專利名稱：重組腸道病毒71型病毒vp1抗原的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程重組蛋白的純化方法。更確切地講本發(fā)明是一種重組腸 道病毒71型病毒VP1抗原的純化方法。
背景技術(shù)：
手、足、口病(hand，foot and mouth disease, HFMD)是由腸道病毒引起的一種急 性傳染病。該病自1957年首次報道以來，曾多次流行，世界衛(wèi)生組織于2006年曾將本病列 為第四位引起死亡的的疾病。美國、澳大利亞、意大利、法國、荷蘭、西班牙、羅馬尼亞、巴西、 加拿大、德國等國家經(jīng)常發(fā)生由各型柯薩奇、?？刹《竞虴V71引起的手足口病。20世紀90 年代后期，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢。1998年，臺灣地區(qū)暴發(fā)EV71的大流 行，約有12萬以上的人被感染，死亡78人。研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)手足口病的病毒有一個共同特點，均為腸道病毒科，為單股正鏈小 RNA病毒。這些病毒有20多種(型)，包括腸道病毒71型(EV 71)、柯薩奇病毒A組的16 型、?？刹《疽约捌渌滤_奇病毒。目前國內(nèi)爆發(fā)的手足口病主要是由EV 71和Cox A16 引起的。由柯薩奇病毒引起的手足口病一般癥狀較輕，而EV71則相對較重，20%的患者可 以伴有引起無菌性或病毒性腦炎，心肌炎和腦麻痹后遺癥的患者。因此，有關(guān)EV71的病毒 生物學特性、致病機理、診斷和預防等的研究日益受到人們的重視。EV71病毒的顆粒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突出，直徑大約在 24 30nm。由EV71病毒基因組編碼的分子量分別為34KD、30KD、26KD和7KD的多肽VP1、 VP2、VP3、VP4，構(gòu)成病毒的外殼。VP1、VP2和VP3三個多肽暴露在病毒外殼的表面，而VP4 包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接，因而抗原決定簇基本上位于VP1-VP3上。其中，病毒衣殼蛋白VP1是該病毒主要的中和決定因子，它直接決定病毒的抗原 性。VP1基因具有與病毒血清型完全對應的遺傳多樣性，VP1基因序列不僅可作為腸道病毒 屬內(nèi)不同血清型分類的依據(jù)，并可作為小RNA病毒科內(nèi)不同屬的分類參考，因此VP1基因成 了 EV71基因分型和遺傳進化分析的最重要的對象。目前，基因重組的EV71衣殼蛋白VP1已經(jīng)在原核和真核表達系統(tǒng)中得到表達。真 核表達系統(tǒng)由于具有原核表達系統(tǒng)不具有的蛋白翻譯后加工過程，因此表達的蛋白活性 高；但同時也具有蛋白表達量低，生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)成本高的缺點。原核表達系統(tǒng)雖然表達 量高，生產(chǎn)周期短、成本低廉，但缺點是表達產(chǎn)物多以不溶解的包涵體形式聚集，蛋白回收 率往往很低。因此，提出一種成本低廉、工藝簡便、蛋白回收率高的腸道病毒71型VP1抗原的純 化方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種重組腸道病毒71 型VP1抗原的純化方法。
為解決技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)是將腸道病毒71型VP1蛋白的 編碼基因插入原核表達載體中，通過大腸桿菌表達生產(chǎn)重組蛋白，經(jīng)復性、純化制備而成。本發(fā)明中的重組腸道病毒71型病毒VP1抗原的純化方法，包括以下步驟 (1)利用大腸桿菌表達生產(chǎn)重組腸道病毒71型病毒VP1蛋白，得到該蛋白的包涵 體；(2)按每lg包涵體15ml增溶液的比例，將包涵體溶解于增溶液中；所述增溶液 的pH值為8. 5，其組成及配比濃度為鹽酸胍4 6M、EDTA 1 10mM、Tris 5 20mM，余 量為H20。(3)在20 25。C的水浴和磁力攪拌條件下，向復性液中逐滴加入包涵體溶液，使 復性液中的VP1蛋白濃度控制在0. 1 lmg/ml ；然后在15°C攪拌復性48小時；所述復性液 的pH值為7. 2，其組成及配比濃度為PB 5 20mM，Arg 0. 1 lmol/L，濃度為1 20%且 5000-30000 道爾頓的 PEG。作為一種改進，所述步驟(1)包括分段設(shè)計合成腸道病毒71型VP1蛋白的基因 片段，并于體外拼接成完整的核苷酸序列；拼接好的基因序列經(jīng)測序驗證正確后，按分子克 隆方法構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，然后由工程菌大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)；發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液離心收集 菌體，破碎菌體，離心收集包涵體。作為一種改進，所述步驟(3)復性液中的蛋白濃度控制在0. 1 0. 5mg/ml。作為一種改進，所述步驟(2)中增溶液的組成及配比濃度為鹽酸胍6M、EDTA 5mM、Tris 10mM，余量為 H20。作為一種改進，所述步驟(3)復性液中精氨酸濃度為0. 1 0. 3mol/L。作為一種改進，所述步驟(3)復性液的組成及配比濃度為PB 10mM, Arg 100mM, 10% PEG20000, pH 7. 2。作為一種改進，包涵體蛋白經(jīng)過稀釋復性后，還進行親和層析純化。作為一種改進，所述親和層析純化包括在GE 公司的 XK 50/30 柱中裝入 200mL 的 Chelating Sepharose Fast FlowS印harose 膠，平衡緩沖液為 20mM PB、0. 5M NaCl、PH 7. 0，洗脫緩沖液為 20mM PB、0. 5M NaCl、0. 5M咪唑、PH 7. 0 ；先用0. 2M硫酸鎳溶液平衡柱子，然后用平衡緩沖液平衡；將經(jīng)過 復性的復性液以20ml/min的流速上樣于平衡好的柱子，上完樣后用平衡緩沖液沖洗2個柱 體積；然后以線性梯度洗脫，收集目標峰的洗脫液。本發(fā)明的有益效果在于1、本發(fā)明提出了一種新的復性體系，通過蛋白復性，能使以包涵體形式存在的蛋 白變成可溶性蛋白，大大提高了表達產(chǎn)物的回收率。由于采用了特別的復性體系，提高了重 組腸道病毒71型VP1抗原的復性收率，復性收率達到每克包涵體最終獲得200毫克蛋白。2、采用親和層析一步純化，純度大于95%。純化的方法操作簡單、方便、省時，有利 于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。3、本發(fā)明采用包涵體的復性、親和層析的方法來純化腸道病毒71型VP1抗原，具 有成本低廉、工藝簡便，純化蛋白純度高等優(yōu)點，可以為EV71型診斷試劑的開發(fā)和血清流 行病學調(diào)查提供診斷用抗原。


圖1為EV71 VP1抗原的層析圖。圖2為純化后的EV71 VP 1抗原的電泳圖。圖1中A為280nm的光吸收曲線，B為電導曲線；圖2中從左到右依次為泳道1 :Marker ；泳道2 :BSA對照；泳道3 純化后的 EV71VP1。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。在基因工程中，已知目的基因核苷酸序列獲得目的基因的方法主要有PCR擴增和 人工化學合成方法。本實施例選取了當前流行的腸道病毒71型C 4亞型，采用人工化學合 成的方法合成了編碼腸道病毒71型VP1蛋白的核苷酸序列，具體是根據(jù)基因片段人工合 成的需要，將設(shè)計的基因分段合成，體外拼接成完整的序列。拼接好的基因序列，經(jīng)測序驗 證正確后按分子克隆(《Molecular Cloning)), J. Sambrook等著；)方法，構(gòu)建了重組表達 質(zhì)粒。然后由工程菌大腸桿菌進行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液離心收集菌體，破碎菌體， 離心收集包涵體，包涵體蛋白經(jīng)過稀釋復性后，經(jīng)過親和層析純化。本發(fā)明使用大腸桿菌來 表達重組EV71 VP1，大腸桿菌因其低廉性、高效性和穩(wěn)定性等優(yōu)點在科研生產(chǎn)中被廣泛應 用。因為利用大腸桿菌表達生產(chǎn)重組蛋白已是本領(lǐng)域內(nèi)非常成熟的技術(shù)，本發(fā)明對此不再 贅述。但是，外源蛋白在大腸桿菌中的高水平表達常常形成不溶的、無活性的聚集體 (aggregation)，或稱為包涵體(inclusion body)。包涵體必須經(jīng)過變性、復性重新折疊形 成原始空間構(gòu)象才能獲得生物學功能。但是，蛋白質(zhì)復性是在體外環(huán)境中進行，過程極其 復雜，其確切機理至今尚未明了。而且，不同種類的蛋白，其復性所需的條件往往是不一樣 的，體外復性由于缺乏細胞內(nèi)廣泛存在的輔助肽鏈折疊的酶系和分子，常常復性效率極其 低下。復性時蛋白濃度、緩沖液體系、pH值、離子強度、各種高分子聚合物、表面活性 劑，甚至變性劑稀釋的速度，都會對最終復性結(jié)果有影響。本發(fā)明研究了不同因素對重組 EV71-VP1復性的影響，優(yōu)化了多種影響復性的各種因素，選擇最優(yōu)的復性體系，使得復性產(chǎn) 物的收率大為提高。具體優(yōu)化后的控制條件如下1、控制復性體系中的蛋白濃度。蛋白質(zhì)的濃度是使蛋白質(zhì)聚集的主要因素之一， 本發(fā)明中采用稀釋方式復性，并且在水浴和磁力攪拌下，逐滴加入變性蛋白(包涵體)，使 變性蛋白在復性液中始終處于低濃度狀態(tài)。復性液中的蛋白濃度控制在0. 1 lmg/ml。優(yōu) 選地，蛋白濃度在0. 1 0. 5mg/ml。2、復性體系中添加精氨酸(Arginine)?，F(xiàn)有的研究表明，蛋白質(zhì)的輔因子、配基 或底物可起到很好的促折疊作用，其作用可能是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折疊中間體，從而防止了蛋 白質(zhì)的聚集。本發(fā)明的研究表明，在復性液中添加適合濃度的精氨酸能夠大大促進重組 EV71-VP1的復性效率。所述的復性體系精氨酸濃度為0. 03 lmol/L，優(yōu)選的為0. 1 0.3mol/L。
3、復性體系中添加(聚乙二醇PEG)。PEG分子通過與折疊中間體特異的形成非聚 集的復合物，可以阻止蛋白質(zhì)分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質(zhì)的聚集。本發(fā)明的研究表 明，在復性液中添加適合濃度的PEG可以有效的有效防止復性過程中重組蛋白的聚集。所 述的復性體系中聚乙二醇的分子量為5000 30000道爾頓，優(yōu)選的為20000道爾頓；濃度 為1 20%，優(yōu)選的為10%。4、親和層析純化。復性后的蛋白仍然含有雜蛋白、內(nèi)毒素、核酸，需進一步分離去 除。本發(fā)明設(shè)計了親和層析來去除雜質(zhì)最終得到高純度的重組蛋白。實例1.重組EV71 VP1工程菌構(gòu)建與發(fā)酵VP1基因來源于腸道病毒71型C4亞型，本實施例采用了全合成的方式，以大腸桿 菌偏愛的密碼子來設(shè)計并合成了 VP1的全基因。ADI基因用Nde I與BamH I雙酶切，嵌入 同樣酶切的載體pET3a中，構(gòu)建成載體pET3a-VPl，轉(zhuǎn)化宿主細胞BL21 DE3 (pLyss)，篩選陽 性克隆并測序。測序正確的陽性菌株作為生產(chǎn)用原始工程菌。挑取單個克隆在500ml含 50ug/ml氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 300rpm震蕩培養(yǎng)直到0D■達到1. 2左右，接 種到15L發(fā)酵罐(B. Braun BIOSTAT C)，直到0D6(1(1達到20左右(以雙蒸水為空白對照)， 加入ImM IPTG開始誘導表達。誘導表達4小時后放罐。實例2.復性發(fā)酵液6000g離心15分鐘，收集菌體。1500psi壓力高壓勻漿破碎細胞，6000g離 心15分鐘收集包涵體，用PBS緩沖液洗滌包涵體兩次。按lg包涵體15ml增溶液的比例 進行溶解，增溶液成分為6M鹽酸胍，5mM EDTA，10mM Tris，pH 8. 5，25°C攪拌2小時。緩慢 倒入 2000ml 的復性液中(10mM PB, lOOmM Arg, 10% PEG20000，pH 7. 2)。15°C攪拌復性 48 小時。實例3.純化在GE 公司的 XK 50/30 柱中裝入 200mL 的 Chelating Sepharose Fast FlowS印harose 膠，平衡緩沖液為 20mM PB,0. 5M NaCl，PH 7. 0，洗脫緩沖液為 20mM PB,0. 5M NaCl，0.5M咪唑，PH 7.0。先用0. 2M硫酸鎳溶液平衡柱子，然后用平衡緩沖液平衡。復性 液以20ml/min的流速上樣于平衡好的柱子，上完樣后用平衡緩沖液沖洗2個柱體積，然后 以線性梯度洗脫，收集目標峰。用SDS-PAGE電泳檢測目標蛋白純度，Lowry法檢測蛋白目 標濃度。經(jīng)過分析，每克包涵體可以獲得VP1蛋白量為200毫克，蛋白回收率為20 %，經(jīng) SDS-PAGE電泳檢查純度95%以上。實例4.病人血清檢測使用純化的VP1檢測了 68份病人血清，其中EV71病人陽性血清31份，陰性血清 37份?？乖♂尪葹? 500血清稀釋度為1 100，二抗稀釋度為1 10000，并設(shè)空白 對照，檢測結(jié)果見下表。
據(jù)此測算靈敏度為93. 5%，特異性為91. 9%。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限 于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導 出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種重組腸道病毒71型病毒VP1抗原的純化方法，包括以下步驟(1)利用大腸桿菌表達生產(chǎn)重組腸道病毒71型病毒VP1蛋白，得到該蛋白的包涵體；(2)按每1g包涵體∶15ml增溶液的比例，將包涵體溶解于增溶液中；所述增溶液的pH值為8.5，其組成及配比濃度為鹽酸胍4～6M、EDTA 1～10mM、Tris 5～20mM，余量為H2O；(3)在20～25℃的水浴和磁力攪拌條件下，向復性液中逐滴加入包涵體溶液，使復性液中的VP1蛋白濃度控制在0.1～1mg/ml；然后在15℃攪拌復性48小時；所述復性液的pH值為7.2，其組成及配比濃度為PB 5～20mM，Arg 0.1～1mol/L，濃度為1～20％且分子量為5000～30000道爾頓的PEG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(1)包括分段設(shè)計合成腸 道病毒71型病毒VP1蛋白的基因片段，并于體外拼接成完整的核苷酸序列；拼接好的基因 序列經(jīng)測序驗證正確后，按分子克隆方法構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，然后由工程菌大腸桿菌發(fā)酵 生產(chǎn)；發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液離心收集菌體，破碎菌體，離心收集包涵體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項中所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(3)復性液 中的VP蛋白濃度控制在0. 1 0. 5mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項中所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(2)中增溶 液的組成及配比濃度為鹽酸胍6M、EDTA 5mM、Tris 10mM，余量為H20。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項中所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(3)復性液 中精氨酸濃度為0. 1 0. 3mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項中所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(3)復性液 的組成及配比濃度為:PB 10mM, Arg 100mM, 10% PEG20000, pH 7. 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項中所述的純化方法，其特征在于，包涵體蛋白經(jīng)過稀釋 復性后，還進行親和層析純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化方法，其特征在于，所述親和層析純化包括在 GE 公司的 XK 50/30 柱中裝入 200mL 的 Chelating Sepharose Fast Flow 凝膠，平 衡緩沖液為 20mM PB、0.5M NaCl、PH 7. 0，洗脫緩沖液為 20mM PB、0. 5M NaCl、0. 5M 咪唑、 PH 7. 0 ；先用0. 2M硫酸鎳溶液平衡柱子，然后用平衡緩沖液平衡；將經(jīng)過復性的復性液以 20ml/min的流速上樣于平衡好的柱子，上完樣后用平衡緩沖液沖洗2個柱體積；然后以線 性梯度洗脫，收集含目標蛋白的洗脫峰。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程重組蛋白的純化方法，旨在提供一種重組腸道病毒71型病毒VP1抗原的純化方法。該方法包括利用大腸桿菌表達生產(chǎn)重組腸道病毒71型病毒VP1蛋白，得到該蛋白的包涵體；將包涵體溶解于增溶液中；在水浴和磁力攪拌條件下向復性液中逐滴加入包涵體溶液，然后在攪拌復性48小時。本發(fā)明提出通過蛋白復性能使以包涵體形式存在的蛋白變成可溶性蛋白，大大提高了表達產(chǎn)物的回收率。采用親和層析一步純化，純度大于95％。純化的方法操作簡單、方便、省時，有利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。具有成本低廉、工藝簡便，純化蛋白純度高等優(yōu)點，可以為EV71型診斷試劑的開發(fā)和血清流行病學調(diào)查提供診斷用抗原。
文檔編號C12N15/70GK101857871SQ20101020287
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者吳強, 周林福 申請人:杭州浙大紫金生物科技有限公司