專利名稱：：軍團菌種快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及團菌種檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種不僅能檢測臨床和環(huán)境水標本中的軍團菌，而且可以對軍團菌進行分型為嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌的軍團菌種快速檢測試劑盒及其檢測方法。技術(shù)背景s目前，軍團菌檢測試劑盒主要分為兩大類。一是利用抗原抗體反應(yīng)檢測軍團菌特異抗體或抗原，此類試劑盒包括軍團菌ELISA法試劑盒以及軍團菌膠體金試劑盒，因為軍團菌相關(guān)抗原或抗體在軍團菌感染病人體內(nèi)出現(xiàn)較晚，一般需要一周及以上的時間才能檢測到，同時只能檢測嗜肺軍團菌，而且具有一定的交叉反應(yīng)，所以該類型的試劑盒具有一定的局限性。第二類是利用分子生物學方法檢測軍團菌，如熒光定量PCR檢測嗜肺軍團菌試劑盒，該試劑盒僅可用以檢測嗜肺軍團菌，對非嗜肺軍團菌不能檢測。雖然臨床上80%以上的軍團菌感染都是由嗜肺軍團菌引起，水環(huán)境也廣泛存在嗜肺軍團菌，但是非嗜肺軍團菌也具有較為廣泛的存在性和一定的感染力。因此一種既能檢測軍團菌屬又能鑒別出屬于嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌種的檢測試劑盒是很有必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對以上所述軍團菌檢測試劑盒存在的不足，提供一種不僅能檢測臨床和環(huán)境水標本中的軍團菌，而且可以對軍團菌進行分型為嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌的軍團菌種快速檢測試劑盒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種軍團菌種快速檢測試劑盒的檢測方法本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的；軍團菌種快速檢測試劑盒，包括細菌基因組DNA提取液，PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物純化液，酶切反應(yīng)液等組成，以上液體分別置于容器中；所述的PCR反應(yīng)液包括第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液，第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液分別置于容器中。其中第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下-TaqDNA聚合酶4xdNTP(dATP，dCTP，dGTP，anddTTP)每種TrisHCl(pH8.3)MgCl2引物1(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC〉引物2(CCAACAGCTAGTTGACATCG)所述的第二PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下TaqDNA聚合酶4xdNTP(dATP，dCTP,dGTP，anddTTP)每種TrisHCl(p戰(zhàn).3)KC1MgCl2引物i(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC)引物3(ATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC)0.150.25阿oyL。所述的DNA提取液含有的組分及組分濃度如下Cheiex100resin5%，TrisHCL[pHO〗1O薩oi/L，EDTANa2O.lmmoi/L，NaN3(疊氮鈉)0.1%，蛋白酶KiO(^ig/ml。快速襝測軍團菌種試劑盒的撿測方法，其檢測步驟如下應(yīng)用DNA提取液提取檢測樣品中的細菌基因組DNA;以細菌基因組DNA為模板，應(yīng)用第一PCR反應(yīng)液擴增1520個循環(huán)后，以前一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，用第二PCR反應(yīng)液擴增3540循環(huán)，將所得的最終PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳；將第一PCR純化液與最終PCR產(chǎn)物混合后，加入到PCR純化柱內(nèi)，離心后加入第二0.040.06U4d，200300jimol/L,812mmoi/L，4060mmoi/L，l,52.0mmol/L，O.150.25,ol/L，0.150.25拜ol/L。0,040.06U4il,20030(Himoi/L，812mmol/L，4060mmol/L，〗..52.0mmol/L;O.150.25,ol/L,，加入第三PCR純化液后離心，得到PCR純化產(chǎn)物；將PCR純化產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液中消化0.52.0小時后，將酶切產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發(fā)明不僅可運用于臨床標本如痰液、支氣管灌洗液中軍團菌種的檢測，也可以運用于水標本中軍團菌檢測，具有快速，簡便，易于使用的優(yōu)點。同時本試劑盒還可以鑒別軍團菌種，即通過本試劑盒的檢測，可以獲知臨床標本與水環(huán)境標本中軍團菌的類型，即是嗜肺軍團菌、或非嗜肺軍團菌、或二者兼有?？偟膩碚f,PCR反應(yīng)液檢測軍團菌屬具有良好的敏感性和特異性，敏感性達到102103cfo/ml，特異性在95%以上；酶切反應(yīng)液可對檢測出的軍團菌屬分型到種，分型準確率達99%。圖i為本發(fā)明軍團菌種快速檢測試劑盒的實施流程示意圖；圖2a為PCR陽性結(jié)果條帶圖PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳檢測中出現(xiàn)226bp條帶說明，樣品中檢測出軍團菌；圖2b為PCR陰性結(jié)果條帶圖PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳檢測未出現(xiàn)226bp條帶，說明樣品中未檢測出軍團菌，報告為未檢測出軍團菌；圖2c為酶切陰性結(jié)果條帶圖酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶與對照條帶比較，若只有226bp條帶，則說明樣品中僅有非嗜肺軍團菌[非菲氏(L,feeleii)及昆氏軍團菌(L.quinlivanii);圖2d為酶切陽性結(jié)果1條帶圖酶切后出現(xiàn)180bp條帶，說明檢測出嗜肺軍團菌；圖2e為酶切陽性結(jié)果2條帶圖酶切后出現(xiàn)153bp條帶，說明檢測出菲氏(X,feeleii)及昆氏(Lquinli、適ii)軍團菌；圖2f為其他結(jié)果l條帶圖酶切后出現(xiàn)180bp，153bp條帶，說明樣品中含有嗜肺軍團菌和菲氏(L.feeleii)和(或)昆氏(L,quinlivanii)軍團菌。圖2g為其他結(jié)果2條帶圖酶切后出現(xiàn)153bp及i80bp，和226bp條帶，說明樣品中檢出嗜肺軍團菌。菲氏或昆氏軍團菌及其他非嗜肺軍團菌；圖2h為其他結(jié)果3條帶圖酶切結(jié)果出現(xiàn)226bp與180bp，則樣品中檢測出非嗜肺軍團菌與嗜肺軍團菌，且其中非嗜肺軍團菌不為菲氏或昆氏軍團菌；圖2i為其他結(jié)果4條帶圖酶切結(jié)果出現(xiàn)226bp與153bp條帶，則樣品中撿測出非嗜肺軍團菌，其中非嗜肺軍團菌包含菲氏與昆氏軍團菌及其他非嗜肺軍團菌。具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明；軍團菌種快速檢測試劑盒，包括細菌基因組DNA提取液，第一PCR反應(yīng)液、第二PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物純化液，酶切反應(yīng)液等組成，以上液體分別置于容器中。其中，DNA提取液用于提取細菌基因組DNA;第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液是用來通過兩歩PCR反應(yīng)擴增軍團菌屬特異的基因片段。PCR產(chǎn)物純化液與純化柱一起純化PCR產(chǎn)物。酶切反應(yīng)液用于消化PCR產(chǎn)物，然后將產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳。第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第二PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>優(yōu)化的第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>所述的第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表。。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>第二PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>所述的PCR產(chǎn)物純化液包括如下表三種DNA純化液，三種PCR產(chǎn)物純化液分別置于容器中，如下表；PCR產(chǎn)物純化液的組成第一PCR純化液碧云天生物技術(shù)研究所的PCR純化試劑盒DNA結(jié)合液第二PCR純化液碧云天生物技術(shù)研究所PCR純化試劑盒洗滌液第三PCR純化液碧云天生物技術(shù)研究所PCR純化試劑盒洗脫液所述的DNA提取液含有的組分及組分濃度如下表:DNA提取液組成成分濃度Chdex廳resin5%TrisHCl[pH8.3iOmmoi/LEDTANa2(乙二胺四乙酸二鈉)O'lmmo!/L暴Jl嫁瞓!《0.1%蛋白酶K廳jxg/ml快速檢測軍團菌種試劑盒的檢測方法，其檢測步驟如下應(yīng)用DNA提取液提取檢測樣品中的細菌基因組DNA;以細菌基因組DNA為模板，應(yīng)用第一PCR反應(yīng)液擴增1520個循環(huán)后，以前一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，用第二PCR反應(yīng)液擴增3540循環(huán)，將所得的最終PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳；將第一PCR純化液與最終PCR產(chǎn)物混合后，加入到PCR純化柱內(nèi)，離心后加入第二PCR純化液，再次離心后，加入第三PCR純化液后離心，得到PCR純化產(chǎn)物；將PCR純化產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液中消化0.52。0小時后，將酶切產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測?？焖贆z測軍團菌種試劑盒的檢測方法的優(yōu)選步驟是快速檢測軍團菌種試劑盒的檢測方法的優(yōu)選步驟是如圖1所示，應(yīng)用DNA提取液提取經(jīng)過預處理的待檢樣品中的細菌基因組DNA;以細菌基因組DNA為模板，應(yīng)用第一PCR反應(yīng)液擴增15個循環(huán)后，以前一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，用第二PCR反應(yīng)液擴增35循環(huán)，將所得的最終PCR產(chǎn)物，取取5ui最終PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳電泳，根據(jù)圖2a和2b檢測出軍團菌；將第一PCR純化液與最終PCR產(chǎn)物混合后-加入到PCR純化柱內(nèi)后依次經(jīng)離心、洗滌、洗脫，離心后加入第二PCR純化液，再次離心后，加入第三PCR純化液后離心，得到PCR純化產(chǎn)物；將PCR純化產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液在37°C下消化1小時后，在酶切產(chǎn)物中取取8P1作瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)圖2a2i所示對軍團菌進行分子分型。權(quán)利要求1、軍團菌種快速檢測試劑盒，包括細菌基因組DNA提取液，PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物純化液，酶切反應(yīng)液等組成，以上液體分別置于容器中；所述的PCR反應(yīng)液包括第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液，第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液分別置于容器中；其中第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下TaqDNA聚合酶0.04～0.06U/μl，4xdNTP(dATP，dCTP，dGTP，anddTTP)每種200～300μmol/L，Tris～HCl(pH8.3)8～12mmol/L，KCl40～60mmol/L，MgCl21.5～2.0mmol/L，引物1(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC)0.15～0.25μmol/L，引物2(CCAACAGCTAGTTGACATCG)0.15～0.25μmol/L；所述的第二PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下TaqDNA聚合酶0.04～0.06U/μl，4xdNTP(dATP，dCTP，dGTP，anddTTP)每種200～300μmol/L，Tris～HCl(pH8.3)8～12mmol/L，KCl40～60mmol/L，MgCl21.5～2.0mmol/L，引物1(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC)0.15～0.25μmol/L，引物3(ATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC)0.15～0.25μmol/L。2、如權(quán)利要求1所述的軍團菌種快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于所述的DNA提取液含有的組分及組分濃度如下Chdex100fesin5%,TrisHCL[pHg.310mmol/L，EDTANa20,l纖oi/L，NaN30.1%，蛋白酶K100pg/mi。3、如權(quán)利要求1所述的軍團菌種快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于其檢測步驟如下應(yīng)用DNA提取液提取檢測樣品中的細菌基因組DNA;以細菌基因組DNA為模板，應(yīng)用第一PCR反應(yīng)液擴增1520個循環(huán)后，以前一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，用第二PCR反應(yīng)液擴增3540循環(huán)，將所得的最終PGR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳；將第一PCR純化液與最終PCR產(chǎn)物混合后，加入到PCR純化柱內(nèi)，離心后加入第二PCR純化液，再次離心后，加入第三PCR純化液后離心，得到PCR純化產(chǎn)物；將PCR純化產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液中消化0,52.0小時后，將酶切產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測。全文摘要本發(fā)明公開了一種軍團菌種快速檢測試劑盒，包括細菌基因組DNA提取液，PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物純化液，酶切反應(yīng)液等組成，以上液體分別置于容器中；所述的PCR反應(yīng)液包括第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液，第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液分別置于容器中。本發(fā)明另外公開了該試劑盒的檢測方法。本發(fā)明不僅可運用于臨床標本如痰液、支氣管灌洗液中軍團菌種的檢測，也可以運用于水標本中軍團菌檢測，具有快速，簡便，易于使用的優(yōu)點。文檔編號C12Q1/68GK101597647SQ20091004095公開日2009年12月9日申請日期2009年7月9日優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日發(fā)明者張遠志,朱慶義,李連青,胡朝暉,詹曉勇申請人:廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司