專利名稱：：通過dsRNA結(jié)合域與PTD/CPPS的融合物轉(zhuǎn)導(dǎo)運(yùn)輸siRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及向細(xì)胞進(jìn)行核酸運(yùn)輸。更具體地，本發(fā)明涉及用融合到對(duì)陰離子電荷進(jìn)行中和的核酸結(jié)合域的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域來向細(xì)胞運(yùn)輸帶陰離子電荷的分子如siRNA。
背景技術(shù)：
：對(duì)作為一種選擇性降解mRNA的細(xì)胞機(jī)制的發(fā)現(xiàn)允許耙向操作細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞表型靶向以及可能研發(fā)出定向療法(Behlke,Mol.Ther.13,644-670,2006;Xie爭(zhēng)乂，DrugDiscov.Today11,67-73,2006)。盡管siRNA具有很大的潛力用于細(xì)胞表型的操作，但由于其大小以及帶有負(fù)(陰離子)電荷的性質(zhì)，因而siRNA是不能進(jìn)入細(xì)胞的大分子。實(shí)際上，siRNA超過Lipinski的"5s規(guī)則"的25倍，該規(guī)則被用于膜可擴(kuò)散分子的細(xì)胞運(yùn)輸，通常這些分子的大小限制在小于500Da。因此，在缺少運(yùn)輸載體或轉(zhuǎn)染劑的情況下，棵siRNA即使在毫摩爾濃度的條件下也不進(jìn)入細(xì)胞(Barquinero爭(zhēng)乂，GeneTher.11Suppl1,S3-9,2004)。重要關(guān)注集中使用對(duì)siRNA進(jìn)行濃縮并在細(xì)胞膜穿孔的陽(yáng)離子脂質(zhì)，以解決siRNA的運(yùn)輸問題。盡管被廣泛應(yīng)用，但轉(zhuǎn)染劑仍然不能夠有效運(yùn)輸?shù)皆S多細(xì)i包類型中，尤其是原代細(xì)胞以及造血細(xì)胞系(T細(xì)胞和B細(xì)胞,巨噬細(xì)胞)。此外，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑常常導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞毒性，其可從肺瘤細(xì)胞中的輕微水平到原代細(xì)胞中的高水平。最近的細(xì)胞定向靶向法抗體融合至DNA濃縮魚精蛋白(Song爭(zhēng)人，Nat.Biotechnol.23,709-717,2005)以及siRNA融合至受體耙向的RNA適體(McNamara爭(zhēng)乂，NatBiotechnol.24,1005-1015,2006)|是供了將siRNA運(yùn)輸?shù)剿x擇的細(xì)胞中的可能。盡管這兩種方法^f艮有前途，但它們不能夠?qū)iRNA運(yùn)輸?shù)?00%的表達(dá)受體的腫瘤細(xì)胞中，也不容易進(jìn)行改變以適合其它的非受體表達(dá)細(xì)胞，并且只在幾種細(xì)胞類型上經(jīng)過測(cè)試。最近，通過包含膽固醇形成LDL粒子以及PEI縮合的方法而引入聚集體形成納米粒子或者將siRNA封裝在脂質(zhì)體中以掩蔽負(fù)電荷的方法已經(jīng)顯示出能夠在不同程度上成功地將siRNA運(yùn)輸?shù)揭恍┓瘟黾?xì)胞中(Scherr爭(zhēng)人，Ann.Hematol.83,1-8,2004;Schiffelers爭(zhēng)乂，NucleicAcidsRes.32，e149,2004;Song爭(zhēng)乂，2005;Soutschek爭(zhēng)乂，Nature432,173-178,2004;Urban-Klein爭(zhēng)乂，GeneTher.12,461-466，2005;Zhang爭(zhēng)入，Genet.VaccinesTher.3,5,2005)。因此，i殳計(jì)出通過快速、非毒性機(jī)制來解決針對(duì)100。/。的所有細(xì)胞類型、原代以及致瘤細(xì)胞的siRNA大分子運(yùn)輸問題，對(duì)于在細(xì)胞培養(yǎng)物中RNAi擴(kuò)增的潛能、靶向篩選以及治療劑研制來講顯是重要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種組合物，其含有核酸結(jié)合蛋白質(zhì)，其與帶陰離子電荷的核酸復(fù)合形成核酸結(jié)合蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物；以及連接到該核酸結(jié)合蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)。一方面，核酸結(jié)合蛋白質(zhì)含有雙鏈RNA結(jié)合域(DRBD)。另一方面，核酸是帶有陰離子電荷的核酸。再一方面，核酸含有dsRNA。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種含有融合多肽的組合物，該多肽含有i)含有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分(PTD)的第一結(jié)構(gòu)域，該轉(zhuǎn)導(dǎo)部分具有膜運(yùn)輸功能；以及ii)含有核酸結(jié)合蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域；b)核酸，其中該核酸帶有陰離子電荷并且與核酸結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用，且其中PTD-核酸結(jié)合蛋白質(zhì)-核酸的全部陰離子電荷相對(duì)于單獨(dú)的核酸減少；以及c)藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明提供了一種融合多肽，其含有a)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)，該轉(zhuǎn)導(dǎo)域包括膜運(yùn)輸功能；以及b)中和或減少結(jié)合的核酸的陰離子電荷的核酸結(jié)合域，其中PTD可操作地連接至核酸結(jié)合域。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，其含有a)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)，該轉(zhuǎn)導(dǎo)域包括膜運(yùn)輸功能；以及b)中和或減少連接的核酸的陰離子電荷的核酸結(jié)合域，其中PTD可操作地連接至核酸結(jié)合域和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明提供一種將帶有陰離子電荷的核酸分子引入到細(xì)胞中的方法，該方法包括將細(xì)胞與組合物接觸，該組合物包括核酸結(jié)合蛋白質(zhì)與帶陰離子電荷的核酸復(fù)合形成的核酸結(jié)合蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物，以及連接到該核酸結(jié)合蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD);或與融合多肽接觸，該融合多狀含有a)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)，該轉(zhuǎn)導(dǎo)域含有膜運(yùn)輸功能；以及b)中和或減少結(jié)合的核酸的陰離子電荷的核酸結(jié)合域，其中PTD可操作地連接至核酸結(jié)合域和連接的核酸。。本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種將帶有陰離子電荷的核酸分子引入到細(xì)胞中的方法，其包括用核酸分子與核酸結(jié)合域結(jié)合以中和或減少陰離子電荷，以及將復(fù)合物連接至蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)并用PTD-電荷中和后的核酸與細(xì)l包進(jìn)4于4妄觸。本發(fā)明還提供一種編碼融合多肽的分離的多核苷酸，該融合多肽包括a)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD),該轉(zhuǎn)導(dǎo)域包括膜運(yùn)輸功能；以及b)中和或減少結(jié)合的核酸的陰離子電荷的核酸結(jié)合域，其中PTD可操作地連接至核酸結(jié)合域。本發(fā)明還提供一種含有多核苷酸的載體以及含有載體和/或多核苷酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供一種制備融合多肽的方法，其包括對(duì)本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)以及對(duì)所表達(dá)的融合多肽進(jìn)行基本地純化。本發(fā)明還提供一種制備融合多肽的方法，其包括在一定條件下對(duì)含有本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，由此多核苷酸得以表達(dá)并且表達(dá)的融合多肽被基本純化。本發(fā)明提供一種制備用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的組合物的方法，包括將帶陰離子電荷的核酸與融合多肽進(jìn)行接觸，該融合多肽含有a)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)，該轉(zhuǎn)導(dǎo)域包括膜運(yùn)輸功能；以及b)中和或減少結(jié)合的核酸的陰離子電荷的核酸結(jié)合域，其中PTD可操作地連接至核酸結(jié)合域。本發(fā)明還提供一種包括一個(gè)或多個(gè)容器的試劑盒，容器含有(a)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域；以及(b)核酸結(jié)合蛋白質(zhì)。該試劑盒中還進(jìn)一步含有dsRNA分子。本發(fā)明提供了方法和組合物，其使用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)通過對(duì)多核苷酸上的電荷進(jìn)行可逆掩蔽或中和，以將siRNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中。一方面，雙鏈RNA(dsRNA)結(jié)合域(DRBD)被用于掩蔽電荷。另一方面，2~4個(gè)DRBD覆蓋dsRNA的柱形表面并且對(duì)多核苷酸需要被運(yùn)輸?shù)幕静糠诌M(jìn)行掩蔽。DRBD以序列獨(dú)立的方式進(jìn)行結(jié)合，這樣任何多核苷酸(如siRNA)都可以通過本發(fā)明的方法和組合物來得到運(yùn)輸。該公開提供了融合多肽以及構(gòu)建物，其用于將帶有陰離子電荷的包括診斷劑和治療劑的核酸分子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中或研究對(duì)象體內(nèi)。該融合構(gòu)建物包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域和核酸結(jié)合域，或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域和核酸，該核酸表面包覆有可對(duì)其上的陰離子電荷進(jìn)行充分中和的一個(gè)或多個(gè)核酸結(jié)合域。例如，陰離子RNA的電荷中和可孝奪》文陽(yáng)離子PTD并且還可防止綴合物的聚集。暴露出的PTD與細(xì)胞表面相互作用，誘發(fā)大胞飲作用并促使其從大胞飲體逃逸出來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。一旦進(jìn)入到細(xì)胞中，核酸結(jié)合蛋白質(zhì)(如DRBD)或者^皮除去，例如通過含有蛋白質(zhì)，如將siRNA載入RISC中涉及的TRBP的內(nèi)源DRBD，或者可加入去穩(wěn)定基元，如PEST序列，允許從細(xì)胞質(zhì)中的siRNA去除。圖1A-E示出了PTD-DRBD介導(dǎo)的向細(xì)胞內(nèi)siRNAs的運(yùn)輸。(A)PTD-DRBD結(jié)合到si西A的示意圖。DRBDs掩蔽約16bp的dsRNA，在兩端留有陰離子電荷，其被假設(shè)為被第一個(gè)陽(yáng)離子PTD結(jié)合。(B)基于在TAT-Cre的工作(Wadia爭(zhēng)乂，2004)而提出的PTD-DRBD:siRNA細(xì)胞進(jìn)入機(jī)制。自由陽(yáng)離子PTD域與細(xì)胞表面的陰離子蛋白多糖相互作用(l)誘導(dǎo)大胞飲作用(2),然后大胞飲體的pH下降增強(qiáng)小泡逃逸(3),PTD-DRBD:siRNA細(xì)胞質(zhì)解體(4)以及siRNA載入到RISC中。(C)PTD-DRBD結(jié)合到Cy3-標(biāo)記的19基體siRNA的EMSA分析。檢測(cè)到兩種不同的更高級(jí)的復(fù)合物。M,dsDNA梯帶標(biāo)記(laddermarker)。(D)用PTD-DRBD:siRNA-Cy3加入6小時(shí)后處理的H1299細(xì)胞進(jìn)行的顯微分析。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗并采用胰蛋白酶/肝素處理以在顯微分析前去除細(xì)胞外結(jié)合的物質(zhì)。(E)釆用PTD-DRBD:siRNA對(duì)dGFP和dDsRed進(jìn)行RNAi敲減(knockdown)。使用siRNAs對(duì)共表達(dá)整合的去穩(wěn)定dGFP和dDsRed報(bào)道蛋白的H1299細(xì)胞根據(jù)指示處理6小時(shí)，24小時(shí)后清洗并進(jìn)行流式細(xì)胞分析。GFP1和GFP2siRNA是獨(dú)立的序列；SN,沉默陰性對(duì)照siRNA;Luc,熒光素酶對(duì)照siRNA。平均值歸一化為百分比對(duì)照，誤差條表示SEM，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。圖2A-D示出了PTD-DRBD介導(dǎo)的dGFPRNAi應(yīng)答的分析(A和B)。如所示，處理后的H1299dGFP/dDsRed細(xì)胞在1天(A)和2天(B)時(shí)的dGFPRNAi應(yīng)答的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)單細(xì)胞直方圖分析。(C)為H1299dGFP/dDsRed細(xì)胞的單siRNA處理后dGFPRNAi敲減衰變動(dòng)力學(xué)的流式細(xì)胞術(shù)分析，如所示。(D)為H1299dGFP細(xì)胞的多重siRNA處理后dGFPRNAi敲減衰變動(dòng)力學(xué)的流式細(xì)胞術(shù)分析，圖所示。平均值歸一化為百分比對(duì)照，誤差條表示SEM，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。圖3A-F示出了內(nèi)源性GAPDHmRNA通過PTD-DRBD:siRNA的敲減。(A-F)為在處理后6、12、24、36、72和96小時(shí)H1299細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性GAPDHmRNA表達(dá)的定量TaqManRT-PCR分析，如所示。平均值歸一化為卩2微球蛋白并記錄為^^莫擬GAPDH對(duì)照的百分比，誤差條表示SEM，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。圖4A-F示出了在多種細(xì)胞類型中PTD-DRBD運(yùn)輸siRNA誘導(dǎo)的RNAi應(yīng)答。(A和B)對(duì)在(A)人源THP-1巨噬細(xì)胞中的dGFPRNAi應(yīng)答以及對(duì)在(B)鼠源B16F0黑素瘤細(xì)胞中的野生型eGFPRNAi應(yīng)答的流式細(xì)胞術(shù)單細(xì)胞直方圖分析，如所示。(C-F)分別為對(duì)(C)人源HFF原代成纖維細(xì)胞，(D)人源JurkatT細(xì)胞，(E)人源HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞，(F),人源T98G惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行單siRNA處理后dGFPRNAi敲減衰變的流式細(xì)胞術(shù)分析，如所示。平均值歸一化為百分比對(duì)照，誤差條表示SEM，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。圖5A-E顯示人源胚胎干細(xì)胞的PTD-DRBD:siRNA耙向分化。(A)表達(dá)野生型eGFP的人源H9胚胎干細(xì)胞經(jīng)過PTD-DRBDGFP2siRNA加入2天處理時(shí)的熒光顯微分析。(B)使用PTD-DRBDOct4或?qū)φ諢晒馑孛?Luc)siRNAs對(duì)HUES9hESC處理后2天的Oct4免疫印跡分析。(C)示出了使用PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)腛ct4或?qū)φ諢晒馑孛?Luc)siRNAs處理的人源HUES9胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞分裂曲線。(D)使用PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)腛ct4或熒光素酶(Luc)siRNAs處理2天后對(duì)HUES9hESCs中Oct4和SSEA4表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析。抗體Alexa594-綴合的抗-Oct4(紅色)，Alexa488-綴合的抗-SSEA-4(綠色)?；蚪MDNA,Hoechst(藍(lán)色)。(E)使用PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)腛ct4或熒光素酶(Luc)siRNAs處理10天后對(duì)HUES9hESC中GATA6和SSEA4的表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析?？贵wAlexa594-綴合的抗-GATA6(紅色)，Alexa488-綴合的抗-SSEA-4(綠色)?；蚪MDNA，Hoechst(藍(lán)色)。圖6A-D示出了細(xì)胞毒性。(A-D)細(xì)胞，如所示，用模擬、月旨質(zhì)轉(zhuǎn)染或PTD-DRBD加siRNA進(jìn)行處理后，如所述，對(duì)其進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)前向散射(FSC)以及側(cè)向散射(SSC)分析來檢測(cè)細(xì)胞毒性。結(jié)果記錄為活細(xì)胞相對(duì)于才莫擬對(duì)照的百分比。圖7顯示在第一天使用500,000U87MG-EGFRvIH惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)棵鼠進(jìn)行顱內(nèi)接種。在第10天，使用靶向EGFRvIII的PTD-DRBD:siRNA對(duì)該鼠進(jìn)行處理。使用PTD-DRBD加入24、48、72小時(shí)后，殺死鼠并取得連續(xù)的冠狀腦切片。鄰近的腦切片使用H&E染色，或根據(jù)所述用抗-EGFR抗體加上H染色進(jìn)行IHC。在24小時(shí)時(shí)EGFR染色減輕，隨后在48和72小時(shí)EGFR染色的顯著減少表明EGFRRNAi應(yīng)答已在惡性膠質(zhì)瘤中擴(kuò)散。具體實(shí)施例方式在這里和所附的權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式"一"、"一個(gè)"和"這個(gè)"除非文中特別指明，包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如，事物"一個(gè)PTD"包括復(fù)數(shù)個(gè)這樣的PTD，事物"細(xì)胞"包括一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞，等。除非另外定義，這里使用的所有科技和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一般理解的意思相同的意思。雖然此處敘述了示例性的方法、器件和材料，但與這里所描述的相似或相同的方法和材料也可以被用于實(shí)施本發(fā)明公開的方法和組合物。以上和本文中討論的出版物被提供，只是說明其公開內(nèi)容先于本申請(qǐng)?zhí)峤蝗?。但不?yīng)理解為由于現(xiàn)有公開，而承認(rèn)本發(fā)明的發(fā)明者們無(wú)權(quán)早于這樣的公開內(nèi)容。由于細(xì)胞膜所造成的生物利用度的限制，向細(xì)胞運(yùn)輸功能性試劑的能力就存問題。即，細(xì)胞的質(zhì)膜形成一有效的屏障，其將細(xì)胞內(nèi)攝取的分子限制在那些幾乎無(wú)極性的以及大小小于約500道爾頓的分子。以前用于提高蛋白質(zhì)內(nèi)化的研究集中于帶有受體配體的融合蛋白(Ng爭(zhēng)乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:10706-11,2002)或?qū)⑵浒b成包裝成籠形的脂質(zhì)載體(Abu-Amer爭(zhēng)乂，J.Biol.Chem.276:30499-503,2001)。然而，這些技術(shù)常常導(dǎo)致差的細(xì)胞攝取以及細(xì)胞內(nèi)螯合作用進(jìn)入胞吞路徑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括胞內(nèi)運(yùn)輸核酸，所述核酸用其他途徑難以進(jìn)行轉(zhuǎn)染且不可能進(jìn)行顯微注射。例如，原代淋巴細(xì)胞很難進(jìn)行轉(zhuǎn)染，需要對(duì)DNA構(gòu)建物進(jìn)行電穿孔。這一過程效率很低，會(huì)殺死90-99%的細(xì)胞，小于10%的存活下來的細(xì)胞產(chǎn)生治療結(jié)果。本公開提供了融合多肽以及組合物，其可用在細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞調(diào)節(jié)中。本公開中的融合多肽包括包含膜運(yùn)輸功能的轉(zhuǎn)導(dǎo)部分結(jié)構(gòu)域以及足以可逆中和核酸上陰離子電荷的核酸結(jié)合域。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的融合多肽包括能夠與核酸結(jié)合域相互作用的陰離子核酸分子(如dsRNA)。-使用這些方法和組合物可以治療各種疾病以及病癥。例如，通過運(yùn)輸抗肺瘤siRNA可以抑制、阻止以及石皮壞腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。例如，抗腫瘤siRNA可以為靶向作用編碼爿f足進(jìn)血管生成的多肽的基因的siRNA。在本領(lǐng)域已知與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的各種血管生成蛋白。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，本公開不局限于任何特定的核酸結(jié)合域或核酸結(jié)構(gòu)域。相反，核酸結(jié)構(gòu)域可為任何核酸結(jié)合域，其能夠可逆中和或減少需要被運(yùn)輸?shù)暮怂嶂械年庪x子電荷。此外，任何帶有陰離子電荷的核酸(如dsRNA、siRNA和類似物)都可以使用此處所描述的方法和組合物進(jìn)行運(yùn)輸。本發(fā)明提供可用于對(duì)干擾RNA劑進(jìn)行運(yùn)輸?shù)姆椒ê徒M合物。RNA干擾(RNAi)是這樣一個(gè)過程，在該過程中信使RNA(mRNA)被小干擾RNA(siRNA)降解，該小干擾RNA來源于雙鏈RNA(dsRNA),該雙鏈RNA含有與需要進(jìn)行沉默的耙基因相同或非常相似的核苦酸序列。該過程阻止了通過轉(zhuǎn)錄后、翻譯前操作產(chǎn)生靶基因編碼的蛋白質(zhì)。因此，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)顯性疾病基因的沉默。涉及植物、蠅類以及蠕蟲的遺傳和生物化學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)它們具有相似的過程，在這些過程中dsRNA被一種稱為切酶即dsRNA核糖核苷酸內(nèi)切核糖核苷酸酶切割為短的干擾RNA(siRNA)(Bernstein爭(zhēng)乂，2001;Hamilton&Baulcombe,1999,Science286:950;MeisterandTuschl,2004,Nature431,343-9),因此可從原始的單個(gè)dsRNA產(chǎn)生多個(gè)分子。siRNA被載入多聚體RNAi沉默復(fù)合物(RISC),產(chǎn)生催化激活以及mRNA的靶向特異性(HannonandRossi，Nature431,371-378,2004;NovinaandSharp,Nature430,161-164,2004)。在siRNA載入RISC的過程中，反義鏈或引導(dǎo)鏈從siRNA中分離出來并停靠在RISC催化亞基Argonaute-2(Ago2)中(Leuschner爭(zhēng)乂，EMBORep.7,314-320,2006)。將mRNA從細(xì)胞核中導(dǎo)出進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中被認(rèn)為在抵達(dá)核糖體前要經(jīng)過活化的RISC,因此可進(jìn)行基因表達(dá)的直接、轉(zhuǎn)錄后、翻譯前調(diào)節(jié)。理論上，每一個(gè)細(xì)胞的mRNA均可通過選擇性RNAi應(yīng)答的誘導(dǎo)來進(jìn)行調(diào)節(jié)。21-23bp的siRNAs在有效地誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNAi應(yīng)答的能力現(xiàn)在是常規(guī)的(Sontheimer,Nat.Rev.Mol.CellBiol.6,127-138,2005)。siRNA的50%抑制濃度(IC5o)在10-100pM范圍內(nèi)，顯著低于具有1-10nM范圍的ICso的最好藥物。因此，由于其極好的選擇性，RNAi已成為細(xì)胞表型、定位遺傳路徑、發(fā)現(xiàn)以及驗(yàn)證治療目標(biāo)定向操作的基礎(chǔ)，并且具有重要的治療潛力。RNAi最受關(guān)注的方面包括(1)dsRNA,而不是單鏈反義RNA是干擾劑；(2)該過程是高度特異性的并且相當(dāng)有效(每個(gè)細(xì)胞僅需要幾個(gè)dsRNA分子就能進(jìn)行有效干擾)；(3)千擾活性(和假定的dsRNA)可引起遠(yuǎn)離引入位點(diǎn)的細(xì)胞和組織中的干擾。然而，有效地運(yùn)輸dsRNA是困難的。例如，分子重量為13,860道爾頓的21bpdsRNA不能穿過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，這是由于RNA的(1)大小以及(2)極度的負(fù)(酸性)電荷。將運(yùn)輸物進(jìn)行大分子融合到陽(yáng)離子多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)(也稱為細(xì)胞穿透肽，CPP)上，如TAT、8xArg、Antp(SnyderandDowdy,2005,ExpertOpin.DrugDeliv.2,43-51)，可被用于幫助大分子的攝取。PTD可用來將多種大分子運(yùn)輸物，包括多肽、蛋白質(zhì)、PNA以及DNA載體運(yùn)輸?shù)?00%的原代和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，以及大部分，但非全部的組織中。包含PTD的臨床前模型當(dāng)前正在幾個(gè)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試(Schwarze爭(zhēng)乂，1999,Science285,1569-1572;Eguchi爭(zhēng)乂，2001,J.Biol.Chem.276,2620426210;Koppelhus爭(zhēng)乂，2002,AntisenseNucleicAcidDrugDev.12,51-63)。陽(yáng)離子PTD通過大胞飲作用進(jìn)入到細(xì)胞中，大胞飲作用是一種所有細(xì)胞的特殊液態(tài)攝取形式。對(duì)模型小泡的生物物理學(xué)研究表明運(yùn)輸物從大胞飲體小泡中逃逸到細(xì)胞質(zhì)中時(shí)需要降低pH(Magzoub爭(zhēng)乂，2005,Biochemistry44,14890-14897)。PTD或CPP的陽(yáng)離子電荷對(duì)于分子橫向跨越細(xì)胞膜是必需的。意料之中的是，陽(yáng)離子PTD(6-8個(gè)正電荷)與陰離子siRNA(約40個(gè)負(fù)電荷)的綴合導(dǎo)致電荷發(fā)生中和并且PTD失活，無(wú)siRNA進(jìn)入細(xì)胞(Turner爭(zhēng)乂，2007,BloodCellsMolDis.,38(1),l隱7)。然而，陽(yáng)離子TAT和陰離子RNA(或DNA)通過可逆的二硫鍵的化學(xué)綴合導(dǎo)致陽(yáng)離子TATPTD的電荷中和，由此消除或降低對(duì)有效跨越細(xì)胞表面以及轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞所需的電荷。此外，由于大量的多余負(fù)電荷存在，如在21bpdsRNA上相對(duì)于TAT上有限陽(yáng)離子電荷的過量負(fù)電荷，任何綴合到RNA上的自由TATPTD都會(huì)產(chǎn)生聚集且出現(xiàn)肽-核酸綴合體發(fā)生沉淀。因此，盡管PTD具有很大的能夠?qū)⒋蠓肿觭iRNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的潛力，但是siRNA對(duì)PTD的電荷中和使得應(yīng)用該方法存在很大的障礙。本發(fā)明的方法和組合物可逆地掩蔽或中和了核酸(如dsRNA)上的電荷。本發(fā)明利用了核酸結(jié)合蛋白質(zhì)來掩蔽核酸上的陰離子，同時(shí)保留了跨越細(xì)胞膜所必需的陽(yáng)離子電荷，由此保持PTD的陽(yáng)離子活性使其能夠跨越細(xì)胞膜并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明提供了有用的方法和組合物來解決大分子的運(yùn)輸問題。為了避免PTD電荷中和以及解決siRNA運(yùn)輸問題，本發(fā)明的一種實(shí)施方式提供了一種通用的siRNA運(yùn)輸方法，其包括一可操作地連接到dsRNA結(jié)合域(DRBD)的PTD運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域，以形成結(jié)合了siRNA且掩蔽其負(fù)電荷的PTD-DRBD構(gòu)建物。DRBD以序列獨(dú)立的方式結(jié)合到siRNA上，該方式允許PTD-DRBD介導(dǎo)的向細(xì)胞內(nèi)的siRNA運(yùn)輸。使用PTD-DRBD運(yùn)輸siRNA，在所有受試細(xì)胞類型中均發(fā)現(xiàn)RNAi以非細(xì)胞毒性的方式對(duì)多個(gè)細(xì)胞靶產(chǎn)生應(yīng)答，包括原代成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、T和B細(xì)胞、巨嗟細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞以及人源胚胎干細(xì)胞(hESC)。例如，本發(fā)明顯示PTD的融合蛋白(如TAT運(yùn)輸肽)以及PKR的dsRNA結(jié)合域(DRBD)可有效地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。DRBD結(jié)合到dsRNA并覆蓋或寺備蔽dsRNA。一方面，可使用一個(gè)或多個(gè)DBRD來覆蓋dsRNA的陰離子表面。例如，一方面，2~4個(gè)DRBD覆蓋dsRNA的圓柱形表面。DRBD以序列獨(dú)立的方式結(jié)合到dsRNA，這意味著任何核酸(如siRNA)都可以在不需考慮序列組成的情況下使用本方法來進(jìn)行運(yùn)輸。可選的方法包括在核酸(如siRNA)和PTD-DRBD(如TAT-DRBD)融合蛋白之間設(shè)計(jì)出二硫鍵或酯鍵以進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)合親合力。該復(fù)合物隨后被還原并釋放到細(xì)胞內(nèi)部。同樣地，siRNA可覆蓋DRBD和以生物敏感的可逆方式直接綴合到siRNA的TAT?！㏄TD-DRBD-核酸復(fù)合物跨越膜，PTD-DRBD-核酸復(fù)合物隨后一皮還原并在細(xì)胞內(nèi)釋;故。然后通過切酶，一種類似RNAseIII的核糖核普酸酶對(duì)dsRNA進(jìn)行水解，以釋放出沉默靶基因的siRNA。因此，RNAi的選擇性治療人類疾病的效力能夠更有效地被運(yùn)輸?shù)绞荏w和細(xì)胞中。本發(fā)明克服了使RNAi難以運(yùn)輸和不能夠被運(yùn)輸?shù)拇笮∫约半姾傻南拗?。通過可逆中和核酸(如dsRNA)上的陰離子電荷，PTD能夠在離體以及活體內(nèi)將帶有陰離子電荷的核酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中。在本領(lǐng)域中已知曉多種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄域/肽,并且已顯示能夠有助于攝取連接到結(jié)構(gòu)域的異源分子(如運(yùn)輸物分子)。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)域通過一種稱為大胞飲作用的過程來幫助攝取。然而，大胞飲作用是所有細(xì)胞進(jìn)行的非選擇性形式的胞吞作用。因此，這種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的非選擇性方面也導(dǎo)致了大部分的PTD運(yùn)輸物在活體內(nèi)被轉(zhuǎn)導(dǎo)到非靶細(xì)胞，由此大大需要更多的原料。因此，從藥理學(xué)角度來講，PTD與當(dāng)前使用的小分子治療劑類似，其不能夠特異地運(yùn)輸?shù)交铙w內(nèi)期望的細(xì)胞及組織中。對(duì)能夠有效通過真核生物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜的幾種蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)得以確認(rèn)出衍生出肽傳導(dǎo)域的一類蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中表征最好的是果蠅同源蛋白antennapedia轉(zhuǎn)錄蛋白(AntHD)(Joliot爭(zhēng)乂，NewBiol.3:1121-34,1991;Joliot爭(zhēng)乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1864-8,1991;LeRoux爭(zhēng)乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:9120-4,1993)、單純性皰滲病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22(ElliottandO，Hare,Cell88:223-33,1997)、HIV-1轉(zhuǎn)錄激活TAT蛋白(GreenandLoewenstein,Cell55:1179-1188,1988;FrankelandPabo,Cell55:1189-1193,1988)以及最近的朊病毒蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子N誦端結(jié)構(gòu)域。不僅這些蛋白質(zhì)可以通過質(zhì)膜，而且與其它的蛋白質(zhì)如酶P-半乳糖香酶的結(jié)合，足以刺激這些復(fù)合物的細(xì)胞攝取。這種嵌合蛋白質(zhì)以生物活性的形式出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。對(duì)該過程的表征顯示以受體獨(dú)立的方式攝取這些融合蛋白的過程是快速的，常常發(fā)生在幾分鐘內(nèi)。此外，這些蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)似乎不會(huì)受細(xì)胞類型的影響，并且能夠有效地對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行約100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)，沒有明顯細(xì)胞毒性(Nagahara爭(zhēng)乂，Nat.Med.4:1449-52,1998)。除了全長(zhǎng)蛋白質(zhì)外，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域也被成功地用來誘導(dǎo)在細(xì)胞內(nèi)攝取DNA(Abu-Amer,見上)、反義寡核普酸(Astriab-Fisher爭(zhēng)乂，Pharm.Res,19:744-54,2002)、小分子(Polyakov爭(zhēng)乂，Bioconjug.Chem.11:762-71,2000)和甚至40納米的無(wú)機(jī)鐵粒子(Dodd爭(zhēng)人，J.Immunol.Methods256:89-105,2001;Wunderbaldinger爭(zhēng)乂，Bioconjug.Chem.13:264-8,2002;Lewin爭(zhēng)乂，Nat.Biotechnol.18:410-4，2000;Josephson爭(zhēng)乂，Bioconjug.,Chem.10:186-91,1999)，這些都表明該過程沒有明顯的大小限制。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)與異源分子(如多核苷酸、小分子或蛋白質(zhì))的融合足以引起它們以依賴于濃度的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)多種不同的細(xì)胞中。此外，用于蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)倪@項(xiàng)技術(shù)看似避開了與基于DNA和藥物的技術(shù)相關(guān)的問題。然而，需要重點(diǎn)提及的是RNAi分子是高價(jià)陰離子，和在本發(fā)明之前這類核酸分子還未能夠使用PTD進(jìn)行有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。PTD本身通常為陽(yáng)離子。這些陽(yáng)離子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域攜帶其連接的運(yùn)輸物進(jìn)入脂膜筏內(nèi)體，并通過破裂內(nèi)體小泡將它們的運(yùn)輸物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。PTD的例子包括AntHD、TAT、VP22、陽(yáng)離子朊病毒蛋白結(jié)構(gòu)域及其功能性片段。本發(fā)明提供了方法和組合物，其將PTD如TAT以及多精氨酸的使用與能夠?qū)怂?即"運(yùn)輸物")結(jié)構(gòu)域上的陰離子電荷進(jìn)行中和的核酸結(jié)合域組合在一起。這些組合物提供方法，由此治療或診斷劑能夠靶向作用細(xì)胞，因此PTD導(dǎo)致組合物^皮才聶取進(jìn)靶細(xì)胞內(nèi)。通常，融合分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)^4幾乎可以為任何合成或天然存在的氨基酸序列，其能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)或幫助轉(zhuǎn)導(dǎo)融合分子。例如，根據(jù)本發(fā)明可通過使用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域來完成轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)域?yàn)槔?，HIVTAT蛋白質(zhì)或其片段，其在N-末端或C-末端共價(jià)連接到核酸結(jié)合域(如DRBD)上、覆蓋了核酸結(jié)合域(如DRBD)的核酸上或同時(shí)連接到這二者上?？蛇x地，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域可含有antennapedia同源異型域或HSVVP22序列、朊病毒蛋白的N-末端片段或其合適的轉(zhuǎn)導(dǎo)片段，例如那些本領(lǐng)域已知的片段。PTD的類型和大小受到包括期望轉(zhuǎn)導(dǎo)程度的幾個(gè)參數(shù)的支配。通常，PTD至少能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)至少約20%、25%、50%、75%、80%或90%、95%、98%或達(dá)到，并且包括約100%的細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，通常表示為轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的百分比，可通過幾種常用的方法進(jìn)行確定。PTD會(huì)顯示細(xì)胞進(jìn)出速率(有時(shí)分別表示為k！和k2),其支持在細(xì)胞內(nèi)至少為皮摩爾量的融合分子。PTD以及任何運(yùn)輸物的進(jìn)出速率可使用可檢測(cè)標(biāo)記的融合分子通過標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)分析容易確定或至少被估計(jì)。通常，進(jìn)出速率的比率在約5~約100，到約1000的范圍內(nèi)?！矫妫捎糜诒景l(fā)明的方法和組合物中的PTD含有以基本上為(x-螺旋結(jié)構(gòu)為特征的肽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)PTD顯示顯著的a-螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)是最佳的。在另一種實(shí)施方式中，PTD包括含有堿性氨基酸殘基的序列，所述殘基基本上沿肽的至少一面排成直線?？捎糜诒景l(fā)明的PTD域可為天然存在的肽或合成的肽。在本發(fā)明的另一方面，PTD包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含強(qiáng)a螺旋結(jié)構(gòu)，其中精氨酸(Arg)殘基位于螺旋柱下方。在另一種實(shí)施方式中，PTD域含有下述通式表示的肽B廣X廣X2-X3誦B2-X4國(guó)Xs-B3(SEQIDNO:l)，其中B2、和B3分別獨(dú)立地為相同或不同的石威性氨基酸；且XpX2、X3、X4和X5分別獨(dú)立i也為相同或不同的a-螺旋結(jié)構(gòu)增強(qiáng)氨基酸。在另一種實(shí)施方式中，PTD域可使用下述通式表示B廣X廣X2-B2畫B3-XrX4-B4(SEQIDNO:2)其中B丄、B2、B3和B4分別獨(dú)立地為相同或不同的堿性氨基酸；且X^X2、X3和X4分別獨(dú)立地為相同或不同的a-螺旋結(jié)構(gòu)增強(qiáng)氨基酸。另外，PTD域含有基本殘基，如賴氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)，并且可進(jìn)一步含有至少一個(gè)足以將"扭結(jié)"引入到域中的脯氨酸(Pro)殘基。這類域的例子包括朊病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)域。例如，這種肽含有KKRPKPG(SEQIDNO:3)。在一種實(shí)施方式中，域?yàn)橥ㄟ^下述序列表示的肽X-X-R-X-(P/X)-(B/X)畫B-(P/X)隱X-B-(B/X)(SEQIDNO:4),其中X為任何a螺旋結(jié)構(gòu)的促進(jìn)殘基例如丙氨酸；P/X可以為脯氨酸或X為上面定義的殘基；B為堿性氨基酸殘基，如精氨酸(Arg)或賴氨酸(Lys);R為精氨酸(Arg)并且B/X可以為上面所定義的B或X。在另一種實(shí)施方式中，PTD為陽(yáng)離子，由7-10個(gè)氨基酸組成且具有式KX!RX2Xi(SEQIDNO:5)，其中X！為R或K，且乂2為任何氨基酸。這樣的肽的例子包含RKKRRQRRR(SEQIDNO:6)。根據(jù)本發(fā)明另外的轉(zhuǎn)導(dǎo)域包括TAT片段，其含有至少TAT片段中的氨基酸49-56,到全長(zhǎng)TAT序列(如參見SEQIDNO:7)。TAT片段可包括足以增強(qiáng)片段的a-螺旋的一個(gè)或多個(gè)氨基酸變化。在一些情況下，引入氨基酸變化會(huì)添加公認(rèn)的a-螺旋增強(qiáng)氨基酸?？蛇x地，氨基酸變化涉及從TAT片段中去除一個(gè)或多個(gè)阻礙a螺旋結(jié)構(gòu)的形成或穩(wěn)定性的氨基酸。在更為具體的實(shí)施方式中，TAT片段將包括至少一個(gè)氨基酸被a-螺旋增強(qiáng)氨基酸取代。盡管重組DNA技術(shù)可在某些情況下使用，但TAT片段通常是通過標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)制得。在一種實(shí)施方式中，對(duì)取代加以選擇，這樣在TAT片段中至少兩個(gè)堿性氨基酸殘基基本上與沿著這樣在TAT49-56序列中至少兩個(gè)堿性氨基酸殘基基本上沿著該序列的至少一面直線排列?？捎迷诒景l(fā)明的組合物和方法中的附加的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)(PTD)包括TAT片段，其中TAT49-56序列已被改性，這樣序列中至少兩個(gè)堿性氨基酸沿著TAT片段中的至少一面基本直線排列。示例性TAT片段包括在TAT的至少氨基酸49-56中的至少一個(gè)特定的氨基酸取代，該取代與沿著該段的至少一面與49-56序列上的堿性氨基酸殘基，通常TAT49-56序列直線排列。還包括嵌合PTD域。這種嵌合轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)包括至少兩種不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)的部分。例如，嵌合轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)可通過將兩種不同的TAT片段，如一種來自于HIV-1而另一種來自于HIV-2或者一種來自于朊病毒蛋白而另一種來自于HIV，進(jìn)行融合而形成。PTD可與任何數(shù)量的核酸結(jié)合域(如DRBD)進(jìn)行連接或融合。核酸結(jié)合域起中和或降低將通過PTD進(jìn)行運(yùn)輸?shù)暮怂岱肿拥年庪x子電荷的作用。核酸結(jié)合域通過充分減少陰離子電荷，這樣PTD域的陽(yáng)離子電荷通過跨越膜足以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)對(duì)含有核酸的融合構(gòu)建物的攝取?？蛇B接到PTD上的示例性的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)包括組蛋白、RDE-4蛋白或魚精蛋白。魚精蛋白是富含精氨酸的蛋白質(zhì)，包括如序列RSRRRRRRSCQTRRR(SEQIDN0:15)。其它的dsRNA結(jié)合蛋白以及在括號(hào)內(nèi)的它們登錄號(hào)包括PKR(AAA36409、AAA61926、Q03963)、TRBP(P97473、AAA36765)、PACT(AAC25672、AAA49947、NP609646)、Staufen(AAD17531、AAF98119、AAD17529、P25159)、NFAR1(AF167569)、NFAR2(AF167570、AAF31446、AAC71052、AAA19960、AAA19961、AAG22859)、SPNR(AAK20832、AAF59924、A57284)、RHA(CAA71668、AAC05725、AAF57297)、NREBP(AAK07692、AAF23120、AAF54409、T33856)、kanadaptin(AAK29177、AAB88191、AAF55582、NP499172、NP198700、BAB19354)、HYL1(NP563850)、hyponasticleaves(CAC05659、BAB00641)、ADAR1(AAB97118、P55266、AAK16102、AAB51687、AF051275)、ADAR2P78563、P51400、AAK17102、AAF63702)、ADAR3(AAF78094、AAB41862、AAF76894)、TENR(XP059592、CAA59168)、RNaseIII(AAF80558、AAF59169、Z81070Q02555/S55784、P05797)和切酶(BAA78691、AF408401、AAF56056、S44849、AAF03534、Q9884)、RDE-4(AY071926)、FLJ20399(NP060273、BAB26260)、CG1434(AAF48360、EAA12065、CAA21662)、CG13139(XP059208、XP143楊、XP110450、AAF52926、EEA14824)、DGCRK6(BAB83032、XP110167)、CG1800(AAF57175、EAA08039)、FLJ20036(AAH22270、XP134159)、MRP-L45(BAB14234、XP129893)、CG2109(AAF52025)、CG12493(NP647927)、CG10630(AAF50777)、CG17686(AAD50502)、T22A3.5(CAB03384)以及登錄號(hào)EAA14308。在本領(lǐng)域可根據(jù)登錄號(hào)知道這些核酸結(jié)合蛋白的序列。與所迷的登錄號(hào)相關(guān)的序列在此以引用的方式明確地全部并入本申請(qǐng)。核酸結(jié)合多肽可以包括任何上述登錄號(hào)的全長(zhǎng)多肽、任何上述的片段以及含有1~10個(gè)氨基酸取代的改性多肽，其中的氨基酸取代含有在上述列出的登錄號(hào)中指明的序列。可以理解的是PTD可與核酸進(jìn)行融合，其中核酸覆蓋足以減少任何陰離子電荷的一個(gè)或多個(gè)核酸結(jié)合域?？蛇x地，PTD也可操作地連接至核酸結(jié)合域(如DRBD)，其反過來覆蓋帶陰離子電荷的核酸。PTD和陰離子核酸分子(如dsRNA)可使用氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或磷酸二酯連接劑進(jìn)行連接。例如，含有3'-氨基并帶有3-碳接頭的siRNA可用于與將siRNA連接到PTD。siRNA通過異源雙功能交聯(lián)劑與PTD進(jìn)4亍綴合。在PTD與siRNA之間或DRBD與siRNA之間可形成二硫鍵，以助于靶向/定時(shí)釋放。在PTD與核酸或在DRBD與核酸之間的二硫鍵可發(fā)生斷裂以釋放出核酸。其中PTD可操作地連接到核酸結(jié)合域(如DRBD)，這兩個(gè)域可通過化學(xué)合成的或多核苷酸構(gòu)建物表達(dá)的肽接頭進(jìn)行連接，其中這兩個(gè)域可操作性連接，這樣它們的編碼框產(chǎn)生含有PTD域和DRBD域的單功能多肽。如提及的，這里公開的融合多肽的組份如PTD核酸結(jié)合域(如DRBD),以及核酸結(jié)構(gòu)域，和任選的肽接頭，可以按幾乎任意方式組織，只要保證融合多肽具有期望的功能(如足夠的陽(yáng)離子電荷)即可。本發(fā)明提供融合多肽或嵌合蛋白，其含有一個(gè)或多個(gè)連接至核酸結(jié)合域的PTD，該核酸結(jié)合域以直接或間接的方式連接至核酸結(jié)構(gòu)域(如治療或診斷DNA、RNA、siRNA和類似物)。這幾個(gè)域中的每一個(gè)都可以直4妄連接或^皮接頭肽分隔開來。域可以以任何順序出現(xiàn)。此外，融合多肽可含有幫助識(shí)別和/或純化融合多肽的標(biāo)記，如6xHIS標(biāo)記?？杀挥迷诒景l(fā)明的融合多肽和方法中的肽接頭基本包括約20或30個(gè)氨基酸，通常約10或15個(gè)氨基酸，更常見的1~5個(gè)氨基酸。接頭序列通常是柔性的，以不會(huì)將融合分子限定在一個(gè)單一的剛性構(gòu)象內(nèi)。接頭序列例如可用來如將PTD域與核酸結(jié)合域和/或核酸結(jié)構(gòu)域隔開。例如，肽接頭序列可位于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域和核酸結(jié)構(gòu)域之間，如提供分子柔性。選擇接頭部分的長(zhǎng)度，以對(duì)含有PTD域融合構(gòu)建物的多肽的生物活性實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化，并且可不通過過度實(shí)驗(yàn)而根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定。接頭部分應(yīng)足夠長(zhǎng)且足夠柔韌以允許核酸結(jié)合域自由地與核酸相互作用或反之亦然。接頭部分的例子為—Gly—Gly—、GGGGS(SEQIDNO:8)、(GGGGS)N(SEQIDNO:9)、GKSSGSGSESKS(SEQIDNO:10)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQIDNO:11)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQIDNO:12)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQIDNO:13)或EGKSSGSGSESKEF(SEQIDNO:14)。例如，在下述文章中有對(duì)連接部分的描述Huston爭(zhēng)乂，Proc.Nat，lAcad.Sci85:5879,1988;Whitlow爭(zhēng)乂，ProteinEngineering6:989,1993;以及Newton爭(zhēng)乂，Biochemistry35:545,1996。其它合適的肽接頭在美國(guó)專利4,751,180和4,935,233中進(jìn)行了描述，其在此以引用的方式并入。該公開提供了含有PTD和核酸結(jié)合蛋白的嵌合/融合多肽。一方面，嵌合/融合多肽含有PTD，其連接至對(duì)陰離子dsRNA電荷進(jìn)行掩蔽的雙鏈RNA結(jié)合蛋白?！矫妫景l(fā)明的融合構(gòu)建物可含有，除了PTD和核酸結(jié)合域外，靶向域。靶向域可為受體或受體配體，其用于將融合構(gòu)建物引導(dǎo)至對(duì)關(guān)聯(lián)結(jié)合域進(jìn)行表達(dá)的特定的細(xì)胞類型上。多肽(包括融合多肽)是指聚合物，其中單體是通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基。當(dāng)氨基酸為a-氨基酸時(shí)，可使用L-旋光異構(gòu)體或D-旋光異構(gòu)體。多肽含有氨基酸序列并且包括改性的序列如糖蛋白、逆反(retro-inverso)多肽、D-氨基酸改性的多肽等等。多肽包括天然存在的蛋白質(zhì)以及那些重組或合成的蛋白質(zhì)。多肽可以含有超過一個(gè)的域，其給予多肽的特定片段或部位功能。域，例如包含多肽的一部分，其顯示出至少一個(gè)有用的表位或功能域。兩個(gè)或多個(gè)域可以功能性接連，這樣每個(gè)域保留其功能并構(gòu)成單個(gè)的多肽(如融合多肽)。例如，PTD的功能片段包括一保留了轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的片段。生物功能性片段，例如大小變化，從小至能夠結(jié)合抗體分子的表位的多肽片段，到大至能夠參與細(xì)胞內(nèi)的特征誘導(dǎo)或規(guī)劃表型改變的大型多肽。在一些實(shí)施方式中使用了逆反肽。"逆反"表示在一個(gè)或多個(gè)氨基酸中發(fā)生tt-羧基反轉(zhuǎn)以及對(duì)映體變化(如左旋(L)到右旋(D))。本公開中的多肽包括如氨基酸序列的氨基-羧基反轉(zhuǎn)，含有一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸的氨基-羧基反轉(zhuǎn)，以及含有一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸的非反轉(zhuǎn)的序列。穩(wěn)定的并保留其生物活性的逆反才莫擬肽可通過Bmgidou"a/.(Biochem.Biophys.Res.Comm.214(2):685-693,1995)和Chorev"(TrendsBiotechnol.13(10):438-445,1995)中的描述進(jìn)行設(shè)計(jì)。逆反多肽的整個(gè)結(jié)構(gòu)特征類似于親代L-多肽的結(jié)構(gòu)特征。然而，這兩種分子大致為鏡像，這是因?yàn)樗鼈児蚕肀举|(zhì)上的手性二級(jí)結(jié)構(gòu)元素?；陔逆I反向和手性反轉(zhuǎn)的主鏈模擬肽表示了肽和蛋白質(zhì)的重要的結(jié)構(gòu)改變，這對(duì)于生物技術(shù)來講非常重要?？乖院兔庖咴钥赏ㄟ^新陳代謝穩(wěn)定的抗原如天然抗原肽的所有D-以及逆反異構(gòu)體獲得。這里提供幾種PTD衍生模擬肽。多肽及片段可與天然衍生的多肽或域具有相同或基本相同的氨基酸序列。"基本相同"表示氨基酸序列大部分，但不是完全相同，但保留了與其相關(guān)的序列的功能活性。功能活性的一個(gè)例子是片段能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)或能夠結(jié)合到RNA上。例如，這里對(duì)具有轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的全長(zhǎng)TAT片段進(jìn)行描述。通常，如果兩種多肽或域的序列至少85%、90%、95%、98%或99%相同，或在序列中有保守的改變，那么它們就是"基本相同"的。計(jì)算機(jī)程序，例如BLAST程序(Altschul爭(zhēng)乂，1990)可用來對(duì)比序列同一性。本公開中的多肽由通過肽鍵或改性的肽鍵即肽等構(gòu)物相互連接起來的氨基酸組成，并且還可以含有除20基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。對(duì)多肽的改性可通過天然過程完成，如翻譯后加工的處理，或通過本領(lǐng)域所熟知的化學(xué)改性技術(shù)來完成。這些改性在基本教科書和更為詳細(xì)的專著以及很多的研究文獻(xiàn)中有詳細(xì)的描述。在肽或多肽中進(jìn)行的改性可在任何位置發(fā)生，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基末端。應(yīng)當(dāng)理解的是，在給定的肽或多肽中，相同類型的改性可以在幾個(gè)位點(diǎn)以相同或不同的程度進(jìn)行。此外，給定的肽或多肽可以含有多種類型的改性。例如，肽或多肽受到泛素化而發(fā)生支化，并且其可以為帶有或不帶有支鏈的環(huán)。環(huán)狀、支化以及分支的環(huán)狀肽或多肽可以通過翻譯后加工的天然過程得到或通過合成方法得到。改性包括乙?；Ⅴ；DP-核糖基化、酰胺化、核黃素的共價(jià)結(jié)合、血紅素的共價(jià)結(jié)合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)結(jié)合、脂類或脂類衍生物的共價(jià)結(jié)合、磷脂酰肌醇的共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、脫曱基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；?、r羧化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、碘化、曱基化、豆蔻?；⒀趸?、聚乙二醇化、蛋白水解處理、磷酸化、戊烯化、外消旋、硒化、硫酸化、轉(zhuǎn)移-RNA介導(dǎo)的向蛋白質(zhì)中的氨基酸加入，如精氨酰化，以及泛素化。(例如參見，PROTEINS-STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES,2ndEd.,T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993);POSTTRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,AcademicPress,NewYork,pgs.1-12(1983);Seifter爭(zhēng)乂，MethEnzymol182:626-646(1990);Rattan爭(zhēng)乂，AnnN.Y.AcadSci663:48-62(1992》。本公開中的多肽域或融合多肽可通過常規(guī)/使用的方法合成，例如那些包括對(duì)a-氨基g吏基團(tuán)進(jìn)行t-BOC或FMOC保護(hù)的方法。這兩種方法均涉及分步合成，在合成中從肽的C末端開始，在每一步中加入單個(gè)氨基酸。(參見Coligan,爭(zhēng)乂，CurrentProtocolsinImmunology,WileyInterscience,1991,Unit9)。本公開中的多肽還可以通過眾所周知的固相肽合成法進(jìn)行合成，例如在Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149,1962;以及StewartandYoung,SolidPhasePeptidesSynthesis,Freeman,SanFrancisco,1969,pp.27-62的描述中，使用了每克聚合物中含有0.1-1.0mMol胺的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)。在完成化學(xué)合成后，在0。C使用液體HF-10。/。苯曱醚，處理約1/4-1小時(shí)將肽去保護(hù)并從聚合物中分離出來。將試劑蒸發(fā)后，使用1%的乙酸溶液將肽從聚合物中提取出來，然后將之凍干而得到粗制材料?？墒褂弥T如用乙酸作為溶劑，在SephadexG-15上凝膠過濾的技術(shù)對(duì)肽進(jìn)行純化。對(duì)柱洗脫液中合適的餾分進(jìn)行凍千得到均相肽，然后使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行表征，如氨基酸分析、薄層層析、高效液相色譜法、紫外光吸收光諳法、摩爾旋光度或測(cè)定溶解度。如需要，還可以使用固相埃德曼降解對(duì)肽進(jìn)行定量分析。另一方面，本公開提供一種用于制備含有PTD域以及核酸結(jié)合域或RNA的融合多肽的方法，該方法通過在多核苷酸能夠進(jìn)行表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有編碼融合多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞，并回收融合多肽而實(shí)現(xiàn)。對(duì)本公開中編碼融合多肽多核苷酸可操作地連接到啟動(dòng)子上以在原核或真核表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。例如，這種多核苷酸可合并到表達(dá)載體中。重組分子生物技術(shù)可用來連接例如PTD域與DRBD域生成本公開的多核苷酸，這樣表達(dá)后含有這些域的多肽在功能上有效。術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"或"可操作地結(jié)合"表示在通過調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)的多肽的調(diào)節(jié)和/或編碼域之間的功能連接，以及在融合多肽的編碼域之間的連接，這樣使得每個(gè)域都符合讀框地連接以得到所期望的多肽序列。因此，本公開還包括分離的對(duì)本公開內(nèi)的多肽進(jìn)行編碼的多核苷酸(如DNA、cDNA或RNA),包括本公開內(nèi)的融合多肽。編碼這里所描述的多肽的類似物、突變體、保守改變以及變異體的多核苷酸^fe包括在內(nèi)。這里使用的術(shù)語(yǔ)"分離的"表示多聚核苷酸，其基本不含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及與活體內(nèi)產(chǎn)生的多核苦酸天然結(jié)合的其它多核苷酸。通常，多核普酸中至少70%、80%或90%與其它物質(zhì)中分離，且用于在離體合成多核苷酸的常規(guī)方法可用來代替活體內(nèi)方法。這里所使用的"多核香酸，，表示脫氧核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，其以分離的片段或較大的基因構(gòu)建物組分的形式存在(如將啟動(dòng)子可操作地連接到對(duì)本公開的肽進(jìn)行編碼的多核苷酸上或可操作地連接到異源編碼域上)。許多基因構(gòu)建物(如質(zhì)粒或其它的表達(dá)載體)在本領(lǐng)域中是已知的并且可用來在無(wú)細(xì)胞系中或原核或真核(如酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中生成本公開的多肽?？紤]到遺傳密碼的簡(jiǎn)并，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地合成對(duì)本公開的多肽編碼的多核苦酸。本公開的多核苷酸可方便地用于常規(guī)的分子生物學(xué)方法中用來生成本公開的肽。這種多核苷酸包括天然生成的、合成的或目的操作的多核苷酸。對(duì)PTD域或DRBD域或其功能片段進(jìn)行編碼的多核香酸包括由于遺傳密碼簡(jiǎn)并后所形成的序列。對(duì)PTD域或DRBD域或其功能片段進(jìn)行編碼的多核苷酸序列可根據(jù)這里所提供的多肽序列以及參考這里所提供的登錄號(hào)很容易被確定。存在20種天然氨基酸，其中的大多數(shù)受一個(gè)以上的密碼子的編碼。因此，只要最終的多肽含有產(chǎn)生功能PTD或DRBD多肽域的氨基酸，則括含有所有簡(jiǎn)并的核苷酸序列的多核苷酸都包括在內(nèi)。對(duì)融合多肽及其域進(jìn)行編碼的多核苷酸可插入到"表達(dá)載體，，中。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體，，表示本領(lǐng)域已知的基因構(gòu)建物，如質(zhì)粒、病毒或其它的載體，其可設(shè)計(jì)成含有對(duì)本公開的多肽進(jìn)行編碼的多核苦酸。這類表達(dá)載體通常為含有啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒，該啟動(dòng)子序列有助于插入的基因序列在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體通常含有復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)子，以及允許進(jìn)行表型選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因(如抗生素抗性基因)。各種啟動(dòng)子，包括可誘導(dǎo)的和組成啟動(dòng)子，都可以用在本公開中。通常，表達(dá)載體含有復(fù)制位點(diǎn)和調(diào)控序列，其來自于與宿主細(xì)胞相容的物種?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)用多肽轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞為大腸桿菌(五.co/Z)時(shí)，能夠進(jìn)行DNA攝取的感受態(tài)細(xì)胞可使用本領(lǐng)域已知的CaCl2、MgCl2或RbCl方法進(jìn)行制備?？蛇x地，還可使用物理方法如電穿孔法或微注射法。電穿孔法通過高壓電脈沖而將多肽轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。另外，多核苦S交還可使用本領(lǐng)域熟知的方法通過原生質(zhì)體融合而被引入宿主細(xì)胞內(nèi)。用于對(duì)真核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的合適的方法，例如電穿孔法和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法也是已知的。本公開中包含的"宿主細(xì)胞，，可為任何細(xì)胞，在該細(xì)胞內(nèi)，本公開的多核苷酸可用來對(duì)其融合多肽或其功能域進(jìn)行表達(dá)。該術(shù)語(yǔ)還包括宿主細(xì)胞的任何子代。有用的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)、植物細(xì)胞以及動(dòng)物細(xì)胞。本公開的融合多肽可通過在原核生物中對(duì)融合多肽編碼的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)而制得。這些原核生物包括但不限于，微生物，如通過編碼本7>開的融合多肽的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。這些構(gòu)建物可在在大腸桿菌中進(jìn)行大規(guī)才莫表達(dá)用于離體分析。宿主細(xì)胞可為高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。向宿主細(xì)胞中51入構(gòu)建物可通過磷酸鉤轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孑L實(shí)現(xiàn)(Davis,L.,Dibner,M.,Battey，I.，BasicMethodsinMolecularBiology(1986))。合適的宿主細(xì)胞的代表性例子可敘述如下真菌細(xì)胞如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2以及斜紋夜蛾(spod叩tera)Sf9;動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑色素瘤；植物細(xì)胞等。根據(jù)這里的教導(dǎo)，對(duì)合適的宿主的選擇被認(rèn)為是在本公開的本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的。宿主細(xì)胞可為真核宿主細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。一方面，宿主細(xì)胞是適合在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物產(chǎn)生細(xì)胞。通常用在工業(yè)中的這類細(xì)胞的例子是CHO、VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos;Cos-7)、MDCK、293、3T3、C127、骨髓瘤細(xì)胞系(尤其是鼠)、PC12以及W138細(xì)胞。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞被廣泛用于制備多種復(fù)雜的重組蛋白，如細(xì)胞因子、凝血因子以及抗體(Brasel爭(zhēng)乂，Blood88:2004-2012,1996;Kaufman爭(zhēng)乂，J.BiolChem263:6352-6362,1988;McKinnon爭(zhēng)乂，JMolEndocrinol6:231-239,1991;Wood爭(zhēng)乂，J.Immunol145:3011-3016,1990)。二氫葉酸還原酶(DHFR)-缺陷突變細(xì)胞系(Urlaub爭(zhēng)乂，ProcNatlAcadSciUSA77:4216-4220,1980)是常用的CHO宿主細(xì)胞系，這是因?yàn)橛行У腄HFR可選擇的和可擴(kuò)增的基因表達(dá)系統(tǒng)使得在這些細(xì)胞中可進(jìn)行高水平重組蛋白表達(dá)(Kaufman,MethEnzymol185:527-566,1990)。此外，這些細(xì)胞作為粘附或懸浮培養(yǎng)基易于操作，并顯示出相對(duì)較好的遺傳穩(wěn)定性。CHO細(xì)胞以及在它們中表達(dá)的重組蛋白已經(jīng)被全面地地表征并且經(jīng)過管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于臨床生產(chǎn)。真核系統(tǒng)以及典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)允許對(duì)表達(dá)的哺乳動(dòng)物蛋白進(jìn)行合適的翻譯后改性。那些具有對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物合理加工、糖基化、磷酸化以及有益地分泌基因產(chǎn)品基因產(chǎn)物的細(xì)胞機(jī)器的真核細(xì)胞可^皮用作宿主細(xì)胞來對(duì)本公開的PTD-融合多肽進(jìn)行表達(dá)。這種宿主細(xì)胞系可包括^旦不局限于，CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、HEK-293以及WI38。對(duì)于長(zhǎng)期的、高產(chǎn)量的生產(chǎn)重組蛋白來講，通常使用穩(wěn)定的表達(dá)。不使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞可以使用由適合的表達(dá)控制元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的編碼本公開的融合多肽和選擇標(biāo)記的cDNA來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。選擇標(biāo)記賦予選擇性致死劑抗性，且在異源多核苷酸穩(wěn)定整合后，允許抗性細(xì)胞的生長(zhǎng)。這種抗性細(xì)胞生長(zhǎng)形成灶，其反過來可被克隆和擴(kuò)增到細(xì)胞系中。例如，在引入外源DNA后，工程細(xì)胞可^f皮允許在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基中。多種選擇系統(tǒng)可供使用，包括但不限于單純皰滲病毒胸苷激酶(Wigler爭(zhēng)乂，Cell,11:223,1977)、次黃噤呤-鳥噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026,1962),以及腺嘌呤-鳥噪呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy爭(zhēng)乂，Cell,22:8n,l兆0)基因可分別應(yīng)用于tk-，hgprt-或aprt-細(xì)胞中。另外，抗代謝物抗性可用于對(duì)以下進(jìn)行選擇的基礎(chǔ)dhfr，其賦予對(duì)甲氨蝶呤的抗性(Wigler爭(zhēng)乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:3567,1980;O'Hare爭(zhēng)乂，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8:1527,1981);gpt，其賦予對(duì)霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072,1981);neo,其賦予對(duì)氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin爭(zhēng)乂，J.Mol.Biol.,150:1,1981);以及hygro，其賦予對(duì)潮霉素基因的抗性(Santerre爭(zhēng)人，Gene,30:147,1984)。另外描述了選擇基因即，trpB,其允許細(xì)胞利用吲哚而不是色氨酸；hisD，其允i午細(xì)胞利用組氨醇而不是組氨酸(Hartman&Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8047,1988);以及ODC(鳥氨酸脫羧酶)，其賦予對(duì)鳥氦酸脫羧酶抑制劑、2-(二氟曱基)-DL-鳥氨酸、DFMO6勺^元'1"生(McConlogueL.,In:CurrentCommunicationsinMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratory,ed.,1987)。在酵母中，多種含有組成性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的載體可被使用(<列^口參見CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.2,Ed.Ausubel爭(zhēng)乂，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience,Ch.13,1988;Grant爭(zhēng)乂，"ExpressionandSecretionVectorsforYeast,"inMethodsinEnzymology,Eds.Wu&Grossman,Acad.Press,N.Y,Vol.153,pp.516-544,1987;Glover,DNACloning,Vol.II,IRLPress,Wash.,D.C.,Ch.3,1986;"Bitter,HeterologousGeneExpressioninYeast,"MethodsinEnzymology，Eds.Berger&Kimmel,Acad.Press,N.Y.,Vol.152,pp.673-684,1987;andTheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces,Eds.Strathem爭(zhēng)入,ColdSpringHarborPress,Vols.IandII,1982)。組成性酵母啟動(dòng)子，如ADH或LEU2，或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如GAL可被使用("CloninginYeast,"Ch.3,R.RothsteinIn:DNACloningVol.11,APracticalApproach,Ed.DMGlover,IRLPress,Wash.,D.C.,1986)。另外，還可使用促進(jìn)外源DNA序列整合到酵母染色體中的載體。行編碼的多核苷酸的宿主細(xì)胞來表達(dá)不同的域(如PTD或DRBD)。然后使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法(如在這里描述的方法)對(duì)域進(jìn)行純化。接著將域進(jìn)行直接或間接的化學(xué)連接(例如用肽接頭)而形成融合的多肽。可選地，對(duì)融合多肽編碼的多核苷酸在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)并且使用已知的方法對(duì)融合多肽進(jìn)行純化，而不論采用哪種方法形成融合多肽；將融合多肽與核酸(如帶陰離子電荷的dsRNA)在核酸結(jié)合蛋白(如DRBD)與核酸以序列獨(dú)立的方式進(jìn)行相互作用接觸條件下接觸。融合構(gòu)建物可含有一個(gè)或多個(gè)核酸結(jié)合蛋白(如DRBD)。一方面，核酸分子(如dsRNA)與至少兩個(gè)核酸結(jié)合蛋白進(jìn)行相互作用。任何本領(lǐng)域已知的用于蛋白質(zhì)純化的方法均可以用來分離本公開中的多肽域或融合多肽。例如，可使用制備色譜分離法以及免疫分離法(例如那些使用單克隆或多克隆的抗體的分離方法)。載體肽可幫助融合多肽的分離。這類載體肽或純化標(biāo)記物可操作地連接到本公開的PTD、DRBD或PTD-DRBD融合多肽上。例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)可采用谷胱甘肽瓊脂糖親和柱進(jìn)行純化。當(dāng)來自于金黃色葡萄球菌Otop/j;;/ococa^aweM)的蛋白質(zhì)A或ZZ域被用作標(biāo)記物時(shí)，可使用IgG隱瓊脂糖凝膠親和柱一步完成純化。屬于綠膿桿菌(i^eM^w朋ay爿en/gz朋w)外膜蛋白質(zhì)F的N端半分子的pOprF肽很容易被純化，這是因?yàn)槠涫峭饽ぶ苽湮镏型怀龅鞍追N。如需要，融合蛋白可使用試劑進(jìn)行純化，這些試劑可與融合肽的殺微生物肽功能片段進(jìn)行特異地反應(yīng)(例如特異的結(jié)合)。例如，與DRBD與PTD域發(fā)生特異結(jié)合的單克隆或多克隆抗體可^f皮用在常規(guī)的純化方法中。在本領(lǐng)域中已熟知這類抗體的制備技術(shù)。本公開的融合多肽還可設(shè)計(jì)成含有幫助蛋白質(zhì)回收的裂解位點(diǎn)或其它可將PTD從核酸結(jié)合蛋白或dsRNA分子中分離出來的接頭部分。如這里所使用的，核酸結(jié)構(gòu)域可為任何多核苷酸(如核酶、反義分子、多核苷酸、寡核苷酸等)。在這里提供的具體的例子中，核酸結(jié)構(gòu)域含有dsRNA。含有與耙基因的核苷酸序列互補(bǔ)的siRNA序列的dsRNA可以通過任意種的方法制備。本領(lǐng)i或已知確^人siRNA序列的方法和一支術(shù)。在提供來自國(guó)家生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)網(wǎng)站(可訪問網(wǎng)址為ncbi.nlm.nih.gov)處獲得的登錄號(hào)或GI號(hào)后，可由WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,MassachusettsInstituteofTechnology,Cambridge,Massachusetts(目前可i方問網(wǎng)i止為http:〃jura.wi.mitedu/bioc/siRNAext/)的siRNA選擇程序獲得siRNA核苷酸序列?？蛇x地，含有合適siRNA序列的dsRNA可使用MiyagishiandTaira的方法(2003)確定。通常，dsRNA序列越長(zhǎng)，陰離子電荷的增加要求額外的DRBD或其它核酸結(jié)合蛋白。也存在可通過商業(yè)獲得的RNAi的設(shè)計(jì)算法(http:〃rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)?？赏ㄟ^商業(yè)渠道來定制RNA。一旦獲得后，含有siRNA序列的RNA分子可通過核酸結(jié)合蛋白結(jié)合或直接或間接連接到本公開的PTD域。將dsRNA可操作地連接到PTD或在特定條件下進(jìn)行溫育，這樣含有核酸結(jié)合蛋白(如DRBD)或核酸結(jié)合蛋白的PTD與dsRNA進(jìn)行相互作用。通常，dsRNA與核酸結(jié)合蛋白的相互作用會(huì)導(dǎo)致復(fù)合物(例如DRBD和dsRNA)的整體陰離子電荷的減少。本發(fā)明的方法、組合物以及融合多肽增強(qiáng)了對(duì)核酸分子的攝取和釋放。這里使用的術(shù)語(yǔ)"治療劑"表示其普通含義，包括治療劑、預(yù)防劑以及替代劑。治療劑分子的例子包括但不局限于，細(xì)胞周期控制劑、抑制細(xì)胞周期蛋白形成的劑，如siRNA多核苷酸對(duì)細(xì)胞周期蛋白Gl以及Dl基因的抑制；能夠進(jìn)行裂解為針對(duì)特定生長(zhǎng)因子的siRNA分子的dsRNA,其中生長(zhǎng)因子例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、促紅細(xì)胞生成素、G-CSF、GM-CSF、TGF-a、TGF-卩以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；細(xì)胞因子，包括但不局限于，白細(xì)胞間介素1~13以及腫瘤壞死因子；抗凝劑、抗血小板劑；TNF受體域等等。4吏用這些方法和組合物可以治療各種疾病以及病癥。例如，運(yùn)輸抗腫瘤siRNA后，可以抑制、阻止以及石皮壞肺瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。例如，抗胂瘤siRNA可以為靶向作用編碼促進(jìn)血管生成的多肽的基因的siRNA。在本領(lǐng)域已經(jīng)熟知與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的各種血管生成蛋白。本發(fā)明的融合多肽可用于運(yùn)輸帶陰離子電荷的核酸分子(例如dsRNA、siRNA、DNA、反義、核酶等等)，用于對(duì)許多疾病和病癥的治療和/或診斷。例如，融合多肽可用于治療細(xì)胞增生癥，其中核酸結(jié)合域(如DRBD)對(duì)核酸上的電荷進(jìn)行中和，這些核酸被用于耙向作用誘導(dǎo)細(xì)胞增生的基因。PTD域有助于攝取融合多肽以及核酸結(jié)合域(如DRBD)。因此，融合多肽可用于對(duì)具有細(xì)胞增生癥的細(xì)胞進(jìn)行治療。類似地，本發(fā)明的融合多肽可用于治療炎性疾病和病癥、感染、血管疾病和病癥等。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是本公開不局限于任何特定的核酸結(jié)合域或核酸結(jié)構(gòu)域。相反，核酸結(jié)構(gòu)域可為任何核酸結(jié)合域，其能夠中和或減少需要被運(yùn)輸?shù)暮怂嶂械年庪x子電荷。此外，任何帶有陰離子電荷的核酸(如dsRNA、siRNA等)都可以使用本發(fā)明中的方法進(jìn)行運(yùn)輸。盡管融合多肽可以作為藥物組合物-故單獨(dú)施用，^旦通常本公開的融合多肽與藥學(xué)上可接受的載體配制為藥物組合物。本公開的藥物組合物用載體、賦形劑和添加劑或助劑可制備成包括本公開的融合多肽的適合對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行施用的形式。經(jīng)常使用的載體或助劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其它糖類、云母、乳蛋白、明膠、淀;盼、維生素、纖維素及其衍生物、動(dòng)物油和;f直物油、聚乙二醇及溶劑，如無(wú)菌水、醇類、甘油和多元醇。靜脈內(nèi)載體包括液體以及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。防腐劑包括抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體。其它的藥學(xué)上可接受的載體包括水溶液、無(wú)毒性的賦形劑包括鹽、防腐劑、緩沖劑等，如Remington'sPharmaceuticalSciences,15thed.,Easton:MackPublishingCo.,1405-1412,1461-1487(1975)以及TheNationalFormularyXIV"14thed.,Washington:AmericanPharmaceuticalAssociation(1975)中戶斤描述的，其內(nèi)容在此通過引用的方式并入。根據(jù)本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)對(duì)藥學(xué)組合物的各種組份的pH以及精確濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)?？蓞⒖糋oodmanandGilman's,ThePharmacologicalBasisforTherapeutics(7thed.)。本公開的藥物組合物可局部或系統(tǒng)施用。"治療有效劑量"表示預(yù)防、治療或至少在某種程度上抑制疾病或病癥的癥狀(如抑制細(xì)胞繁殖)所需要本公開融合多肽的量。當(dāng)然，所使用的有效量需取決于疾病的嚴(yán)重程度以及研究對(duì)象的體重和通常狀況。通常，在離體使用的劑量可對(duì)原位施用藥物組合物所需要的量提供有用的指導(dǎo)，且可用動(dòng)物模型來確定治療特定病癥所需要的有效劑量。在Langer,Science,249:1527,(1990);Gilman"a/.(eds.)(1990)中對(duì)各種考慮的因素進(jìn)行了描述，其在此通過引用的方式并入。這里所使用的"施用治療有效劑量"旨在包括對(duì)能夠發(fā)揮出所期望的治療功效的研究對(duì)象給予或施用本公開的藥物組合物的方法。治療有效劑量可根據(jù)因素進(jìn)行改變，如研究對(duì)象的感染程度、個(gè)體的年齡、性別以及體重。給藥方案可經(jīng)調(diào)整而^是供最佳的治療應(yīng)答。例如，可每日施用分次劑量或可才艮據(jù)治療中出現(xiàn)的緊急事件而成比例地減少劑量。藥物組合物可以合適方式施用，如通過注射(如皮下、靜脈等)、口服、吸入、經(jīng)皮給藥或直腸施用。根據(jù)施用途徑，可對(duì)藥物組合物進(jìn)行包衣以保護(hù)藥物組合物不受可使藥物組合物失去活性的酶，酸和其他天然條件的作用(例如本領(lǐng)域熟知的腸溶衣)。藥物組合物還可進(jìn)行腸胃外或腹膜內(nèi)施用。分散液可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇或這二者的混合物以及油中進(jìn)行制備。在正常的存儲(chǔ)和使用條件下，這些制備物中可含有防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。適合進(jìn)行注射使用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(此處可溶解于水)或分散液或可即時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。組合物通常是無(wú)菌的以及是易于進(jìn)行注射的液態(tài)。通常組合物在生產(chǎn)條件下保持穩(wěn)定并且能夠存儲(chǔ)和防止微生物，如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以為溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(如丙三醇、丙二醇以及液態(tài)聚乙二醇等)，它們合適的混合物以及植物油。例如，通過使用合適的包衣如卵磷脂，在分散液的情況下，通過在分散液中保持所需要的粒子大小，以及通過使用表面活性劑可以保持合適的流動(dòng)性。通過各種抗菌以及抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸脂類、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等，可實(shí)現(xiàn)防止微生物作用。在許多情況下，等滲劑例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化鈉可以被用在組合物中?？勺⑸浣M合物的長(zhǎng)效吸收可通過在組合物中包含延遲吸收的試劑，例如一硬脂酸鋁和明膠而實(shí)現(xiàn)。制備無(wú)菌可注射的溶液可將藥物組合物按需要的量加入到具有上述所列舉的一種組分或組合組分的適當(dāng)溶劑中，再按需要進(jìn)行過濾消毒。通常，分散液是通過將藥物組合物加入到無(wú)菌載體中制得，其中載體含有一種基本的分散介質(zhì)以及來自于上述列舉的所需要的其它組分。例如，具有惰性稀釋劑或可吸收食用載體的藥物組合物可進(jìn)行口服。藥物組合物和其它的組分還可封裝到硬殼或軟殼明膠膠嚢中，壓縮成藥片或直接添加到研究對(duì)象的飲食中。對(duì)于口服治療來講，藥物組合物中可加入賦形劑并以可吸收藥片、含片、錠劑、膠嚢、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙嚢劑等的形式使用。這種組合物和制備物應(yīng)含有至少1重量％的活性化合物。當(dāng)然，組合物和制備物的含量可以變化并且適宜地在整個(gè)單位重量的約5%~約80%。藥片、片劑、藥丸、膠嚢等還可含有下述物質(zhì)粘合劑，如西黃蓍膠、金合歡膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸等；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂以及增甜劑如蔗糖、乳糖或糖精或者調(diào)味劑如薄荷油、冬青油或櫻桃香精。當(dāng)劑量單位的形式是膠嚢時(shí)，其除了含有上述類型的材料外還含有液體載體。也可存在各種其他的材料作為包衣或用來改變劑量單位的物理形式。例如，藥片、藥丸或膠嚢可用蟲膠、糖或二者包衣。糖漿或酏劑中可含有試劑、蔗糖作為增甜劑、作為防腐劑的對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯，染料以及調(diào)味劑，如櫻桃香精或橙香精。當(dāng)然，在制備任何劑量單位形式中使用的任何材料都應(yīng)為藥用純并且在使用量中基本無(wú)毒性。此外，藥物組合物可加入到緩釋制備物和制劑中。因此，"藥學(xué)上可接受的載體"包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌制劑、等滲和吸收延遲劑等。使用這些介質(zhì)和試劑作為藥學(xué)活性物質(zhì)為本領(lǐng)域熟知。除了那些現(xiàn)已知的與藥物組合物不相容的那些傳統(tǒng)介質(zhì)或試劑之外，在治療組合物和治療方法中的使用這些介質(zhì)和試劑被包括在內(nèi)。也可在組合物中添入補(bǔ)充活性化合物。以劑量單位的形式配制成腸道外組合物的特別有利之處在于易于施用并且劑量統(tǒng)一。這里使用的"劑量單位形式"表示物理離散單位，其適合用作被治療的研究對(duì)象的單位劑量；含有預(yù)先確定量的藥物組合物的每個(gè)單位是經(jīng)過計(jì)算得到，其與期望的藥物載體組合使用時(shí)可產(chǎn)生期望的治療效果。本公開的劑量單位形式的規(guī)格與藥物組合物的特性以及需要獲得的特定的治療效果相關(guān)。為了以有效量方便以及有效地施用，將主要藥物組合物與可接受劑量單位的合適的可藥用載體進(jìn)行復(fù)合。在組合物含有補(bǔ)充活性成份的情況下，通過參考所述成卩分的常規(guī)劑量以及施用方式來確定組合物的劑量。下面的實(shí)施例是對(duì)本公開發(fā)明進(jìn)行闡述，但不局限于此。實(shí)施例PTD-DRBD融合蛋白pPTD-DRBD的構(gòu)建物設(shè)計(jì)以及純化可以通過/人人源HepG2cDNA庫(kù)PCR克隆PKRDRBD-1，隨后插入到含有單個(gè)N-末端TATPTD、HA表位標(biāo)記以及C-末端6xHis純化標(biāo)記的NpTAT載體中構(gòu)建(Wadia爭(zhēng)乂，2004)。向N-端中插入另外兩個(gè)的TATPTD以生成pPTD-DRBD。為制備表達(dá)EGFP-PEST(dGFP)或DsRed-PEST(dDsRed)慢病毒的VSVG,從pCSC-SP-CW(Miyoshi爭(zhēng)乂，1998)和pd2EGFP-Nl-或pDsRed-Express-DR(BDclontech)中構(gòu)建pCSC-SP-CW-EGFP腸PEST或pCSC-SP-CW-DSRED。為了進(jìn)行蛋白表達(dá)，使用pPTD-DRBD對(duì)BL21condonplus(DH3)大腸桿菌(Strategene)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在37°C下在LB中進(jìn)行培養(yǎng)，然后在使用400pMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)后于25°C下培養(yǎng)12小時(shí)。在4,500g下進(jìn)行離心5分鐘對(duì)細(xì)胞進(jìn)行回收，在緩沖液A(20mMHepes[pH7.5],500mMNaCl,5pg/ml抑蛋白酶肽，1pg/ml亮抑蛋白酶肽，0.8mMPMSF)加20mM咪唑進(jìn)行超聲并且在50,000g下進(jìn)行離心15分鐘分離出可溶蛋白。PTD-DRBD通過Ni-NTA柱(Qiagen)進(jìn)行純化，隨后負(fù)載到緩沖液B(50mMHepes[pH7.5],20mMNaCl,5%甘油)中的Mono-SAKATFPLC并在緩沖液C(緩沖液B加5MNaCl)中洗脫。純化的PTD-DRBD用PBS-10。/。甘油進(jìn)行透析，在50^MPTD-DRBD快速冷凍并存儲(chǔ)在-2(TC。細(xì)胞培養(yǎng)的條件。H1299、HaCaT、HFF、B16F0細(xì)胞在10%FBS-DMEM、抗生素中進(jìn)行培養(yǎng)。T98G細(xì)胞在5%FBS-MEM、抗生素中進(jìn)行培養(yǎng)。JurkatT細(xì)胞與NamalwaB細(xì)胞在10%FBS-RPMI、抗生素中進(jìn)行培養(yǎng)。THP-1巨喧細(xì)胞在10%FBS-RPMI加1mM丙酮酸鈉、4.5g/L葡萄糖、50pM|3-巰基乙醇、抗生素中進(jìn)行培養(yǎng)。hESC系HUES9是一饋贈(zèng)物，而H9hESC是從WiCell中獲得的。H9hESC在鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的加有55P-巰基乙醇20%敲除(knockout)血清-DMEM國(guó)F12、NEAA、Gluta-Max、4ng/mlbFGF、抗生素中進(jìn)行培養(yǎng)。HUES9hESC在HUES培養(yǎng)基(10%敲除血清-DMEM力。10%Plasmonate、55pM|3-巰基乙醇、NEAA、Gluta-Max、4ng/mlbFGF、抗生素)中生長(zhǎng)，在對(duì)鼠成纖維細(xì)胞預(yù)處理24小時(shí)的培養(yǎng)基中沒有伺養(yǎng)層。用表達(dá)dGFP和/或dDsRed慢病毒的VSVG進(jìn)行感染以得到表達(dá)dGFP和dDsRed的細(xì)胞。使用FACS對(duì)VSVG-dGFP和/或VSVG-dDsRed感染的細(xì)胞進(jìn)行分離。將PTD-DRBDsiRNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中。典型的PTD-DRBDsiRNA運(yùn)輸反應(yīng)進(jìn)行如下將水中10pl的1-5siRNA與PBS-10%甘油中10pl的10-50[iMPTD-DRBD加4plPBS-10o/o甘油在水上進(jìn)行混合45分鐘，培養(yǎng)基中進(jìn)行1:5的稀釋并加入到7.5x104細(xì)胞/孔的48孔板中保持6小時(shí)，最終的siRNA濃度在100-400nM之間。然后用胰蛋白酶沖洗細(xì)胞以去除細(xì)胞外的PTD-DRBD:siRNA,隨后加入新鮮的培養(yǎng)基以及FBS?；蛘邔⒓?xì)胞與PTD-DRBD:siRNA同時(shí)涂平板保持6小時(shí)，使用力口入58pg/ml^i酸肝素的培養(yǎng)基沖洗10分鐘，隨后加入新鮮的加入FBS的培養(yǎng)基。對(duì)于Jurkat、Namalwa、THP-1懸浮細(xì)胞，在培養(yǎng)基加10%Q-血清(5mlFBS+1mlSource30Q樹脂[mershamBioscience]室溫下在混合平臺(tái)上混合30min再進(jìn)行0.22過濾)中使用100-200nMsi西A:PTDDRBD對(duì)2x105細(xì)J包進(jìn)行處理1小時(shí)，，用培養(yǎng)基沖洗兩次，隨后加入新鮮的完全培養(yǎng)基。對(duì)于H9和HUES9hESC,在無(wú)飼料層的無(wú)血清的培養(yǎng)基中使用200-400nMsiRNA-PTD-DRBD對(duì)6.6x105細(xì)胞進(jìn)行處理1小時(shí)，隨后在成纖維細(xì)胞飼料層上無(wú)血清的培養(yǎng)基中處理5小時(shí)，然后使用全HUES培養(yǎng)基加血清處理24小時(shí)。對(duì)于siRNA對(duì)照，細(xì)胞用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-2000(Invitrogen)中的100nMsiRNA根據(jù)生產(chǎn)廠家的教導(dǎo)處理。在該研究中使用到的siRNAs序列EGFP1、EGFP2(沉默子GFP)、GAPDH、Oct-4、Nanog、Sox2、Cdk4以及沉默子陰性對(duì)照(Ambion);pGL3-熒光素酶(Luc)以及DsRed(Dharmacon);和EGFRvIII(FanandWeiss,2005)。免疫印跡以及RT-PCR用胰蛋白酶/EDTA回收48孔板中的7.5x104細(xì)胞/孔，在水上在RIPA緩沖液(1%TritonX-100,]%脫氧膽酸鈉，40mMTris-HCl,150mMNaCl,0.2%SDS,5嗎/ml抑蛋白酶肽，1嗎/ml亮抑蛋白酶肽，0.8mMPMSF)中裂解30分鐘制備全細(xì)胞的裂解產(chǎn)物，離心澄清溶液并使用10。/oSDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。免疫印跡分析在用4%脫脂乳、PBS-T(0.05%PBS,Tween20)在室溫下封閉1小時(shí)的PVDF膜上進(jìn)行，在4°C下與抗-Oct4(SantaCmz),抗-GAPDH(SantaCmz)抗體隔夜反應(yīng)，與抗-a-微管蛋白(Sigma)抗體反應(yīng)1小時(shí)，洗滌，暴露于HRP綴合的抗-IgG(Santacruz)抗體并通過ECL(Pierce)進(jìn)行檢測(cè)。為了進(jìn)行GAPDHmRNATaqManTMRT-PCR(AppliedBiosystems)，如上所述用400nMGAPDH或?qū)φ諢晒馑孛竤iRNA來處理48孔板中的7.5x104dGFP-H1299細(xì)胞/孔，在加入后的6、12、24、36、72和96小時(shí)后分離總的RNA。使用Oligo-dT來合成cDNA并用TAQ-MAN探針(Ambion)在7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems)上檢測(cè)GAPDHmRNA表達(dá)。免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)分析。用4%低聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞30分鐘，在室溫下于0.1%TritonX100PBS中滲透15分鐘，在室溫下于3。/。脫脂奶-PBS中封閉30分鐘，然后在4°C下與在0.1%BSA-PBS中的抗Oct4(SantaCruz)、抗-SSEA4(SantaCruz)和抗-GATA6(SantaCruz)抗體隔夜反應(yīng)。洗滌細(xì)胞并與Alexa488或Alexa594綴合的抗-IgG(MolecularProbes)在室溫下反應(yīng)30分鐘。使用Hoechst33342(MolecularProbes)對(duì)DNA進(jìn)行復(fù)染。使用共焦顯微鏡(Olympus)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。對(duì)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，在指定的時(shí)間內(nèi)在FACScan(BDBiosciences)上對(duì)1x104dGFP和/或dDsRed陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析。siRNA的PTD-dsRNA結(jié)合域融合物的運(yùn)輸在研發(fā)siRNA運(yùn)輸策略之前，需確定的三個(gè)入選標(biāo)準(zhǔn)l)siRNA運(yùn)輸?shù)?00%的所有細(xì)胞類型中(原代的或轉(zhuǎn)化的)，2)無(wú)細(xì)胞毒性，以及3)siRNA序列獨(dú)立，這樣所有的siRNA都能應(yīng)用該方法。陽(yáng)離子PTD的已證實(shí)的大分子運(yùn)輸性質(zhì)^皮用于siRNA運(yùn)輸。然而，為了避免電荷中和的問題，將PTD融合到dsRNA結(jié)合域(PTD-DRBD)上(圖1A)。DRBD通過使兩個(gè)大溝中的2，-OH接觸而特異結(jié)合到具有高親合力的dsRNA上，在螺旋結(jié)構(gòu)的90。表面象限上連接大溝形成4xDBRD掩蔽的~16bpdsRNA(RyterandSchultz,1998)。產(chǎn)生了多種PTD-DRBD融合組合，純化達(dá)到同質(zhì)并對(duì)各種PTD-DRBD融合組合進(jìn)行測(cè)試，基于顯示未掩蔽的siRNA突出端中和第一和/或第二PTD的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(圖1A和1B)放置PTD-PTD-HAtag-PTD-DRBD。向雙鏈siRNA中加入PTD-DRBD導(dǎo)致多個(gè)亞基以濃度依賴的方式進(jìn)行特異且迅速的結(jié)合。對(duì)PTD-DRBD運(yùn)輸siRNA至細(xì)胞中的能力進(jìn)行檢測(cè)。含有PTD-DRBD的Cy3-標(biāo)記的siRNA加入細(xì)胞導(dǎo)致群體的所有細(xì)胞的siRNA細(xì)胞才聶耳又，而對(duì)照Cy3-標(biāo)記的siRNA則不能進(jìn)入細(xì)胞(圖ID)。為了檢驗(yàn)RNAi應(yīng)答的PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)膕iRNA誘導(dǎo)，生成人源H1299肺腺癌報(bào)道細(xì)胞系，其含有多個(gè)整合拷貝數(shù)的載體，該載體組成性表達(dá)比野生型蛋白質(zhì)(>24hr)半衰期顯著短的(-2hr)的去穩(wěn)定的eGFP-PEST(dGFP)和去穩(wěn)定的DsRed-PEST(dDsRed)蛋白質(zhì)。dGFP/dDsRed整合的報(bào)道分子可直接確定單細(xì)胞，由此確定出在群體中正在經(jīng)歷RNAi應(yīng)答的細(xì)胞百分比，而其它的報(bào)道分子如熒光素酶或mRNA測(cè)定則不能。使用PTD-DRBD、對(duì)照DRBD、對(duì)照PTD肽或?qū)φ罩|(zhì)轉(zhuǎn)染結(jié)合多個(gè)GFP、DsRed和對(duì)照siRNAs對(duì)H1299dGFP/dDsRed報(bào)道細(xì)胞進(jìn)行處理。對(duì)siRNA處理的報(bào)道細(xì)胞在24小時(shí)進(jìn)行流式細(xì)胞分析dGFP和dDsRed的表達(dá)以及細(xì)胞生存力(圖IE,圖6)。重要的是，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑僅用作獨(dú)立的對(duì)照而未與任何PTD-DRBD樣品使用。加入單獨(dú)的PTD-DRBD、對(duì)照PTD肽或?qū)φ誅RBD(無(wú)PTD)與GFPsiRNA組合，不會(huì)對(duì)dGFP或dDsRed的表達(dá)水平產(chǎn)生影響。相反，向細(xì)胞中加入GFPs]'RNAs和PTD-DRBD會(huì)誘發(fā)dGFP的RNAi顯著敲減而不會(huì)改變內(nèi)對(duì)照dDsRed。同樣地，加入PTD-DRBD和DsRedsiRNA將導(dǎo)致dDsRed敲減而dGFP的表達(dá)不會(huì)改變。對(duì)總共5個(gè)序列獨(dú)立的GFPsiRNA進(jìn)行測(cè)試，所有的這5個(gè)都誘發(fā)了GFP特異性RNAi應(yīng)答，而對(duì)照dDsRed無(wú)改變，其中的2個(gè)示于圖1E中。由PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)腉FPsiRNA對(duì)dGFP的降低也明顯強(qiáng)于GFPsiRNAs的對(duì)照脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體(圖IE)。加入含有兩種經(jīng)驗(yàn)證的RISC負(fù)載的對(duì)照siRNA的PTD-DRBD、陰性沉默子(SN)以及熒光素酶(Luc)，對(duì)dGFP或dDsRed的信號(hào)無(wú)改變。很少到?jīng)]有檢測(cè)出PTD-DRBD處理的細(xì)胞中細(xì)胞生存力的變化，而脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體導(dǎo)致可測(cè)的細(xì)胞毒性(圖6)。用單細(xì)胞流式細(xì)胞分析檢測(cè)出由PTD-DRBD對(duì)造成的顯著更強(qiáng)的dGFPRNAi敲減應(yīng)答(圖IE)。在加入后24小時(shí)，PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)膁GFPsiRNA在100%的細(xì)胞中誘發(fā)了最大的GFPRNAi應(yīng)答(圖2A)。相反，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體運(yùn)輸?shù)膕iRNA誘發(fā)的RNAi應(yīng)答既不完全又是部分穿透的，具有一群未反應(yīng)的細(xì)胞，，其表達(dá)與與未處理的對(duì)照細(xì)胞等量的dGFP。在48小時(shí)，PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)腉FPsiRNA保持完全的100%RNAi應(yīng)答(圖2B)。然而，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞進(jìn)一步分離為兩種不同的群體具有與PTD-DRBD介導(dǎo)的RNAi類似的GFP敲減程度的dGFPRNAi應(yīng)答群體以及~20%的細(xì)胞未顯示出dGFPRNAi應(yīng)答信號(hào)的第二群體(圖2B)。所觀察到的這些與脂質(zhì)轉(zhuǎn)染不能將siRNA運(yùn)輸入群體中100%的細(xì)胞，甚至在這里使用的高度可轉(zhuǎn)染的肺瘤細(xì)胞完全一致，并且在siRNA運(yùn)輸領(lǐng)域中，充分意識(shí)到相關(guān)的細(xì)胞毒性。對(duì)由PTD-DRBD介導(dǎo)的siRNA運(yùn)輸誘導(dǎo)的RNAi應(yīng)答動(dòng)力學(xué)進(jìn)行檢驗(yàn)。使用PTD-DRBD、對(duì)照PTD肽或?qū)φ罩|(zhì)轉(zhuǎn)染體結(jié)合多個(gè)GFP、DsRed和對(duì)照siRNA對(duì)H1299dGFP/dDsRed報(bào)道細(xì)胞進(jìn)行處理，然后在8天內(nèi)每天使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析(圖2C)。與上面的觀察一致，僅有PTD-DRBD加GFPsiRNAs誘導(dǎo)了dGFP特定的RNAi應(yīng)答，而所有的對(duì)照組合則沒有。PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)腉FPsiRNA在1-3天之間保持了最多的dGFPRNAi，接著逐漸衰減，在第8天達(dá)到對(duì)照水平(圖2C)。除了有限數(shù)目的應(yīng)答細(xì)胞，對(duì)照脂質(zhì)轉(zhuǎn)染運(yùn)輸?shù)腉FPsiRNA誘導(dǎo)了具有類似于PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)膕iRNA的誘導(dǎo)和衰減動(dòng)力學(xué)的GFPRNAi應(yīng)答。衰變曲線與siRNA負(fù)載的RISC在細(xì)胞分裂和siRNA半衰期內(nèi)被稀釋的觀點(diǎn)完全一致。為避免RNAi衰變曲線，用PTD-DRBDsiRNA在第3天和第6天對(duì)分裂細(xì)胞進(jìn)行再處理。重復(fù)的處理使得在超過8天內(nèi)測(cè)得的GFPRNAi應(yīng)答的程度和量級(jí)得以維持(圖2D)?？偟膩碚f，所觀察到的這些顯示了PTD-DRBD融合蛋白能夠siRNA以無(wú)細(xì)胞毒性的方式有效運(yùn)輸?shù)?00%細(xì)胞中。盡管整合的dGFP/dDsRed基因充當(dāng)了RNAi應(yīng)答的優(yōu)異的報(bào)道靶，但內(nèi)生基因受RNAi的，即GAPDHmRNA,—種標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)照RNAi靶的靶向作用。用由PTD-DRBD融合體運(yùn)輸?shù)膬煞N序列獨(dú)立的GAPDHsiRNA處理H1299細(xì)胞導(dǎo)致GAPDHRNAi應(yīng)答，其在添加6小時(shí)后首先檢測(cè)到并在12小時(shí)達(dá)到最大的RNAi應(yīng)答(圖3)。相反，所有的PTD-DRBD陰性對(duì)照未能誘導(dǎo)GAPDHRNAi應(yīng)答。有趣的是，PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)腉APDHsiRNA獲得的RNAi應(yīng)答明顯早于相同GAPDHsiRNA的對(duì)照脂質(zhì)轉(zhuǎn)染運(yùn)輸，這表明PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)膕iRNA更快的載入到RISC中(圖3)。這完全與所觀察到的通過TAT-Cre加入得到的LoxP重組的快速檢測(cè)(15min)完全一致。類似于dGFPRNAi誘導(dǎo)和衰變動(dòng)力學(xué)，PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)腉APDHsiRNA在治療后72小時(shí)顯示出最大的RNAi應(yīng)答并在96小時(shí)出現(xiàn)緩慢衰變?？偟膩碚f，這些觀察表明PTD-DRBD介導(dǎo)的siRNA運(yùn)輸能有效的靶向作用內(nèi)源的mRNA。PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)膕iRNA在很多種細(xì)胞類型中誘導(dǎo)RNAi應(yīng)答。目前，還沒有將siRNA運(yùn)輸?shù)?00%的所有細(xì)胞中的方法。例如，siRNA的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染運(yùn)輸基本上局限于那些耐受相當(dāng)?shù)哪_動(dòng)的粘附的、高度致瘤細(xì)胞。其對(duì)大多數(shù)的原代細(xì)胞和非粘附性造血細(xì)胞系，例如T和B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞很弱到完全無(wú)效。為了探索通用siRNA運(yùn)輸?shù)目赡苄?，dGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體^皮穩(wěn)定地引入到幾個(gè)原代的和致瘤細(xì)胞類型中(圖4)。與脂質(zhì)轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的完全陰性結(jié)果相比，進(jìn)到巨噬細(xì)胞和黑素細(xì)胞中的PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)膕iRNA在100%群體中誘導(dǎo)了GFPRNAi應(yīng)答(圖4A)。此外，PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)膕iRNA在粘附的原代人源成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、T細(xì)胞和成膠質(zhì)瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)了完全的RNAi應(yīng)答，它們具有類似于H1299細(xì)胞的衰變動(dòng)力學(xué)(圖4B)。相反，所有的陰性對(duì)照未能誘導(dǎo)GFPRNAi應(yīng)答。本公開顯示在至今為止分析的所有14種不同的原代的、致瘤的、粘附的以及非粘附細(xì)胞系中有RNAi應(yīng)答(表1)，其表明PTD-DRBD融合體介導(dǎo)通用siRNA向細(xì)胞中的運(yùn)輸。表1.所有細(xì)胞系中siRNAs的PTD-DRBD運(yùn)輸測(cè)試總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>在人源胚胎干細(xì)胞中PTD-DRBD介導(dǎo)siRNA運(yùn)輸。人源胚胎干細(xì)胞(hESC)具有很大的潛力來治療人類疾病且RNAi具有將hESC靶向分化導(dǎo)入成熟細(xì)胞系中的潛力。然而，通過RNAi操作hESC進(jìn)入特定細(xì)胞系中并最終置于患者體內(nèi)將要求嚴(yán)格的方案，其避免hESC暴露于病毒載體和細(xì)胞毒性化合物如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。由于PTD-DRBD融合體的有效和無(wú)細(xì)胞毒性的siRNA運(yùn)輸，對(duì)PTD-DRBD介導(dǎo)的siRNA的引導(dǎo)hESC分化的能力進(jìn)行了測(cè)試。使用慢病毒感染，生成了載有野生型eGFP報(bào)道基因的hESC細(xì)胞系。PTD-DRBD介導(dǎo)的eGFPsiRNA的運(yùn)輸導(dǎo)致了eGFP表達(dá)的顯著降低，而所有的對(duì)照均未能誘導(dǎo)RNAi應(yīng)答(圖5A)。所觀察到的這些與上面討論的PTD-DRBD介導(dǎo)的siRNA運(yùn)輸?shù)耐ㄓ眠\(yùn)輸方面完全一致。對(duì)PTD-DRBD介導(dǎo)的siRNA運(yùn)輸影響hESC命運(yùn)的能力進(jìn)行了測(cè)試。需要Oct4(PFU5)轉(zhuǎn)錄因子來維持hESC多能性，且最近的才艮道已顯示Oct4RNAi敲減導(dǎo)致了hESC分化(Boyer"a/.2005;Orkin,2005)。用PTD-DRBD加上Oct4siRNA進(jìn)行的hESC處理導(dǎo)致Oct4特異性的敲減和生長(zhǎng)速率的降低，這意味著多能性的喪失和分化的開始(圖5B,C)。相反，才莫擬及對(duì)照PTD-DRBD加熒光素酶siRNA沒有改變hESC的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)或Oct4表達(dá)水平。多能性的hESC表達(dá)了多個(gè)細(xì)胞表面的標(biāo)記，包括階段特異性的胚胎抗原-4(SSEA4)(Henderson爭(zhēng)乂，2002)。在分化進(jìn)內(nèi)胚層期間，hESC降低了SSEA-4表達(dá)，停止了細(xì)胞分裂，大小增加并隨后表達(dá)了GATA6分化轉(zhuǎn)錄因子(Hay爭(zhēng)乂，2004)。PTD-DRBD運(yùn)輸?shù)腛ct4siRNA在第2天導(dǎo)致了Oct4表達(dá)的損失但具有持續(xù)的SSEA-4表達(dá)(圖5D)。然而，在處理后的第10天，Oct4siRNA處理的細(xì)胞喪失了SSEA-4表達(dá)，并誘導(dǎo)了GATA6內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(圖5E)。相反，模擬的和對(duì)照PTD-DRBD加上熒光素酶siRNA處理的hESC沒有誘導(dǎo)分化或改變hESC標(biāo)記表達(dá)(圖5E)。總的來說，所觀察到的這些顯示了PTD-DRBD融合體在各種不同的原代細(xì)胞和致瘤細(xì)胞中運(yùn)輸siRNA和誘導(dǎo)特異的RNAi應(yīng)答的一般能力，耙向作用內(nèi)源基因和誘導(dǎo)hESC分化的能力。siRNA誘導(dǎo)的RNAi應(yīng)答是細(xì)胞生物學(xué)，遺傳途徑的剖析，靶向校驗(yàn)中的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方法，并具有治療干涉的巨大潛力。然而，由于它們的大分子大小(14,000Da),以及強(qiáng)的陰離子電荷，siRNA無(wú)法依靠自身而進(jìn)入細(xì)胞中。因此，設(shè)計(jì)出了多種方法來解決siRNA運(yùn)輸?shù)膯栴}。陽(yáng)離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑為目前標(biāo)準(zhǔn)的siRNA離體運(yùn)輸載體。然而，該方法和PEIsiRNA縮合、抗體-魚精蛋白融合siRNA縮合、膽固醇LDL顆粒形成和脂質(zhì)體包埋的其他方法盡管有前景，但不能靶向作用群體中100%的細(xì)胞，特別是原代細(xì)胞和造血細(xì)胞系(T和B細(xì)胞，巨謹(jǐn)細(xì)胞)。因此，就非常需要一種通用的siRNA運(yùn)輸方法，其能夠1)靶向作用100%的所有細(xì)胞類型，原代的和致瘤的，粘附的和非粘附的，2)無(wú)細(xì)胞毒性，和3)是siRNA序列獨(dú)立的。這里描述的PTD-DRBDsiRNA運(yùn)輸方法滿足了通用siRNA運(yùn)輸系統(tǒng)的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。首先，PTD-DRBD融合體將siRNA運(yùn)輸進(jìn)每個(gè)測(cè)試的細(xì)胞類型中，包括14種不同的原代和致瘤的，粘附的和非粘附的細(xì)胞類型。其次，通過無(wú)細(xì)胞毒性的大胞飲作用這一攝取所有細(xì)胞進(jìn)行的特殊液相胞吞形式將PTD-介導(dǎo)的siRNA運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞，因此不需要特異性受體高水平的表達(dá)。再次，DRBD結(jié)合至dsRNA(siRNA)序列獨(dú)立的組合物，由此能夠?qū)⑺械膕iRNA均運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞?？偟膩碚f，PTD-DRBD融合體顯示出運(yùn)輸進(jìn)許多細(xì)胞類型中的通用的siRNA運(yùn)輸方法，這些細(xì)胞類型，特別是原代細(xì)胞不容易進(jìn)行RNAi操作。盡管上面已描述了多種實(shí)施方式和特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解，對(duì)上述實(shí)施方式和特征的修改和變形可在不脫離本公開的教導(dǎo)和由后附權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍之下做出。權(quán)利要求1.一種組合物，包含核酸結(jié)合蛋白質(zhì)，其與帶陰離子電荷的核酸復(fù)合形成核酸結(jié)合蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物；以及連接到該核酸結(jié)合蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)。2.權(quán)利要求1的組合物，其中核酸結(jié)合蛋白質(zhì)含有雙鏈RNA結(jié)合域(DRBD)。3.權(quán)利要求2的組合物，其中DRBD包含選自由組蛋白、RDE-4蛋白、魚精蛋白、包括以下所列的dsRNA結(jié)合蛋白(括號(hào)中為登錄號(hào))組成的組的序列PKR(AAA36409、AAA61926、Q03963)、TRBP(P97473、AAA36765)、PACT(AAC25672、AAA49947、NP609646)、Staufen(AAD17531、AAF98119、AAD17529、P25159)、NFAR1(AF167569)、NFAR2(AF167570、AAF31446、AAC71052、AAA19960、AAA19961、AAG22859)、SPNR(AAK20832、AAF59924、A57284)、RHA(CAA71668、AAC05725、AAF57297)、NREBP(AAK07692、AAF23120、AAF54409、T33856)、kanadaptin(AAK29177、AAB88191、AAF55582、NP499172、NP198700、BAB19354)、HYL1(NP563850)、hyponasticleaves(CAC05659、BAB00641)、ADAR1(AAB97118、P55266、AAK16102、AAB51687、AF051275)、ADAR2P78563、P51400、AAK17102、AAF63702)、ADAR3(AAF78094、AAB41862、AAF76894)、TENR(XP059592、CAA59168)、RNaseIII(AAF80558、AAF59169、Z81070Q02555/S55784、P05797)和切酶(BAA78691、AF408401、AAF56056、S44849、AAF03534、Q9884)、RDE-4(AY071926)、FLJ20399(NP060273、BAB26260)、CG1434(AAF48360、EAA12065、CAA21662)、CG13139(XP059208、XP143416、XP110450、AAF52926、EEA14824)、DGCRK6(BAB83032、XP110167)、CG1800(AAF57]75、EAA08039)、FLJ20036(AAH22270、XP134159)、MRP-L45(BAB14234、XP129893)、CG2109(AAF52025)、CG12493(NP647927)、CG10630(AAF50777)、CG17686(AAD50502)、T22A3.5(CAB03384)以及登錄號(hào)EAA14308。4.權(quán)利要求1的組合物，其中核酸包含dsRNA。5.權(quán)利要求l的組合物，其中PTD可操作地連接至核酸結(jié)合蛋白質(zhì)。6.權(quán)利要求l的組合物，其中PTD可操作地連接至核酸。7.權(quán)利要求l的組合物，其中核酸結(jié)合蛋白質(zhì)與核酸的比率為1:1。8.權(quán)利要求l的組合物，其中核酸結(jié)合蛋白質(zhì)與核酸的比率為2:1。9.權(quán)利要求1的組合物，其中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分(PTD)選自由含皰滲病毒VP22蛋白質(zhì)的多肽、含人免疫缺陷性病毒(HIV)TAT蛋白質(zhì)的多肽、含ante皿apedia蛋白質(zhì)(AntpHD)的同源異型結(jié)構(gòu)域的多肽以及它們的功能片段組成的組。10.權(quán)利要求1的組合物，其中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域可操作地連接至至少1個(gè)核酸結(jié)合蛋白質(zhì)。11.一種組合物，包含a)第一融合多肽，其包含i)包含蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分(PTD)的第一結(jié)構(gòu)域，該轉(zhuǎn)導(dǎo)部分包含膜運(yùn)輸功能；以及ii)含有核酸結(jié)合蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域；b)核酸，其中該核酸帶有陰離子電荷并且與核酸結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用，且其中PTD-核酸結(jié)合蛋白質(zhì)-核酸的全部陰離子電荷相對(duì)于核酸單獨(dú)所帶電荷減少；以及c)藥學(xué)上可接受的載體。12.權(quán)利要求11的組合物，其中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分(PTD)選自由含皰滲病毒VP22蛋白質(zhì)的多肽、含人免疫缺陷性病毒(HIV)TAT蛋白質(zhì)的多肽、含antennapedia蛋白質(zhì)(AntpHD)的同源異型結(jié)構(gòu)域的多肽以及它們的功能片,殳組成的組。13.權(quán)利要求11的組合物，其中核酸包含dsRNA。14.權(quán)利要求11的組合物，其中核酸是用在原位雜交中的探針。15.權(quán)利要求11或13的組合物，其中核酸調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。16.權(quán)利要求15的組合物，其中調(diào)節(jié)抑制了細(xì)胞增殖。17.—種融合多肽，其包含a)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)，該轉(zhuǎn)導(dǎo)域包括膜運(yùn)輸功能；以及b)可中和或減少結(jié)合的核酸的陰離子電荷的核酸結(jié)合域，其中PTD可操作地連接至核酸結(jié)合域。18.權(quán)利要求17的融合多肽，其中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域選自由含皰滲病毒VP22域的多肽、含人免疫缺陷性病毒(HIV)TAT域的多肽、含antennapedia蛋白質(zhì)(AntpHD)的同源異型結(jié)構(gòu)域的多肽、N-末端陽(yáng)離子朊病毒蛋白質(zhì)域以及它們的功能片段組成的組。19.權(quán)利要求1的融合多肽，其中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域包含選自以下序列組成的組的序列來自SEQIDNO:7的氣基酸47-57;B1-X1-X2-X3-B2-X4-X5-B3,其中B2、和B3分別獨(dú)立地為相同或不同的堿性氨基酸；且X!、X2、X3、X4和X5分別獨(dú)立地為相同或不同的a-螺旋結(jié)構(gòu)增強(qiáng)氨基酸(SEQIDNO:l);B1-X1隱X2-B2-B3-X3-X4曙B4，其中B2、B3和B4分別獨(dú)立地為相同或不同的堿性氨基酸，且X^X2、X3和X4分別獨(dú)立地為相同或不同的a-螺旋結(jié)構(gòu)增強(qiáng)氨基酸(SEQIDNO:2);X-X-R-X-(P/X)-(B/X)-B-(P/X)-X-B-(B/X),其中X為任何a螺旋結(jié)構(gòu)的促進(jìn)殘基例如丙氨酸；P/X可以為脯氨酸或以上限定的X，B為堿性氨基酸殘基且B/X可以為以上限定的的B或X(SEQIDNO:4);由7到10個(gè)氨基酸組成并含有KX1RX2X1的序列，其中Xi為R或K且乂2為任何氨基酸(SEQIDNO:5);RKKRRQRRR(SEQIDNO:6);以及KKRPKPG(SEQIDNO:3)。20.權(quán)利要求17的融合多肽，其中核酸是dsRNA或siRNA。21.權(quán)利要求17的組合物，其中核酸結(jié)合域選自由組蛋白、RDE-4蛋白，魚精蛋白，包括以下所列的dsRNA結(jié)合蛋白(括號(hào)中為登錄號(hào))組成的組中的序列PKR(AAA36409、AAA61926、Q03963)、TRBP(P97473、AAA36765)、PACT(AAC25672、AAA49947、NP609646)、Staufen(AAD17531、AAF98119、AAD17529、P25159)、NFAR1(AF167569)、NFAR2(AF167570、AAF31446、AAC71052、AAA19960、AAA19961、AAG22859)、SPNR(AAK20832、AAF59924、A57284)、RHA(CAA71668、AAC05725、AAF57297)、NREBP(AAK07692、AAF23120、AAF54409、T33856)、kanadaptin(AAK29177、AAB88191、AAF55582、NP499172、NP198700、B馬9354)、HYL1(NP563850)、hyponasticleaves(CAC05659、BAB00641)、ADAR1(AAB97118、P55266、AAK16102、AAB51687、AF051275)、ADAR2P78563、P51400、AAK17102、AAF63702)、ADAR3(AAF78094、AAB41862、AAF76894)、TENR(XP059592、CAA59168)、RNaseIII(AAF80558、AAF59169、Z81070Q02555/S55784、P05797)和切酶(BAA78691、AF408401、AAF56056、S44849、AAF03534、Q9884)、RDE-4(AY071926)、FLJ20399(NP060273、BAB26260)、CG1434(AAF48360、EAA12065、CAA21662)、CG13139(XP059208、XP143416、XP110450、AAF52926、EEA14824)、DGCRK6(BAB83032、XP110167)、CG1800(AAF57175、EAA08039)、FLJ20036(AAH22270、XP134159)、MRP-L45(BAB14234、XP129893)、CG2109(AAF52025)、CG12493(NP647927)、CG10630(AAF50777)、CG17686(AAD50502)、T22A3.5(CAB03384)以及登錄號(hào)EAA14308。22.—種藥物組合物，含有權(quán)利要求17的融合多肽。23.—種將帶有陰離子電荷的核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求1或11的組合物，或權(quán)利要求17的融合多肽接觸。24.—種將帶有陰離子電荷的核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，其包括用核酸結(jié)合域?qū)怂岱肿舆M(jìn)行結(jié)合以中和或減少陰離子電荷，以及將復(fù)合物連接至蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)并用PTD-電荷中和的核酸與細(xì)胞進(jìn)行接觸。25.權(quán)利要求23的方法，其中接觸是體內(nèi)的或離體的。26.權(quán)利要求24的方法，其中接觸是體內(nèi)的或離體的。27.權(quán)利要求24的方法，其中核酸分子包含dsRNA。28.權(quán)利要求24的方法，其中dsRNA被細(xì)胞加工成siRNA。29.權(quán)利要求24的方法，其中核酸抑制靶基因產(chǎn)物的生成。30.權(quán)利要求29的方法，其中耙基因產(chǎn)物導(dǎo)致了細(xì)胞增生癥。31.—種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求17的融合多肽。32.—種包含權(quán)利要求31的多核苷酸的載體。33.—種含有權(quán)利要求32的載體的宿主細(xì)胞。34.—種含有權(quán)利要求31的多核苷酸的宿主細(xì)胞。35.—種產(chǎn)生融合多肽的方法，包括表達(dá)權(quán)利要求31的多核苷酸，和基本純化表達(dá)的融合多肽。36.—種產(chǎn)生融合多肽的方法，包括在表達(dá)多核苷酸的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求33或34的宿主細(xì)胞，和基本純化表達(dá)的融合多肽。37.—種制備用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的組合物的方法，包括將帶陰離子電荷的核酸與權(quán)利要求17的融合多肽進(jìn)行接觸。38.—種包括一個(gè)或多個(gè)容器的試劑盒，含有(a)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域；以及(b)核酸結(jié)合蛋白質(zhì)。39.權(quán)利要求38的試劑盒，進(jìn)一步含有dsRNA分子。40.—種包含含權(quán)利要求17的融合多肽的容器的試劑盒。41.一種將核酸導(dǎo)入靶細(xì)胞中的方法，該方法包括將細(xì)胞與權(quán)利要求1或11的組合物接觸。全文摘要該公開提供了融合多肽和構(gòu)建物，其用于將包括診斷劑和治療劑的帶有陰離子電荷的核酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中或研究對(duì)象體內(nèi)。該融合構(gòu)建物包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域和核酸結(jié)合域，或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域和核酸，該核酸包覆有可對(duì)其上的陰離子電荷進(jìn)行充分中和的一個(gè)或多個(gè)核酸結(jié)合域。另外還提供了治療疾病和病癥如細(xì)胞增生癥的方法。文檔編號(hào)C07K16/00GK101421301SQ200780013087公開日2009年4月29日申請(qǐng)日期2007年2月9日優(yōu)先權(quán)日2006年2月10日發(fā)明者史蒂文·F·道蒂,布萊恩·米德,江口晶子,賈汗季·S·瓦迪亞申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)