測的1-50種微生物，分別確定特異性靶基因；(2)根據(jù)步驟(1)確定的每一靶基因，分別確定其特異性的一對內(nèi)側(cè)引物和一對外側(cè)引物，所述內(nèi)側(cè)引物的序列既能與相應(yīng)的靶基因部分互補(bǔ)，又能與相應(yīng)的超級引物部分互補(bǔ)；所述的超級引物為一引物對，正向超級引物序列如SEQ ID NO :1所示，反向超級引物序列如SEQ ID NO 2所示；混合上述引物，得到引物混合物；(3)以待測樣品為PCR模板，以步驟⑵的引物混合物為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR 擴(kuò)增體系；(4)在步驟(3)的PCR擴(kuò)增體系中加入帶有可檢測信號的探針，所述的探針能特異性地與對應(yīng)的靶基因互補(bǔ)，并且針對不同的靶基因可檢測信號不同；和(5)鑒定可檢測信號，從而確定微生物的種類。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反向超級引物的5’端帶有一可識別信號。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，正向超級引物的量是每一靶基因?qū)?yīng)的引物的3-10倍，而反向超級引物的量是每一靶基因?qū)?yīng)的引物的10-50倍。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物靶基因及其對應(yīng)的引物和探針如下單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)誘導(dǎo)肌動蛋白組裝前體蛋白基因，引物如 SEQ ID NO 8-11 所示，探針如 SEQ ID NO 12 所示；志賀氏菌(Shigella)侵襲性質(zhì)粒H抗原基因，引物如SEQ ID NO 13-16所示，探針如 SEQ ID NO 17 所示；沙門氏菌(Salmonella)侵襲蛋白A基因，引物如SEQ ID NO :18-21所示，探針如SEQ ID NO 22 所示；變形桿菌(Bacillus proleus)F型ATP酶β亞基基因，引物如SEQ ID NO :23- 所示，探針如SEQ ID NO 27所示；蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)腸毒素T基因，引物如SEQ ID NO :33-36所示，探針如 SEQ ID NO 37 所示；大腸桿菌ETEC (Escherichia coli ETEC)不耐熱腸毒素AB亞單位基因，引物如SEQ ID NO 43-46所示，探針如SEQ ID NO 47所示；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)熱穩(wěn)定性核酸酶基因，引物如SEQ ID N0: 53-56所示，探針如SEQ ID NO 57所示；空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)促旋酶A亞基基因，引物如SEQ IDNO :63-66所示，探針如SEQ ID NO 67所示；大腸桿菌0157 (Escherichia coli 0157) 0-抗原特異性基因，引物如SEQ IDNO :73-76 所示，探針如SEQ ID NO 77所示；結(jié)腸彎曲桿菌(Campylobacter. Coli)含鐵細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因，引物如SEQ ID NO 83-86所示，探針如SEQ ID NO 87所示；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)黏附侵襲蛋白基因，引物如SEQ ID NO 88-91所示，探針如SEQ ID NO 92所示；霍亂弧菌(Vibrio cholerae)溶血素蛋白A基因，引物如SEQ ID NO :93-96所示，探針如SEQ ID NO :97所示；或副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticu)耐熱溶血毒素基因，引物如SEQID NO: 98-101所示，探針如SEQ ID NO :102所示。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，PCR反應(yīng)過程如下(a)90-99 °C 進(jìn)行 15 士 2min ；(b)90-99°C進(jìn)行 30 士 3sec — 50-65°C進(jìn)行 2 士0. 5min — 72°C進(jìn)行 60 士 5sec ；共 10-30 個循環(huán)；(c)90-99°C進(jìn)行30士3sec — 65_72°C進(jìn)行 90士5sec ；共 3-20 個循環(huán)；(d)90-99 °C進(jìn)行 20 士 2sec — 50-65°C進(jìn)行 20 士 2sec — 72°C進(jìn)行 30sec ；共 25-45 個循環(huán)；(e)72°C，3±0.5min。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的可檢測信號是熒光微球。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物是致病菌。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的致病菌是食源性致病菌。
9.一種微生物快速檢測試劑組合，其特征在于，所述的試劑組合包括超級引物，所述的超級引物為一引物對，正向超級引物序列如SEQ ID NO :1所示，反向超級引物序列如SEQ ID NO 2所示；針對待檢測的1-50種微生物靶基因的引物，對應(yīng)于任一靶基因的引物包括一對內(nèi)側(cè)引物和一對外側(cè)引物，所述內(nèi)側(cè)引物的序列既能與相應(yīng)的靶基因部分互補(bǔ)，又能與相應(yīng)的超級引物部分互補(bǔ)；以及針對待檢測的1-50種微生物靶基因的探針，所述的探針能特異性地與對應(yīng)的靶基因互補(bǔ)且?guī)в锌蓹z測信號，并且針對不同的靶基因可檢測信號不同。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑組合，其特征在于，針對待檢測的微生物靶基因的引物和探針選自對應(yīng)于單增李斯特菌誘導(dǎo)肌動蛋白組裝前體蛋白基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO 8-11所示，探針如SEQ ID NO 12所示；對應(yīng)于志賀氏菌侵襲性質(zhì)粒H抗原基因的引物和探針，其中引物如SEQ IDNO :13-16所示，探針如SEQ ID N0:17所示;對應(yīng)于沙門氏菌侵襲蛋白A基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO :18-21所示，探針如SEQ ID NO :22所示；對應(yīng)于變形桿菌F型ATP酶β亞基基因的引物和探針，其中引物如SEQ IDNO 23-26 所示，探針如SEQ ID NO 27所示；對應(yīng)于蠟樣芽孢桿菌腸毒素T基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO :33-36所示， 探針如SEQ ID NO :37所示；對應(yīng)于大腸桿菌ETEC不耐熱腸毒素AB亞單位基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO 43-46所示，探針如SEQ ID NO 47所示；對應(yīng)于金黃色葡萄球菌熱穩(wěn)定性核酸酶基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID N0 53-56所示，探針如SEQ ID NO 57所示；對應(yīng)于空腸彎曲桿菌促旋酶A亞基基因的引物和探針，其中引物如SEQ IDNO :63-66所示，探針如SEQ ID NO 67所示；對應(yīng)于大腸桿菌01570-抗原特異性基因的引物和探針，其中引物如SEQID NO :73-76 所示，探針如SEQ ID NO 77所示；對應(yīng)于結(jié)腸彎曲桿菌含鐵細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO 83-86所示，探針如SEQ ID NO 87所示；對應(yīng)于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌黏附侵襲蛋白基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO 88-91所示，探針如SEQ ID NO 92所示；對應(yīng)于霍亂弧菌溶血素蛋白A基因的引物和探針，其中引物如SEQ ID NO :93-96所示， 探針如SEQ ID NO 97所示；或?qū)?yīng)于副溶血性弧菌耐熱溶血毒素基因的引物和探針，其中引物如SEQ IDNO =98-101 所示，探針如SEQ ID NO :102所示。
11.權(quán)利要求9或10所述的試劑組合的用途，用于制備檢測微生物的試劑盒。
12.—種微生物快速檢測試劑盒，其特征在于，含有容器；以及分裝于容器中的權(quán)利要求9或10所述的試劑組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物快速檢測方法以及微生物快速檢測試劑盒。本發(fā)明所述的方法和試劑能夠在很短的時間內(nèi)檢測到多種致病菌，具有操作簡便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低廉、樣品所需量少、可高通量、適合現(xiàn)場篩查等特點(diǎn)，可用于食源性中毒及食品安全快速檢測，克服了當(dāng)前微生物快速檢測技術(shù)和設(shè)備存在的缺陷。
文檔編號C12Q1/04GK102286612SQ201010202838
公開日2011年12月21日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者吳松潔, 李井泉, 王子良, 王慧, 相麗 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院