專利名稱：：純化細菌抗原的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及從包括肺炎鏈球菌(S化印tococc^;"eMmom'ae)在內的革蘭氏陽性細菌獲得的菌毛，制備和分離菌毛的方法以及用該菌毛誘導抗革蘭氏陽性細菌免疫應答的應用。本發(fā)明還提供檢測革蘭氏陽性細菌感染的方法，治療革蘭氏陽性細菌感染的方法和鑒定革蘭氏陽性細菌菌毛與基質結合的抑制劑的方法。還提供與該菌毛結合的抗體。背景革蘭氏陽性細菌肺炎鏈球菌(也稱為肺炎球菌)是全球發(fā)病和死亡率的主要原因，其是四種主要感染性疾病殺手之一，其它三種是HIV、瘧疾和肺結核(1-5)。它是呼吸道感染，例如中耳炎、鼻竇炎和社區(qū)獲得性肺炎(communityacquiredpneumonia)的主要原因，但也是侵襲性疾病，例如敗血癥和腦膜炎的重要病原體。雖然肺炎球菌是破壞性病原體，但它也能廣泛無害地寄居于曰間護理中心的健康兒童中(6，7)。肺炎球菌疾病中主要的毒力因子是多糖莢膜，依據(jù)多糖莢膜可將肺炎球菌分成至少90種不同血清型(8)。據(jù)稱其它遺傳因子，例如CbpA(膽堿結合蛋白A)和肺炎球菌溶血素對于毒力至關重要(9-11)。肺炎鏈球菌感染通過先寄居在鼻咽中而導致侵襲性疾病，但其粘附機制尚未了解。在體外，有包膜的肺炎球菌的粘附能力遠低于無包膜無毒力的衍生物(4)，即使莢膜表達是上呼吸道成功寄居所必需的。這些觀察結果提示在體內，雖然肺炎球菌產生厚的莢膜，但仍有粘附性(5)。在其它革蘭氏陽性細菌，例如白喉棒桿菌(Coo^e6acfen'wwt^fe/^/ae)(12，13)、放線菌屬(A^'"om;;ceyspp.)(14)和最近的A群鏈球菌(GAS)及B群鏈球菌(GBS)(15,16)中，已通過電子顯微鏡鑒定到菌毛樣表面結構，并作了遺傳學以及生物化學表征(12，13，15，16)。在放線菌屬中，1型菌毛基因介導與牙齒和粘膜表面的粘附(17)。然而，需要病原性鏈球菌屬的菌毛在感染性疾病中的生理學作用和功能的功能數(shù)據(jù)。革蘭氏陽性菌毛是通過轉肽酶反應形成的延伸聚合物(extendedpolymer),所述反應包括共價交聯(lián)含特定氨基酸基序的亞單位蛋白，由特異性分選酶(sortase)組裝。分選酶還負責菌毛與肽聚糖細胞壁的共價連接。發(fā)明概述本發(fā)明描述了革蘭氏陽性細菌肺炎鏈球菌的菌毛的分離和表征，等等。菌毛在肺炎鏈球菌和其它革蘭氏陽性細菌的致病機理中起作用，其本身可用于抵御革蘭氏陽性細菌感染的治療和免疫方法，等等。在一些方面，本發(fā)明提供分離的革蘭氏陽性細菌菌毛，例如肺炎鏈球菌菌毛、A群鏈球菌(GAS)菌毛或B群鏈球菌(GBS)菌毛。在一些實施方式中，所述菌毛包含肺炎鏈球菌RrgA蛋白、肺炎鏈球菌RrgB蛋白和肺炎鏈球菌RrgC蛋白中的至少一種，例如具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽，或它們的加工形式。在一些實施方式中，分離的菌毛的分子量約lxlO5-lxl07Da，或者在一些實施方式中為2xl06-3xl06Da。在一些實施方式中，分離的菌毛是長約0.1-2pm(例如，約O.l、0.2、0.5、1、1.5或2nm)的纖絲。在一些實施方式中，分離的菌毛直徑約10nm(例如，約8、9、10、11或12nm)。在一些實施方式中，分離的菌毛包含三種原纖絲。在一些實施方式中，通過酶消化(例如，利用一種或多種裂解酶，如肽聚糖水解酶(例如，變溶菌素、溶葡萄球菌素和溶菌酶))從細胞分離菌毛。在一些實施方式中，通過機械剪切(例如，通過超聲波)從細胞分離菌毛。在一些實施方式中，通過降低或抑制SrtA活性從細胞分離菌毛。在一些實施方式中，用能干擾細胞壁完整性的化合物(例如，抗生素)處理細胞而從細胞分離菌毛。在一些實施方式中，菌毛基本上游離于細菌細胞。在一些實施方式中，菌毛基本上不含肽聚糖。在一些實施方式中，本發(fā)明的特征在于制備分離的革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌菌毛)菌毛的方法，其中所述方法包括使產生革蘭氏陽性細菌菌毛的細菌細胞經酶消化或機械剪切而從細胞分離菌毛。在一些方面，本發(fā)明的特征在于包含一種或多種分離的革蘭氏陽性細菌菌毛(例如，肺炎鏈球菌菌毛)的免疫原性組合物。在一些方面，本發(fā)明的特征在于分離革蘭氏陽性細菌菌毛(例如，肺炎鏈球菌、GAS或GBS菌毛)的方法，其中所述方法包括從產生革蘭氏陽性細菌菌毛的細菌細胞(例如，革蘭氏陽性細菌細胞或經轉化而能產革蘭氏陽性菌毛的細菌細胞)分離菌毛，以及從細胞分離菌毛。在一些實施方式中，通過酶消化(例如，利用一種或多種裂解酶，如肽聚糖水解酶(例如，變溶菌素、溶葡萄球菌素和溶菌酶))從細胞分離菌毛。在一些實施方式中，通過機械剪切(例如，通過超聲波)從細胞分離菌毛。在一些實施方式中，通過降低或抑制SrtA活性從細胞分離菌毛。在一些實施方式中，用能干擾細胞壁完整性的化合物(例如，抗生素)處理細胞而從細胞分離菌毛。在一些實施方式中，分離包括采用密度梯度離心。在一些實施方式中，分離包括降低多分散性，例如按照大小分離諸組分，如采用凝膠過濾層析。在一些實施方式中，分離包括一步或多步層析，例如凝膠過濾層析、離子交換層析、反相層析或親和層析。在一些實施方式中，該方法還包括一步或多步濃縮。在一些方面，本發(fā)明的特征在于與分離的革蘭氏陽性細菌菌毛(例如，肺炎鏈球菌菌毛)特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗體是單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合型抗體、人抗體、人源化抗體、單鏈抗體或Fab片段。在一些實施方式中，例如利用酶、放射性同位素、毒素、對比劑(如，金顆粒)或熒光團標記所述抗體。在一些實施方式中，相比于所述抗體與構成菌毛的各種蛋白質的結合，所述抗體優(yōu)先結合分離的細菌菌毛或其片段。在一些實施方式中，相比于所述抗體與選自RrgA、RrgB或RrgC的未形成復合物的菌毛蛋白質的結合，所述抗體優(yōu)先結合菌毛復合物。在一些實施方式中，所述抗體不與未形成復合物的RrgA、RrgB或RrgC特異性結合。在一些方面，本發(fā)明的特征在于誘導抵御革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)的免疫應答的方法，其中所述方法包括將有效量的革蘭氏陽性細菌菌毛，例如肺炎鏈球菌菌毛(如，分離的肺炎鏈球菌菌毛)給予對象，例如人或非人動物。在一些方面，本發(fā)明的特征在于檢測對象，例如人中革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)感染的方法，其中所述方法包括檢驗對象的樣品，例如血清或痰中存在革蘭氏陽性細菌菌毛(例如，肺炎鏈球菌菌毛)的證據(jù)。在一些實施方式中，存在革蘭氏陽性細菌菌毛(例如，肺炎鏈球菌菌毛)的抗體是存在革蘭氏陽性細菌菌毛(例如，肺炎鏈球菌菌毛)的證據(jù)。在一些實施方式中，相比于所述抗體與未形成復合物的菌毛蛋白質(例如，RrgA、RrgB和RrgC)的結合，所述抗體優(yōu)先結合菌毛復合物。在一些實施方式中，所述抗體不與未形成復合物的菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB或RrgC)特異性結合。在一些方面，本發(fā)明的特征在于檢測對象人中革蘭氏陽性細菌感染，例如肺炎鏈球菌感染的方法，其中所述方法包括使樣品與特異性結合革蘭氏陽性細菌菌毛，例如肺炎鏈球菌菌毛結合的試劑(例如，抗體)相接觸，并檢測該試劑與樣品組分的結合。在一些實施方式中，相比于所述抗體與未形成復合物的菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB和RrgC)的結合，所述抗體優(yōu)先結合菌毛復合物。在一些實施方式中，所述抗體不與未形成復合物的菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB或RrgC)特異性結合。在一些方面，本發(fā)明的特征在于治療已被或懷疑已被革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)感染的對象(例如，人對象)的方法，其中所述方法包括將有效量的能特異性結合革蘭氏陽性菌毛的試劑給予該對象。在一些實施方式中，所述試劑是抗體(例如，單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合型抗體、人抗體、人源化抗體、單鏈抗體或Fab片段)。在一些實施方式中，所述試劑(例如，抗體)阻斷革蘭氏陽性細菌與細胞，例如宿主細胞的粘附或結合。所述細胞可以是上皮細胞，例如肺或鼻咽上皮細胞，在一些實施方式中，與構成菌毛的各蛋白質相比，所述抗體特異性結合分離的細菌菌毛或其片段。在一些實施方式中，所述試劑(例如，抗體)特異性結合一種或多種肺炎鏈球菌菌毛蛋白，例如RrgA、RrgB或RrgC(例如，一種或多種具有SEQIDNO:2、4或6所示氨基酸序列的多肽，或它們任一種的加工形式)。在一些實施方式中，所述試劑(例如，抗體)特異性結合具有SEQIDNO:4的氨基酸殘基316-419的多肽。在一些實施方式中，粘附試驗檢測與對照相比，所述試劑(例如，抗體)阻斷至少50%的肺炎鏈球菌與A549肺上皮細胞粘附。在一些方面，本發(fā)明的特征在于測定已被或懷疑已被革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)感染的對象(例如，人對象)的治療過程的方法，其中所述方法包括檢驗對象的樣品中是否存在針對革蘭氏陽性菌毛的抗體，并根據(jù)該抗體的存在與否選擇治療過程。如果未檢測到該抗體，所述方法還可包括用抗體試劑治療對象。如果檢測到該抗體，該方法還包括用抗炎藥治療對象。本發(fā)明的特征還在于包含以下多肽的分離的革蘭氏陽性菌毛，所述多肽包含具有最多50個(例如，最多40、30、20、10或5個)氨基酸取代、插入或缺失的革蘭氏陽性(例如肺炎鏈球菌)菌毛蛋白氨基酸序列。在一些實施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些實施方式中，革蘭氏陽性菌毛蛋白是RrgA(例如，SEQIDNO:2)、RrgB(例如，SBQIDNO:4)或RrgC(例如，SEQIDNO:6)。在一些實施方式中，所述多肽包含SEQIDNO:2、4或6中兩個或多個的氨基酸序列，或其中任一種的免疫原性片段。在一些實施方式中，所述多肽包含SEQIDNO:2、4和6所示氨基酸序列，或它們全部的免疫原性片段。本發(fā)明的特征還在于分離的革蘭氏陽性菌毛的免疫原性片段，例如含有肺炎鏈球菌菌毛蛋白，如RrgA、RrgB和RrgC的那些片段(例如，SEQIDNO:2、4和6的免疫原性片段)。本發(fā)明的特征還在于誘導抵御革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)的免疫應答的方法，其中所述方法包括將有效量的分離的革蘭氏陽性菌毛給予對象，例如人對象。本發(fā)明的特征還在于產生革蘭氏陽性菌毛的方法，所述方法用一種或多種足以產生菌毛的核酸轉化宿主細胞并從宿主細胞分離該菌毛。在一些方面，本發(fā)明的特征在于在細胞中表達抗-革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛抗體的方法，其中所述方法包括在細胞中表達編碼抗-革蘭氏陽性菌毛抗體的核酸。在一些方面，本發(fā)明的特征在于從含革蘭氏陽性細菌的樣品中純化革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)的方法，其中所述方法包括提供含有抗體的親和基質，而所述抗體能與結合于固體支持物上的革蘭氏陽性菌毛特異性結合；將該樣品與該親和基質接觸以形成親和基質/革蘭氏陽性細菌復合物;將該親和基質/革蘭氏陽性細菌復合物與其余的樣品相分離;和從親和基質上釋放所述革蘭氏陽性細菌。在一些方面，本發(fā)明的特征在于將細胞毒性劑或診斷劑遞送給革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)的方法，其中所述方法包括提供與能特異性結合革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛的抗體或其片段偶聯(lián)的細胞毒性劑或診斷劑，并使細菌與此抗體-試劑或片段-試劑偶聯(lián)物接觸。在一些方面，本發(fā)明的特征在于鑒定肺炎鏈球菌調節(jié)劑的方法，其中所述方法包括使易受肺炎鏈球菌感染的細胞，例如HEP2細胞、CHO細胞、HeLa細胞或A549肺上皮細胞與候選化合物和肺炎鏈球菌接觸，測定肺炎鏈球菌的活性，例如與細胞(例如，A549肺上皮細胞)的粘附能力是否受到抑制，其中肺炎鏈球菌活性受抑制表明(候選化合物)是肺炎鏈球菌抑制劑。在一些方面，本發(fā)明的特征在于鑒定革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛結合的調節(jié)劑的方法，其中所述方法包括使易與革蘭氏陽性菌毛結合的動物細胞與候選化合物和具有革蘭氏陽性菌毛的細菌細胞接觸，測定該細菌細胞與該動物細胞的結合是否受到抑制，其中結合活性受抑制表明(候選化合物)是革蘭氏陽性菌毛結合抑制劑。在一些方面，本發(fā)明的特征在于鑒定革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛結合調節(jié)劑的方法，其中所述方法包括使易與革蘭氏陽性菌毛結合的細胞與候選化合物和革蘭氏陽性菌毛接觸，測定該菌毛與該細胞的結合是否受到抑制，其中結合活性受抑制表明(候選化合物)是革蘭氏陽性菌毛結合抑制劑。在一些方面，本發(fā)明的特征在于鑒定革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛結合調節(jié)劑的方法，其中所述方法包括使易與革蘭氏陽性菌毛結合的細胞與候選化合物和革蘭氏陽性菌毛蛋白或其細胞結合片段接觸，測定該菌毛蛋白或其細胞結合片段與該細胞的結合是否受到抑制，其中結合活性受抑制表明(候選化合物)是革蘭氏陽性菌毛結合抑制劑。在一些方面，本發(fā)明的特征在于鑒定革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛結合調節(jié)劑的方法，所述方法包括使易與革蘭氏陽性菌毛結合的蛋白，例如胞外基質蛋白或其革蘭氏陽性菌毛結合片段與候選化合物和革蘭氏陽性菌毛、革蘭氏陽性菌毛蛋白或其片段接觸，測定該兩種蛋白或其片段之間的結合是否受到抑制，其中結合活性受抑制表明(候選化合物)是革蘭氏陽性菌毛結合抑制劑。本發(fā)明的特征還在于包含分離的革蘭氏陽性細菌菌毛(例如，肺炎鏈球菌菌毛)的藥物、免疫原性組合物和疫苗組合物。本發(fā)明的特征還在于革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛(或上述任何多肽或核酸)在制備治療或預防革蘭氏陽性細菌感染的免疫原性組合物或疫苗組合物中的應用。本發(fā)明的特征還在于可用于醫(yī)藥的革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛(或上述任何多肽或核酸)。本發(fā)明的特征還在于用于治療或預防革蘭氏陽性細菌感染的革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛(或上述任何多肽或核酸)。本發(fā)明的特征還在于包含特異性結合肺炎鏈球菌菌毛的試劑(例如，抗體)的藥物組合物。本發(fā)明的特征還在于特異性結合肺炎鏈球菌菌毛的試劑(例如，抗體)在制備治療或預防革蘭氏陽性細菌感染的藥物中的應用。本發(fā)明的特征還在于用于醫(yī)藥的這些試劑。本發(fā)明的特征還在于這些試劑在治療或預防革蘭氏陽性細菌感染中的應用。本發(fā)明的特征還在于分離肺炎鏈球菌菌毛的方法，其中所述方法包括從產肺炎鏈球菌菌毛的肺炎鏈球菌，例如肺炎鏈球菌TIGR4分離菌毛，和分離的肺炎鏈球菌菌毛。在一些實施方式中，通過酶消化(例如，用一種或多種裂解酶，如肽聚糖水解酶(例如，變溶菌素、溶葡萄球菌素和溶菌酶))從肺炎鏈球菌細胞分離菌毛。在一些實施方式中，通過機械剪切(例如，通過超聲波)從肺炎鏈球菌細胞分離菌毛。在一些實施方式中，通過降低或抑制SrtA活性從肺炎鏈球菌細胞分離菌毛。在一些實施方式中，用能干擾細胞壁完整性的化合物(例如，抗生素)處理細胞而從肺炎鏈球菌細胞分離菌毛。在一些實施方式中，所述方法包括用核酶降解核酸。在一些實施方式中，所述方法包括降低多分散性，例如采用凝膠過濾層析按照分子大小分離肺炎鏈球菌菌毛。在一些實施方式中，所述方法包括一步或多步層析步驟，例如凝膠過濾層析、離子交換層析、反相層析或親和層析。在一些實施方式中，產生肺炎鏈球菌菌毛的肺炎鏈球菌細胞表達比肺炎鏈球菌TIGR4更多的菌毛。除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所述領域的普通技術人員常規(guī)理解相同的意義。雖然可利用與本文所述相似或等價的那些方法和材料，但下述的是合適的方法和材料。本文述及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻全文納入本文作為參考。如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實施例只是說明性而非限制性的。本發(fā)明一種或多種實施方式中的細節(jié)見以下附圖和說明書。通過說明書和附圖以及以下其它實施方式中可明白本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點。附圖簡述圖1.(A)在細菌表面顯示豐富菌毛的肺炎鏈球菌菌株T4的負染色(negativestaining)。(B)顯示無菌毛的突變型菌株T4A(n^4-^D)的負染色。(C)顯示豐富菌毛的T4A(mgM)突變體的負染色。(D)在細菌表面顯示無菌毛的T4A(廳W-WD，wgM)突變體的負染色。(E)利用抗-RrgA免疫金標記T4。(F)利用抗-RrgB(5nm)和抗-RrgC(10nm)免疫金標記T4?？?RrgB顯示染色整個菌毛(棒，200nm)。(G)用抗-RrgB(5nm)和抗-RrgC(10nm)雙重標記的T4菌毛的高放大率。其顯示用抗-RrgC特異性標記菌毛，箭頭所示(棒，100nm)。(H)免疫金標記缺失突變型肺炎鏈球菌T4A0r^4-WD)，用抗-RrgB和抗-RrgC檢測到表面沒有可見的菌毛(棒，200nm)。圖2.血清型4菌株T4(TIGR4)中islet的基因組構成，并與序列已知的實驗室菌株R6作比較。19F菌株，ST162^具有相似的構成，全長序列相同性為98%，而無包膜的菌株R6及其祖先D39是菌毛-islet-陰性菌株。插入序列(/S1167)側接陽性菌株中的基因座[轉座酶之一是移碼的(fs)]，而RUP元件(肺炎球菌中的重復單位)在菌毛-islet-陰性菌株中鑒定至U。顯示了此基因座的大小及其G+C含量。標出了陰性調節(jié)子的位置。包括編碼無乳鏈球菌(5V/^/7toc<9ccws"ga/"cf/ae)禾卩白喉棒桿菌(C(rj^eZ)"cfen'wmd^/^/^n'ae)的菌毛結構的islet的基因組構成比較。圖3.(A)利用4-12%聚丙烯酰胺梯度凝膠和RrgB抗血清作蛋白質印跡檢測表達菌毛的菌株(T4，T4A(mgM)，ST162觀和ST162^A(mgM))中的高分子量(HMW)聚合物梯，而缺乏菌毛的突變型菌株(T4A(廳^-WD)，T4A(rr^4-WZ)，wg")和ST162^A0t^4-w/DX)沒有HMW聚合物。與各種野生型相比，wgM突變體顯示強度增加。(B)對于缺乏islet的D39、引入r/Mislet的突變型D39(D39A0rgJ"WD))及其/VM缺失衍生菌株(D39A0rgJ-^tD)A(W^4))，利用4-12%梯度凝膠以RrgB抗血清進行蛋白質印跡。圖4.(A)D39和D39A0rgv4畫sWD)以及D39A0rgv4-^tD)AO/M)粘附A549肺上皮細胞單層。(B-D)粘附A549肺上皮細胞的D39(B)、D39A(at^4-WD)(C)和D39A0r^4-w")A0^力(D)的免疫熒光顯微鏡。顯示了用抗-莢膜抗體標記肺炎球菌(綠色)以及用羅丹明顯示的上皮細胞F-肌動蛋白。圖5.(A-E)用有菌毛的T4及其同基因無菌毛缺失突變型T4A(ATg^-w^>)鼻內攻擊C57BL/6小鼠。(A和B)接種5x106cfb(高劑量，A)或5x105cfii(中等劑量，B)后的小鼠存活情況。利用卡普蘭-邁耶對數(shù)排名檢驗分析存活情況。(C-E)體內競爭感染實驗，其中先將T4及其同基因突變型T4A0r^4-^VD)以1:1的比例混合再進行鼻內感染。如下所述計算競爭性指數(shù)(CI)，各圓環(huán)代表各競爭實驗組中每只小鼠的CI。1以下的CI表明突變體相對于野生型菌株為競爭劣勢。<10爿的CI值設定為l(T4。所有小鼠都有細菌寄居。(C)高劑量攻擊后(n二20)細菌寄居、肺炎和菌血癥的CI。20只小鼠中，只有14只顯示肺炎(定義為從肺中回收到細菌)，14只有菌血癥。(D)中等劑量攻擊后(11=IO)細菌寄居的CI。IO只小鼠中，只有5只顯示肺炎，l只有菌血癥。(E)低劑量攻擊后(nMO)細菌寄居的CI。IO只小鼠中，只有4只顯示肺炎，無小鼠產生菌血癥。(F)用野生型D39及其同基因菌毛islet插入衍生菌株D39A0r^-^D)或r/M基因滅活的D39A(;r^4"W/))A(r^4)混合感染后，細菌寄居和肺炎的CI。1以上的CI表明D39A0rg」-sWD)中存在WMislet獲得毒力。圖6.r/M菌毛islet在全身性宿主炎性反應中的作用。用高攻擊劑量(5x106-2x107cfo)的T4、ST162^和它們的同基因突變型T4A0rgJ-^D)以及ST162^A(AT^4"WD)腹膜內攻擊小鼠，感染后6小時殺死小鼠。(A)高劑量腹膜內攻擊后血液中的細菌生長。顯示了每只小鼠的結果。水平線表示中值，通過曼-惠特尼U檢驗分析得到無顯著性差異(PX).05)。(B)血清TNF應答。數(shù)據(jù)以平均值和SEM表示。曼-惠特尼U檢驗建立有統(tǒng)計學顯著意義(**，P<0.0001;*，P<0.001)。(C和D)用T4和T4A(—"剛(C)或ST162觀和ST16219FA(n^-WD)(D)接種后各小鼠的TNF應答與菌血癥水平相關。圖7.分析與圖6所示相同的腹膜內攻擊后的IL-6應答。血液中的細菌生長示于圖6A。(A)感染后6小時的血清IL-6應答。數(shù)據(jù)以平均值和SEM表示(曼-惠特尼U檢驗；*，P<0.0001)。(B)用T4和T4A(rrg」-WD)接種后各小鼠的IL-6應答與菌血癥水平相關。圖8是肺炎球菌T4菌毛的結構蛋白RrgA、RrgB和RrgC的分析。8A是在革蘭氏陽性菌毛蛋白中發(fā)現(xiàn)的預計基序的示意圖。8B是肺炎鏈球菌(T4)中存在的預計菌毛蛋白和E-盒基序的序列。顯示棒狀桿菌種菌毛蛋白和E-盒的序列以供參考(Ton陽That等，2004，Mol.Microbiol.，53:251-261;Ton-That和Schneewind，2004，TrendsMicrobiol.，12:228-34;Scott禾口Zahner;2006，Mol.Microbiol.，62:320-330)。8C總結了在肺炎球菌T4RrgA、RrgB和RrgC中發(fā)現(xiàn)的基序。8A和8C,S:N-末端信號肽，P:菌毛蛋白基序，E:E-盒，C鄰胞壁分選信號基序，M:疏水性延伸和帶電荷的尾部。圖9A描述了用考馬斯藍染色的聚丙烯酰胺凝膠，其顯示純化的RrgA和RrgB蛋白的自身締合。圖9B描述了顯示純化的RrgA和RrgB蛋白的自身締合的免疫印跡。圖9C描述了純化的RrgA、RrgB和RrgC蛋白進行尺寸排阻層析的一系列痕跡線(trace)。觀察到RrgA和RrgB的分子量較高的復合物。圖IOA是描繪通過蔗糖梯度純化高分子量、天然、肺炎球菌T4菌毛的直線圖。圖10B是描繪通過尺寸排阻層析純化高分子量、天然、肺炎球菌T4菌毛的痕跡線圖。圖10C描述了高分子量、天然、肺炎球菌T4菌毛純化結果的聚丙烯酰胺凝膠。左側的凝膠顯示銀染色的結果。右側的凝膠顯示含特異性結合RrgB的抗體作的免疫印跡。圖11A描述與RrgB的預計氨基酸序列相比，進行Edmann分析以測定菌毛蛋白N-末端氨基酸序列(下劃線)的結果。菌毛蛋白的N-末端對應于預計的信號肽酶切割位點(/)。圖11B描述了胰蛋白酶消化純化高分子量菌毛的質譜分析結果。高分子量菌毛的胰蛋白酶肽序列(斜體字)(從SDS-PAGE凝膠分離)與預計的RrgB氨基酸序列(黑體字)匹配。圖12顯示用HMW菌毛的抗血清(50pl/小鼠)免疫(腹膜內)并用260CFU的T4/小鼠攻擊(腹膜內)的BALB/c小鼠的菌血癥和死亡率。T4A菌毛制品用作陰性對照。A.攻擊后24小時的菌血癥。圓圈=每只小鼠每ml血液的CFU值；水平棒=各組的幾何平均值；虛線=檢測下限(S卩，虛線以下在血液樣品中檢測不到CFU)。B.死亡進程.菱形=每只動物的存活天數(shù)；水平棒=各組存活天數(shù)的中值；虛線=觀察終點(即，虛線以上的動物在終點處存活)。ctrl=只接受相應佐劑加鹽水的小鼠；抗-菌毛=純化HMW菌毛的抗血清；抗-A菌毛=純化對照(T4A菌毛)的抗血清；*=<0.05禾口**=<0.01，與相應的對照組相比。圖13顯示純化的重組蛋白(BSA、RrgA、RrgB、RrgC)和天然菌毛與BSA及胞外基質蛋白粘蛋白I、透明質酸、玻連蛋白、硫酸軟骨素、乳鐵蛋白、膠原I和IV、層粘連蛋白、纖連蛋白和血纖蛋白原的結合結果的系列圖。BSA用作陰性對照。通過ELISA以405nm吸光度定量測定結合。圖14顯示通過用純化菌毛和A菌毛對照制品體外攻擊誘導外周血單核的細胞(PBMC)和單核細胞產生炎性細胞因子TNF-a、IL-12p40和IL-6的系列直方圖。圖15描述了用RrgB特異性抗體作免疫金標記的肺炎鏈球菌細菌的電子顯微照片。圖16描述了用RrgA(與15nm金顆粒偶聯(lián))、RrgB(與5nm金顆粒偶聯(lián))和RrgC(與10nm金顆粒偶聯(lián))的特異性抗體作免疫金標記的純化菌毛制品的電子顯微照片。RrgB是菌毛的主要組分。沿著菌毛的長度可發(fā)現(xiàn)RrgA和RrgC，常發(fā)現(xiàn)RrgA成簇。圖17描述了用磷鎢酸(PTA)作負染色的純化菌毛的電子顯微照片，以5000x放大率觀察。圖18是菌毛結構分析以測定菌毛平均直徑的示意圖。圖19是菌毛結構分析以測定菌毛體積的示意圖。圖20是產生菌毛的改進2D表示的方法的示意圖，所述方法求取菌毛電子顯微照片的平均值并過濾這些照片。圖21是菌毛的旋轉2D視角的示意圖，顯示由三股原纖絲構成的螺旋結構。圖22是測定兩處菌毛橫斷面結構的密度概況示意圖。圖23描述了菌毛結構的模型。菌毛由至少3股"原纖絲"，按照巻曲螺旋結構排列而成，平均直徑為10.5-11.0nm，螺距為13.2nm。結節(jié)處菌毛的直徑是6.8nm，每股"原纖絲"的直徑是3.5nm。發(fā)明詳述申請人分離和表征了革蘭氏陽性細菌，肺炎鏈球菌(也稱為肺炎球菌)的菌毛。經鑒定這些菌毛由肺炎鏈球菌TIGR4(—種臨床莢膜血清型4分離物)表達，其基因組由基因組研究院(TheInstituteforGenomicResearch)測序(參見萬維網址tigr.org)。這些菌毛由病原性分離株，rlrAislet表達，其存在于一些而非所有臨床肺炎球菌分離株中。菌毛在鼠科感染模型中顯示對于肺炎球菌粘附肺上皮細胞以及寄居至關重要。類似地，菌毛還顯示能影響小鼠肺炎和菌血癥的產生。此外。表達菌毛的肺炎球菌在全身性感染中引發(fā)的腫瘤壞死因子(TNF)應答高于無菌毛(nonpiliated)的同基因突變株，這表明菌毛在宿主炎性應答中起作用。因此，本發(fā)明的特征在于革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)菌毛和菌毛蛋白組合物以及它們在抵御革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)感染的治療和免疫方法中的應用。肺炎鏈球菌菌毛肺炎球菌菌毛由肺炎鏈球菌TIGR4中存在的r/Mislet編碼，其含有3種分選酶和編碼含LPXTG基序的蛋白質的3種基因0rg厶wg5和/rgQ。抗RrgA、RrgB和RrgC蛋白的免疫金標記抗體檢測肺炎鏈球菌表面的伸長纖絲狀結構?？?RrgA顯示能標記細菌細胞表面，提示RrgA能將菌毛結構錨定在細胞壁上。抗-RrgB顯示能遍布整個菌毛，而抗-RrgC聚集于菌毛尖端。菌毛基因缺失使菌毛染色消失，而菌毛操縱子(/ngM)的陰性調節(jié)劑缺失造成細胞表面的菌毛量增加。肺炎鏈球菌菌毛在細胞表面位置使得它們成為有吸引力的抗原。從肺炎鏈球菌TIGR4分離均質或接近均質的菌毛，顯示其分子量范圍是2x106-3x106Da。純化的菌毛是最長約1pm和直徑約10nm的伸長纖絲狀，免疫金標記在分離的菌毛中檢測到RrgB和RrgC蛋白。示范性廳gj核酸序列(TIGR注釋號sp0462)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>示范性RrgA氨基酸序列(TIGR注釋號SP0462)如下所示'MIi'NRETHMKKVRKIFQKAVAGIiCCISQLTAFSSIVADAETPETSPAIGKVV工KBTGEGGALIjGDAVFEIjKNNTDGTTVSQRTEAQTGEAIFSNIKPGTYTtiTEAQPPVGYKPSTKQWTVEVEKNGRTTVQGEQVENREEALSDQYPQTGTYPDVQTPYQ:iIKVDGSEKNGQHKALNPNPYERVIPEGTIiSKR工YQVNNLDDNQYGIELTVSGKTVYEQKDKSVPIiDWIliliDNSNSMSlTIRNKNARRAERAGEATRSIjIDKITSDSENRVALVTYASTIFDGTEFTVEKGVADKNGKRLNDSIiFWNYDQTSFTTNTKDYSYLKLTNDKNDIVELKNKVPTEAEDHDGiMRIjMYQFGATFTQKALMKADEIIiTQQARQNSQKVIFHITDGVPTMSYPI'NFNHATFAPSYQNQLUAFFSKSPNKDG工LiIjSDFITQATSGEHTIVRGDGQSYQMFTDKTVYEKGAPAAFPVKPEKYSEMKAAGYAVIGDPINGGVTWLNWRESILAYPFNSNTAKITNHGDPTRWYYNGN工APDGYDVFTVG工G工NGDPGTDEATATSFMQS工SSKPENYTNVTDTTKIIiEQLNRYFHTIVTEKKSIENGTITDPMGEIiIDIiQIjGTDGRFDPADYTLTANDGSRIiENGQAVGGPQNDGGLLKNAKVIjYDTTEKRIRVTGLYLGTDEKVTIjTYNVRLNDEFVSNKFYDTNGRTTLHPKEVEQKJTVRDFP工PKIRDVRKYPE工TISKEKKLGDIEPIKVNKNDKKPIiRGAVFSIiQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFipsrLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPAGYEFTNDlblY工TNEPIPPKREYPRTGGIGMLPFYLIGCMMMGGVIiIiYTRKHP(SEQ.IDNO:2)RrgA含有分選酶底物基序YPXTG(SEQIDNO:8)，在以上SEQIDNO:2中以下劃線顯示。兩種推定的Can蛋白B-型結構域(Deivanayagam等，2000，Structure,8:67-78)在SEQIDNO:2的氨基酸殘基62-132和751-824處鑒定?，F(xiàn)已鑒定到推定的vonWillebrand因子A型結構域(Sadler，1998，Annu.Rev.Biochem.，67:395-424;Ponting等，1999，J.Mol.Biol.，289:729-4226-579)。該vonWillebrand因子A型結構域可能涉及肺炎鏈球菌菌毛介導的細胞粘附或細胞信號轉導特性。示范性核酸序列(TIGR注釋號sp0463)如下所示ATGAAATCAATCAACAAATTTTTAACAATGCTTGCTGCCTTATTACTGACAGCGAGTAGCCTGTTTTCAGCTGCAACAGTTTTTGCGGCTGGGACGACAACAACATCTGTTACCGTTCATAAACTATTGGCAACAGATGGGGATATGGATAAAATTGCAAATGAGTTAGAAACAGGTAACTATGCTGGTAATAAAGTGGGTGTTCTACCTGCAAATQCAAAAGAAATTGCCGGTGTT]ATGTTCGTTTGGACAAATACTAATAATGAAATTAT"TGATGAAAATGGCCAAACTCT^GGAGTGAATATTGATCCACAAACATTTAAACTCTCAGGGGCAATGCCGGCAACTGCAATGAAAAAATTAACAGAAGCTGAAGGAGCTAAATTTAACACGGCAAATTTACCAGCTGCTAAOTATAAAATTTATGAAATTCACAGTTTATCAACTTATGTCGGTGAAGATGGAGCAACCTTAACAGGTTCTAAAGCAGTTCCAATTGAAATTGAATTACCATTGAACGATGTTGTGGATGCGCATGTGTATCCAAAAAATACAGAAGCAAAGCCAAAAATTGATAAAGATTTCAAAGGTAAAGCAAATCCAGATACACCACGTGTAGATAAAGATACACCTGTGAACCACCAAGTTGGAGATGTTGTAGAGTACGAAATTGTTACAAAAATTCCAGCACTTGCTAATTATGCAACAGCAAACTGGAGCGATAGAATGACTGAAGGTTTGGCATTCAACAAAGGTACAGTGAAAGTAACTGTTGATGATGTTGCACTTGAAGCAGOTGATTATGCTCTAACAGAAGTAGCAACTGGTTTTGATTTGAAATTAACAGATGCTGGTTT再GCTAAAGTGAATGACCAAAACGCTGAAAAAACTGTGAAAATCACTTATTCGGCAACATTGAATGACAAAGCAATTGTAGAAGTACCAGAATCTAATGATGTAACATTTAACTATGGTAATAATCCAGATGACGGOAATACTCCAAAGCCGAATAAGCCAAATGAAAACGGCGATTTGACATTGACCAAGACATGGGTTGATGCTACAGGTGCACCAATTCCGGCTGGAGCTGAAGCAACGTTCGATTTGGTTAATGCTCAGACTGGTAAAGTTGTACAAACTGTAACTTTbACAACAGACAAAAATACAGTTACTGTTAACGGATTGGATAAAAATACAGAATATAAATTCGTTGAACGTAGTATAAAAGGGTATTCACCAGATTATCAAGAAATCACTACAGCTGGAGAAATTGCTGTCAAGAACTGGAAAGACGAAAATCCAAAACCACTTGATCCAACAGAGCCAAAAGTTCTTACATATGGTAAAAAGTTTGTC^AAGTTAATGATAAAGATAATCGTTTAGCTGGGGCAGAATTTGTAATTGCAAATGCTbATAATGCTGGTCAATATTTAGCACGTAAAGCAGATAAAGTOAGTCAAGAAGAGAAGCAGTTGGTTGTTACAACAAAGGATGCTTTAGATAGAGCAGTTGCTGCTTATAACGCTCTTACTGCACAACAACAAACTCAGCAAGAAAAAGAGAAACTTGACAAAGCTCAAGCTGCTTATAATGCTGCTGTGATTGCTGCCAACAAfGCATTTGAATGGGTGGCAGATAAGGACAATGAAAATGTTOTGAAATTAGTT^TCTGATGCACAAGGTCGCTTTGAAATTACAGGGCTTCTTGCAGGTACATATTACTTAGAAGAAACAAAACAGCCTGCTGGTTATGCATTACTAACTAGCCGTCAGAAATTTGAAOTGACTOCAACTTCTTATTCAGCGACTGGACAAGGCATTGAGTATACTGCTGGTTCAGGTAAAGATGACGCTACAAAAGTAGTCAACAAAAAAA"fCACTATCCCACAAACGGGTGGTATTGGTACAATTATCTTTGCTGTAGCGGGGGCTGCGATTATGGGTATTGCAGTGTACGclATATGTTAAAAACAACAAAGATGAGGATCAACTTGCTTAA('SEQIDNO-3)示范性RrgB氨基酸序列(TIGR注釋號SP0463)如下所示MKS工NKFIjTMLAALIiIjTASS:LFSAATVFAAGITTTSVTVHKLLATDGDMDKIANE:LETGNYAGNKVGVI/PANAKEIAGVMFVWTNTNNEIIDENGQTIjGVNIDPQTFKLSGAMPATAMKKLTEAEGAKFNXAJNLPAAKYKIYE工HSIjSTYVGED6ATIiTGSKAVPIEIE:LPLNDWDAHVYPKNTEAKPKIDKDFKGKANPDTPRVDKDTPVNHQVGDWEyEIVTK工PALANYATANWSDRMTEGLAFNKGTVKVTVDDVALEAGDYALTEVATGFDLKLTDAGLAKVNDQWAEKTVKITYSATLNDKAIVEVPESNDVTFNyGNNPDHGNTPKPNKPNENGDIiTI/TKTWVDATGAP工PAGAEATFDLVNA。TGKVVQTVTLTTDKNTVTVNGLDKNTEYKFVERSIKGYSADYQEITTAGEIAVKNWKDEKTPKPIiDPTEPKVVTYGKKFVKVNDKDNRIAGAEFVIANADNAGQYLARKADKVSQEEKQI/WTTKDALDRAVAAYNALTAQQQTQQEKEKVDKAQAAYNAAV工AMJNAFEWVADKDKrENWKLVSDAQGRFEITGLLAGTYYLEET.KQPAGYALLTSRQKPEVTATSYSATGQGIEYi:AGSGKDDATKVVNKKITIPQTpGIGTIIFAVAGAAIMGIAVYAYVKNMKDEDQIA(SEQIDNO:4)RrgB含有分選酶底物基序IPXTG(SEQIDNO:9)，在以上SEQIDNO:4中以下劃線顯示。推定的Can蛋白B-型結構域(Deivanayagam等，2000，Structure,8:67-78)在SEQIDNO:4的氨基酸殘基461-605處鑒定。示范性廳gC核酸序列(TIGR注釋號sp0464)如下所示ATGATTAGTCGTATCTTCTTTGTTATGGCTCTGTGTTTTTCTCTTGTATGGGGTGCA.CATGCAGTCCAAGCGCAAGAAGATCACACGTTGOTCTTGCAATTGGAGAACTATCAGGAGGTGGTTAGTCAATTGCCATCTCGTGATGGTCATCGGTTGCAAGTATGGAAGTTG■GATGATTCOTATTCCTATGATGATCGGGTGCAAATTOTAAGAGACTTGCATTCGTGGGATGAGAATAAACTTTCTTCTTTCAAAAAGACTTCGTTTGAGATGACCTTCCTTGAGaatcagattgaagtatctcatattccaaatggtctttactatgttcgctctattatccagacggatgcggtttcttatccagctgaatttctttttgaaatgacagatcaaacggtagagcctttggtcattgtagcgaaaaaaacagatacaatgacaacaa^gotgaagctgataaaggtggatcaagaccacaatcgcttggagggtgtcggctttaAattggtatcagtagcaagagatgtttctgaaaaagaggttcccttgattggagaataccgttacagttcttctggtcaagtagggaqaactctctatactgataaaaatggagagatttttgtgacaaatcttcctcttgggaactatcgtttcaaggaggtggagccactggcaggctatgctgttacgacgctggatacggatgtccagctggtagatcatcagctggtgacgattacggttgtcaatcagaaattAccacgtggcaatgttgactttatgaaggtggatggtcggaccaatacctctcttcaaggggcaatgttcaaagtcatgaaagaagaaagcggacactatactcctgttcttcaaaatggtaaggaaotagttgtaacatcagggaaagatggtcgtttccgagtggaaggtctagagtatgggacatactatttatgggagctccaagctccaactggttatgttcaattaacatcgcctgtttcctttacaatcgggaaagatactcgtaaggaactggtaacaotggttaaaaataacaagcgaccacggattgatgtgccagatacaggggaagaaaccttgtatatcttgatgcttgttgccattttgttgTTTGGTAGTGGTTATTATCTTACGAAAAAACCAAATAACTGA(SEQIDNO:5)示范性RrgC氨基酸序列(TIGR注釋號SP0464)如下所示MISRIFFVMALCFSLVWGAHAVQAQEDHTLVLQL咖YQEWSQLPSRDGHRLQWKL.DDSYS.YDDRVQIVRpiiHSWDENKLSSFKKTSFEMTFIiENQ:rEVSHIPNGIiYYVRS工IQTDAVSYPAEFIiFEMTDQTVEPLV工VAKKTDTMTTKVKL工KVDQDHNRLEGVGFKLVSVARDVSEKEVPIiIGEYRYSSSGQVGRTIiYTDKNGE工FVTNLPIiGNYRFKEVEPIjAGYAVTTLDTDVQIjVDHQLVTITVVNQKLPRGNVDFMKVDGRTNTSIiQGAMFKVMKEESGHYTPVLQNGKEVVVTSGKDGRFRVEGLEYGTYYLWEIjQAPTGYVQLTSPVSFTIGKDTRKEIiVTWKNNKRPRIDVPDTGEETI/yiliMIiVAILLFGSGYYLTKKPNN(SEQ工DNO:6)兩種推定的Can蛋白B-型結構域(Deivanayagam等，2000，Structure,8:67-78)在SEQIDNO:6的氨基酸殘基163-251和273-352處鑒定。RrgC含有分選酶底物基序VPXTG(SEQIDNO:10)，以上SEQIDNO:6中以下劃線顯示。其它革蘭氏陽性細菌菌毛本文所述的方法和組合物可利用任何革蘭氏陽性細菌的菌毛。現(xiàn)已在GAS(例如，釀膿鏈球菌(S"e;^ococcz^;;;oge"e力)(Mora等，2005，Proc.Natl.Acad.Sci,USA,102:15641-6)、GBS(例如，無乳鏈球菌O^w/^ococcz^aga/ac"ae))(Lauer等，2005，Science,309:105;WO2006/078318)、內氏方夂線菌(」c""om戸^swaes/w"刷(Yeung等，1998，Infect.Immun.，66:1482-91)、白喉棒桿菌(Coo^e6a"eWwmc^/2f/7e〃'ae)(Ton-Tha等，2003，Mol.Microbiol.,50:1429-38;Ton-That禾卩Schneewind，2004，Trends.Microbiol.,12:228—34)、產氣莢膜梭菌(C/oWW&wmpe^W"ge""和糞腸球菌(￡^^^0"^>^。//力中鑒定了已知和推定的菌毛蛋白。本文所述的方法和組合物可利用其它革蘭氏陽性細菌的菌毛。這種革蘭氏陽性細菌包括但不限于厚壁菌門，例如鏈球菌屬(如肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、豬鏈球菌(S.w&)、獸瘟鏈球菌(S.zoo印Wew/cw)、綠色鏈球菌(S.v/nWa朋)、變異鏈球菌(S.mwto似)、格氏鏈球菌(S.go^om7)、馬鏈球菌OS.e《w/));芽孢桿菌屬(Sfl"7/ws)(例如，炭疽芽孢桿菌(5.a"Arac&)、蠟狀芽孢桿菌(5.cerew)、枯草芽胞桿菌(及w6"/"));利斯特菌(i^^^)(如，無害利斯特菌(丄./朋ocw)、單核細胞增生利斯特菌(丄.w朋oc;^oge"ey));葡萄球菌屬0Sto;/2;;/ococcM)(如金黃色葡萄球菌OS.awrew力、表皮葡萄球菌epWerm/flfo)、山羊葡萄球菌ca;me)、腐生葡萄球菌(S.s，—,'c一、路鄧葡萄球菌/w^/"w冊/s)、施氏葡萄球菌(S.■sc/z/ez/eW));腸球菌屬CE"&rococcw51)(如糞腸球菌(五./aecafe)、屎腸球菌(五./aec/wm))、乳桿菌屬(La"o6ac/〃w"、乳球菌(丄a"ococcw"(如乳酸乳球菌(丄./acto));明串珠菌屬(Lewco"oWoc)(如腸膜明串珠菌(丄.mese她ro,tfes));梳狀菌屬(尸ec""齒力；片球菌屬CPed/ococc—;醋酸桿菌屬(^cefoZaCe〃.ww);梭菌屬(C7oitA7'd/wm)($口肉毒梭菌(C1.Zow//wwm)、艱難梭菌(C^^cZ/e)、產氣莢膜梭菌(C./7e，/"ge""、破傷風梭菌(C.^to"/));瘤胃球菌屬(iwm/"ococczw)(如白色瘤胃球菌(i.a/6ws));螺旋桿菌屬(Zfe"o6acfen'wm);(//e/z'05p/n7/wm)禾口鼠孢菌屬(S/o;-omw5(3);禾口方夂線菌，例如放線菌屬04"/"om;;ce&力(如內氏放線菌)；棒桿菌屬(Coo;"e6a"e〃'wm)(如，白喉棒桿菌、(C.e^c/e似))、節(jié)桿菌屬C4W/^oZ^c^);雙歧桿菌屬(5訴afo6a"eWwm)(如長雙歧桿菌(5./owgwm));弗蘭克氏菌屬CFmwha);微球菌屬(Mcrococcws);小單孢菌屬(Mz'cromowo印ora);分枝桿菌屬(Mj;co6ac/eW"m)(如，結核分枝桿菌(T^"6en:w/a^)、麻風分枝桿菌(Mleprae)、牛分枝桿菌(MZjov/力、非洲分枝桿菌(Ma/Wca"wm)、田鼠分枝桿菌(Mm/cro"));諾卡式菌屬(7Voc。W/fl)(如，星狀諾卡式菌(TV.(x^e/"o/tfey));丙酸桿菌屬(尸rop/om力a"eWwm)禾口鏈霉菌屬(S^"e/^omyces)(如，索馬里鏈霉菌OS,■soma//ew1^)、除蟲鏈霉菌(S.awm"http://&)、天藍色鏈霉菌(i5.coe/,co/or))。分離的菌毛分離的革蘭氏陽性(例如肺炎鏈球菌)菌毛和包含革蘭氏陽性菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB和RrgC)的其它菌毛樣結構或它們的片段或變體可用于本文所述的方法中并用作免疫原性組合物的抗原以在對象中產生抗體和/或刺激免疫應答。包含革蘭氏陽性菌毛蛋白變體在內的菌毛也可用于本文所述的方法，并用作免疫原性組合物的抗原以在對象中產生抗體和/或刺激免疫應答。與革蘭氏陽性蛋白氨基酸序列(例如，SEQIDNO:2、4或6)有至少80%序列相同性(例如，85%、90%、95%、98%或99%)的革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛樣多肽也可用于所述新方法。此外，含最多50個，例如l、3、5、10、15、20、25、30、或40個氨基酸插入、缺失或取代(如保守性氨基酸取代)的革蘭氏陽性菌毛多肽可用于本文所述的組合物和方法中?？衫胣cbi.nlm.nih.gov/BLAST對公眾公開的BLAST2.0程序測定兩條氨基酸序列之間的相同性百分比。采用無空位比對和默認參數(shù)(BLOSUM62矩陣、空位存在成本(gapexistencecost)為11、每個殘基空位成本(perresiduegapcost)為1，X比例(lambdaratio)為0.85)進行序列比較。Altschul等，1997，NucleicAcidsResearch,25:3389-3402描述了BLAST程序所用的數(shù)學算法。本文所用的"保守性氨基酸取代"表示多肽中氨基酸家族內的氨基酸取代。氨基酸家族是本領域公認的，其依據(jù)氨基酸側鏈的物理和化學特性。家族包括以下含堿性側鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；含酸性側鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)；含不帶電荷側鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)；含非極性側鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)；含分支側鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸);和含芳族側鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和組氨酸)。某種氨基酸可屬于一個以上的家族。在一些實施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白，可將其配制或純化成寡聚(菌毛)形式。在一些實施方式中，寡聚形式是超寡聚物(hyperoligomer)。在一些實施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含以寡聚(菌毛)形式分離的革蘭氏陽性菌毛蛋白?？杉兓蚺渲瓢锾m氏陽性菌毛蛋白的寡聚物或超寡聚物菌毛結構用于免疫原性組合物中。一個或多個肺炎鏈球菌菌毛蛋白開放讀框的多核苷酸序列可用編碼被替代ORF的片段的多核苷酸序列替代?；蛘?，一個或多個肺炎鏈球菌菌毛蛋白開放讀框可用與被替代的ORF具有序列同源性的序列替代。一種或多種革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白序列通常包含LPXTG基序(例如LPXTG(SEQIDNO:ll))或其它分選酶底物基序。肺炎鏈球菌菌毛蛋白的LPXTG分選酶底物基序通常以式X,X2X3X4G表示，其中氨基酸1位的X是L、V、E、Y、I或Q;如果氨基酸1位的X是L，則氨基酸2位的X是P;如果氨基酸1位的X是E或Q，則氨基酸2位的X是V;如果氨基酸l位的X是V，則氨基酸2位的X是V或P;氨基酸3位的X是任何氨基酸殘基；如果氨基酸1位的X是V、E或Q，則氨基酸4位的X是T;如果氨基酸1位的X是L，則氨基酸4位的X是T、S或A。LPXTG基序的一些例子包括YPXTG(SEQIDNO:8)、IPXTG(SEQIDNO:9)、LPXSG(SEQIDNO:57)、VVXTG(SEQIDNO:12)、EVXTG(SEQIDNO:13)、VPXTG(SEQIDNO:10)、QVXTG(SEQIDNO:14)、LPXAG(SEQIDNO:15)、QVPTG(SEQIDNO:16)和FPXTG(SEQIDNO:17)。一種或多種革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白序列可包含菌毛基序序列。菌毛基序序列的一些例子包括WLQDVHVYPKHQXXXXXXK(SEQIDNO:58)、濯YNVVAYPKNTXXXXXXK(SEQIDNO:59)、WLYDVNVFPKNGXXXXXXK(SEQIDNO:60)、WIYDVHVYPKNEXXXXXXK(SEQIDNO:61)、麗YNVHVYPKNTXXXXXXK(SEQIDNO:62)、FLSEINIYPKNVXXXXXXK(SEQIDNO:63)和DVVDAHVYPKNTXXXXXXK(SEQIDNO:64)。示范性的共有菌毛基序序列是(W/F/E/D)-X-X-X-(V/I/A)-X-(V/I/A)-(Y/F)陽P-K-(應/D)-XXXXXXX隱(K/L)(SEQIDNO:65)或WXXXVXVYPK(SEQIDNO:76)。菌毛基序的保守性內部賴氨酸可用作分選酶反應中的親核位點。一種或多種革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白序列可包含E-盒基序序列。E-盒基序序列的一些例子包括FCLVETATASGY(SEQIDNO:66)、FCLKETKAPAGY(SEQIDNO:67)、YVLVETEAPTGF(SEQIDNO:68)、YCLVETKAPYGY(SEQIDNO:69)、YKLKETKAPYGY(SEQIDNO:70)、YPITEEVAPSGY(SEQIDNO:71)、YRLFENSEPAGY(SEQIDNO:72)、示范性E-盒基序共有序列是(Y/F)-X-(L/I)-X-E-T-X-(A/Q/T)-(P/A)-X-G-(Y/F)(SEQIDNO:75)或LXET(SEQIDNO:77)。本文所述的革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛可影響革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)粘附和侵入上皮細胞的能力。菌毛還可影響革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)通過上皮細胞層轉運的能力。一種或多種革蘭氏陽性菌毛優(yōu)選能結合上皮細胞表面或與之締合。革蘭氏陽性菌毛還可結合血纖蛋白原、纖連蛋白或膠原或與之締合。據(jù)認為，革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)分選酶蛋白參與含LPXTG的表面蛋白的分泌和錨定。在與wgj、/Tg5和/rgC基因相同的病原性islet中發(fā)現(xiàn)的基因一W、WC和w^O編碼這些肺炎鏈球菌分選酶蛋白?？蓮母锾m氏陽性細菌獲得用于本文所述方法中的分選酶蛋白和分選酶蛋白的變體。革蘭氏陽性(例如肺炎鏈球菌)菌毛蛋白可以通過膜相關轉肽酶，例如分選酶共價連接于細菌細胞壁。分選酶的功能是切割(優(yōu)選在LPXTG基序的蘇氨酸和甘氨酸殘基之間)表面蛋白。然后分選酶協(xié)助在蘇氨酸羧基和細胞壁前體，例如脂質II之間形成酰胺鍵連接。然后通過細菌細胞壁合成時的轉糖基化(transglycoslylation)和轉肽反應將該前體摻入肽聚糖中。參見Comfort等，Infection&Immunity(2004)72(5):2710-2722。在一些實施方式中，本發(fā)明包括含有寡聚菌毛樣結構的組合物，所述結構包含革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白(例如，RrgA、RrgB或RrgC(如SEQIDNO:2、4或6))。寡聚菌毛樣結構可包含多個單位的菌毛蛋白質。在一些實施方式中，寡聚菌毛樣結構可包含兩種或更多種菌毛蛋白質。在一些實施方式中，寡聚菌毛樣結構包括超寡聚菌毛樣結構，所述結構包含至少兩個(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、150、200個或更多個)寡聚亞單位，其中各亞單位包含菌毛蛋白或其片段。寡聚亞單位可經菌毛基序內的保守性賴氨酸共價連接。寡聚亞單位可經LPXTG基序，優(yōu)選分別通過蘇氨酸或絲氨酸氨基酸殘基共價連接。在一些實施方式中，寡聚菌毛樣結構是分離的菌毛。在一些實施方式中，要摻入本發(fā)明寡聚菌毛樣結構的革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白或其片段包含菌毛基序。寡聚菌毛可單用或與本發(fā)明聯(lián)用。在一些實施方式中，本發(fā)明包括寡聚形式的肺炎鏈球菌菌毛。在一些實施方式中，所述菌毛是超寡聚形式。純化菌毛的方法可通過，例如機械剪切或酶消化分開細胞與菌毛，然后分離分開的菌毛從而能自表達革蘭氏陽性菌毛或菌毛樣結構(例如，鏈球菌菌毛，如肺炎鏈球菌、A群鏈球菌和B群鏈球菌的菌毛)的細胞，例如細菌細胞純化菌毛。純化菌毛合適的細菌細胞包括有菌毛的革蘭氏陽性細菌菌株、已用一種或多種革蘭氏陽性菌毛蛋白，例如肺炎鏈球菌RrgA、RrgB和RrgC(如SEQIDNO:2、4和6)轉化的無菌毛革蘭氏陽性細菌，以及用一種或多種革蘭氏陽性菌毛蛋白，例如肺炎鏈球菌RrgA、RrgB和RrgC(如SEQIDNO:2、4和6)轉化的革蘭氏陰性或前其它細胞。用于純化菌毛的細胞通常只產生一種或多種所需類型的菌毛，例如內源或異源菌毛。對于異源菌毛的產生，可通過，例如突變或重組DNA方法改變細胞，使之不產生內源性菌毛。可用于純化的產菌毛革蘭氏陽性細菌細胞通常表達一種或多種相容的分選酶，從而將菌毛表達在細胞表面。一般通過機械剪切、酶消化、降低或抑制SrtA活性或用干擾細胞壁完整性的化合物處理使菌毛與革蘭氏陽性細菌細胞分開。機械剪切可物理除去細胞的菌毛，而其它方法可清除菌毛的附著點(例如，通過降解細胞壁或菌毛組分)。細胞與菌毛分開后，可通過，例如離心分開菌毛與細胞。機械剪切的非限制性例子包括超聲處理、玻璃珠剪切和混合。超聲方法的討論可見，例如Yamaguchi等，2004，CurrentMicrobiol.，49:59-65。玻璃珠剪切的方法可見，例如Levesque等，2001，J.Bacterid.,183:2724-32。機械剪切的通用方法可見，例如Wolfgang等，1998，MolMicrobiol.,29:321-30;Trachtenberg等，2005，J.Mol.Biol.，346:665-676;Parge等，19卯，J.Biol.Chem.，265:2278-85;Isaacson等，1981，J.Bacteriol.，146:784-9;Korhonen等，1980，Infect.Immun.，27:569-75;Hahn等，2002，J.Mol.Biol,，323:845-57;St.Geme等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:11913-18;Weber等，2005，J.Bacteriol.，187:2458-68;禾卩Mu等，2002，J.Bacteriol.,184:4868-74。適合于酶消化的非限制性例子包括細胞壁降解酶，例如變溶菌素、溶葡萄球菌素和溶菌酶。酶消化的方法見，例如Bender等，2003，J.Bacteriol.，185:6057-66;Ton-That等，2004，Mol.Microbiol.,53:251-61;禾卩Ton-That等，2003，Mol.Microbiol.,50:1429-38。對于對象的菌毛下游給藥而言，可利用多種酶除去可導致不良宿主反應的細胞壁組分。抑制或降低SrtA活性的非限制性方法包括通過引入SrtA的功能喪失等位基因、刪除內源性SrtA基因、表達能降低SrtA表達的核酸(例如反義或miRNA)和用能抑制SrtA活性的化合物處理細胞來降低SrtA活性(參見，例如Marrafini等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，70:192-221，2006)。示范性的分選酶A抑制劑包括甲烷-硫代磺酸酯(例如，MTSET禾口(2-磺基乙基)甲烷-硫代磺酸酯)(Ton-That和Schneewind，J.Biol.Chem.，274:24316-24320，1999)，對-羥基苯甲酸汞(p-hydroxymercuribenzoicacid)，葡糖基類固醇(3-谷固醇-3-0-吡喃型葡萄糖(glucosylsterol(3-sitosterol-3-0-glucopyranol)(Kim等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，67:2477-79，2003)，鹽酸小檗堿(Kim等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，68:421-24，2004)，肽?；?重氮甲烷(LPAT-CHN2)(Scott等，Biochem.J.，366:953-58，2002)，肽?；?氯甲烷(LPAT-CH2C1)，肽?；?乙烯砜[LPAT-S02(Ph)](Conolly等，J.Biol.Chem.，278:34061-65，2003)，乙烯砜(例如，二-、乙基-、甲基-和苯基乙烯砜)(Frankel等，J.Am.Chem.Soc，126:3404-3405，2004)，亞膦酸基團取代了蘇氨酸殘基的LPXTG基序肽(例W，LPE\|/{P02H-CH2}G)(Kruger等，Bioorg.Med.Chem.，12:3723-29,2004)，取代的(Z)-二芳基-丙烯腈(Oh等，J.Med.Chem.，47:2418-21，2004)，和各種藥用植物的提取物(Kim等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，66:2751-54，2002)。干擾細胞壁完整性的化合物的非限制性例子包括甘氨酸和抗生素，例如青霉素(如，甲氧青霉素、阿莫西林、氨芐西林)、頭孢菌素(如，頭孢氨芐、頭孢丙烯、頭孢吡肟)、糖肽(如，萬古霉素、替考拉寧、雷莫拉寧)和環(huán)絲氨酸?？山柚芏龋缑芏忍荻入x心將分離的菌毛與其它組分分開。例如，可通過蔗糖梯度離心分離菌毛。含革蘭氏陽性菌毛的樣品通常因菌毛中存在不同數(shù)量的菌毛蛋白亞單位而含有分子量不同的聚合物。為降低多分散性，可通過尺寸分離含革蘭氏陽性菌毛的樣品。例如，可采用凝膠過濾或尺寸排阻柱。還可利用超濾膜降低革蘭氏陽性菌毛的多分散性。還可采用親和方法，例如親和層析分離革蘭氏陽性菌毛?？蓪⒛芘c革蘭氏陽性菌毛特異性結合的蛋白質，例如能與菌毛組分特異性結合的抗體或優(yōu)先與菌毛結合的抗體固定于固體支持物(例如，層析基材)上，使含革蘭氏陽性菌毛的樣品與固定的結合蛋白質接觸。這種親和分離方法還可用于分離、純化或富集表達革蘭氏陽性菌毛的細胞制品。還可采用本領域已知的任何其它蛋白質純化方法，例如沉淀、柱層析方法和樣品濃縮分離革蘭氏陽性菌毛。所述分離可包括，例如凝膠過濾層析、離子交換層析、反相層析或親和層析。其它方法描述于，例如Ruffolo等，1997，Infect.Immun.，65:339-43。蛋白質純化的方法詳細描述于，例如Scopes,R.K.，《蛋白質純化原理和實踐》(ProteinPurification:PrinciplesandPractice),第三版，1994，斯普林格公司(Springer),紐約。純化期間，對各部分中存在的革蘭氏陽性菌毛隨后可進行電泳(例如，聚丙烯酰胺電泳)，檢測特異性結合革蘭氏陽性菌毛的試劑(例如，抗菌毛蛋白的抗體或優(yōu)先結合菌毛的抗體)的結合情況，和/或檢測菌毛的活性，例如與蛋白質或細胞結合(活性)?？贵w本發(fā)明的革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛還可用于制備革蘭氏陽性或革蘭氏陽性菌毛蛋白的特異性抗體。在一些實施方式中，這些抗體能與寡聚或超寡聚形式的革蘭氏陽性菌毛蛋白特異性(例如，優(yōu)先)結合。本發(fā)明還包括革蘭氏陽性菌毛蛋白特異性抗體的組合，選擇這種抗體來提供抵御范圍增加的血清型和分離菌株的保護作用。本發(fā)明的革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛特異性抗體包括一個或多個生物學部分，所述生物學部分可通過化學或物理方式與革蘭氏陽性菌毛多肽某表位結合或締合。本發(fā)明的抗體包括與分離的菌毛蛋白相比，能優(yōu)先結合革蘭氏陽性菌毛的抗體。本發(fā)明包括從多克隆和單克隆抗體制品，以及以下抗體雜交(嵌合)抗體分子(參見，例如Winter等，(1991)Nature349:293-299;和美國專利號4,816,567);F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共價異質二聚體，參見，例如Inbar等(1972)ProcNatlAcadSciUSA69:2659-2662;和Ehrlich等(1980)Biochem19:4091-4096);單鏈Fv分子(sFv)(參見，例如Huston等，(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:5897-5883);二聚和三聚抗體片段構建物；小抗體(minibody)(參見，例如Pack等(1992)Biochem31:1579-1584;Cumber等(1992)JImmunology149B:120-126);人源化抗體分子(參見，例如Riechmann等(1988)Nature332:323-327;Verhoeyan等(1988)Science239:1534-1536;禾P1994年9月21日公布的美國專利公布號GB2,276,169);和從這些分子獲得的任何功能片段，其中這些片段保留親代抗體分子的免疫學結合特性。本發(fā)明還包括通過非常規(guī)方法，例如噬菌體展示獲得的抗體。本發(fā)明的抗體可以是多克隆、單克隆、重組，例如嵌合型或人源化，完全人的、非人的，例如鼠科，或單鏈抗體。制備這種抗體的方法是已知的。在一些情況中，這些抗體具有效應物功能，可固定補體。這些抗體還可與毒素、報道基團或顯影劑偶聯(lián)。在一些實施方式中，本發(fā)明的革蘭氏陽性菌毛蛋白特異性抗體是單克隆抗體。單克隆抗體包括含有均質抗體群的抗體組合物?？蓮氖罂齐s交瘤以及利用人而非鼠科雜交瘤獲得的人單克隆抗體獲得單克隆抗體。參見，例如Cote等，《單克隆抗體和癌癥治療》(MonoclonalAntibodiesandCancerT'iierapy)，AlanR.Liss，1985，第77頁。嵌合型、人源化，例如完全的人抗體對于包括反復給藥在內的應用，例如人對象的治療性治療(和一些診斷性應用)是理想的。這些抗體還可用于預防性或治療性治療革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)感染。這些抗體可阻斷革蘭氏陽性細菌對宿主細胞的粘附或一些其它活性。此外，可利用這些抗體將毒素或治療劑，例如抗生素遞送至革蘭氏陽性細菌細胞。這些抗體可用于診斷性應用，例如檢測生物學樣品中是否存在革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白?？稍\斷性使用抗-菌毛或菌毛蛋白抗體作為臨床檢驗過程的一部分來監(jiān)測組織中的該蛋白質的水平，例如測定某給定治療方案的效力。將此抗體與可檢測試劑偶聯(lián)(即，物理連接，例如直接或間接；艮P，抗體標記)可有助于檢測?？蓹z測試劑的例子包括各種酶、輔基、熒光材料、對比劑、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶和乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物的例子包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹酰氯或藻紅蛋白；對比劑的例子包括用于電子顯微鏡的電子致密材料，例如金顆粒或用于磁共振成像的磁活性材料，例如超磁鐵顆粒(supermagneticironparticles);發(fā)光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性材料的例子包括125I、mI、"S和311。這些診斷性抗體可用于檢測受感染患者中是否存在革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)的方法中，例如檢驗該患者的樣品。然后可根據(jù)有菌毛的革蘭氏陽性細菌的存在與否選擇治療方案。例如，可用抗生素治療感染了無菌毛革蘭氏陽性細菌的患者，而用菌毛結合化合物，例如抗體和/或抗炎藥(例如，IL-6或抗-TNF制劑，如抗-TNF抗體)治療感染了菌毛革蘭氏陽性細菌的患者。篩選試驗在一些方面，本發(fā)明提供鑒定調節(jié)劑的方法(本文也稱為"篩選試驗")，所述調節(jié)劑即是從能抑制革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白的活性，例如結合活性的一種或多種測試化合物(例如，抗體、蛋白質、肽、肽模擬物(peptidomimetics)、類肽、小的無機分子、小的非核酸有機分子、核酸(例如，反義核酸、siRNA、寡核苷酸或合成的寡核苷酸)、或其它藥物)中鑒定的候選化合物或試劑。如此鑒定的化合物可用于治療方案中以調節(jié)革蘭氏陽性細菌的結合或粘附活性，或闡明革蘭氏陽性菌毛的生物學功在一些實施方式中，提供試驗來篩選測試化合物以鑒定與革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白或其一部分結合的那些化合物?？梢詼y試與革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白結合的化合物的調節(jié)革蘭氏陽性菌毛的相關活性，例如粘附、感染或炎性應答的能力。可采用本領域已知的組合文庫方法中的任何方法獲得本文所述方法使用的測試化合物，包括生物學文庫；類肽文庫(具有肽官能團，但具有新型非肽骨架的分子文庫，這些分子耐受酶消化，但保留了生物活性，參見例如Zuckermann等，1994，J.Med,Chem.，37:2678-2685);空間可尋址的平行固相或液相文庫；需要去巻積(deconvolution)的合成文庫方法；"一珠一化合物(one-beadone-compound)"文庫方法；和采用親和層析篩選的合成文庫方法。生物學文庫和類肽文庫方法局限于肽文庫，而其它四種方法適用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文庫(Lam，1997，AnticancerDrugDes.，12:145)。本領域已知合成分子文庫的方法的例子，例如刊于DeWitt等，(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卯:6909;Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:11422;Zucke醒nn等，1994，J.Med.Chem,，37:2678;Cho等，1993，Science,261:1303;Carrell等，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，33:2059;Carell等，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，33:2061;禾卩Gallop等，1994，J.Med.Chem.，37:1233)?；衔镂膸炜纱嬖谟谌芤褐?例如，Houghten，1992，Biotechniques，13:412-421)，或小珠上(Lam，1991，Nature,354:82-84)，芯片上(Fodor，1993，Nature,364:555-556)，細菌(Ladner，美國專利號5,223,409),孢子(Ladner，美國專利號5,223,409)，質粒(Cull等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:1865-1869)，或噬菌體上(Scott禾卩Smith,1990，Science,249:386-390;Devlin,1990，Science,249:404-406;Cwirla等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:6378-6382;Felici，1991，J.Mol.Biol.，222:301-310;和Ladner，同上)。在一些實施方式中，所述試驗是細胞試驗，其中表達革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白或其生物學活性部分的細胞，例如細菌細胞與測試化合物接觸，通過，例如監(jiān)測細胞結合來測定該測試化合物調節(jié)革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白活性的能力。例如，所述細胞可以是哺乳動物來源，如小鼠、大鼠或人來源。所述細胞可以是上皮細胞，例如A549肺上皮細胞。可以通過，例如將化合物，如底物與放射性同位素或酶標記偶聯(lián)，從而能通過檢測復合物中的標記化合物，例如底物來測定化合物，例如底物與革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白的結合情況，從而能評估測試化合物調節(jié)革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白與配體或底物，例如細胞或蛋白質，例如血纖蛋白原、纖連蛋白或膠原結合的能力?；蛘?，可將革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白偶聯(lián)于放射性同位素或酶標記以監(jiān)測測試化合物調節(jié)復合物中革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白與底物結合的能力。例如，可用放射性同位素(例如，125I、35S、14C或311)直接或間接標記化合物(例如，革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白結合伴侶)，通過射線(radioemission)的直接計數(shù)或閃爍計數(shù)法檢測放射性同位素?；蛘撸捎?，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶等酶標記化合物，通過合適底物轉變?yōu)楫a物來檢測酶標記?？赏ㄟ^標記或不標記任何相互作用物之一來評估某化合物與革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白相互作用的能力。例如可用微型生理機能測試儀(microphysiometer)檢測化合物與革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白的相互作用，而無需標記該化合物或革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白(McConnell等，1992，Science257:1906-1912)。本文所用的"微型生理機能測試儀"(例如，Cytosenso,)是利用光可尋址電勢傳感器(LAPS)檢測細胞酸化其環(huán)境速度的分析儀器。該酸化速度的改變可用作化合物與革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白之間相互作用的標志。一些實施方式提供無細胞試驗，其中革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白或其生物學活性部分與測試化合物接觸，評估該測試化合物與革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白或其生物學活性部分結合的能力。該新試驗中使用的革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白的生物學活性部分通常包括參與與革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白分子相互作用的片段。無細胞試驗包括在足以允許耙基因蛋白和測試化合物相互作用的條件和時間下制備該兩組分的反應混合物，從而形成可以除去和/或檢測的復合物。還可采用，例如熒光能量轉移(FET)(參見，例如Lakowicz等，美國專利號5,631,169和Stavrianopoulos等，美國專利號4,868,103)檢測兩種分子之間的相互作用。選擇第一"供體"分子上的熒光團標記物，其發(fā)射的熒光能量被第二"接受"分子上的熒光標記物吸收，而該熒光標記物因吸收能量而能發(fā)出熒光?；蛘?，"供體"蛋白分子可簡單地利用色氨酸殘基的天然熒光能量。選擇的標記物應能發(fā)出不同波長的光，從而能區(qū)分"接受"分子標記物與"供體"的標記物。由于標記物之間能量轉移的效率與二分子相隔的距離有關，因而可以評估分子之間的空間關系。在二分子之間發(fā)生結合的情況中，試驗中"接受"分子標記物的熒光發(fā)射應是最大值。通過本領域熟知的標準熒光檢測裝置(例如，使用熒光計)可常規(guī)檢測FET結合情況。在一些實施方式中，可采用實時生物分子相互作用分析(BIA)(例如，Sjolander等，1991，Anal.Chem.，63:2338-2345和Szabo等，1995，Curr.Opin.Struct.Biol.，5:699-705)測定革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白與靶分子(例如，血纖蛋白原、纖連蛋白或膠原多肽或其片段)結合的能力。"表面等離振子共振"或"BIA"能實時檢測生物特異性相互作用，而無需標記任何相互作用物(例如，BIAcore)。結合后表面質量的改變(表明結合事件)導致該表面附近光的折射率改變(表面等離振子共振(SPR)的光學現(xiàn)像)，從而產生可用作生物分子之間的實時反應標志的可檢測信號。在一些實施方式中，將靶基因產物或測試物質錨定在固相上。檢測反應結束時錨定在固相上的靶基因產物/測試化合物復合物?？蓪谢虍a物錨定在固體表面，可用本文所述的可檢測標記物直接或間接標記未錨定的測試化合物?？刹捎玫鞍踪|微陣列技術將多種靶基因產物錨定在固相上，所述技術的名稱還有蛋白質芯片技術和固相蛋白質陣列技術。本領域普通技術人員熟知蛋白質微陣列技術，這些技術依據(jù)(但不限于)在固定的基材上獲得經鑒定肽或蛋白質的陣列，使靶分子或生物學成分與這些肽結合，評估這種結合。參見，例如G.MacBeath和S.L.Schreiber，"將蛋白質印刷成微陣列以進行高通量功能測定"(PrintingProteinsasMicroarraysforHigh-ThroughputFunctionDetermination),Science289(5485):1760-1763，2000。微陣列基材包括但不限于玻璃、二氧化硅、鋁硅酸鹽、硼硅酸鹽、金屬氧化物，例如氧化鋁和氧化鎳，各種粘土、硝酸纖維素或尼龍?？捎没衔锿坎嘉㈥嚵谢囊源龠M在基材上合成探針(例如，肽)?？衫门悸?lián)劑或基材上的基團將第一氨基酸共價連接于基材。本領域技術人員已知各種偶聯(lián)劑或基團?？蓪㈦奶结樦苯雍铣稍诨纳项A定的柵格中?；蛘?，可將肽探針點樣在基材上，在這種情況中，可用化合物涂布基材以促進探針與基材的結合。在這些實施方式中，以精確的預定體積和柵格的模式將預先合成的探針施加于基材，優(yōu)選利用計算機控制的機器人以接觸印刷(contact-printing)方式或非接觸印刷方式，例如噴墨或壓電遞送將探針施加于基材?？蓪⑻结樄矁r連接于基材。在一些實施方式中，一種或多種對照肽或蛋白質分子粘附于基材，對照肽或蛋白質分子能測定例如肽或蛋白質質量和結合特征，試劑質量和效力，雜交成功(率)及分析閾值和成功(率)等因素。在一些實施方式中，優(yōu)選固定革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白，抗菌毛或菌毛蛋白的抗體，或革蘭氏陽性菌毛結合蛋白(例如，抗體)以促進形成復合物的與未形成復合物的一種或多種蛋白質的分離，以及適應試驗的自動化。測試化合物與革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白的結合，或在候選化合物存在或不存在下革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白與靶分子的相互作用可以在任何適合含有反應物的容器中進行。這些容器的例子包括微量滴定板，試管和微量離心管。在一個實施方式中，可以提供融合蛋白，將其加入結構域從而能將所述蛋白質的一種或兩種結合于基質。例如，可以將谷胱甘肽-S-轉移酶/菌毛蛋白的融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉移酶/靶融合蛋白吸附到密蘇里州圣路易斯市西格瑪化學品公司的谷胱甘肽SepharoseTM珠上(SigmaChemical,St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后使之與測試化合物混合或與測試化合物和未吸附的靶蛋白或革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白混合，在有助于復合物形成的條件下(例如，生理條件的鹽和pH)培育混合物。培育后，洗滌這些珠或微量滴定板孔以除去未結合的組分，固定基質(在珠的情況中)，如上所述直接或間接測定復合物?；蛘?，可將復合物與基質解離，采用標準技術測定革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白結合或活性的水平。將革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白或結合靶標固定在基質上的其它技術包括采用生物素和鏈霉親和素的偶聯(lián)?？刹捎帽绢I域已知的技術(例如，伊利諾斯州羅克福德市皮爾斯化學品公司(PierceChemicals,Rockford，IL)的生物素化試劑盒)，從生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化的革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白或靶分子，將其固定在包被鏈霉親和素的96孔板上(皮爾斯化學品公司)。為進行這種試驗，將未固定的組分加入含有錨定組分的包被表面。反應完成后，在能將形成的任何復合物維持固定在固體表面上的條件下除去(例如，通過洗滌)未反應組分?？刹捎枚喾N方法檢測錨定在固體表面上的復合物。如果以前未固定的組分已被預先標記，則檢測到固定在表面的標記物表明復合物形成。如果以前未固定的組分未被預先標記，可利用間接標記物檢測錨定在表面的復合物；例如利用固定組分的特異性標記抗體(進而能用，例如標記的抗-Ig抗體直接標記或間接標記該抗體)。在一些實施方式中，利用與革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白或結合靶標特異性結合，但不干擾革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白與其靶標結合的抗體實施該試驗?？蓪⑦@些抗體衍生后固定到平板的各孔上，未結合的靶標或革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白通過抗體偶聯(lián)而截留在各孔中。除上述GST-固定復合物的那些檢測方法外，檢測這些復合物的方法包括利用革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白或靶分子的反應性抗體免疫檢測復合物，以及依賴檢測革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白或耙分子相關酶活性的酶聯(lián)試驗。在一些實施方式中，可在液相中進行無細胞試驗。在這種試驗中，可通過各種標準技術分開反應產物與未反應的組分，所述技術包括但不限于差速離心(例如，Rivas等，1993，TrendsBiochem.Sci.，18:284-287);層析(凝膠過濾層析、離子交換層析)；電泳(例如，Ausubel等編，，1999，《分子生物學最新方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),J.W公司(J.Wiley):紐約)；和免疫沉淀(例如，Ausubel等編，1999，《分子生物學最新方法》，J.W公司紐約)。本領域技術人員已知這些樹脂和層析技術(例如，Heegaard，1998，J.Mol.Recognit，11:141-148禾口Hage等，1997，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.，699:499-525)。此夕卜，還可方便地采用本文所述的熒光能量轉移來檢測結合情況而無需從溶液中進一步純化復合物。在一些實施方式中，所述試驗包括使革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白或其生物學活性部分與結合革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白的已知細胞或化合物(例如，蛋白質)接觸以形成試驗混合物，使該試驗混合物與測試化合物接觸，測定該測試化合物影響革蘭氏陽性菌毛或革蘭氏陽性菌毛蛋白與該細胞或化合物結合的能力。在一些實施方式中，表達肺炎鏈球菌菌毛的細菌細胞的結合試驗包括培育表達肺炎鏈球菌菌毛的細菌細胞與A549肺上皮細胞，洗滌以除去未粘附的細菌細胞后，檢測粘附的細菌細胞。可通過本領域已知的任何方法，例如檢測抗體與粘附細菌細胞的結合情況或裂解上皮細胞，計數(shù)相關細菌細胞的數(shù)目來檢測細菌的粘附情況。HEP2細胞、CHO細胞或HeLa細胞也可用于表達肺炎鏈球菌菌毛的細菌細胞結合試驗中。免疫原性組合物包含革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛的本發(fā)明免疫原性組合物還可包含一種或多種抗原性試劑。示范性抗原包括下述那些。此外，可用本發(fā)明組合物治療或預防任何下述微生物或相關微生物所致的感染。用于免疫原性組合物的抗原包括但不限于以下所列的一種或多種，或衍生自以下所列一種或多種的抗原—輔微腦膜炎奈瑟球菌(W.mem'"gZ"cfes):腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135、Y和/或B(l-7)的蛋白質抗原；腦膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜囊泡(OMV)制品(8、9、10、11);腦膜炎奈瑟球菌血清群A、B、C、W135和/或Y的糖抗原，包括LPS，例如血清群C的寡糖(參見，PCT/US99/09346;PCTIB98/01665;和PCTIB99/00103);肺炎鏈球菌糖或蛋白質抗原，特別是肺炎鏈球菌的糖或PhtD的蛋白質或抗原性肽(BVH-ll-2，SP1003，spr0907)(Adamou等，Infect.Immun.，69:949-53，2001;Hamel等，Infect.Immun.，72:2659-70，2004);PhtE(BVH-3，SP1004，spr0908)(Adamou等，Infect.Immun.，69:949-53，2001;Hamel等，Infect.Immun.，72:2659-70，2004);PhtB(PhpA，BVH-ll，SP1174,sprl060)(Adamou等，Infect.Immun.，69:949-53，2001;Zhang等，Infect.Immun.，69:3827-36，2001;Hamel等，Infect.Immun.，72:2659-70，2004);PhtA(BVH-ll-3，SP1175,sprl061)(Adamou等，Infect.Immun.，69:949-53，2001;Wizemann等，Infect.Immun.，69:1593-98，2001;Zhang等，Infect.Immun.，69:3827-36，2001;Hamel等，Infect.Immun.，72:2659-70，2004);NanA(SP1693,sprl536)(Tong等，Infect.Immun.，73:7775-78，2005);SP1872(sprl687)(Brown等，Infect.Immun,，69:6702-06，2001);PspC(CbpA，SP21卯，sprl995KOgunniyi等，Infect.Immun.，69:5997-6003，2001);PspA(SP0177,spr0121，spr1274)(Briles等，Vaccine,19:S87-S95，2001);SP0498(spr0440);LytB(SP0965，spr0867)(Wizemann等，Infect.Immun.，69:1593-98，2001);AliB(SP1527，sprl382);PpmA(SP0981，spr0884)(Overweg等，Infect.Immun.，68:4180-4188，2000);LytC(SP1573，sprl431)(Wizemann等，Infect.Immun.,69:1593-98，2001);PsaA(Briles等，Vaccine,19:S87-S95，2001);PdB(Ogunniyi等，Infect.Immun.，69:5997-6003，2001);RPhp(Zhang等，Infect.Immun.，69:3827-36，2001);PiuA(Jomaa等，Vaccine,24:5133-39，2006);PiaA(Jomaa等，Vaccine,24:5133-39,2006);6PGD(Daniely等，Clin.Exp.Immunol.,144:254-263，2006);或PppA(Green等，Infect.Immun.，73:981-89，2005);無乳鏈球菌特別是B群鏈球菌抗原；釀膿鏈球菌特別是A群鏈球菌抗原；糞腸球菌或屎腸球菌特別是美國專利號6,756,361提供的三糖重復或其它腸球菌衍生抗原；幽門螺桿菌包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原；百日咳博德特菌(50^^&/&;eWMM/力例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，任選還與百日咳桿菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3抗原混合；金黃色葡萄球菌包括任選與無毒重組銅綠假單胞菌(i^e^/omo"w。w"g/m^0外毒素A偶聯(lián)的5型和8型金黃色葡萄球菌莢膜多糖，例如StaphVAXTM，或衍生自表面蛋白質的抗原，侵染素(殺白細胞素、激酶、透明質酸酶)，抑制吞噬細胞吞噬作用的表面因子(莢膜，A蛋白)，類胡蘿卜素，過氧化氫酶產生，A蛋白，凝固酶，凝血因子，和/或裂解真核細胞膜的膜破壞性毒素(任選脫毒的)(溶血素、白細胞毒素、殺白細胞素)；表皮葡萄球菌特別是表皮葡萄球菌黏液相關抗原(SAA);腐生性葡萄球菌(Sto//y^ococcwm/^o;/^/cw力(導致尿道感染)特別是腐生性葡萄球菌抗原的160kDa血凝素；銅綠假單胞菌特別是內毒素A、Wzz蛋白、銅綠假單胞菌LPS、更尤其是從PAOl(05血清型)分離的LPS;和/或外膜蛋白，包括外膜蛋白F(OprF)(InfectImmun.2001年5月；69(5):3510-3515);炭疽桿菌(5flc/〃wa"Amc/"(炭疽)例如A-組分(致死因子(LF)和水腫因子(EF))的炭疽桿菌抗原(任選脫毒的)，二者可以共有稱為保護性抗原(PA)的B-組分；粘膜炎莫拉菌(Moraxe〃acaf^t/za//":(呼吸道)包括外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS;鼠疫耶爾森菌(7e"/"/apw他)(鼠疫)例如Fl莢膜抗原(InfectImmun.，2003年1月；71(1):374-383)，LPS(InfectImmun.1999年10月；67(10):5395)，鼠疫耶爾森菌V抗原(InfectImmun.1997年11月;65(11):4476-4482);小腸結腸炎耶爾森菌(ye"/m'fle"^oco/Z"ca)(胃腸病原體)特別是LPS(InfectImmun.2002年8月；70(8):4414);假結核耶爾森菌(7e"/m'a/wewflfo^6ercw/ow'力胃腸病原體抗原；結核分枝桿菌(M;/co6a"e/^m化6en:w/ow力例如脂蛋白、LPS、BCG抗原、抗原85B(Ag85B)和/或ESAT-6的融合蛋白，任選配制在陽離子脂質載體中(InfectImmun,2004年10月;72(10):6148)，結核分枝桿菌(Mtb)異檸檬酸脫氫酶相關抗原(ProcNatlAcadSciUSA.2004年8月24日；101(34):12652)，和/或MPT51抗原(InfectImmun.2004年7月；72(7):3829);嗜肺性軍團病桿菌(丄^/0^//";7"e,o;Ma)(軍團病)嗜肺性軍團病桿菌抗原-任選衍生自含破壞的osc/基因的細胞系(InfectImmun.1998年5月；66(5):1898);立克次體(//cA:eto/a):包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)(BiochimBiophysActa.2004年11月1日；1702(2):145)，LPS和表面蛋白抗原(SPA)(JAutoimmun.1989年6月；2增刊:81);大腸桿菌(五.包括腸毒性大腸桿菌(ETEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAggEC)、彌散性粘附性大腸桿菌(diffuselyadheringE.coli)(DAEC)、腸病原性(enter叩athogenic)大腸桿菌(EPEC)和/或腸出血性(enterohemorrhagic)大腸桿菌(EHEC)的抗原；霍亂弧菌(^n'oc/zo/erae):包括蛋白酶抗原，LPS,特別是霍亂弧菌II的脂多糖，01InabaO-特異性多糖，霍亂弧菌0139，IEM108疫苗的抗原(InfectImmun.2003年10月;71(10):5498-504)和/或緊密連接毒素(Zot);傷寒沙門菌(^^0"6/^0^"')(傷寒熱)包括莢膜多糖，優(yōu)選偶聯(lián)物(Vi，即vax-TyVi);鼠傷寒沙門菌0^/附0恥//"(胃腸炎)從其衍生的抗原考慮可用于微生物和癌癥治療，包括flk的血管生成抑制和調節(jié)；單核細胞增多性利斯特菌("We〃'awo"oc^oge"e力(免疫受損或老年人中的全身性感染，胎兒感染)衍生自單核細胞增多性利斯特菌的抗原優(yōu)選用作運胞質內遞送本發(fā)明偶聯(lián)物/締合組合物的載體/載體；牙齦卟啉單孢菌(尸o^/^omowwg/"g/vafc):特別是牙齦卟啉單孢菌外膜蛋白(OMP);破傷風例如破傷風類毒素(TT)抗原，優(yōu)選用作結合/偶聯(lián)本發(fā)明組合物的運載體蛋白；白喉例如白喉類毒素(如CRMm)，此外考慮將能調節(jié)、抑制ADP核糖基化或與之結合的抗原與本發(fā)明組合物聯(lián)用/共同給藥/偶聯(lián)，所述白喉類毒素可用作運載體蛋白；博氏疏螺旋體CSo廳e/Z"6w^/or/en')(萊姆病)例如P39和P13(膜內在蛋白，InfectImmun.2001年5月；69(5):3323-3334)，VisE抗原性變異蛋白質(J.Clin.Microbiol.1999年12月；37(12):3997)的相關抗原；乙型流感嗜血桿菌(/Zflewo;/zz7w/"y/we"zae):例如其糖抗原；克雷伯菌(尺/e6wW/fl):例如OMP，包括OMPA，或任選與破傷風類毒素偶聯(lián)的多糖；淋病奈瑟球菌(7Ve&^r/ago"o^r/zoeae):包括Por(或膜通道蛋白)蛋白，例如PorB(參見Zhu等，Vaccine(2004)22:660-669)，轉移結合蛋白，例如TbpA和TbpB(參見Price等，InfectionandImmunity(2004)71(1):277誦283)，混濁蛋白(例如Opa)，可還原修飾的蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制品(參見Plante等，JInfectiousDisease(2000)182:848-855)，還可參見，例如W099/24578,W099/36544,WO99/57280,WO02/079243);肺炎衣原體(C7^m;^/a/wewmom'ae):特別是肺炎衣原體蛋白抗原；砂眼衣原體(C/z/am;^afrac/wwa^):包括衍生自血清型A、B、Ba和C(砂眼致病因子，致盲的原因)，血清型L!、L2和L3(與性病淋巴肉芽腫(Z^m;AogAYmw/owflfve"erewm)有關)禾口血清型D-K的抗原；蒼白密螺旋體(7V印o"ewapa〃/^m)(梅毒)特別是TmpA抗原；和杜克雷嗜血桿菌(Z/aemo;Mw^c^y/)(導致軟性下疳)包括外膜蛋白(DsrA)。如果未專門述及，本發(fā)明的其它細菌抗原可以是任何上述的莢膜抗原、多糖抗原或蛋白質抗原。其它細菌抗原還可以包括外膜囊泡(OMV)制品。此外，抗原包括活的、減毒的和/或純化的任何上述細菌。本發(fā)明的細菌或微生物衍生抗原可以是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性的以及需氧或厭氧的。此外，任何上述細菌衍生的糖(多糖，LPS、LOS或寡糖)可以偶聯(lián)于另一物質或抗原，例如運載體蛋白(如，CRM197)。這種偶聯(lián)可以是通過還原胺化糖上的羰基部分而實現(xiàn)與蛋白質上的氨基直接偶聯(lián)，例如美國專利號5,360,897和Ca"J5/oc/zemCe〃SZo/.1984年5月；62(5):270-5中所述?；蛘?，糖可以經接頭，例如琥珀酰胺或《生物偶聯(lián)技術》(BioconjugateTechniques),1996和CRC，《蛋白質偶聯(lián)和交聯(lián)化學》(ChemistryofProteinConjugationandCross-Linking),1993中提供的其它連接鍵偶聯(lián)。瘋毒貧嚴流感病毒(/"/"e"Zfl):包括完整的病毒顆粒(減毒的)、裂解的或含有血凝素(HA)和/或神經氨酸酶(NA)表面蛋白的亞單位，流感抗原可以衍生自雞胚或用細胞培養(yǎng)物增殖，和/或流感抗原衍生自甲、乙和/或丙型流感(病毒)，等等；呼吸道合胞體病毒(RSV):包括RSV的A2毒株的F蛋白(JGenVirol.2004年ll月；85(11部分):3229)和/或G糖蛋白；副流感病毒CParaf"y7wewzawVtw)(PIV):包括1、2和3型PIV，優(yōu)選含有血凝素、神經氨酸酶和/或融合糖蛋白；脊髓灰質炎病毒(/>0//0^>7):包括小RNA病毒科的抗原，優(yōu)選脊髓灰質炎病毒抗原，例如OPV，或優(yōu)選IPV;麻疹病毒(Afe似/w):包括任選與Protollin混合的裂解麻疹病毒(MV)抗原和/或MMR疫苗中存在的抗原；腮腺炎病毒(Mwm/w):包括MMR疫苗中存在的抗原；風疹病毒(7^^//。)包括MMR疫苗中存在的抗原以及登革熱病毒在內的披膜病毒科(rogav/nWae)的其它抗原；狂犬病病毒(/aW"):例如凍干的滅活病毒(RabAvertTM);黃病毒科病毒(F/flv/wWcfeev/nwes):例如(和從中衍生的抗原)黃熱病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒(l、2、3或4型)、蜱傳腦炎病毒和西尼羅病毒；杯狀病毒科(<^//(^>油6):其抗原；HIV:包括HIV-1或HIV-2毒株抗原，例如gag(p24gag和p55gag)、env(gpl60禾口gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、小蛋白(miniprotein)(優(yōu)選p55gag和gpl40v缺失)和分離株HIVmb、HIVSF2、HIVLAV、HIVlav、HIV固、HIV-1CM235、HIV-1US4、HIV-2;猿免疫缺陷病毒(STV)等的抗原；輪狀病毒(7otov/ms):包括VP4、VP5、VP6、VP7、VP8蛋白(ProteinExprPurif.2004年12月；38(2):205)和/或NSP4;鼠疫病毒(尸eW/v/ri^):例如經典豬熱病毒(classicalporcinefevervirus)、牛病毒性腹瀉病毒和/或邊境病病毒的抗原；細小病毒(尸arvov/rws):例如細小病毒B19;冠狀病毒(CorwwWn^):包括SARS病毒抗原，特別是其刺突蛋白或蛋白酶，以及WO04/92360所包括的抗原；甲型肝炎病毒例如滅活的病毒；乙型肝炎病毒例如表面禾n/或核心抗原(sAg)以及前表面序列(presurfacesequences),pre-Sl和pre-S2(以前稱為pre-S)，以及上述的組合，例如sAg/pre-Sl、sAg/pre-S2、sAg/pre-Sl/pre-S2禾卩pre-Sl/pre-S2，(參見，例如AHBV《疫苗-人疫苗和疫苗接種》(Vaccines-HumanVaccinesandVaccination),第159-176頁；和美國專利號4,722,840，5,098,704，5,324,513;Beames等，J.Virol.(1995)69:6833-6838;Birabaum等，J.Virol(1990)64:3319-3330;禾BZhou等，J.Virol.(1991)65:5457-5464);丙型肝炎病毒例如E1、E2、E1/E2(參見Houghton等，Hepatology(1991)14:381)、NS345多蛋白、NS345-核心多蛋白、核心、和/或非結構區(qū)的肽(國際公布號WO89/04669;WO90/11089和WO90/14436);丁型肝炎病毒(HDV):其衍生的抗原，特別是HDV的S抗原(參見，例如美國專利號5,378,814);戊型肝炎病毒(HEV):其衍生的抗原；己型肝炎病毒(HepatitisGvirus)(HGV):其衍生的抗原；水痘帶狀皰疹病毒(Farc/ce〃azoWerWn^):衍生自水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的抗原(J.Gen.Virol(1986)67:1759);E-B病毒衍生自EBV的抗原(Baer等，Nature(1984)310:207);巨細胞病毒CMV抗原，包括gB和gH(《巨細胞病毒》(Cytomegaloviruses)(J.K.McDougall編，S-V公司(Springer-Verlag)，1990)第125-169頁)；單純皰疹病毒包括HSV-1或HSV-2毒株的抗原和糖蛋白gB、gD和gH(McGeoch等，J.Gen.Virol.(1988)69:1531和美國專利號5，171，568);人皰疹病毒衍生自其它人皰疹病毒，例如HHV6和HHV7的抗原；和HPV:包括人乳頭瘤病毒(HPV)相關的或衍生的抗原，例如E1-E7、Ll、L2及其融合物中一種或多種，特別是本發(fā)明的組合物可包含病毒樣顆粒(VLP)，該顆粒含有L1主要衣殼蛋白，更具體地說，HPV抗原具有抗HPV血清型6、11、16和/或18中一種或多種的保護作.用。還提供了包括在《疫苗》(Vaccines),第4版(Plotkin和Orenstein編，2004);《醫(yī)學微生物》(MedicalMicrobiology),第4版(Murray等編，2002);《病毒學》(Virology),第3版(W.K.Joklik編，1988);《基礎病毒學》(FundamentalVirology),第2版(B.N.Fields和D.M,Knipe編，1991)中的抗原、組合物、方法和微生物，考慮可將它們與本發(fā)明組合物聯(lián)用。此外，抗原包括活的、減毒的、裂解的和/或純化的任何上述病毒。凝綠本文所用的與疫苗相結合的真菌抗原包括以下文獻所述的那些抗原美國專利號4,229,434和4,368,191，用于預防和治療須發(fā)癬菌(7Wc/zop/^o"me"togro;/z;;^s)所致的毛癬菌病(trich叩ytosis);美國專利號5,277,904和5,284,652，用于預防動物，例如豚鼠、貓、家兔、馬和羊羔中皮膚真菌感染的廣譜皮膚真菌疫苗，這些抗原包含有效量的殺傷馬發(fā)癬菌(r.e《m>n^)、須發(fā)癬菌(顆粒狀變種(var.granulare))、犬小孢子菌(Mc朋/"和/或石膏樣小孢子菌(Mgy;wewn)的混懸液，其任選與佐劑混合；美國專利號5,453,273和6,132,733，用于包含有效量的均質、甲醛殺傷真菌的癬疫苗，即運載體培養(yǎng)的犬小孢子菌培養(yǎng)物；美國專利號5,948,413，其包括用于腐霉病(pythiosis)的胞外和胞內蛋白質?？拐婢呙缰需b定的其它抗原包括RingvacbovisLTF-130禾卩Bioveta。此外，本文所用的真菌抗原可衍生自皮膚真菌，包括絮狀表皮癬菌(五/^Wermo/一owyoccz^s騰)、頭癬小孢子菌(M/cms770r讓flwdoM/"/)、犬小孢子菌、扭曲小孢子.菌(Af/cro57oramcfc/oWwm)、馬小孢子菌(M"/crc^/orwme,'"膽)、石膏樣小孢子菌、矮小孢子菌(M'CT05/7W謂Wfif"謂)、同心發(fā)癬菌(7Wc/zo//z,wco"ce"Wc)、馬發(fā)癬菌、雞發(fā)癬菌(7Wc/zop一owga〃/朋e)、石膏樣發(fā)癬菌(7Wc/20//^to"gy;wew附)、麥格發(fā)癬菌(7Wc/o//y^o"附eg"/"/)、須發(fā)癬菌、昆克努發(fā)癬菌(7Wc/zo;/^^w《w/wcA;eflwwm)、紅色發(fā)癬菌(7Wc/zo/一own/6nw2)、舍恩萊發(fā)癬菌(JWc/zo/一o"5r/oew/e〖"/)、斷發(fā)癬菌(7Wc/20/7一ow加swra朋)、疣狀發(fā)癬菌(7Wc/op一owvem/C(W,)、疣狀發(fā)癬菌album變禾中(var.album)、discoides變禾中(var.discoides)、ochraceum變禾中(var.ochraceum)、堇色發(fā)癬菌(7Wc/zo/A^owv/otoceww)和/或蜜塊狀發(fā)癬菌可用作抗原或可獲得抗原與本發(fā)明組合物聯(lián)用的真菌病原體包括煙曲霉(J5/erg/〃ws/扁/g齒s)、黃曲霉(A;erg〃/M、黑曲霉045/erg〃/"51m'ger)、構巢曲霉(v45^erg〃/w51m'c^/fl/w)、土曲霉(^5/erg/〃wj1fe^reiw)、聚多g/flwciw)、頭狀芽生裂殖酵母C8/oytoyc/z/zcwy;cescap"fl^s)、白色念珠菌(Omc/Waa/6/ca"s)、烯醇酶假絲酵母(Omc/Waewo/awe)、熱帶念珠菌(Ca"&Wa^"op/c"/")、光滑念珠菌(Ca"c/Wflg7o6n3M)、克魯斯念珠菌(Ca"力WaArww/)、近平滑念珠菌(C""d油戸a戶7肌'力、類星形念珠菌(Cfl"<^/a他〃a加Wea)、克魯斯念珠菌、(Ca"J油戸raA^se/)、葡萄牙念珠菌(Ca"c/油/wwY薩'fle)、假熱帶念珠(Om力Wa戸ew^/o^o;/cato)、吉利蒙德念珠菌(am&Wag"〃//ermom//)、卡里翁分支孢子菌(C7ado5^on'謹c"m'om7)、茅且球孢子菌(Cocc/cZ/ofcfey/mm〖"s)、皮炎芽生菌CS/asomycesi/^vna"d/s)、新型^^球菌(Oj/^ococcwsweo/brwa;w)、棒地霉(GeoWc/zwmc/av她m)、夾膜組織胞漿菌(歷s鄉(xiāng)/fljwaca/ww/C訓)、巴西芽生菌CPfln3coccWo/i/"6m57'/,e肌'51)、卡氏月市囊蟲(尸wewwocjAS"scaWm7)、(尸j^/z/wmw/"wW/cwmw)、瓶形酵母(尸;Xvro5^o;-"wova/e)、酉良酒酵母OSac/wromycescerev/犯e)、布,立第酵母菌(iSacc/zai-omycesZ)ow/aW,)、粟酒裂殖酵母(Sacc/^om戸s;owZe)、尖端賽多孢子菌(Sce^w;on'wmap/(w/erwm)、申克(氏)孢子絲菌(SporoAWxsc/ze"ch7)、白色毛抱子菌(7Wc/7cw/7orow6e/ge/")、鼠弓形體(7bxo//a，ago"A7)、馬尼弗(氏)青霉菌(尸6"/"'〃/"附marwej^e0、鱗夢王霉屬(Malasseziaspp.)、產色芽生菌屬(Fonsecaeaspp.)、萬吉拉菌屬(Wangiellaspp.)、孢子絲菌屬(Sporothrixspp.)、擔子菌團屬(Basidiobolusspp.)、耳霉屬(Conidiobolusspp.)、根霉菌屬(Rhizopusspp)、毛霉屬(Mucorspp)、犁頭霉屬(Absidiaspp)、被孢霉屬(Mortierellaspp)、小克銀漢霉屬(Cunninghamellaspp)禾口瓶霉屬(Saksenaeaspp)。可獲得抗原的其它真菌包括鏈格孢屬(Alternariaspp)、彎孢霉屬(Curvulariaspp)、長蠕孢屬(Helminthosporiumspp)、鐮孢菌屬(Fusariumspp)、曲霉菌屬(Aspergillusspp)、青霉菌屬(Penicilliumspp)、褐腐病菌屬(Monoliniaspp)、絲核菌屬(Rhizoctoniaspp)、擬青霉屬(Paecilomycesspp)、皮司霉屬(Pithomycesspp)禾口分支孢子菌屬(Cladosporiumspp)。本領域熟知制備真菌抗原的方法(參見美國專利號6,333,164)。在一些實施方式中，提取溶解組分，將其與真菌細胞的不可溶組分分開，其中基本上除去或至少部分除去了細胞壁，該方法的特征在于包括獲得活的真菌細胞；獲得基本上除去或至少部分除去細胞壁的真菌細胞；使基本上除去或至少部分除去細胞壁的真菌細胞破裂；獲得不可溶組分；和提取溶解的組分并將其與不可溶組分分開。即拔嚴在一些實施方式中，可實施本發(fā)明組合物和方法以抵御的微生物(細菌、病毒和/或真菌)包括導致性傳播疾病(STD)的那些和/或在其表面展示抗原的那些微生物，所述抗原可以是本發(fā)明的靶標或抗原組合物。在一些實施方式中，組合物可與衍生自病毒或細菌STD的抗原混合。可將衍生自細菌或病毒的抗原與本發(fā)明組合物聯(lián)合給予以提供抵御以下STD中至少一種的保護作用衣原體、生殖器皰疹、肝炎(特別是HCV)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或軟性下疳(參見，例如WO00/15255)。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物與抗原共同給予以預防或治療STD。衍生自上文詳述的以下STD相關病毒的抗原與本發(fā)明組合物共同給予肝炎(病毒)(特別是HCV)、HPV、HIV或HSV。此外，衍生自上文詳述的以下STD相關細菌的抗原與本發(fā)明組合物共同給予淋病奈瑟球菌、肺炎衣原體(C/z/amj^/ap"ewmo"/ae)、砂眼衣原體、蒼白密螺旋體或杜克雷嗜血桿菌。呼吸道抗原在一些實施方式中，革蘭氏陽性(例如肺炎鏈球菌)菌毛抗原是呼吸道抗原，其可用于預防和/或治療呼吸道病原體所致感染，特別是通過降低或防止感染和/或呼吸道病毒感染的一種或多種癥狀來預防和/或治療的免疫原性組合物中，所述病原體包括病毒、細菌或真菌，例如呼吸道合胞體病毒(RSV)、PIV、SARS病毒、流感(病毒)、炭疽桿菌。包含本文所述抗原(例如衍生自呼吸道病毒、細菌或真菌的抗原)的組合物可與本發(fā)明組合物聯(lián)合給予具有接觸特定呼吸道微生物危險或感染了呼吸道病毒、細菌或真菌的個體?？蓪⒈景l(fā)明組合物與呼吸道病原體的抗原在同一時間或同一制劑中共同給予。給予組合物導致呼吸道感染的發(fā)病率和/或一種或多種癥狀的嚴重程度降低。兒科/老年人抗原在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物可與一種或多種治療兒科人群的抗原，例如兒科抗原聯(lián)用。在一些實施方式中，兒科人群中對象的年齡小于約3歲，或小于約2歲，或小于約1歲。在一些實施方式中，兒科抗原(與本發(fā)明組合物聯(lián)用)在至少l、2或3年間給予多次。在一些實施方式中，本發(fā)明組合物可與一種或多種治療老年人群的抗原，例如老年人抗原聯(lián)用。在一些實施方式中，老年人群中對象的年齡大于50、55、60、65、70或75歲。將微可與本發(fā)明組合物聯(lián)用的其它抗原包括醫(yī)院獲得性(醫(yī)院的)相關抗原。在一些實施方式中，考慮聯(lián)用寄生蟲抗原與本發(fā)明組合物。寄生蟲抗原的例子包括衍生自致病(包括但不限于瘧疾和/或萊姆病)生物的那些抗原。在一些實施方式中，可與本發(fā)明組合物聯(lián)用的抗原與蚊子傳播的疾病有關和/或能有效抵御該疾病。在一些實施方式中，可與本發(fā)明組合物聯(lián)用的抗原與腦炎有關和/或能有效抵御腦炎。在一些實施方式中，可與本發(fā)明組合物聯(lián)用的抗原與神經系統(tǒng)感染有關和/或能有效抵御神經系統(tǒng)感染。在一些實施方式中，可與本發(fā)明組合物聯(lián)用的抗原是可經血液或體液傳播的抗原。微娜本發(fā)明的一些方面提供制備吸附抗原的微粒的方法。該方法包括(a)將含有以下成分的混合物分散來提供乳液(i)水，(ii)洗漆劑，(iii)有機溶劑和(iv)生物可降解的聚合物，所述聚合物選自聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。與有機溶劑相比，混合物中存在的所述聚合物濃度通常約1%-約30%，而根據(jù)洗滌劑-聚合物的重量比，混合物中存在的洗滌劑通常約為O.OOOOl:l-約0.1:1(更常見是約0.0001:1-約0.1:1，約O.OOl:l-約0.1:1，或約0扁:l-約0.1:1);(b)除去乳液中的有機溶劑；和(c)將抗原吸附到微粒表面。在一些實施方式中，與有機溶劑相比，所述生物可降解聚合物的存在濃度是約3%-約10%。在一些實施方式中，可以用可滅菌、無毒和生物可降解的材料制備本文所用的微粒。這些材料包括但不限于聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。在一些實施方式中，本發(fā)明所用的微?？稍醋跃?a-羥酸)，特別是聚(丙交酯)("PLA")或D,L丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)("PLG"或"PLGA")或D,L-丙交酯和己內酯的共聚物。微粒可源自分子量不同的任何聚合起始材料，以共聚物，例如PLG為例，各種丙交酯:乙交酯的比例(其選擇在很大程度上是個選擇問題)部分取決于共同給予的大分子。下文將更詳細地討論這些參數(shù)。其它抗原還包括外膜囊泡(OMV)制品。還可將抗原吸附到各種革蘭氏陽性細菌的肽聚糖上以制備革蘭氏陽性增強基質(GEM)顆粒，如Bosma等(Appl.Env.Microbiol.，72:880-889，2006)所述，該篇文獻的內容全文納入本文以供參考。該方法依賴于將LysM基序(Buist等，J.Bact.，177:1554-63，1995;Bateman和Bycroft，J.MoI.Biol.，299:1113-19，2000)非共價結合于酸處理細胞的細胞壁肽聚糖。簡言之，將與一個或多個LysM基序相連的多肽抗原(例如，非共價或共價相連，如作為融合蛋白或通過偶聯(lián))加入酸處理的革蘭氏陽性細菌?？乖囊愿哂H和力結合，其可用于免疫原性組合物中。這些方法所用的示范性酸包括三氯乙酸(例如，0.1%-10%)、乙酸(例如，5.6M)、HC1(例如，0.01M)、乳酸(例如，0.72M)和甲酸(例如，0.56M)。美國專利序列號09/581,772提供了其它配制方法和抗原(特別是腫瘤抗原)。貧嚴參考以下參考文獻包括可與本發(fā)明組合物聯(lián)用的抗原，這些參考文獻各自專門全文納入以供參考國際專利申請W099/24578國際專利申請W099/36544.國際專利申請WO99/57280.國際專利申請WO00/22430.Tettelin等，(2000)Science287:1809-1815.國際專利申請W096/29412.Pizza等，(2000)Science287:1816-1820.PCTWO01/52885.Bjune等，(1991)Lancet338(8775).Fuskasawa等，(1999)Vaccine17:2951-2958.Rosenqist等，(1998)Dev.Biol.Strand92:323-333.Costantino等，(1992)Vaccine10:691-698.Costantino等，(1999)Vaccine17:1251-1263.Watson(2000)PediatrInfectDisJ19:331-332.Rubin(20000)PediatrClinNorthAm47:269-285，v.Jedrzejas(2001)MicrobiolMolBiolRev65:187-207.2001年7月3日提交的國際專利申請，要求GB0016363.4;WO02/02606;PCTIB/01/00166的優(yōu)先權.Kalman等，(1999)NatureGenetics21:385-389.Read等，(2000)NucleicAcidsRes28:1397-406.Shirai等，(2000)J.Infect.Dis181(增刊3):S524-S527.國際專利申請WO99/27105.國際專利申請WO00/27994.國際專利申請WO00/37494.國際專利申請W099/28475.Bell(2000)PediatrInfectDisJ19:1187-1188.Iwarson(1995)APMIS103:321-326.Gerlich等，(1990)Vaccine8增刊:S63-68和79-80.Hsu等，(1999)ClinLiverDis3:卯1-915Gastofsson等，(1996)N.Engl.J.Med.334-:349-355.Rappuoli等，(1991)TIBTECH9:232-238.《疫苗》(Vaccines)(1988)Plotkin和Mortimer編,ISBN0-7216-1946-0,DelGuidice等，(1998)MolecularAspectsofMedicine19:1-70.國際專利申請WO93/018150.國際專利申請WO99/53310.國際專利申請WO98/04702.Ross等，(2001)Vaccine19:135-142.Sutter等，(2000)PediatrClinNorthAm47:287-308.Zimmerman和Spann(1999)AmFanPhysician59:113-118，125-126.Dreensen(1997)Vaccine15增刊"S2-6.MMWRMorbMortalWHyrep1998年1月16:47(1):12，9.McMichae1(2000)Vaccine19增刊I:SIO1-107.Schuchat(1999)Lancet353(9146):51-6.英國專利申請0026333.5，0028727.6和0105640.7.Dale(1999)InfectDisclinNorthAm13:227-43，viii.Ferretti等，(2001)PNASUSA98:4658-4663.Kuroda等，(2001)Lancet357(9264):1225-1240;還參見第1218-1219頁.Ramsay等，(2001)Lancet357(9251):195-196.Lindberg(1999)Vaccine17增刊2:S28-36.Buttery禾口Moxon(2000)JRCoilPhysiciansLong34:163-168.Ahmad和Chapnick(1999)InfectDisClinNorthAm13:113-133，vii.Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47:663-567.歐洲專利0477508.美國專利號5,306,492.國際專利申請W098/42721.《偶聯(lián)疫苗》(ConjugateVaccines)(Cruse等編)ISBN3805549326，特別是第10:48-114巻.Hermanson(1996)《生物偶聯(lián)技術》(BioconjugateTechniques)ISBN:012323368和012342335X.歐洲專利申請0372501.歐洲專利申請0378881.歐洲專利申請0427347.國際專利申請W093/17712.國際專利申請W098/58668.歐洲專利申請0471177.國際專利申請WOOO/56360.國際專利申請WO00/67161.融合蛋白本發(fā)明所用的革蘭氏-陽性(例如，肺炎鏈球菌)蛋白在組合物中可作為單獨分開的多肽存在。在一些實施方式中，這些抗原的至少兩種(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18種)表達為含菌毛亞單位的一條多肽鏈("雜交"或"融合"多肽)。這些融合多肽主要提供兩個優(yōu)點第一，本身不穩(wěn)定或表達不佳的多肽可通過加入合適的融合伴侶而克服這些問題；第二，由于只需進行一次表達和純化即可產生均可用作抗原的兩種多肽，從而簡化了商品化生產。融合多肽可含有一種或多種革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛多肽序列。因此，本發(fā)明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的一種或多種融合肽，其中所述第一和第二氨基酸序列選自革蘭氏陽性菌毛蛋白或其片段。在一些實施方式中，融合多肽中的第一和第二氨基酸序列包含同一蛋白質的不同表位。在一些實施方式中，本發(fā)明提供含有兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種抗原的氨基酸序列的雜交體(或融合體)。在一些實施方式中，本發(fā)明提供包含兩種、三種、四種或五種抗原的氨基酸序列的雜交體?？蓪⒉煌碾s交多肽一起混合在一種制劑中。在這些組合中，革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛序列可以存在于多種雜交多肽中和/或以非雜交多肽存在。在一些實施方式中，抗原可以雜交體或非雜交體存在，但二者不能同時存在。雜交多肽可如式NH2-A+X-L-^-B-COOH所示，其中X是革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛蛋白或其片段的氨基酸序列；L是任選的接頭氨基酸序列；A是任選的N-末端氨基酸序列；B是任選的C-末端氨基酸序列；和n是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。如果-X-部分具有野生型的前導肽序列，其在雜交蛋白中可含有或省去。在一些實施方式中，刪除位于雜交蛋白N-末端的-X-部分的前導肽之外的前導肽，即Xi的前導肽得以保留，但省去了X2…Xn的前導肽。這樣等于刪除所有前導肽而用X,的前導肽作為部分-A-。對于(-X-L-)的各w實例，接頭氨基酸序列-L-可以存在或不存在。例如，當n=2時，雜交體可以是NH2-X廣L廣X2-L2-COOH、NH2-X廣X2隱COOH、NH2-X廣L廣X2-COOH、NH2-X廣X2-L2-COOH，等等。接頭氨基酸序列-l-通常是短序列(例如，20個或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有助于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接頭(g卩，包含Gly。，其中11=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)和組氨酸標簽(即，Hisn，其中11=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。本領域技術人員知道其它合適的接頭氨基酸序列。有用的接頭是GSGGGG(SEQIDNO:53),其中Gly-Ser二肽從SamHI限制性位點產生因而有助于克隆和操作，而(Gly)4四肽是典型的聚-甘氨酸接頭。在一些實施方式中，-A-是任選的N-末端氨基酸序列。其通常是短序列(例如，40個或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指導蛋白質運輸?shù)那皩蛄?，或有助于克隆或純化的短肽序?例如，組氨酸標簽，即Hisn，其中11=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。本領域技術人員知道其它合適的N-末端氨基酸序列。在一些實施方式中，如果Xi缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，則-A-是提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，含1、2、3、4、5、6、7或8個氨基酸)。在一些實施方式中，-B-是任選的C-末端氨基酸序列。其通常是短序列(例如，40個或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指導蛋白質運輸?shù)那皩蛄校蛴兄诳寺』蚣兓亩屉男蛄?例如，包含組氨酸標簽，即HiSn，其中11=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或提高蛋白質穩(wěn)定性的序列。本領域技術人員知道其它合適的C-末端氨基酸序列。在一些實施方式中，n是2或3。免疫原性組合物和藥物在一些實施方式中，本發(fā)明組合物是免疫原性組合物。在一些實施方式中，這些組合物是疫苗組合物。在一些實施方式中，這些組合物的pH在6-8之間，在一些實施方式中，pH是約7?？捎镁彌_液調節(jié)pH。組合物可以是無菌和/或無熱原的。組合物可以是對人等滲的。在一些實施方式中，組合物是無菌可注射的。本發(fā)明的疫苗可以是預防性(即，防止感染)或治療性的(即，治療感染)。因此，本發(fā)明提供在易受革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)感染的動物中治療性或預防性治療這種革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)感染的方法，包括給予所述動物治療或預防量的本發(fā)明組合物。例如，本發(fā)明包括在易受鏈球菌感染的動物中治療性或預防性治療肺炎鏈球菌感染的方法，包括給予所述動物治療或預防量的本發(fā)明組合物。本發(fā)明還提供將本文所述組合物用作藥物的本發(fā)明組合物。在一些實施方式中，所述藥物能在動物中引發(fā)免疫應答(即，其是免疫原性組合物)。在一些實施方式中，所述藥物是疫苗。本發(fā)明還提供本發(fā)明組合物在制備引發(fā)哺乳動物免疫應答的藥物中的應用。在一些實施方式中，所述藥物是疫苗。本發(fā)明還提供裝有本發(fā)明組合物的一個或多個容器的試劑盒。組合物可以是液體形式或可以是凍干的，例如可以是單獨的抗原。這些組合物的合適容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器和試管?？捎酶鞣N材料制成容器，包括玻璃或塑料。容器可以具有無菌端口(例如，所述容器可以是具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內輸注溶液袋或小瓶)。組合物可含有第一組分，所述第一組分可含有一種或多種革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛或菌毛蛋白。在一些實施方式中，革蘭氏陽性菌毛或菌毛蛋白是寡聚或超寡聚形式。試劑盒還可裝有包含藥學上可接受的緩沖液，例如磷酸緩沖鹽水、林格液或葡萄糖溶液的第二容器。試劑盒還可裝有最終用戶可用的其它材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾膜、針頭和注射器。試劑盒還可裝有含另一種活性物質，例如抗生素的第二或第三容器。試劑盒還可裝有包裝插頁，該插頁包含誘導抗革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)的免疫力或治療革蘭氏陽性細菌感染的書面使用說明書。包裝插頁可以是未批準的草案包裝插頁或可以是食品藥品管理局(FDA)或其它管理機構批準的包裝插頁。本發(fā)明還提供預填充了本發(fā)明免疫原性組合物的遞送裝置。本發(fā)明還提供在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，包括給予有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一些實施方式中，免疫應答是保護性的，而在一些實施方式中，免疫應答包括抗體和/或細胞介導的免疫力。該免疫應答優(yōu)選誘導持續(xù)時間長的(例如，中和性)抗體和對接觸一種或多種革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)抗原快速起反應的細胞介導免疫力。該方法可引起加強應答。本發(fā)明提供中和哺乳動物革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)感染的方法，包括將有效量的本發(fā)明免疫原性組合物，本發(fā)明疫苗或識別本發(fā)明免疫原性組合物的抗體給予該哺乳動物。在一些實施方式中，所述哺乳動物是人。如果疫苗是預防性使用，所述人是男性或女性(發(fā)育期(bearingage)兒童或青少年)?；蛘?，所述人是老年人(例如，年齡在50、55、60、65、70或75歲以上)，所述人還可以患有潛在的疾病，例如糖尿病或癌癥。在一些實施方式中，所述人是懷孕的女性或老年人。在一些實施方式中，這些應用和方法可用于預防和/或治療革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)所致疾病。這些組合物對其它鏈球菌細菌也有效。這些組合物對其它革蘭氏陽性細菌也有效。檢測治療性治療效力的一種方法包括給予一種或多種本發(fā)明組合物后監(jiān)測革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)細菌感染。給予這些組合物后可監(jiān)測針對本發(fā)明組合物中革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)抗原的免疫應答。評估本發(fā)明免疫原性組合物中蛋白質組分的免疫原性的一種非限制性方法是重組表達該蛋白質，通過免疫印跡篩選患者血清或粘膜分泌物。蛋白質和患者血清之間的陽性反應表明該患者已產生針對所述蛋白質的免疫應答，即該蛋白質是免疫原。還可采用該方法鑒定免疫顯性蛋白和/或表位。檢測治療性治療效力的另一種非限制性方法包括給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)的感染。檢測預防性治療效力的一種手段是給予組合物后監(jiān)測針對本發(fā)明組合物中革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)抗原的全身性(例如，監(jiān)測IgGl和lgG2a的產生水平)和粘膜(例如，監(jiān)測IgA的產生水平)免疫應答。一般測定免疫接種后但在攻擊前革蘭氏陽性細菌血清特異性抗體應答。在一些實施方式中，先用體外和體內動物模型評估本發(fā)明的疫苗組合物，再給予宿主，例如人。還可將免疫原性組合物(給予)革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)感染攻擊的動物模型，例如豚鼠或小鼠來體內測定本發(fā)明免疫原性組合物的效力。免疫原性組合物可以衍生自或不衍生自與攻擊血清型相同的血清型。在一些實施方式中，免疫原性組合物衍生自與攻擊血清型相同的血清型。在一些實施方式中，免疫原性組合物和/或攻擊血清型可衍生自革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)血清型。體內效力模型包括但不限于(i)利用人革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)血清型的鼠科感染模型；(ii)鼠科疾病模型，其是利用適應小鼠的革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)菌株(例如在小鼠中特別具有毒力的那些菌株)的鼠科模型；和(iii)利用人革蘭氏陽性細菌(例如，肺炎鏈球菌)分離株的靈長類模型。免疫應答可以是TH1免疫應答和TH2免疫應答中的一種或兩種。免疫應答可以是提高的或增強的或改變的免疫應答。免疫應答可以是全身性和粘膜免疫應答中的一種或兩種。在一些實施方式中，免疫應答是增強的全身和/或粘膜免疫應答。增強的全身和/或粘膜免疫應答體現(xiàn)在TH1和/或TH2免疫應答增強。在一些實施方式中，增強的免疫應答包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA產生增加。在一些實施方式中，粘膜免疫應答是TH2免疫應答。在一些實施方式中，粘膜免疫應答包括IgA產生增加?；罨腡H2細胞增強抗體產生，因此在對胞外感染起反應中有價值?；罨腡H2細胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一種或多種。TH2免疫應答可導致IgGl、IgE、IgA和以后保護作用的記憶B細胞產生。TH2免疫應答可包括一種或多種TH2免疫應答相關細胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)增加，或IgGl、IgE、IgA和記憶B細胞的產生增加。在一些實施方式中，增強的TH2免疫應答包括IgGl產生增加。TH1免疫應答可包括CTL增加、一種或多種TH1免疫應答相關細胞因子(例如，IL-2、IFNy和TNFP)增加、活化巨噬細胞增加、NK活性增加或IgG2產生增加中的一種或多種。在一些實施方式中，增強的TH1免疫應答包括IgG2產生增加。具體地說，可單用含有一種或多種本發(fā)明革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛抗原的本發(fā)明免疫原性組合物，或與能引發(fā)Thl和/或Th2應答的其它抗原和任選的免疫調節(jié)劑聯(lián)用。本發(fā)明組合物通常直接給予患者。某些組合物優(yōu)選特定的途徑，例如可產生更有效的免疫應答(優(yōu)選CMI應答)，或者不大可能誘導副作用，或者更易于給藥。可通過胃腸外注射(例如，皮下、腹膜內、真皮內、靜脈內、肌肉內或注射至組織間質的間隙)直接遞送，或直腸，口服(例如，片劑、噴劑)，陰道，局部，透皮(例如，參見WO99/27961)或經皮(例如，參見WO02/074244和WO02/064162)、鼻內(例如，參見WO03/028760)，眼部，耳部，肺部或其它粘膜給藥來實現(xiàn)直接遞送。在一些實施方式中，可利用本發(fā)明引發(fā)全身性和/或粘膜免疫力。在一些實施方式中，免疫原性組合物包含引發(fā)中和抗體應答的一種或多種革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛抗原和引發(fā)細胞介導免疫應答的一種或多種革蘭氏陽性(例如，肺炎鏈球菌)菌毛抗原。在一些實施方式中，中和抗體應答防止或抑制原始革蘭氏陽性細菌感染，同時能引發(fā)增強的Thl細胞應答的細胞介導免疫應答能防止感染的進一步擴散。免疫原性組合物可包含一種或多種革蘭氏陽性菌毛抗原和一種或多種非菌毛革蘭氏陽性抗原，例如胞質抗原。在一些實施方式中，免疫原性組合物包含一種或多種革蘭氏陽性表面抗原或類似抗原，和一種或多種其它抗原，例如能引發(fā)Thl細胞應答的胞質抗原。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。多劑量可用于初次免疫方案和/或加強免疫方案中。在多劑量方案中，可通過相同或不同的途徑，例如胃腸外致敏和粘膜加強，粘膜致敏和胃腸外加強等給予各種劑量?？蓪⒈景l(fā)明組合物制備成各種形式。例如，可將組合物制備成溶液或混懸液形式的可注射劑。還可制備適合于先溶解或懸浮在液體載體中再注射的固體形式(例如，凍干的組合物)?？梢灾苽溆糜诰植拷o藥的組合物，例如軟膏、乳膏或粉末?？梢灾苽溆糜诳诜o藥的組合物，例如片劑或膠囊、噴劑、或糖漿(任選調味)?？梢岳眉毞刍驀婌F制備用于肺部給藥的組合物，例如吸入劑?？梢詫⒔M合物制備成栓劑或陰道栓劑?？梢灾苽溆糜诒遣?、耳部或眼部給藥的組合物，例如滴劑。組合物可以是試劑盒的形式，如此設計則可以先重建混合的組合物再給予患者。所述試劑盒可裝有一種或多種液體形式的抗原或一種或多種凍干的抗原。用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的一種或多種抗原以及任何其它組分，例如抗生素，如果需要的話。"免疫有效量"表示將該用量給予個體(單一劑量或作為一系列劑量中的一部分)可有效治療或預防，或提高可檢測的免疫應答，或防止或降低臨床癥狀。該用量依待治療個體的健康和身體條件、年齡、待治療個體的分類學分組(例如，非人靈長類、靈長類等)、個體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需保護的程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)學情況的評估和其它相關因素而有所不同。預計該用量處于可通過常規(guī)試驗測定的較寬范圍內。組合物的其它組分除了上述組分，本發(fā)明組合物通常包含一種或多種藥學上可接受的運載體，包括自身不誘導產生對接受組合物的個體有害的抗體的任何運載體。合適的運載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂質凝聚物(例如，油滴或脂質體)。本領域技術人員熟知這些運載體。這些疫苗還可含有稀釋劑，例如水、鹽水、甘油等。此外，可以存在輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。藥學上可接受的賦形劑的詳細討論見Gennaro(2000)《雷明頓藥學科學和實踐》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy)，第20版，ISBN:0683306472。佐劑本發(fā)明的疫苗其它免疫調節(jié)劑聯(lián)合給予。具體地說，組合物通常包含一種或多種佐劑。本發(fā)明所用的佐劑包括但不限于下文所列的一種或多種-A#礦麵微合激適合用作本發(fā)明佐劑的含礦物質的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括礦物鹽，例如氫氧化物(如羥基氧化物)、磷酸鹽(如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等(如參見《疫苗設計》(7acc/"eZ)es/g"…)的第8和9章，(1995)，Powell和Newman編，ISBN:030644867X，普萊納姆出版社(Plenum.:O，或不同礦物質化合物的混合物(例如，磷酸鹽和氫氧化物佐劑的混合物，任選磷酸鹽過量)，這些化合物可采取任何合適的形式(如凝膠、晶體、無定形等)，這些鹽優(yōu)選(具有)吸附性。含有礦物質的組合物也可配制為金屬鹽顆粒(W000/23105)。本發(fā)明疫苗中可包含鋁鹽，A產的劑量在0.2-1.0mg/劑之間。5.適合用作本發(fā)明佐劑的油乳劑組合物包括角鯊烯-水乳劑，例如MF59(利用微流化儀配制成亞微米顆粒的5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%司盤85)。參見W090/14837。也參見Podda，"含新型佐劑的佐劑配制流感疫苗MF59佐劑配制疫苗的經驗"(Theadjuvantedinfluenzavaccineswithnoveladjuvants:experiencewiththeMF59-adjuvantedvaccine)Fiacc/we(2001)19:2673-2680;Frey等，"MF59-佐劑配制流感疫苗和無佐劑流感疫苗的安全性、耐受性和免疫原性在非老年成人中比較"(Comparisonofthesafety,tolerability,andimmunogenicityofaMF59-adjuvantedinfluenzavaccineandanon-adjuvantedinfluenzavaccineinnon-elderlyadults)Fiacc/we(2003)21:4234-4237。MF59在FLUADTM流感病毒三價亞單位疫苗中用作佐劑。在一些實施方式中，用于組合物中的佐劑是亞微米水包油乳劑。在一些實施方式中，本文所用的亞微米水包油乳劑是任選含有不同含量的MTP-PE的角鯊烯/水乳劑，例如含4-5%w/v角鯊烯、0.25-1.0%w/v吐溫80(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)和/或0.25-1.0%司盤^85(失水山梨醇三油酸酯)和任選的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亞微米水包油乳劑，例如稱為"MF59"的亞微米水包油乳劑(國際公布號WO90/14837;美國專利號6,299,884和6,451,325，全文納入本文以供參考；和Ott等，"MF59—人用疫苗的一種安全而強效佐劑的設計與評估"(MF59--DesignandEvaluationofaSafeandPotentAdjuvantforHumanVaccines)()，刊于《疫苗設計亞單位和佐劑方法》(Kacc/"e"ewg":7TzeSw6ww"cmc爿《mw^^7jwoac/i)(Powell,M.F.和Newman,M.J.編)，普萊納姆出版社，紐約，1995，第277-296頁)。MF59含有4-5%w/v角鯊烯(如4.3%)、0.25-0.5%w/v吐溫80tm和0.5%司盤85，并任選含有各種含量的MTP-PE，用微流化儀，例如110Y型微流化儀(微射流公司(Microfluidics)，牛頓市，馬薩諸塞州)配制成亞微米顆粒。例如，MTP-PE的含量可以是約0-500pg/劑，約0-250pg/劑和約0-100ng/劑。本文所用的術語"MF59-0"指不含MTP-PE的以上亞微米水包油乳劑，而術語"MF59-MTP"表示含有MTP-PE的制劑。例如，"MF59-100"含有100ngMTP-PE/劑，等等。MF69是本文所用的另一種亞微米水包油乳劑，其含有4.3%w/v角鯊烯、0.25。/。w/v吐溫80tm和0.75%w/v司盤85TM和任選的MTP-PE。還有另一種亞微米水包油乳劑是MF75，也稱為SAF，其含有10%角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亞微米乳劑。MF75-MTP表示含有MTP的MF75制劑，例如100-400|agMTP-PE/劑。全文納入本文以供參考的國際公布號WO90/14837;美國專利號6,299,884和6,451,325詳細描述了用于組合物中的亞微米水包油乳劑、其制備方法和免疫刺激劑，例如胞壁酰肽。完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)也可用作本發(fā)明佐劑。C.棘麟皂苷制劑也適用作本發(fā)明佐劑。皂苷是在許多植物種類的樹皮、葉、莖、根、甚至花中發(fā)現(xiàn)的固醇糖苷和三萜系糖苷的異質混合物(heterologousgroup)。皂樹(gz^to'a^po"an'aMolina)樹皮中分離的皂苷是廣泛研究的佐齊U。皂苷也可商品化購自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、錐花絲石竹(Gypsophillapaniculata)(婚紗花(bridesveil))和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根(soaproot))。皂苷佐劑制劑包括純化的制劑，例如QS21，以及脂質制劑，例如ISCOM。已利用高效薄層色譜(HP-LC)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化皂苷組合物。已經鑒定了用這些技術專門純化的組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷優(yōu)選QS21。美國專利號5,057,540披露了QS21的制備方法。皂苷制劑也可含有固醇，例如膽固醇(參見W096/33739)?？陕?lián)用皂苷和膽固醇來形成稱為免疫剌激復合物(ISCOM)的獨特顆粒。ISCOM—般還含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。在一些實施方式中，ISCOM含有QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。EP0109942、W096/11711和W096/33739進一步描述了ISCOM。ISCOM任選不含其它洗滌劑。參見WO00/07621。皂苷佐劑開發(fā)的綜述見Barr等，"ISCOM和其它皂苷佐劑"(ISCOMsandothersaponinbasedadjuvants)(1998)AdvancedDrugDeliveryReviews.11:247-271。也參見Sjolander等，"口服遞送的皂苷和ISCOM疫苗的攝取禾口佐齊廿活性"(UptakeandadjuvantactivityoforallydeliveredsaponinandISCOMvaccines)AdvancedDrugDeliveryReviews(1998)12:321-338。".瘋毒體浙瘋毒摔^^控(TZ"病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也適用作本發(fā)明的佐劑。這些結構通常含有任選與磷脂混合或用磷脂配制的一種或多種病毒蛋白質。它們通常無致病性、不能復制，通常不含有任何天然病毒基因組?？芍亟M產生或從完整病毒分離病毒蛋白。適用于病毒體或VLP中的這些病毒蛋白包括源自以下的蛋白質流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、QP-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如逆轉錄轉座子Ty蛋白pl)。WO03/024480、WO03/024481;Niikura等，"作為呈遞外來表位的口服疫苗載體的嵌合型重組戊肝病毒樣顆粒"(ChimericRecombinantHepatitisEVirus-LikeParticlesasanOralVaccineVehiclePresentingForeignEpitopes)Fz>o/ogy(2002)，221:273-280;Lenz等，"乳頭瘤病毒樣顆粒誘導樹突細胞的急性激活"(Papillomarivurs-LikeParticlesInduceAcuteActivationofDendriticCells)(2001)，JournalofImmunology(2001)5246-5355;Pinto等，"用重組HPV-16LI病毒樣顆粒免疫的健康志愿者對人乳頭瘤病毒(HPV)-16LI的細胞免疫應答"(CellularImmuneResponsestoHumanPapillomavirus(HPV)-16LIHealthyVolunteersImmunizedwithRecombinantHPV-16LIVirus-LikeParticles),JournalofInfectiousDiseases(2003)188:327-338;和Gerber等，"與大腸桿菌熱不穩(wěn)定的內毒素突變型R192G或CpG共同給予時人乳頭瘤病毒-樣顆粒是有效的口服免疫原"(HumanPapillomavirusVims-LikeParticlesAreEfficientOralImmunogenswhenCoadministeredwithEscherichiacoliHeat-LabileEnterotoxinMutantR192GorCpG)，JournalofVirology(2001)75(10):4752-4760。例如，Gluck等，"未來疫苗開發(fā)的新技術平臺"(NewTechnologyPlatformsintheDevelopmentofVaccinesfortheFuture),Vaccine(2002)20:B10-B16進一步討論了病毒體。鼻內三價INFLEXAL頂產品(Mischler和Metcalfe,(2002)Kacc/we20，增刊5:B17-B23)和INFLUVACPLUSTM產品中使用免疫增強型重建流感病毒體(IRIV)作為亞單位抗原遞送系統(tǒng)。￡.一智,或微主激欲仝笏在一些實施方式中，適用于本發(fā)明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，例如(1)應一智蘑霸多瀞fZ尸》游無毒欲生激.'這種衍生物包括單磷?；|A(MPL)和3-0-脫?；鵐PL(3dMPL)。3dMPL是含有4、5或6條酰化鏈的3脫-O-?；瘑瘟柞；|A的混合物。EP0689454公開了3脫-O-酰化單磷?；|A的"小顆粒"形式的非限制性例子。3dMPL的這種"小顆粒"足夠小從而可經0.22jim膜無菌過濾(參見EP0689454)。其它無毒的LPS衍生物包括單磷酰基脂質A模擬物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。參見Johnson等，(1999)S/oorg.MedC/zew.9:2273-2278。(2)扁^欲德脂質A衍生物包括大腸桿菌的脂質A衍生物，例如OM-174。OM-174描述于，例如Meraldi等"OM-174,—種可能人用的新型佐劑，與柏格鼠瘧原蟲的環(huán)子孢子蛋白的合成C-末端片段242-310—起給予能誘導保護性應答"(OM-174,aNewAdjuvantwithaPotentialforHumanUse,InducesaProtectiveResponsewithAdministeredwiththeSyntheticC-TerminalFragment242-310fromthecircumsporozoiteproteinofPlasmodiumberghei)Facc/"e(2003)21:2485-2491;和Pajak等，"佐劑OM-174誘導鼠科樹突細胞的體內遷移和成熟，，(TheAdjuvantOM-174inducesboththemigrationandmaturationofmurinedendriticcellsinvivo)F"cc/"e(2003)21:836-842。(3)督微性微嫌適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通過磷酸鍵與后面鳥苷相連的未甲基化胞嘧啶的序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的細菌雙鏈RNA或寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。CpG可含有核苷酸修飾/類似物，例如硫代磷酸酯修飾并且可以是雙鏈或單鏈。可任選用類似物，例如2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷?？赡艿念愃莆锶〈睦涌蓞⒁奒andimalla等，"分散合成的核苷酸基序識別模式具有不同細胞因子誘導模式的強效免疫調節(jié)性寡聚脫氧核糖核苷酸的設計和開發(fā)"(Divergentsyntheticnucleotidemotifrecognitionpattern:designanddevelopmentofpotentimmunomodulatoryoligodeoxyribonucleotideagentswithdistinctcytokineinductionprofiles),NucleicAcidsResearch(2003)31，(9):2393-2400;WO02/26757和W099/62923。Krieg，"CpG基序:細菌提取物中的活性成分？"(CpGmotifs:theactiveingredientinbacterialextracts),NatureMedicine(2003)9(7):831-835;McCluskie等，"利用乙肝表面抗原和CpGDNA的小鼠胃腸外和粘膜致敏-力卩強免疫方案"(Parenteralandmucosalprime-boostimmunizationstrategiesinmicewithhepatitisBsurfaceantigenandCpGDNA)，F(xiàn)EMSImmunologyandMedicalMicrobiology(2002)32:179-185;WO98/40100;美國專利號6,207,646;美國專利號6,239,116和美國專利號6,429,199進一步討論了CpG寡核苷酸作為佐劑的作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT(SEQIDNO:54)或TTCGTT(SEQIDNO:55)。參見Kandimalla等，"Toll-樣受體9:通過新型合成的CpGDNA調節(jié)識別和細胞因子誘導"(Toll-likereceptor9:modulationofrecognitionandcytokineinductionbynovelsyntheticCpGDNAs)，BiochemicalSocietyTransactions(2003)31.(部分3):654-658。CpG序列，例如CpG-AODN可特異性誘導Thl免疫應答，或者，例如CpG-BODN可更特異地誘導B細胞應答。Blackwell等，"利用類漿細胞樹突細胞衍生的IFN-a調節(jié)CpG-A-誘導的單核細胞IFN卞可誘導蛋白-10產生"(CpG-A-InducedMonocyteIFN-gamma-InducibleProtein-10ProductionisRegulatedbyPlasmacytoidDendriticCellDerivedIFN-alpha)，J.Immunol.(2003)170(8):4061-4068;Krieg，"CpG上的A到Z，，(F醒AtoZonCpG)，TRENDSinImmunology(2002)23(2):64-65;和WO01/95935討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優(yōu)選CpG-AODN。在一些實施方式中，將CpG寡核苷酸構建為5'端易于為受體識別。任選將兩條CpG寡核苷酸序列在它們的3'端相連以形成"免疫聚體"(immunomer)。參見，例如Kandimalla等，"CpG寡核苷酸的二級結構影響免疫朿U激活性"(SecondarystructuresinCpGoligonucleotidesaffectimmunostimulatoryactivity)，55iC(2003)306:948-953;Kandimalla等，"Toll-樣受體9:通過新型合成的CpGDNA調節(jié)識別和細胞因子誘導"，BiochemicalSocietyTransactions(2003)31.(部分3):654-658;Bhagat等，"作為強效免疫刺激劑的CpG五-和六脫氧核糖核苷酸"(CpGpenta-andhexadeoxyribonucleotidesaspotentimmunomodulatoryagents),5朋C(2003)300:853-861;和W。03/035836。(4)v4D尸-樣靜基化毒紊浙SY/7游厲毒欲主欽細菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。在一些實施方式中，蛋白質源自大腸桿菌(即，大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素"LT")、霍亂(弧菌)("CT")或百日咳(桿菌)("PT")。W095/17211描述了脫毒ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的應用，W098/42375描述了其作為胃腸外佐劑的應用。在一些實施方式中，佐劑是脫毒的LT突變體，例如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72作為佐劑的應用見專門全文納入本文以供參考的以下參考文獻Beignon等，"共同施加于裸露皮膚后，大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的LTR72突變體增強肽抗原引發(fā)CD4+T細胞和分泌y干擾素的能力"(TheLTR72MutantofHeat-LabileEnterotoxinofEscherichiacoliEnhancestheAbilityofPeptideAntigenstoElicitCD4+TCellsandSecreteGammaInterferonafterCoapplicationontoBareSkin)，InfectionandImmunity(2002)70(6):3012-3019;Pizza等，"粘膜疫苗作為粘膜佐劑的LT和CT無毒衍生物"(Mucosalvaccines:nontoxicderivativesofLTandCTasmucosaladjuvants),Kacc/"e(2001)19:2534-2541;Pizza等，"LTK63禾卩LTK72，用于臨床試驗的兩種粘膜佐劑"(LTK63andLTR72,twomucosaladjuvantsreadyforclinicaltrials),/A/ed^/I^.ctoZj/o/.(2000)290(4-5):455-461;Scharton-Kersten等，"利用細菌ADP-核糖基化外毒素、亞單位和無關佐劑白勺纟5皮免疫，，(TranscutaneousImmunizationwithBacterialADP-RibosylatingExotoxins,SubunitsandUnrelatedAdjuvants),InfectionandImmunity(2000)68(9):5306-5313;Ryan等，"大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素的突變體用作有效的粘膜佐劑經鼻部遞送無細胞百日咳疫苗無毒AB復合物和酶活性對Thl和Th2細胞的不同作用"(MutantsofEscherichiacoliHeat-LabileToxinActasEffectiveMucosalAdjuvantsforNasalDeliveryofanAcellularPertussisVaccine:DifferentialEffectsoftheNontoxicABComplexandEnzymeActivityonThlandTh2Cells)，InfectionandImmunity(1999)67(12):6270-6280;Partidos等，"大腸桿菌的熱不穩(wěn)定腸毒素及其定點突變體LTK63增強經鼻內共免疫合成肽的增殖性和細胞毒性T細胞應答"(Heat-labileenterotoxinofEscherichiacolianditssite-directedmutantLTK63enhancetheproliferativeandcytotoxicT-cellresponsestointranasallyco-immunizedsyntheticpeptides),7mww"o/.(1999)67(3):209-216;Peppoloni等，"作為鼻內遞送疫苗的安全強效佐劑的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素突變體，，(MutantsoftheEscherichiacoliheat-labileenterotoxinassafeandstrongadjuvantsforintranasaldeliveryofvaccines)，Kacc/wes(2003)2(2):285-293;和Pine等，"利用流感疫苗和大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的脫毒突變體(LTK63)的鼻內免疫"(IntranasalimmunizationwithinfluenzavaccineandadetoxifiedmutantofheatlabileenterotoxinfromEscherichiacoli(LTK63))，,Cowfro/ie/ewe(2002)85(l-3):263-270。氨基酸取代的數(shù)字基準優(yōu)選依據(jù)Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)U(6):l165-1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基排列對比，該篇文獻專門全文納入本文以供參考。主欽搭合娜碰搭合浙生物粘合劑(bioadhesive)和粘膜粘合劑(mucoadhesive)也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘合劑包括酯化的透明質酸微球(Singh等，(2001)Co"f.Ae/ewe.70:267-276)，或者粘膜粘合劑，例如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。殼多糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑。例如，參見WO99/27960。G.徵粒微粒也可用作本發(fā)明的佐劑。可從生物可降解和無毒的材料(例如，聚(ot-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內酯等)，優(yōu)選用聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即，直徑約100nm到150pm，約200nm到約30|am，約500nm到約10的顆粒)，任選處理這些微粒而使表面帶負電(例如，用SDS)或帶正電的表面(例如，用陽離子洗滌劑，如CTAB)。//.顏體適合用作本發(fā)明佐劑的脂質體制劑的例子描述于美國專利號6,090,406;美國專利號5,916,588和EP0626169。/,覆奪z微或褒奪z;錄激湖在一些實施方式中，適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(W099/52549)。這種制劑還包括聯(lián)用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑(WO01/21207)以及聯(lián)用至少一種其它非離子表面活性劑，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯垸基醚或酯表面活性劑(W001/21152)。在一些實施方式中，聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂?；?steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。/眾艨嚴(PC尸"PCPP制劑描述于，例如Andrianov等，"通過聚磷腈水溶液的凝聚制備水凝膠微球"(Preparationofhydrogelmicrospheresbycoacervationofaqueouspolyphophazenesolutions),B/omG^Wa/s(1998)，i^(l-3):109-l15禾口Payne等，"聚磷腈基質中的蛋白質釋放"(ProteinReleasefromPolyphosphazeneMatrices),Adv.Drug.Del,Rev.(1998)，U(3):185誦196?！紤谖⑦m合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙?；邗?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。丄.^絲辦墜諾厥眾合激適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括但不限于Stanley,"咪喹莫特和咪唑并喹諾酮作用機制和治療潛能"(Imiquimodandtheimidazoquinolones:mechanismofactionandtherapeuticpotential),C7/".De謂to/.(2002)27(7):571-577和Jones,"萊西喹莫特"(Resiquimod3M)，Cw〃.<9//"./"ve幼'g.Drags(2003)4(2):214-218中描述的咪喹莫特及其同系物。本發(fā)明還提供包含上述佐劑組合的組合物。例如，以下佐劑組合物是可用作本發(fā)明佐劑組合的非限制性例子(1)皂苷和水包油乳齊U(W099/11241);(2)皂苷(例如QS21)+無毒的LPS衍生物(例如3dMPL)(參見WO94/00153);(3)皂苷(例如(^821)+無毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+固醇)(W098/57659);(5)聯(lián)用3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑混合物(參見EP0835318;EP0735898禾卩EP0761231);(6)含有10%角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化成亞微米乳劑或旋振(vortex)產生粒度較大的孚L劑；(7)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)，(Ribi免疫化學公司(RibiImmunochem))，其含有2%角鯊烯、0.2。/。吐溫80和一種或多種由單磷酸酰脂質A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)組成的細菌細胞壁組分，優(yōu)選MPL+CWS(Detox);(8)—種或多種礦物鹽(例如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(例如3dMPL);(9)一種或多種礦物鹽(例如鋁鹽)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的寡核苷酸序列)。第(9)組合是優(yōu)選的佐劑組合。適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調節(jié)劑包括細胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如，干擾素-力、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和腫瘤壞死因子。在一些實施方式中，鋁鹽和MF59是可注射流感疫苗所用的優(yōu)選佐劑。在一些實施方式中，細菌毒素和生物粘合劑是經粘膜遞送的疫苗，例如鼻疫苗的優(yōu)選佐劑。本發(fā)明的免疫原性組合物可與抗生素治療方案共同給予。在一些實施方式中，先給予抗生素，再給予本發(fā)明的抗原或包含一種或多種本發(fā)明抗原的組合物。在一些實施方式中，先給予本發(fā)明的抗原或包含一種或多種本發(fā)明抗原的組合物，再給予抗生素。適用于治療鏈球菌感染的抗生素的例子包括但不限于青霉素或其衍生物，或克林霉素等。以下實施例進一步說明(而不是限制)了本發(fā)明。實施例實施例1.材料與方法淑W效樣膽遂在這些背景中產生的肺炎球菌菌株和缺失突變株描述于表1。采用PCR連接誘變(23)產生了T4和ST162^的敲除突變株。用特定的引物對擴增靶基因上游和下游的片段。將上游片段構建成含Apal位點，將下游片段構建成含BamHI位點。用于構建和篩選缺失等位基因的引物見表2。用相應的限制性酶消化PCR產物(l,OOObp),純化并與含Apal和BamHI位點的erm盒(1,306bp)(GenBank登錄號AB057644)或盒，Janus(24)(1,368bp)連接。然后如(25)所述將連接混合物轉化入受者肺炎球菌菌株中，接種于含紅霉素(l嗎/ml)或卡那霉素(400昭/ml)的血瓊脂平板上。通過PCR和測序證實插入正確。表l.所用的肺炎鏈球菌菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>EmR，紅霉素-耐受；KmR，卡那霉素耐受；SpcR，大觀霉素耐受；SmR，鏈霉素耐受；CmR，氯霉素耐受；表2.用于產生突變株的引物和限制性酶<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>為產生含有r/Mislet的D39(血清型2菌株)的插入突變株，用CH155(在r/n4islet側翼的/Sl167元件之一中含有mflge/^w5轉座子插入的血清型4肺炎鏈球菌菌株)的基因組DNA轉化感受態(tài)D39細胞。通過接種于大觀霉素平板選擇雙重重組細胞，通過PCR證實islet存在。為產生D39V0rg」-w/")的r/M突變衍生株，用引物對RLRAFR/RLRARX進行突變型血清型4菌株中突變區(qū)域的PCR擴增，將純化的擴增子轉化入所需的血清型2背景。通過接種氯霉素(平板)選擇重組r/M(的細胞)，通過PCR驗證。7一、i^g5f踏gC艦靨、表達微眾采用標準重組DNA技術構建所有表達質粒。pET21b+購自英杰公司(Invitrogen)。用羅氏公司(Roche)的PfuTurboTaq進行PCR，將基因組DNA擴增25輪。純化PCR產物，消化，將其連接入載體中，轉化入大腸桿菌TOPOIO，隨后亞克隆入大腸桿菌BLR(DE3)。按照生產商的使用說明書表達重組蛋白并從轉化細菌中純化。動激逾獰用米利波爾公司(Millipore)的CentriconYM-30自旋柱構建純化的重組RrgA、RrgB和RrgC，隨后用于免疫BALB/c小鼠(20嗎)和新西蘭白兔(100嗎)。扇染色就負染色而言，細菌在血瓊脂上培養(yǎng)最多16小時，將菌落懸浮在0.15M二甲砷酸鈉緩沖液中。將4^等份試樣加入FormvarTM支持膜包被的柵格中，5分鐘。用濾紙吸去過量溶液，用水配制的0.5%乙酸雙氧鈾染色柵格5秒，空氣干燥。用飛利浦公司(Phillips)的Tecnai10電子顯微鏡，80kV檢査樣品。^疫培f—顯徵翁肺炎鏈球菌在液體THY培養(yǎng)基中生長過夜。4°C，3,000rpm離心OD600為0.5的1毫升細菌懸浮液，重懸于500pl除菌過濾的PBS中。將20微升樣品加入FormvarTM-包被的鎳柵格中，靜置5分鐘。隨后將這些柵格在1%低聚甲醛/PBS中固定，在封閉緩沖液(1%正常的家兔血清，1%BSA，lxPBS)中與1:10稀釋的RrgA、RrgB或RrgC的多克隆小鼠抗體一起培育。用封閉緩沖液洗滌樣品5次，5分鐘，以l:20與金偶聯(lián)的第二抗體(山羊抗-小鼠IgG，5-nm金顆粒；山羊抗-兔IgG，10nm)—起培育。用封閉緩沖液洗滌樣品5次，5分鐘，隨后在1。/。低聚甲醛/PBS中固定30分鐘。用蒸餾水中洗滌樣品5次，5分鐘，靜置干燥。用水性乙酸雙氧鈾染色各柵格15秒，用TecnaiTM高-視野透射電子顯微鏡加工。歪顏伊跡將細菌在血瓊脂平板上培養(yǎng)最多16小時。將細菌(30mg濕重)重懸在含400單位變溶菌素(西格瑪公司)的1ml50mMTris-HCl，pH6.8中，37。C培育2小時。凍融三輪后，13,000rpm離心15分鐘除去細胞碎片。70°C，用NuPageTM樣品緩沖液和巰基乙醇處理50微升上清液10分鐘，取10pl加載于4-12%或3-8%NuPageNovexBis-Tris凝膠(英杰公司)上。按照供應商的使用說明書用1:500稀釋的RrgB抗體(小鼠免疫血清)進行電印跡和檢測。，9顏微37°C，5%(:02/95%空氣氣氛中，將生長至指數(shù)中期(006。。=0.3-0.4)的肺炎鏈球菌細胞與A549細胞培育30-40分鐘，用PBS(pH7.4)洗滌三次以除去未粘附的細菌。就粘附和/或內在化細菌的計數(shù)而言，用200^10.25%胰蛋白酶/1mMEDTA處理使上皮細胞與各孔脫離，加入800pl冰冷卻的0.025%TritonX-100使之裂解。將合適的稀釋液接種在血瓊脂平板上以計數(shù)粘附于真核細胞的細菌數(shù)量，將各菌株的粘附細菌滴度與輸入滴度作比較，測定粘附細菌的百分比。就熒光顯微術而言，在24-孔組織培養(yǎng)皿中將A549單層在蓋玻片上培養(yǎng)。在3%低聚甲醛中固定蓋玻片上的感染細胞單層，用抗體標記，培育30-40分鐘后，PBS洗滌。用抗-莢膜抗體標記細菌，用羅丹明偶聯(lián)鬼筆毒環(huán)肽染色F-肌動蛋白滲透處理后目測觀察上皮細胞。所有的實驗一式四份進行，各實驗在不同日期重復三次。</、嵐攻擊37°C，5%(302下，將T4和ST162"F及它們各自的等基因突變株在血瓊脂平板上培養(yǎng)16小時。直接從平板上取得菌落，溫和重懸在PBS中獲得OD62()=0.5，或者接種入半合成C+Y培養(yǎng)基，生長至對數(shù)中期(OD620=0.5)用于鼻內接種，0062()=0.2用于腹膜內(^浪種。進行適當稀釋以獲得所需濃度。如(5)所述，6-8周齡的C57BL/6小鼠用于T4和ST162^及它們的突變株作鼻內和腹膜內細菌攻擊。D39及其等基因突變株在補加了合適抗生素的THY培養(yǎng)基中培養(yǎng)。査爾斯河實驗室(CharlesRiverLaboratories)的6-10周齡雌性CD1(英國)小鼠用于1"07細菌的鼻內攻擊。對于競爭實驗，將突變型和野生型細菌以1:1比例混合。通過在紅霉素、鏈霉素和/或氯霉素血瓊脂平板上選擇來測定突變株cfli與野生型cfo相比的輸出值。將體內競爭指數(shù)(CI)計算成突變株與野生型輸出cfu除以突變體與野生型輸入cfti的比值。利用BD生物科學公司(BDBiosciences)的市售ELISA試劑盒測定腹膜內攻擊后血清中的TNF和IL-6。統(tǒng)^學力浙采用GraphPadPRISMtm第4版分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學顯著性。采用t檢驗或非參數(shù)曼-懷二氏檢驗比較連續(xù)變量(continuousvariable)。統(tǒng)計學顯著性定義為P<0.05。37°C，5%C02下，將肺炎鏈球菌[T4，ST16219F，T4A(wgM)和T4A("gJ-sWD)]分離株在THY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。稀釋樣品，使之生長至OD620=0.250(約1x108/ml)。3,000rpm離心細菌培養(yǎng)液，重懸于lxPBS中。將15微升細菌懸浮液加入96-孔平板。將5微升20%正常家兔血清連同1:3,200的第一抗體(抗-RrgB、PI抗-RrgB、Nm抗-961)加入各孔。樣品在冰上培育30分鐘，然后向各孔中加入150^1l封閉緩沖液(l。/。BSA/PBS)。4°C，2,500rpm離心96-孔板5分鐘。以1:100的終濃度加入用藻紅蛋白作標記的第二抗-小鼠抗體，將混合物在冰上培育30分鐘。然后加入150pl封閉緩沖液，樣品按照上述離心。將樣品重懸在200^1。/。低聚甲醛/PBS中，用BD公司(BectonDickinson)的FACSCaliber分析。在7VZ\(Wg」"wA)^V^全y^復體通過再引入敲除的基因與卡那霉素盒將Wn4islet重新引入T4A0r^4-sWD)中。首先通過PCR連接誘變將卡那霉素盒整合入野生型T4菌株中靶基因的下游。利用這些突變株的染色體DNA轉化敲除株并恢復為野生型表型。在第一步中，用引物Kan-Apa和Kan-Bam擴增Janus的卡那霉素盒(Sung等，2001，Appl.Environ.Microbiol.，67:5190-6)，產生含Apal和BamHI末端的PCR產物。用T4A(^^4"WD)突變株的引物pili-rev-1-4擴增靶位點的上游和下游片段。將上游片段構建成含Apal位點，下游片段構建成含BamHI位點。用相應的限制性核酸內切酶消化所有片段，連接等摩爾量的上游片段、下游片段和卡那霉素片段。轉化入T4后，在含200mg/L卡那霉素的血瓊脂平板上選擇轉化株。對照PCR證實構建正確后，利用這些轉化株的染色體DNA轉化T4A(n^4-sWD)。在含卡那霉素的平板上再次選擇，通過檢測紅霉素敏感性和菌毛表達驗證突變株。實施例2.肺炎球菌中菌毛樣結構的透射電子顯微術證據(jù)通過透射電子顯微術和負染色，發(fā)現(xiàn)在血瓊脂平板上和(C+Y)或(THY)培養(yǎng)基中培養(yǎng)最多16小時的肺炎球菌表達了菌毛樣結構。在菌株T4(TIGR4)(屬于多基因座序列類型ST205的高度侵襲性血清型4克隆)以及具有多基因座序列類型162的19F型臨床分離株(菌株ST162^)上發(fā)現(xiàn)這些結構(圖1A)。該19F克隆與人攜帶疾病和侵襲性疾病有關，并已顯示能有效寄居在C57BL/6和BALB/c小鼠的呼吸道中(5)。雖然T4的無包膜突變株(T4R)能形成菌毛，但在無包膜實驗室菌株R6上未觀察到菌毛。實施例3.肺炎球菌基因組中的WMIslet編碼菌毛-樣結構比較白喉棒桿菌的^"5C操縱子(12)和B群鏈球菌的粘附islet1(16)揭示了T4基因組內的推定菌毛基因簇(圖2)。菌毛基因位于前述肺炎鏈球菌病原性islet中(18，19)。肺炎球菌r/rjislet由7種基因構成，其中wgj、廳g^和廳gC預計編碼結合宿主胞外基質的含LPXTG的微生物表面組分識另U性粘附基質分子(microbialsurfacecomponentsrecognizingadhesivematrixmolecules)(MSCRAMM)(20)。此外，islet還含有三種分選酶，w/5、和sWD，以及r/M(^^-樣調節(jié)劑)(基因簇的正調節(jié)齊U)的基因(18)(圖2)?；蚪Mislet側接含有反向重復的ZS1167，其特征在于可動的基因元件(圖2)。測序的菌株R6及其祖先D39缺乏r/"-菌毛islet(圖2)。轉錄阻遏子mg"位于WMislet外端，其參與調節(jié)菌毛基因(21)。PCR擴增血清型19F的臨床分離株ST162^中相應區(qū)域后進行序列分析，顯示與T4islet的同源基因簇有98%相同。然而，ST162^分離株中不存在T4中功能未知的小ORF。通過PCR連接誘變構建了刪除mgM基因的T4和ST162^敲除突變株，從而產生過量表達r/r^islet基因的菌株。此外，我們刪除了T4(圖1B)和ST162^以及它們各自mgM衍生株中的wgj-w①區(qū)域。進行負染色和電子顯微術后，發(fā)現(xiàn)T4/ngM和ST16219FmgM突變株能產生豐富的菌毛(圖1C)，而廳^4-w①缺失的細菌完全缺乏菌毛(圖1D)。利用大腸桿菌中表達的RrgA、RrgB和RrgC蛋白產生抗血清，用于免疫金標記T4表達的菌毛。RrgB抗體染色整個菌毛多聚物(圖1E-G)。利用RrgB-特異性抗體作FACS分析顯示分別有84%和90%的T4和ST16219F細胞表達菌毛結構。在mg^突變衍生株中，幾乎所有(99%)細菌有菌毛。FACS分析檢測到缺乏r/Mislet的細胞無菌毛。為證實在T4和ST16219F中觀察到的菌毛結構的多聚性質，用變溶菌素處理這些菌株和它們各自廳g」-s^D缺失衍生株的總提取物，用4-12%(圖3A)和3-8。/。(圖3B)聚丙烯酰胺梯度凝膠分離，用RrgB特異性抗血清作免疫印跡。觀察到范圍在<100kDa->1,000kDa的高分子量(HMW)聚合物階梯，這類似于以前白喉棒桿菌所述的(12，13)。即使將等量的蛋白質提取物加載于凝膠上，mg^突變株的RrgB抗體染色條帶強于它們各自的野生型菌株，從而支持了透射電子顯微術和FACS分析時獲得mg^突變株背景中肺炎球菌表達的菌毛結構百分比更高的數(shù)據(jù)。與預期的一樣，T4和ST16219F中ATgJ-w①缺失突變株分別顯示沒有RrgB-反應性條帶(圖3)。然而，當將菌毛islet再引入此缺失突變株T4A0r^4-w^D)中時，利用RrgB抗血清作蛋白質印跡檢測到HMW多聚物類似于野生型T4菌株的那些多聚物。采用蛋白質印跡觀察到用液體培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)的肺炎球菌菌株中均存在菌毛，即使采用透射電子顯微術并不總能觀察到菌毛，從而提示為何以前未發(fā)現(xiàn)菌毛。實施例4.r/MIslet對于肺炎球菌粘附肺上皮細胞至關重要血清型2菌株D39(類似于其無包膜衍生株R6)缺乏WMislet(圖2)。將T4的完整WMislet引入D39(D39V^r^4-MD))。依據(jù)利用抗-RrgB的蛋白質印跡HMW多聚物階梯(圖3B)證明D39的這種islet插入突變株表達菌毛。D39V(n^4-sWD)中的菌毛表達依賴于正調節(jié)劑，因為在D39V(n^4-w^))的WM突變型衍生株中未觀察到HMW多聚物(圖3B)。利用D39、D39V0rg^-sWD)和D39V0t^4-w^)VO/M)研究與A549肺上皮細胞的粘附情況(圖4)。只有表達菌毛的D39V(廳^4-^^))才與這些細胞結合(圖4)。該結合類似于表達菌毛的T4,而T4的Wav4突變株顯示不與A549細胞有可檢測的結合。實施例5.r/MIslet影響在小鼠模型中的毒力為研究菌毛在肺炎球菌寄居和侵襲性疾病中的作用，將菌株T4和T4V(/rgJ-w^))用于鼠科感染模型中。為模擬感染的天然途徑，6-8周齡C57BL/6小鼠鼻內接種高[5xl(^菌落形成單位(cfu)]和中等(5xl05cfu)劑量的肺炎球菌。通過動物尸檢進行鼻咽-氣管灌洗評估寄居。感染突變株的小鼠存活率較高顯示無菌毛突變株的毒力低于野生型菌株(圖5A和5B)。再引入r/Mislet可恢復該毒力缺陷。分別給予的野生型和突變型肺炎球菌在小鼠中寄居的程度相似(曼-懷二氏U檢驗無顯著性，P>0.05)。然而，在大多數(shù)病例中，當將相同數(shù)量的野生型和突變型T4細菌一起鼻內給予時，在上呼吸道、肺和血液中菌毛缺陷型突變株均競爭不過野生型(圖5C-E)。2型菌株D39(islet插入衍生株D39V0rgJ-sWD))，禾Qr/M突變株D39V0rg」-w^))AO/^4)也用于鼻咽攜帶(nasopharyngealcarriage)和肺炎的競爭實驗。無菌毛的衍生株D39競爭不過有菌毛的islet插入突變型D39V(^t^4-w①)，而缺乏r/M的突變株并非如此(圖5F)。該數(shù)據(jù)證明肺炎球菌菌毛在寄居、肺炎和侵襲性疾病中起作用。實施例6.WMIslet在宿主炎性應答中起作用肺炎球菌感染的結果受宿主炎性應答的影響，炎性應答可促進細菌清除以及導致局部損傷(肺炎)或全身性損傷(最嚴重的形式是膿毒性休克)。最近，我們證明將各種肺炎球菌克隆腹膜內給予小鼠時會引發(fā)不同的致炎細胞因子應答(26)。本文顯示能產生菌毛的血清型6B菌株和T4及ST162^菌株在腹膜內攻擊后均引發(fā)高TNF應答(5)。相反，克隆類型不同的血清型19F菌株，即ST42519F，在小鼠上氣道中不能有效寄居，其引發(fā)低TNF應答(5)。血清型1和血清型7F分離株也一樣(5，22)，其屬于在人中較溫和侵襲性和無致死性疾病的相關侵襲克隆類型。通過PCR、測序和Sourthern印跡雜交來分析這些克隆中是否存在WMislet。結果證明WMislet-陽性肺炎球菌菌株(分別是4和19F型的ST205"和ST162"F)引發(fā)高細胞因子應答，而rlrAislet-陰性菌株(分別是7F和1型的ST1917F、ST228!和ST306"誘導低TNF應答(5)。因此，肺炎球菌菌毛islet存在與否可以解釋TNF應答的差異。為直接檢驗該可能性，檢測用有菌毛的野生型和缺乏菌毛的廳g-w①缺失突變株腹膜內攻擊小鼠后侵襲性肺炎球菌感染期間的炎性應答。還用較高感染劑量的兩種缺失突變株感染以確保TNF應答低不是因為血流中細菌數(shù)量較低所致。與它們的野生型菌株相比，T4以及ST162^背景中的菌毛缺失突變株顯示TNF應答(圖6)和IL-6應答(圖7)明顯較低。將TNF值對細菌數(shù)量作圖，證明對有菌毛肺炎球菌的TNF應答明顯高于相同數(shù)量的無菌毛肺炎球菌(圖6C和6D)。此外，將r/"islet再引入T4A0t^4-;WD)恢復了有菌毛T4的高TNF應答。這些結果證明肺炎鏈球菌可產生伸出細菌細胞表面的菌毛樣結構。在一些但不是所有肺炎球菌菌株中發(fā)現(xiàn)r/"菌毛islet編碼肺炎球菌菌毛。在有包膜的肺炎鏈球菌中，菌毛在鼠科感染模型中負責粘附培養(yǎng)的上皮細胞和寄居以及侵襲性疾病。菌毛表達還增強宿主炎性應答。在不同的感染階段，肺炎球菌利用各種機制與它們的宿主相互作用。表達菌毛有助于細菌的初始粘附，從而促進鼻咽寄居。同時，表達這些結構的細菌更易于引發(fā)能促進清除的粘膜炎癥，但如果炎癥導致粘膜屏障損傷，也可能導致肺炎球菌侵染入組織。實施例7.肺炎鏈球菌菌毛的純化用補加了5。/。去纖維蛋白羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)(37'C，5%<:02中過夜)肺炎鏈球菌TIGR4甘油原種(-8(TC)。利用新鮮的細菌接種新的瓊脂平板，37°C，5%C02中培養(yǎng)約12小時。用35mlPBS洗滌收集的約10個平板的細菌一次，重懸于卡爾生物化學公司(Calbiochem)的2ml含有蛋白酶抑制劑混合物的原生質體緩沖液PPB中(10mMMgCl2，50mM磷酸鈉，pH6.3，20%蔗糖)。將100mM磷酸鈉，pH6.3配制的約450U變溶菌素加入各一半懸浮液中，37。C培育約5-8小時，輕柔震蕩直至顯微鏡檢測到形成原生質體。將含有經消化菌毛物質的上清液加載于蔗糖梯度上(25-56%，10mMMgCl2，50mM磷酸鈉，pH6.3配制)，4'C以38,000rpm離心約20小時(圖IOA)。4°C，利用含有蛋白酶抑制劑的緩沖液進行所有其余步驟。此外，加入諾瓦金公司(Novagen)的BenzonaseTM核酸酶以除去DNA和RNA雜質。利用抗-RrgB抗體檢測所收集的各梯度組分的菌毛物質。合并含菌毛的組分，用10mMMgCl2，50mM磷酸鈉，pH6.3透析約1天以除去蔗糖。為降低多分散性，可加入其它層析步驟。需要時，可先濃縮合并的菌毛制品再將它們加載于阿姆山姆生物科學公司(AmershamBiosciences)的Superose610/300GL柱上(圖10B)。凝膠過濾將含有不同分子量的物質的菌毛分開。根據(jù)電子顯微術和十二垸基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳以及利用RrgB特異性抗體作免疫印跡判斷純化菌毛組分是否為均質(圖10C)。將樣品保存在-8(TC或液氮中待以后使用。純化的高分子量菌毛顯示分子量范圍是2x106-3x106Da。在有SDS存在下熱處理菌毛將其解離成較小分子，從而在聚丙烯酰胺-SDS凝膠上產生低分子量條帶梯。Edmann降解純化的菌毛鑒定到對應于切除信號序列產生RrgB蛋白預計的N-末端序歹!j(AGTTTTSVTVHXL;SEQIDNO:56)(圖11A)。菌毛胰蛋白酶肽序列的氨基酸分析鑒定到含氨基酸序列LAGAEFVIANADNAGQYLAR.(SEQIDNO:7)(圖11B)的肺炎球菌TIGR4RrgB蛋白的片段。對負染色(in/。PTA)、免疫金標記的純化菌毛制品進行電子顯微術研究。觀察到最長1pm和直徑約10nm的延長管狀纖絲，類似于在完整細菌上檢測到的。除單根的菌毛纖絲外，還觀察到緊密填塞的單結構束。在免疫金EM(圖15)和蛋白質印跡分析中，針對純化RrgB和RrgC的抗血清與分離的菌毛反應?？?RrgA、抗-RrgB和抗-RrgC的金標記模式見圖16。實施例8.菌毛蛋白RrgA和RrgB的體外締合菌毛蛋白RrgA、RrgB和RrgC如實施例1所述純化。室溫下、37°C、65°C和95'C體外培育純化的蛋白制品5分鐘。在變性的聚丙烯酰胺凝膠上對培育的制品進行電泳。在RrgA和RrgB制品中觀察到高分子量復合物，但在RrgC-His制品中未觀察到(圖9A)。蛋白質印跡證實高分子量復合物中存在RrgA和RrgB(圖9B)。通過尺寸排阻層析還在RrgA和RrgB制品中檢測到高分子量復合物(圖9C)。實施例9.用菌毛制備的抗血清對抵御感染具有保護作用如實施例1所述用T4細菌腹膜內攻擊小鼠，此外給予小鼠抗純化菌毛的抗血清(抗-菌毛)、用在相同條件下從不產菌毛的細菌制備的制品的抗血清(抗A菌毛)或鹽水對照(對照)。在平行實驗中，給予小鼠1:10稀釋的相同抗血清。觀察IO天期間動物的死亡率，檢測攻擊后24小時的細菌負載量。用未稀釋的抗-菌毛血清治療的所有小鼠的細菌負載量低于檢測水平；用1:10稀釋的血清治療仍能提供一定保護作用(圖12A)。與鹽水對照相比，稀釋和未稀釋的抗-菌毛血清能顯著降低死亡率(圖12B)。此外，用菌毛制備的血清對菌血癥和死亡率的保護作用高于抗A菌毛血清(圖12A-B)。本實施例證明在動物模型中，純化菌毛的特異性血清能提供針對肺炎鏈球菌感染的明顯保護作用。實施例10.純化菌毛和菌毛蛋白與胞外基質組分結合通過ELISA測定RrgA、RrgB、RrgC、純化的菌毛和模擬純化的菌毛與胞外基質組分的結合。檢測菌毛組分與胞外基質組分粘蛋白I、玻連蛋白、乳鐵蛋白、膠原I和IV、層粘連蛋白、纖連蛋白和血纖蛋白原的結合。簡言之，37°C,包被丹麥羅絲克爾德市南克公司的Maxisorp96-孔平底板(Nunc，Roskilde，Denmark)l小時，然后在4"C與磷酸緩沖鹽水pH7.4(PBS)配制的2pg/孔粘蛋白I、玻連蛋白、乳鐵蛋白、膠原I和IV和血纖蛋白原以及l(fā)pg/孔層粘連蛋白和纖連蛋白培育過夜。BSA包被的平板用作陰性對照。用PBS/0.05%Tween20洗滌包被的各孔3次，37。C用200|il1%BSA封閉2小時。用PBS/0.05%Tween20洗滌各平板3次。首先用PBS將蛋白樣品(RrgA、RrgB和RrgC)稀釋至0.4嗎/pl。將200^蛋白溶液和25pi菌毛制品(用PBS配制成200^總體積)及各自的對照轉移入包被-封閉的平板，其中樣品用PBS作連續(xù)兩倍稀釋。37。C培育平板2小時，4。C過夜。用PBS/0.05%TweenTM20洗滌平板3次，37'C與小鼠抗Rrg第一抗體(1/10,000稀釋液)培育2小時:RrgA、RrgB和RrgC包被的平板分別與抗-RrgA、抗-RrgB和抗-RrgC(抗體)培育，菌毛包被的平板與抗RrgB抗體培育。再洗滌3次后，37°C，經與密蘇里州圣路易斯市西格瑪化學品公司的堿性磷酸酶偶連山羊抗小鼠IgG培育2小時顯示抗原特異性IgG。觀察到與膠原I、乳鐵蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白和血纖蛋白原明顯結合(圖13)。在所有情況中，觀察到RrgA的結合最強，RrgC次之，RrgB的結合水平較低。純化的菌毛顯示較弱但可測的結合。本實施例證明純化菌毛和分離的菌毛蛋白能與胞外基質組分結合，提示菌毛在粘附/寄居中起作用。實施例11.純化菌毛誘導體外細胞因子應答在體外將外周血單核的細胞(PBMC)和單核細胞與純化菌毛制品和從不表達菌毛的T4純化的模擬制品接觸。通過ELISA檢測這些細胞對菌毛起反應中產生的細胞因子。與delta菌毛對照相比，純化菌毛誘導炎性細胞因子TNF-a、IL-12p40和IL-6產生(圖14)。未觀察到對TLR2、7、8和9的誘導。實施例12.純化菌毛的電子顯微術分析將5微升純化菌毛制品置于涂布有碳薄膜的300-目銅柵格上。然后加入5微升P/。PTA(磷鎢酸)負染色這些柵格。吸干多余的液體。利用FEG200電子顯微鏡觀察這些柵格。在低劑量條件下，以100kV加速電壓和50000名義放大率(nominalmagnification)記錄圖像。觀察到延長、可彎曲結構的菌毛(圖18)。掃描電子顯微圖，然后轉換成IMAGIC5格式(imagic5.de)。采用EMAN軟件，利用正方形框(300x300像素)從數(shù)字化底片(digitizednegative)中選菌毛的相同部分。在全框內(boxed)菌毛集合之間，只處理具有相同生長方向和相似直徑的直菌毛。在第一分析中，按密度、高通(high-pass)和低通(low-pass)濾過倒轉框內的菌毛，然后與直徑相同的模型圓柱體的投影比對(圖18)。采用自我校正功能實施旋轉比對，然后進行只與圓柱體軸垂直的平移比對(translationalalignment)。計算橫貫纖絲軸的平均密度分布，以圖解表示示。此密度分布強烈表明菌毛是一緊密的固體結構，中間沒有孔洞，其整體結構計算的平均直徑為11.5rnn(圖18)。通過將旋轉角度隨機指定為比對的莖干區(qū)段獲得旋轉對稱的三-兩維體積(rotationallysymmetrizedthree-dimensionalvolume),計算的直徑(llnm)相似(圖19)。此外，該體積顯示菌毛表面不光滑(圖18-19)。通過軸平均(axialaveraging)對顯示13nm重復的強烈結構特征的幾個預比對莖干區(qū)段作進一步比對，從而產生信號更強的改進2D圖像(圖20)。這些2D圖像(3D結構的投影)(圖21-22)明確顯示菌毛由巻曲螺旋結構排列的至少3根"原纖絲"構成，平均直徑為10.5-11.0nm，螺距為13.2nm(圖23)。結節(jié)位置處菌毛的直徑是6.8nm，每根"原纖絲"的直徑為3.5nm(圖23)。參考文獻(各篇文獻全文納入本文以供參考)1.Bruyn，G.A.W.和vanFurth，R.(1991)Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.10，897-910.2.Ryan，M.W.禾卩Antonelli，P.J.(2000)Laryngoscope110，961-964.3.Cutts，F(xiàn).T.，Zaman，S.M.，Enwere，G.，Jaffar，S.，Levine，O.S.，Okoko，C.Oluwalana，A.，Vaughan，S.，Obaro，A.，Leach，A.等，(2005)Lancet365，1139-1146.4.Swiatlo，E.，Champlin，F(xiàn).R.，Holman，S.C，Wilson,W.W.禾口Watt,J.M.(2002)Infect.Immun,70，412-415.5.Sandgren，A.，Albiger，B.，Orihuela，C，Tuomanen，E.，Normark，S.和Henriques陽Normark，B.(2005)J.Infect.Dis.192,791-800.6.HenriquesNormark，B.，Christensson，B.，Sandgren，A.，Noreen，B.，Sylvan,S.,Burman，L.G.禾卩Olsson-Liljequist，B.(2003)Microb.DrugResist.9，337-344.7.Nunes，S.，Sa-Leao，R.，Carrico,J.，Alves，C.R.，Mato，R.，AvO，A.B.，Saldanha，J.，Almeida,J.S.，Sanches，I.S.禾口deLencastre，H.(2005)J.Clin.Microbiol.43，1285-1293.8.Henrichsen，J,(1995)J.Clin.Microbiol.33，2759-2762.9.Lau，G.W.，Haataja，S.，Lonetto，M.，Kensit，S.E.，Marra，A.，Bryant,A.P.，McDevitt，D.，Morrison,D.A.禾卩Holden，D.W.(2001)Mol.Microbiol.40，555-571.10.Rosenow，C，Ryan，P.，Weiser，J.N.，Johnson,S.，F(xiàn)ontan，P.，Ortqvist，A.和Masure，H.R.(1997)MolMicrobiol.25，819-829.11.Tuomanen，E.(1999)CurrentOpin.Biol.2，35-39.12.Ton-That，H.，Marraffini，L.A.和Schneewind，O.(2004)Mol.Microbiol.53，251-261.13.Ton-That，H.和Schneewind，O.(2003)Mol.Microbiol.50，1429-1438.14.Kelstrup，J.，Theilade,J.和Fejerskov，O.(1979)Scand.J.Dent.Res.87，415-423.15.Mora,M.，Bensi，G.，Capo，S.，F(xiàn)alugi，F(xiàn).，Zingaretti，C，Manetti，A.G.O.，Maggi，T.，Taddei，A.R.，Grandi，G.禾口Telford,J.L.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102，15641-15646,16.Lauer，P.，Rinaudo，C.D.，Soriani，M.，Margarit，L，Mainone，D.，Rosini，R.，Taddei，A.R.，Mora，M.，Rappuoli，R.，Grandi，G.禾口Telford,J.L.(2005)Science309，105.17.Li，T.，Khah，M.K.，Slavnic，S.，Johansson,LScStromberg，N.(2001)InfectImmun.69，7224-7233.18.Hava，D.L.，Hemsley，C.J.和Camilli，A.(2003)J.Bacteriol.185，413-421.19.Hava，D.L.和Camilli，A.(2002)Mol.Microbio1.45，1389-1406.20.Schwarz-Linek，U.,Hook，M.和Potts，J.R.(2004)MolMicrobiol.52，631-641.21.Hemsley，C，Joyce,E.，Hava，D丄，Kawale，A.禾卩Camilli,A.(2003)J.Bacteriol.185，6640-6647.22.Sj0str0m，K.，Spindler，K.，Ortqvist，A.，Kalin，M.，Sandgren，A.和HenriquesNormark,B.(2006)Clin.Infect.Dis.，印刷中.23.Lau，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年2月17日發(fā)明者A·科瓦茨,I·費林希,M·希勒林曼申請人:諾華有限公司