專利名稱：具有經(jīng)修飾的特異性的I-CreI大范圍核酸酶變體、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
具有經(jīng)修飾的特異性的l-Orl大范圍核酸酶變體、
其制備方法及應(yīng)用
本發(fā)明涉及一種制備具有經(jīng)修飾的切割特異性的I-CmI大范圍核酸 酶(megaimclease )變體的方法。本發(fā)明還涉及通過所述方法可獲得的 I-CVd大范圍核酸酶變體以及它們或者用于切割新DNA靶標或者用于 非治療目的的遺傳工程和基因組工程的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及編碼所述變體的核酸、包含所述核酸的表達盒、包含所 述表達盒的栽體、被所述載體轉(zhuǎn)化的細胞或生物，植物或非人動物。
大范圍核酸酶是識別大(>12bp;通常14-40bp) DNA切割位點的 序列特異性內(nèi)切核酸酶(Thierry and Dujon， 1992 )。野生型的大范圍核 酸酶基本上以歸巢內(nèi)切核酸酶為代表，通常由可移動遺傳元件如內(nèi)含肽 和I型內(nèi)含子編碼(Belfort and Roberts, 1997; Chevalier and Stoddard, 2001 )。歸巢指由所述大范圍的內(nèi)切核酸酶活性啟動的這些元件的動員， 這依賴于DNA雙鏈斷裂(DSB )修復。早期對HO ( Haber， 1998; Klar "fl/.， 1984; Kostriken " a/" 1983 )、 I-5"cd ( Colleaux W fl/.， 1988; Jacquier and Dujon, 1985; Perrin " 1993; Plessis " a/" 1992 )和 I-化v/ ( Bell-Pedersen " /" 1990; Bell-Pedersen " 1989; Bell-Pedersen W "/., 1991; Mueller W a;.， 1996 )蛋白的研究已經(jīng)闡明了 歸巢過程的生物學特性。另一方面，這些研究也已經(jīng)提供了在活細胞中 研究DSB修復的范例。
歸巢核酸內(nèi)切酶的靼序列通常是不對稱的，這與大多數(shù)限制性酶識 別位點為典型的二分對稱是不同的。已經(jīng)表明，某些由內(nèi)含子ORF或 內(nèi)含肽編碼的歸巢核酸內(nèi)切酶促進它們各自的遺傳元件歸巢至等位基 因的無內(nèi)含子或無內(nèi)含肽位點。通過在無內(nèi)含子或無內(nèi)含肽等位基因中 引入位點特異性的雙鏈斷裂，這些核酸酶產(chǎn)生引起重組的末端，其參與 復制編碼序列并導致在DNA水平插入內(nèi)含子或間插序列的基因轉(zhuǎn)換過 程。
歸巢核酸內(nèi)切酶基于非常保守的氨基酸基序分為4個獨立的家族 [綜述參見Chevalier and Stoddard (Nucleic Acids Research, 2001， 29，3757-3774)1 。其中之一是十二肽家族(十二聚體， D0D，D1-D^AGLIDADG，P1-PZ )。這是通過其最通用的保守序列基序劃分的
最大的蛋白質(zhì)家族，所述保守序列基序為 一個或兩個拷貝(絕大多數(shù)) 的十二殘基序列，即十二肽(dodecapeptide)。具有一個十二肽(D) 的歸巢核酸內(nèi)切酶的分子量約為20 kDa并以同源二聚體起作用。那些 具有兩個拷貝(DD)的范圍從25kDa(230個氨基酸)到50kDa(HO， 545個氨基酸)并且在每個基序之間有70至150個殘基，并以單體起作 用。切割在識別位點內(nèi)部，交錯切割保留4nt的3，OH突出端。含有單 拷貝LAGLIDADG基序的酶，如和作為同源二聚體發(fā)揮 作用并識別近乎回文的歸巢位點。
歸巢核酸內(nèi)切酶I-Oe/ (pdb登記碼lg9y)的序列和結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定 (Rochaix JD et al.， NAR, 1985, 13, 975-984; Heath pi et al., Nat. Struct. Biol.， 1997, 4,
468-476; Wang et aU NAR， i997， 25, 3767-3776; Jurica et al. Mol. Ce]l， 1998, 2, 469-476:)， 并且已使用X-射線結(jié)晶學產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)模型(Heath et al.， 1997 )。
包含163個氨基酸(pdb登記碼lg9y);所述內(nèi)切核酸酶作 為二聚體進行切割。LAGLIDADG基序?qū)?yīng)于殘基13至21;在 LAGLIDADG a-螺旋的任意一側(cè)，四個|3-片層(21-29位；37-48位； 66-70位和73-78位)提供了 DNA結(jié)合界面，該界面驅(qū)使該蛋白質(zhì)與耙 DNA序列的半位點相互作用。該二聚化界面包括兩個LAGLIDADG螺 旋以及其它殘基。
I-Oel識別和切割的歸巢位點的長度為22-24bp,并且是簡并的回 文序列(參見Jurica MS et al， 1998的圖2以及SEQ ID NO:65 )。更精 確地說，所述I-CVeI歸巢位點是22bp的半回文序列，在每個半位點中 的llbp中有7bp是一致的(Seligman LM et al.， NAR， 2002， 30, 3870-3879 )。
也已經(jīng)描述了該內(nèi)切核酸酶-DNA界面(參見Jurica MS et al， 1998
的圖4),并導致關(guān)于特異性蛋白質(zhì)-DNA接觸的諸多預測 (Seligman LM et al,, Genetics, 1997， JiZ， 1653-1664; Jurica MS etal.， 1998; ChevalierB. etal.
Biochemistry, 2004,組14015-14026:)。 從所述的文獻可以看出
-殘基G19、 D20、 Q47、 R51、 K98和D137是I-O乂'I的內(nèi)切核酸
位點的一部分；
-歸巢位點序列必須具有至少20bp從而獲得0.2nM的最大結(jié)合親 和力；
-序列特異性接觸分布于歸巢位點的全部長度上；
-在許多不同的歸巢位點位置堿基對替換可以被耐受，而沒有嚴重 地破壞歸巢位點的結(jié)合或切割；
-R51和K98位于酶活性位點中并且在酶切反應(yīng)中作為Lewis酸或 激活質(zhì)子供體的候選者；已觀察到這些殘基中每一個的突變會急 劇地降低I-OeI內(nèi)切核酸活性(R51G， K98Q)。
-5個額外的殘基，其被突變時完全破壞I-Od內(nèi)切核酸酶活性， 位于酶活性位點中或附近(R70A、 L39R、 L91R、 D75G、 Q47H)。
這些研究已經(jīng)為大范圍核酸酶普遍用于基因組工程鋪平了道路。同 源基因打靶是穩(wěn)定修飾活細胞中染色體基因座位的最精確方法，但是其 低效率成為主要的阻礙。因為大范圍核酸酶誘導的DSB刺激同源重組 高達10000倍，所以大范圍核酸酶當前是提高哺乳動物細胞中基因打乾 效率(Choulika " fl/" 1995; Cohen-Tannoudji " a/" 1998; Donoho " a/" 1998; Elliott e, fl/" 1998; Rouet ef 1994 ) k乂及在i者3口植物(Puchta ef fl/.，1993; Puchta " 1996 )和昆蟲(Rong and Golic, 2000; Rong and Golic, 2001; Rong "a/., 2002 )等生物體中提供可行效率的最好方式。
大范圍核酸酶已被用于誘導多種類型的同源重組事件，如哺乳動物 細胞(Liang " 1998 )、植物(Siebert and Puchta, 2002 )、昆蟲(Rong C"/.，2002)和細菌(Posfai W fl/.， 1999 )中的直接重復重組，或染色體 間重組(Moynahan and Jasin, 1997; Puchta, 1999; Richardson " a/" 1998 )。
然而，該技術(shù)仍受限于大范圍核酸酶的潛在天然靶位點的數(shù)目低 雖然已鑒定了幾百種天然歸巢內(nèi)切核酸酶(Belfort and Roberts, 1997; Chevalier and Stoddard, 2001 )，但是存在切割目的基因的天然大范圍核 酸酶的可能性還極低。制造具有指定特異性的人工大范圍核酸酶將避開這種限制。
基于內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域與鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相融合，已經(jīng)制備 出具有新特異性的人工核酸內(nèi)切酶(Bibikova et al.， 2003; Bibikova et al" 2001; Bibikova et al" 2002; Porteus and Baltimore, 2003 )。
歸巢核酸內(nèi)切酶還已用作骨架來制備新的內(nèi)切核酸酶，或者通過不 同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的融合(Chevalier e"/" 2002; Epinat 2003 ),或
者通過單個特異性氨基酸殘基的突變(Seligman C "/.， 1997, 2002; Sussman " 2004;國際PCT申請WO2004/067736 )。
國際PCT申請WO2004/067736描述了用于從初始的大范圍核酸酶 定制生產(chǎn)大范圍核酸酶的一般方法，所述大范圍核酸酶變體能夠切割與 初始大范圍核酸酶的識別和切割位點不同的DNA靶序列。該一般性方 法包括以下步驟制備在與DNA靶序列接觸或者直接或間接與所述 DNA靶標相互作用的位置具有突變的大范圍核酸酶變體文庫，和選擇 能夠切割所述DNA靶序列的的變體。當初始大范圍核酸酶是I-Od N75 蛋白時，建立其中殘基44、 68和7(H皮突變的文庫，并針對接近I-CVeI 天然靶位點的一系列6個靼標進行篩選；與I-OdN75骨架蛋白相比， 篩選出的突變體具有經(jīng)修飾的結(jié)合特性；然而，它們切割I(lǐng)-Od天然靶 位點。
Seligman et al., 2002描述了改變的切割特異性的突變。更具 體地，他們已研究了 I-CVeI的預測直接與DNA耙標接觸的9個氨基酸 (Q26、 K28、 N30、 S32、 Y33、 Q38、 Q44、 R68和R70)的作用。在 這9個氨基酸中，7個被認為在對稱位置與核苷酸相互作用(S32、 Y33、 N30、 Q38、 R68、 Q44和R70 )。構(gòu)建含有所述9個氨基酸中每一個以 及預測參與水介導相互作用的轉(zhuǎn)換為丙氨酸的第10個(T140)的突變 體，并在基于大腸桿菌的分析中進行檢測。
得到的突變體與野生型歸巢位點相比較分為四類獨特的表
型
-S32A和T14()A的接觸似乎對于歸巢位點識別最不重要，
-N30A、 Q38A和Q44A在每個分析中表現(xiàn)出中等水平的活性，
-Q26A、 R68A和Y33A無活性，
-K28A和R70A是無活性的并且無毒性。
從所述結(jié)果得出，l-Ot，l的第30、 38、 44、 26、 68、 33、 28和70 位突變體與野生型l-Ox'I的歸巢位點相比較具有行為變化。
關(guān)于改變I-CVeI歸巢位點中7個對稱位置的突變體，從得到的結(jié)果 得出，在每個半位點7個對稱位置中的5個似乎對野生型在體內(nèi) 進行有效的位點識別是關(guān)鍵的2/21、 3/20、 7/16、 8/15和9/14 (對應(yīng) 于SEQIDNO:65中的-10/+10、 -9/+9、 -5/+5、 -4/+4和-3/+3位)。在這 些位置發(fā)生改變的所有突變體對野生型的體內(nèi)切割具有抗性；然 而，使用大腸桿菌的體外分析似乎比體內(nèi)試驗更加敏感，并且允許比體 內(nèi)實驗更高效地檢測野生型的歸巢位點；因此體外檢測顯示野生 型I-Oel的DNA靼標可能如下參照SEQ ID NO:65在-5至-3位的gtc (在所有引用文獻中均被認為是歸巢位點)、gcc或gtt三聯(lián)體。
Seligman et al.還研究了在的33位和歸巢位點堿基2和21 (±10)之間或者在I-Crel的32位和歸巢位點堿基1和22 (±11)之間 的相互作用；發(fā)現(xiàn)Y33C、 Y33H、 Y33R、 Y33L、 Y33S和Y33T突變 體切割在土IO位已修飾并且不被切割的歸巢位點(表3 )。另 一方 面，發(fā)現(xiàn)S32K和S32R切割在士ll位已^f務(wù)飾并且仍被切割的歸 巢位點(表3)。
Sussman et al.， 2004,才艮道了他們的研究，其中同源二聚體 LAGLIDADG歸巢核酸內(nèi)切酶I-Orl在26位、并最終在66、或在33 位被改變，分別在士6和±10位接觸歸巢位點堿基。得到的酶構(gòu)建體 (Q26A、 Q26C、 Y66R、 Q26C/Y66R、 Y33C、 Y33H)驅(qū)使選定DNA 靶標在體內(nèi)特異性消除并在體外表現(xiàn)出DNA結(jié)合和切割的特異性改 變。
選擇和表征針對單個靶位點變體的酶點突變的總體結(jié)果是結(jié)合特 異性以及底物切割的動力學都有變化和擴展。
與野生型酶相比，每種突變體針對原始的野生型靶位點表現(xiàn)出更高 的解離常數(shù)(更低的親和力)；并且與野生型酶相比，每種突變體針對 其新的靶標表現(xiàn)出更低的解離常數(shù)(更高的親和力)。
所述酶突變體表現(xiàn)出底物切割的相似動力學特點，與針對結(jié)合親和 力所描述的那些相似，它們的底物優(yōu)先性也有變化和擴展。
為了得到更大數(shù)目的DNA靶序列，極其有價值的是產(chǎn)生具有新特 異性的新I-Crel變體，即其能夠切割不被I-Ox'l或至今已分離的少數(shù) 變體所切割的DNA乾標。
這些變體將對遺傳或基因組工程尤其有意義。
在此，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在I-OeI的44、 68和70位的突變，由其得到 的變體能夠切割至少 一個在±3至5位改變的歸巢位點。
因此，本發(fā)明的主題是一種制備具有經(jīng)修飾的切割特異性的l畫C"4 大范圍核酸酶變體的方法，所述方法包括
(a) 用選自A、 D、 E、 G、 H、 K、 N、 P、 Q、 R、 S、 T和Y的氨 基酸替換參照l-Oel pdb登記碼lg9y的氨基酸Q44、 R68和/或R70;
(b) 參照雙鏈DNA靶標中-5至-3位，選擇步驟(a)中獲得的具有 至少一個下列R3三聯(lián)體切割特征的大范圍核酸酶變體，所述-5 至-3位對應(yīng)于下式I的R3:
5'- R!CAAAR2線R,4R'3R'2TTTGR、 -3，， 其中
!^不存在或存在；并且當存在時代表包含1至9個核苷酸的核酸片 段，所述核酸片段對應(yīng)于隨機核酸序列或?qū)?yīng)于位于從-20至-12位(從 5，向3，)的大范圍核酸酶歸巢位點的片段，Ri至少對應(yīng)于所述歸 巢位點的-12位，
R2代表核酸雙聯(lián)體ac或ct并且對應(yīng)于所述歸巢位點的-7至-6位，
R3代表對應(yīng)于所述-5至-3位的核酸三聯(lián)體，選自g、 t、 c和a，并 排除以下的三聯(lián)體:gtc、 gcc、 gtg、 gtt和gct;因此所述核酸三聯(lián)體優(yōu) 選地選自以下三聯(lián)體
ggg， gg^ ggt, ggc， gag, gaa, gat, gac, gta, gcg, gca, tgg, tga, tgt， tgc, tag， taa,tat， tac, ttg， tta， ttt, ttc, tcg， tca， tct， tcc, agg， aga, agt, agc， aag, aaa， aat， aac, atg， ata， att, atc， acg， aca， act， acc， cgg， cga， cgt, cgc, cag, caa， cat, cac， ctg， cta, ctt, ctc， ccg, cca, cct and ccc and more preferably among the following triplets: ggg， ggt, ggc, gag， gat, gac, gta, gcg, gca， tag, taa， tat， tac, ttg, ttt, ttc， tcg， tct, tec, agg， aag, aat, aac， att， ate, act， acc, cag, cat, cac， ctt, etc, ccg, cct和ccc ，
R4代表核酸雙聯(lián)體gt或tc并且對應(yīng)于所述歸巢位點的-2至-1位，
R、不存在或存在；并且當存在時代表包含1至9個核苷酸的核酸片 段，所述核酸片段對應(yīng)于隨機核酸序列或?qū)?yīng)于位于從+12至+20位(從 5，向3，)的大范圍核酸酶歸巢位點的片段，R、至少對應(yīng)于所述 歸巢位點的+12位，
R，2代表核酸雙聯(lián)體ag或gt并且對應(yīng)于所述歸巢位點的+6至+7位，
R，3代表對應(yīng)于所述+3至+5位的核酸三聯(lián)體，選自g、 t、 c和a;當 R3和R，3是非回文序歹'J時，R，3不同于gac、 ggc、 cac、 aac和agc，
R，4代表核酸雙聯(lián)體ga或ac并對應(yīng)于所述歸巢位點的+1至+2位。
定義
-多肽序列中的氨基酸殘基在本文中依據(jù)單字母編碼指定，其中， 例如，Q表示Gln或谷氨酰胺殘基，R表示Arg或精氨酸殘基以及D 表示Asp或天冬氨酸殘基。
-在本發(fā)明中，除非另外提及，所述殘基編號參考I-CVd序列 SWISSPROT P05725或pdb登記碼lg9y的氨基酸編號方式。依據(jù)該定 義，名為"ADR，，的變體是氨基酸殘基Q44和R68已分別被替換為丙 氨酸和天冬氨酸、而R70未被替換的大范圍核酸酶。其它不改 變所述變體的切割活性的突變不被注明，并且本文采用的命名不限制突 變僅在44、 68和70三個位置。
-核苷酸以如下方式表示單字母編碼用于指代核苷的堿基a是 腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，以及g是鳥嘌呤。對于簡并核苷 酸，r代表g或a (嘌呤核苷酸)，k代表g或t, s代表g或c， w代表 a或t, m代表a或c， y代表t或c (嗜咬核苷酸)，d代表g、 a或t， v 代表g、 a或c， b代表g、 t或c, h代表a、 t或c， 以及n代表g、 a、
t或C。
-在本申請中，當給出序列用于舉例說明識別或歸巢位點時，應(yīng)該明白它代表雙鏈多核香酸從5，向3，的僅一條鏈。
-所述術(shù)語"部分回文序列"、"部分對稱序列"、"簡并回文序列"、 "假回文序列"均不加區(qū)分地用于表示具有不完全對稱性的回文序列。
例如 22bp 序歹'J : C.ii&幽a^7C-6g-5"C-3g-2t ig+a+2g+3a+4C+5a+6g+7"8"9tM0g+11
(SEQ ID NO:")是部分回文序列，其中對稱性在堿基對+/-1、 2、 6和7 處被破壞。依據(jù)另一種規(guī)則，+/-8至11位以及+/-3至5位的核苷酸序 列是回文序列。對稱軸位于-1和+1位堿基對之間。使用另一種編號方 式，從5，末端到3，末端，回文序列在1至4位和19至22位，以及7 至9位和14至16位，對稱性在堿基對5、 6、 10、 11、 12、 13、 17和 18處凈皮破壞，并且對稱軸位于11和12位堿基對之間。
-如本文中使用的，術(shù)語"野生型表示具有序列 SWISSPROT P05725或pdb登記碼lg9y的I-CVeI大范圍核酸酶。
-術(shù)語"識別位點"、"識別序列"、"靶標"、"靶序列"、"DNA靶標"、 "歸巢識別位點"、"歸巢位點"、"切割位點"均不加區(qū)分地用于表示14 至40bp的雙鏈、回文、非回文或部分回文的大范圍核酸酶識別并切割 的多核苷酸序列。這些術(shù)語指大范圍核酸酶誘導雙鏈斷裂(切割)的獨 特DNA位置，優(yōu)選染色體位置。
例如，野生型I-CVd的已知歸巢識別位點表示為22bp序列 5,-caaaacgtcgtgagacagtttg-3， (SEQ ID NO: 71)或者圖 2A 所示的 24bp 序列
5'-tcaaaacgtcgtgagacagtttgg-3，(》匕處命名為C1234 ， SEQ ID NO: 65; gtc位于
-5至-3位并且gac位于+3至+5位)。此特定位點在之后還被稱為"I-CVd
天然靶位點"。來自于天然靼標可以通過在+1、 +2、 +6和+7位或者-1、
-2、 -6和-7位核普酸進行突變而得到兩個回文序列C1221( SEQ ID NO:
12 )和C4334 ( SEQ ID NO: 66)，見圖2A所示。二者均在-5至-3位具
有g(shù)tc，以及在+3至+5位具有g(shù)ac，并且在體外和在酵母中被所切割。
-術(shù)語"變化特異性"涉及能夠切割在相同條件下不被其來源的初 始大范圍核酸酶(骨架蛋白)所切割的歸巢位點的大范圍核酸酶變體；
所述的初始或骨架蛋白可能是野生型大范圍核酸酶或其突變體。
實際上，當在酵母菌林中使用體內(nèi)分析時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)野生型 不僅切割在-5至-3位的回文序列為gtc (與C1234、 C1221或C4334中 一樣)的歸巢位點，而且切割gcc、 gac、 ggc、 atc、 etc和ttc (圖9a )。
所述I-OeI D75N突變體(I-Oel N75)，其也可以用作骨架蛋白，用 于制備具有新特異性的變體，其不僅切割在-5至-3位的回文序列是gtc 的歸巢位點，而且切割所述在-5至-3位的回文序列是gcc、 gtt、 gtg或 gct的歸巢位點(圖8和9a)。
-異源二聚體形式例如可以通過將兩個單體進行融合處理而獲得。
得到的異源二聚大范圍核酸酶能夠切割至少 一 個不被同源形式切割的 靶位點。因此，當大范圍核酸酶變體以異源聚合體形式使用時仍是本發(fā) 明的一部分。另一種選作形成異源二聚體大范圍核酸酶的單體可以是另 一種變體單體，但是它也可以是野生型單體，例如單體或 單體。
因此，發(fā)明人從骨架蛋白(I-Oel D75N)構(gòu)建了 變 體文庫，其中每一個在44、 68和/或70位(pdb編碼lg9y )的氨基酸 殘基中呈現(xiàn)出至少一個突變，并且其中每一個能夠切割至少一個不被 骨架蛋白所切割的靶位點。
在這種特定方法中，所述突變由將至少一個位于44、 68和/或70的 氨基酸殘基替換為另一個選自包括A、 D、 E、 G、 H、 K、 N、 P、 Q、 R、 S、 T和Y的組中的殘基組成。獨立于其他殘基改變每個突變的氨 基酸殘基，并且所選的氨基酸殘基可以相同于或可以不同于44、 68和/ 或70位的其它氨基酸殘基。在該方法中，除了在-5至-3位的三聯(lián)體序 列(對應(yīng)于式I中R3)和/或在+3至+5位的三聯(lián)體序列(對應(yīng)于式I中 R'3)與被骨架蛋白切割的歸巢位點中相同位置的三聯(lián)體序列不 同以外，被依據(jù)本發(fā)明的I-CVeI大范圍核酸酶變體切割但不被 骨架蛋白所切割的歸巢位點與前述相同并示例于圖2中。
出乎意料地發(fā)現(xiàn)，通過上述方法可獲得的、即具有"經(jīng)修飾的特異 性"的所述I-Oe大范圍核酸酶變體能夠切割至少一個與-5至-3位和/ 或+3至+5位I-Orl骨架蛋白靶標不同的靶標。必須注意的是所述DNA 靶標在+/-3至5位不必然是回文序列。同源二聚體形式的I-CVd有活性， 但是異源二聚體形式也可能有活性。因此，依據(jù)本發(fā)明的I-CVd變體不 僅以同源二聚體形式、而且以異源二聚體形式、以及在兩種情況下均可 以是有活性的，它們可以識別在+/-3至5位具有回文或非回文序列的靶 標，前提是當I-OdN75蛋白用作骨架蛋白時，在-5至-3位和/或+3至 十5位的三聯(lián)體分別不同于gtc、 gcc、 gtg、 gtt和gct、以及不同于gac、 ggc、 cac、 aac和agc。因為I-CVt'I變體的每個單體結(jié)合歸巢位點的一 半，所以能夠切割多種靶標的變體也可以切割在+/-3至5位序列不是回 文序列的靼標。另外，變體以同源二聚體形式和異源二聚體形式都可以 工作。I-CVd變體可以形成異源二聚體大范圍核酸酶，其中另一種變體 可以是野生型I-Oel單體、另一種野生型大范圍核酸酶單體如I-D附oI, 另一種1-C"'1變體單體，或者非I-CVd之外另一種大范圍核酸酶的變體 的單體。
依據(jù)所述方法的一個有利的實施方案，由步驟(b)獲得的 大范圍核酸酶變體選自
A44/A68/A70， A44/A68/G70， A44/A68/H70， A44/A68/K70， A44/A68/N70，
A44/A68/Q70,A44/A68/R70,A44/A68/S70,A44/A68/T70,A44/D68/H70,
A44/D68/K70,A44/D68/R70,A44/G68/H70,A44/G68/K70,A44/G68/N70,
A44/G68/P70,A44/G68/R70,A44/H68/A70,A44/H68/G70,A44/H68/H70,
A44/H68/K70，A44/H68/N70,A44/H68/Q70,A44/H68/R70，A44/H68/S70,
A44/H68/T70,A44/K68/A70,A44/K68/G70,A44/K68/H70，A44/K68/K70，
A44/K68/N70，A44/K68/Q70，A44/K68/R70,A44/K68/S70,A44/K68/T70，
A4頓68/A70,A4標68/E70,A44/N68/G70，A4頓68/H70，A44/N68/K70,
A44/N68/N70,A44/N68/Q70,A44/N68/R70,A44/N68/S70,A44/N68/T70,
A44/Q68/A70,A44/Q68/D70'A44/Q68/G70，A44/Q6菌0，A44/Q68/N70，
A44/Q68/R70，A44/Q68/S70,A44/R68/A70，A44/R68/D70,A44/R68/E70，
A44/R68/G70，A44/R68/H70，A44/R68/K70,A44/R68/L70,A44/R6謝70,
A44/R68/R70,A44/R68/S70，A44/R68/T70，A44/S68/A70,A44/S68/G70,
A44/S68/K70，A44/S6,70，A德68/Q70,A44/S68/R70,A44/S68/S70， A44/S68/T70，
A術(shù)6謝70，
D44/D68/H70,
D4德8/Q70，
E4傷8/A70，
E44/S68/T70,
G44/T68/D70,
H44/R68/A70,
H44麵/R70,
H4德8/T70，
K44/A68/E70,
K44/A68/S70，
K44/E68/N70，
K44/G68/S70,
K44服8/N70，
K44/K68/H70,
K44/N68/G70，
K44/N68/T70，
K44/Q68/S70,
K44/R68/G70，
K44/R68/T70,
K44/S68/S70，
K44腦/G70，
K44/T68/T70,
N44/K68/G70,
蒸歸/D70,
N44/R68/E70,
N44/R68/R70，
N44/S68/K70,
N44/T68/R70,
Q44/A68/H70:
Q44/N68/A70:
A44/T68/A70, A44/T68/Q70, D44/N68/S70, D44/R68/R70, E44/R68/H70， G44/H68/K70， G44/T68/P70, H44/R68/D70， H44/R68/S70, H44腦/S70, K44/A68/G70, K44/A68/T70, K44/E68/S70, K44/G68/T70， K44服8/S70, K44/K68/T70, K4頓68/H70, K44/P68/H70, K44/Q68/T70， K44/R68/H70， K44/S68/A70, K德68/T70， K44/T68/H70, N44/A68/H70, N44/K68/H70, 簡/Q68/H70， N44/R68/G70, N44/R68/S70， N44/S68/R70， N44/T68/S70, Q44/A68/R70， Q44/N68/H70:
A44/T68/G70, A44/T68/R70, D44/R68歸， D44麵/S70, E44/R6薩0， G44/Q68/H70, G44腦/R70， H44/R6脂0， H4概8/T70， H44簡/T70， K44/A68/H70， K44/D68/A70, K44/G68/A70， K44/H68/D70， K44/H68/T70， K4頓68/A70,
K44/Q68/A70， K44/R68/A70， K44/R68/N70, K44/S68/D70, K44簡/A70， K44/T68/N70, N44/A6脂0， 腿/K68/R70, N44/Q68/R70, N44/R68/H70， N44/R68/T70， N44腦/H70， P4頓68/D70， Q44/G68/K70, Q44/N68/S70:
A44/T68/H70, A44腦/S70, D44/R68/K70， D44/R68/T70， E4傷8/S70， G44/R68/Q70, H4德8/S70， H44/R68/G70, H4楊8/G70, K44/A68/A70, K44/A68/N70， K44/D68/T70, K44/G68/G70, K44/H6衡0， K4復68/A70， K44/N68/D70, K44/N68/Q70: K44/Q68/D70, K44/R68/D70， K44雌/Q70， K44/S68/H70, K44/T68/D70, K44腕/Q70: N44/H68/N70, N44/K68/S70, 麗鐘/A70， N44/R68/K70， N44/S68/G70, N44/T68/K70, P44/T68/T70, Q44/G68/R70, Q4秦8/P70,
A44脂/K70, A44/T68/T70， D德6,70， E44/H68/H70, E44/R68/T70， G44/R6,0, H44/A68/T70， H44/R68/N70， H44/S68/S70, K44/A68/D70， K44/A68/Q70， K44/E68/G70， K44/G68/N70, K44服8/G70, K44/K68/D70, K44扁8/E70， K44/N68/S70， K44/Q68/E70， K44/R6S/E70, K44/R68/S70, K44脂/N70， K44/T68/E70, K44/T68/S70, N44/H68/R70, N44/N6面0, N44麵歸: N44/R68/N70: N44/S68/H70: N44腕/Q70: Q44/A68/A70: Q44/K6S/G70: Q44/Q68/G70,Q44/R68/A70，Q44/R68/D70,Q44/R68/E70,Q44/R68/G70，Q4德8/H70,
Q44細/N70,Q44鍵/Q70,Q44艦/S70,Q44/S68/H70,Q44/S瞎70,
Q4德8/S70,Q44/T68/A70，Q44聰/G70，Q44/T68/H70,Q44腕/R70，
R德68/G70,R德68/T70,歸G68/T70，R4德8/D70，R44服8/T70,
R44/N68/T70，R44/R68/A70,R4概謹0，R4德脂0，R44腕/G70，
R44/R6謝70,R44/R68/Q70,R44/R6S/S70，R4概8/T70，R44纖/G70,
R44/S68/N70,R44/S68/S70,R44/S瞎70，S44/D68/K70，S44/H68/R70,
S機68/G70，S44鍵/N70,S德鍾70,S44/R68/S7"T德68/K70,
T44/A68/R70，T44/H68/R70,T44/K68/R70,T44/N68脂，T44/N68/R70,
丁44/Q68/K70，T44/Q68/R70,T44/R68/A70，T4極8/D70,T44/R68/E70,
T44雄/G70，T44/R68/H70,T44麵/K70，T44/R68/N70，T44/R68/Q70，
T4傷8/R70,T44/R68/S70,T44雄/T70，T44/S68/K70，T4橋8/RJ0，
T44脂/K70,和丁44/T68織
依據(jù)所述方法的另一個有利的實施方案，選擇所述I-CreI大范圍核 酸酶變體的步驟(b)在酵母細胞中活體內(nèi)進行。
本發(fā)明的主題還有本文如上定義、即通過如上所述方法可獲得的 大范圍核酸酶變體，在體外或體內(nèi)為非治療性目的，用于切割包 含至少20-2化p部分回文序列的雙鏈核酸靶標的用途，其中在+/-8至11 位的序列至少為回文序列，并且在-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體和/或在+3 至+5位的核苷酸三聯(lián)體分別不同于gtc、 gcc、 gtg、 gtt和gct、以及不 同于gac、 ggc、 cac、 aac和agc。式I描述了這樣的DNA乾標。
依據(jù)所述用途的一個有利的實施方案，所述l-C"4大范圍核酸酶變 體選自A44/A68/A70，
A44/A68/G70, A44/A68/H70,
A44/A68/R70， A44/A68/S70，
A44/D68/R70, A44/G68/H70,
A44/G68/R70, A44/H68/A70,
A44/H68/N70， A44/H68/Q70:
A44/K68/A70, A44/K68/G70:
A44/A68/K70, A44/A68/T70， A44/G68/K70, A44鵬8/G70, A4柳68/R70: A44/K68/H70，
A44/A6蘭0' A44/D68/H70， A44/G6隨70: A44鵬8/H70, A4柳68/S70: A44/K68/K70.
A44/A68/Q70, A44/D68/K70: A44/G68/P70: A44/H68/K70: A44/H68/T70: A44/K68/N70:
A44/K68/Q70,A44/K纖70,A44/K68/S70,A44/K68/T70,A44/N68/A70,
A44/N68/E70,A4傷8/G70,A44/N68/H70，A4頓68/K70,A4頓6薩0，
A44麵/Q70,A44/N68/R70，A44繊/S70，A44/N68/T70,A44/Q68/A70,
A44/Q68/D70,A44/Q68/G70,A44/Q68/H70，A44/Q68/N70，A44/Q68/R70,
A44/Q68/S70，A44/R68/A70，A44/R68/D70,A44yR68/E70,A44麵/G70,
A44/R68/H70,A44/R68/K70，A44/R68/L70，A44/R6,70,A44雌/R70,
A44/R68/S70,A44/R68/T70,A44/S68/A70,A44/S68/G70，A44/S68/K70,
A44/S68/N70,A4德8/Q70，A4德8/R70，A44/S68/S70，A44/S68/T70,
A44/T68/A70，A44/T68/G70,A44脂/H70,A44/T68/K70,A44/T68/N70,
A44/T68/Q70,A4頻8/R70，A44/T68/S70，A44腦/T70,D44/D68/H70,
D44/N68/S70，D44/R68/A70,D44/R68/K70,D44/R6謝70，D44腦/Q70,
D44/R68/R70,諸/R68/S70，D44/R68/T70,E44/H68/H70,E44/R68/A70，
E44/R68/H70,E44/R68/N70,E44/R68/S70,E44/R68/T70,E44/S68/T70,
G44/H68/K70,G44/Q68/H70,G44/R68/Q70,G44/R68/R70,G44/T68/D70,
G44/T68/P70,G44/T68/R70，H44/A68/S70，H44/A68/T70，H44/R68/A70，
H44/R68/D70，H44/R68/E70,H44/R68/G70，H44/R68/N70，H44/R68/R70，
H44/R68/S70,H44/R68/T70，H44/S68/G70,H4德8/S70,H44細/T70,
H44/德/S70，H44/T68/T70，K44/A68/A70，K44/A68/D70，K44/A68/E70,
K44/A68/G70,K44/A68/H70,K44/A6謹70，K44/A68/Q70,K44/A68/S70,
K44/A68/T70,K44/D68/A70,K44/D68/T70,K44/E68/G70，K44/E68/N70，
K44/E68/S70,K44/G68/A70,K44/G68/G70，K44/G68/N70,K44/G68/S70,
K44/G68/T70,K44/H68/D70,K44/H68/E70,K44/H68/G70,K44服8/N70,
K44服8/S70,K44/H68/T70,K44/K68/A70,K44/K68/D70,K44/K68/H70,
KL44/K68/T70,K44/N68/A70，K44/N68/D70，K44/N68/E70，K44/N68/G70,
K4頓68/H70,K44/N6畫70,BC4頓68/Q70，K44扁8/S70，K4傷8/T70,
K44纖/H70，K44/Q68/A70，K44/Q68/D70，K44/Q6脂0，K44/Q68/S70,
K44/Q68/T70，K44/R68/A70，K44細/D70,K44/R68/E70，K44/R68/G70，
K44/R68/H70,K44/R68/N70，K44/R68/Q70，K44/R68/S70，K44/R68/T70,
K44/S68/A70，K44/S68/D70,K44雄/H70，K44/S68緒0，K44/S68/S70，
K44/S68/T70，K44/T68/A70,K44腦/D70,K44/T68/E70,K44腦/G70,
K44/T68/H70,K44腦/N70，K44/T68/Q70,K44/T68/S70，K44/T68/T70,
N44/A68/H70，N44/A68/R70,N44/H6謹0，N44/H68/R70,麗/K68/G70,
N44/K68/H70,N44/K6脂0，N44/K68/S70,N4頓68/R70,N44/P68/D70，
N44/Q68/H70,N44/Q68/R70，N44/R68/A70，畫/R68/D70,蒸/R6窗0，
N4概8/G70,N祖68/H70,N44雄/K70,N44雄/N70,N44/R68/R70,
N44/R68/S70,N44/R68/T70,N44/S68/G70,N44/S68/H70，N4楊8/K70,
N44/S68/R70,N44/T68/H70,藤/T68/K70，N44/T68/Q70，N44/T6簡0，
N44/T68/S70,P4柳68/D70，P44/T68/T70,Q44/A68/A70,Q44/A鐘70，
Q44/A68/R70,Q44/G68/K70,Q44/G68/R70,Q44/K68/G70,Q44/N68歸，
Q4頓68/H70,Q44/N68/S70,Q44歸/P70， /G70,Q44/R68/A70，
Q44麵/D70,Q44/R68/E70,Q44/R68/G70,Q44麵/H70,Q44/R68/N70,
Q4懇8/Q70，Q44/R68/S70,Q44/S68/H70，Q44/S68/R70,Q44/S68/S70,
Q44簡/A70,Q44/T68/G70,Q44/T68/H70,Q44/T68/R70,R44/A68/G70,
R44/A68/T70，R44/G68/T70，R44/H68/D70,R44/H68/T70,R44/N68/T70,
R44腦/A70，R44/R68/D70,諸/R68/E70，R44/R68/G70,R44/R68/N70，
R44/R68/Q70,R44/R68/S70,R44/R68/T70,R44/S68/G70,R44/S68/N70,
R44/S68/S70,R44/S68/T70,S44/D68/K70，S44/H6S/R70,S44/R68/G70，
S44/R68/N70，S44/R68/R70，S44編/S70,T44/A68/K70，雨A68/R70,
T44/H68/R70,T44/K68/R70,T4頓68/P70,T44麵8/R70,T44/Q68/K70,
T44/Q68/R70，T44/R68/A70，T44/R68/D70，T44/R68/E70，T44/R68/G70,
T4德8/H70，T44/R68/K70,T44細/N70,T44/R68/Q70,T44/R敏70,
T44/R68/S70, T44/R68/T70, T44/S68/K70， T44/S68/R70， T44/T68/K70, 和 T44/T68/R70.
依據(jù)所述用途的另一個有利的實施方案，所述I-CVd大范圍核酸酶 變體是同源二聚體。
依據(jù)所述用途的另一個有利的實施方案，所述I-Od大范圍核酸酶 變體是異源二聚體。
所述異源二聚體可以是由本發(fā)明中定義的兩種不同I-Odt變體融合 或者I-Od骨架蛋白與本發(fā)明中定義的I-O^I變體融合而組成的單鏈嵌
合分子?；蛘?，所述異源二聚體可以由選自本發(fā)明中定義的兩種不同
1-C"'I變體或l-Ox'I骨架蛋白以及本發(fā)明中定義的變體的兩種分
離單體組成。
依據(jù)所述用途-或者所述I誦Od大范圍核酸酶變體能夠切割在其+/-3至5位序列 為回文序列的DNA靼標，
-或者所述大范圍核酸酶變體能夠切割在其+/-3至5位序列 為非回文序列的DNA靼標，
依據(jù)所述用途的另一個有利的實施方案，被切割的核酸靶標是在-11 至-8位和+8至+11位的回文序列分別為caaa和tttg的DNA耙標。
依據(jù)所述用途的另一個有利的實施方案，所述的大范圍核酸 酶變體還包含75位的突變，優(yōu)選地為不帶電荷的氨基酸突變，更優(yōu)選 地為天冬酰胺或纈氨酸(D75N或D75V )。
依據(jù)所述用途的另一個有利的實施方案，所述的大范圍核酸 酶變體在44位具有丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)，用于切割在-4位包 含核苷酸a和/或在+4位包含t的DNA乾標。
依據(jù)所述用途的另一個有利的實施方案，所述的大范圍核酸 酶變體在44位具有谷胺酰胺(Q)，用于切割在-4位包含核苷酸t(yī)和/ 或在+4位包含a的DNA靼標。
依據(jù)所述用途的另一個有利的實施方案，所述的大范圍核酸 酶變體在44位具有賴氨酸(K),用于切割在-4位包含核苷酸c和/或在 十4位包含g的耙標。
本發(fā)明的主題還有大范圍核酸酶變體
-通過以上定義的制備方法可以獲得；
-在l-Od的44、 68和70位中至少一個氨基酸殘基處具有一個突 變；所述的突變可以是在與DNA靶標直接接觸的氨基酸中僅有 的一個；并且
-在±3至5位具有經(jīng)修飾的切割特異性。
這種新的l-CVd大范圍核酸酶可以作為體外消化中非常特異的內(nèi)切 核酸酶用于限制性酶切或作圖，或者在體內(nèi)或者離體用作基因組工程的 工具。另外，每種可以作為新的骨架用于第二輪的突變和選擇/篩選, 目的是制備新的、第二代歸巢核酸內(nèi)切酶。
依據(jù)本發(fā)明的大范圍核酸酶僅在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的44、 68 和/或70位進行突變。然而，本發(fā)明還包括能夠形成異源二聚體的不同 蛋白質(zhì)來自以上列表兩種不同蛋白質(zhì)的異二聚化還導致非回文序列的 切割，這種非回文序列由來自被親本蛋白單獨切割之位點的兩半構(gòu)成。 這可以通過體外在反應(yīng)緩沖液中加入兩種不同的pod變體而獲得，以
及體內(nèi)或離體過表達而獲得。另一種可能性是構(gòu)建如Epinat W /, (Epinat ""/ ， 2003)所述的單鏈分子。該單鏈分子是兩種不同 變體的融合體，并且還應(yīng)該導致嵌合的非回文序列的切割。
依據(jù)所迷I-OeI大范圍核酸酶變體的一個有利的實施方案，選用于 替換44、 68和/或70位氨基酸的氨基酸殘基選自包含A、 D、 E、 G、 H、 K、 N、 P、 Q、 R、 S、 T和Y的組。
依據(jù)另一個有利的實施方案，所述的I-Oel大范圍核酸酶變體選自
A44/A68/A70，
A44/A68/G70,A44/A68/H70,A44/A68/K70,A44/A6,70，A44/A68/Q70，
A44/A68/S70,A44/A68/T70，A44細/H70,A44/D68/K70，A44/D68/R70,
A44/G68/H70，A44/G68/K70，A44/G68/N70,A44/G68/P70,A44/H68/A70,
A44/H68/G70,A44/H68/H70，A44/H68/K70,A44/H68/N70,A44服8/Q70，
A44/H68/S70，A44/H68/T70,A44/K68/A70,A44/K68/G70，A44/K6,0,
A44/K6,70,A44/K68/Q70，A概6,0,A44/K68/S70,A44/脇/T70,
A4頓68/A70,A44/N6脂0，A44/N68/G70,A44/N68/H70，A4頓68/K70，
A44/N68/N70,A44扁8/Q70，A44/N6衡0，A4頓68/S70，A4頓68/T70,
A44/Q68/A70,A44/Q6隨0，A44/Q68/G70,A44/Q68/H70,A44/Q6謝70,
A44/Q68/S70,A44/R68/E70,A44/R68/K70,A44/R68/L70,A4楊歸0，
A44/S68/G70,A44/S68/N70，A44/S68/Q70,A44/S68/R70,A44/S68/S70,
A44/S68/T70,A44簡/A70，A44腦/G70,A44/T68/H70,A44/T6,70,
A44/T68/Q70,A44/T68/S70,A44/T68/T70,D44/D68/H70，D44/N68/S70,
D44/R68/A70,D44/R6歸0，D44/R68/Q70,D44/R68/R70,D44麵/S70,
D44雌/T70，E44/H68/H70,E44細/A70,E44/R68/H70,E4德8/N70,
E4德8/S70,E44纖/T70,E44/S68/T70,G4娜8/K70,G44/Q68/H70,
G44麵/Q70,G44/T6瞎0，G44脂7P70,G44/T68/R70,H44/A68/S70，
H4德8/T70，H植6薩0，H44/R68/E70,H44/R68/G70,H44/R68/N70,
H44/R68/R70，H44/R68/S70，H術(shù)68/G70，H44/S68/S70，H44/S68/T70，
H44/麗S70，H44/T68/T70,K44歸/A70,K44/A68/D70，K44/A68/￡70，
K44/A68/G70,K44/A68/H70，K4德薩0，K44/A68/Q70，K44/歸A70，
K44/D68/T70，K44/E68/G70,K44/E68/S70，K44/G68/A70,K44/G68/G70，
K44/G68/N70，K44/G68/S70,K44/G68/T70，K44/H68/D70,K44/H6,0，
K4德8/G70,K44/H6歸0，K額68/S70，K44/H68/T70，K44/K68/A70,
K4復68/D70，K44/K68/H70，K44/K68/T70,K4頓68/A70,K44/N68/D70,
K44/N68/E70，K44/N68/G70,K44/N68/H70,K44/N68/N70，K4頓68/Q70，
K44麵8/S70，K44/N68/T70,K44/P68/H70,K44/Q68/A70,K44/Q68/D70，
K44/Q68/E70，K44/Q68/S70,K44/Q68/T70，K44/R68/A70,K44麵/D70,
K44/R68/E70,K44/R68/G70,K44/R68/H70,K44/R6,70,K44麵/S70，
K4條8/A70,K44/S68/D70,K4德8/H70,K44/S6S/N70,K44/S68/S70，
K44/S68/T70,K44/T68/A70,K44/T6S/D70,K44/T68/E70,K44/T68/G70,
K44/T68/H70,K44脂/N70，K44腦/Q70,K44/T68/S70,K44脂/T70，
N44/A68/H70,N44/H68/N70，N44/H68/R70,N44/K68/G70,N44/K68/H70,
建/K68/R70,N44/K68/S70，菌扁/D70，簡,/H70,N44/R68/A70，
N4德8/D70，N44/R68/E70，N44/R68/K70，N44/S68/G70,N44/S68/H70,
N44雄/K70,N44/S68/R70,頻頭/H70，N44/T68/K70,N44/T68/Q70,
N44/T68/S70,P44感8/D70,P44/T68/T70,Q44/G68/K70,Q44/G68/R70,
Q44/K68/G70,Q44/N68/A70，'Q44顏/H70，Q44/N68/S70,Q44/P6諮0，
Q44/Q68/G70,Q44/R6S/D70，Q44/R68/E70,Q44/R68/G70,Q機68/Q70,
Q44細/S70,Q44/T68/A70,Q44腦/G70,Q44/T68/H70，R44/A68/G70,
R44/A68/T70，R44/G68/T70,R44服,0,R44/H68/T70，R44/N68/T70,
R44/R68/A70,R44/R68/D70，R44/R68/E70,R44/R68/G70,R44/R68/Q70,
R44/R68/S70，R44/R68/T70,R4楊8/G70,R44/S6S/N70，R44/S68/S70,
R44/S68/T70,S44/D68/K70,S44/R6節(jié)0，S44/R68/S70,T44/A68/K70，
T44/N68/P70， T44/N68/R70, T44/R68/E70， T44/R68/Q70:和T44/S68/K70;戶斤述j.Oel大'范
圍核酸酶變體能夠切割至少一個如前定義的不祐:N75骨架蛋白 所切割的靼標。
依據(jù)另一個有利的實施方案，所述大范圍核酸酶變體在44 位具有丙氨酸(A)或天冬酰胺(N),并切割在-4位包含核苷酸a和/ 或在+4位包含t的乾標，但排除國際PCT申請WO 2004/067736的表4 和表5中所示的變體，優(yōu)選所述變體具有丙氨酸或天冬酰胺。
依據(jù)另一個有利的實施方案，所述I-CVdt大范圍核酸酶變體在44 位具有谷胺酰胺(Q)并切割在-4位包含核苷酸t(yī)和/或在+4位包含a 的靶標，但排除國際PCT申請WO 2004/067736的表3、表4和表5中 所示的變體。
依據(jù)另一個有利的實施方案，本發(fā)明的大范圍核酸酶變體在 44位具有賴氨酸(K)，并切割在-4位包含核苷酸c和/或在+4位包含g 的靶標，但排除國際PCT申請WO 2004/067736的表5中所示的變體。
如前所具體描述的，在本應(yīng)用申請中大范圍核酸酶變體的定 義范圍內(nèi)，所述I-OeI大范圍核酸酶變體可以是同源二聚體或異源二聚 夠切割回文或非回文DNA靼標。它還可以包含75位突變， 如前面所具體描述的。
本發(fā)明的主題也是多核苷酸，其特征在于它編碼依據(jù)本發(fā)明的 大范圍核酸酶變體。
另外，本發(fā)明的主題也是包含所述多核苷酸和調(diào)節(jié)序列如啟動子的 表達盒，以及包含所述表達盒的表達栽體。當所述變體是由兩個不同單 體組成的異源二聚體時，每個單體可以從單一載體(雙重表達載體)或 從兩個不同栽體中表達。
本發(fā)明的主題也是如前所述的進一步包含靶向DNA構(gòu)建體的表達 載體。
術(shù)語"栽體"指能夠運送與其連接的另一核酸的核酸分子。優(yōu)選的 載體類型之一為附加體，即能夠在染色體外復制的核酸。優(yōu)選的載體能 夠自主復制和/或表達與其連接的核酸。能夠指導與其操作性連接的基 因表達的栽體在本文稱為"表達栽體"。依據(jù)本發(fā)明的栽體包含但不限 于，YAC(酵母人工染色體)、BAC(細菌人工染色體)、桿狀病毒載體、 噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒載體、質(zhì)粒、RNA栽體或者線性或環(huán)狀 DNA或RNA分子，其可以由染色體的、非染色體的、半合成的或合成的DNA組成。通常，用于重組DNA技術(shù)的表達載體常常是"質(zhì)粒"形 式，其通常表示其載體形式不與染色體結(jié)合的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。大量 的合適載體已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且有市售，比如以下細菌載體
pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen)， pbs, pDIO， phagescript， psiX174. pbluescript SK， pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a， pKK223-3， pKK233-3， pDR540, pRJT5 (Pharmacia); pWLNEO,pSV2CAT, pOG44， pXTI， pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV， pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (Q〗Aexpress)， pET
(Novagen )。
病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、細小病毒(例如，腺伴隨病毒)、 冠狀病毒、負鏈RNA病毒如正黏病毒(例如，流感病毒)、彈狀病毒(例 如，狂犬病和皰滲性口炎病毒)、副黏病毒(例如，麻滲和仙臺)、正鏈 RNA病毒如小RNA病毒和甲病毒、以及雙鏈DNA病毒包括腺病毒、 皰滲病毒(例如，1型和2型單純皰瘆病毒、Epstein-Barr病毒、巨細 胞病毒)和痘病毒(例如，痘苗、禽痘和金絲雀痘)。其它病毒包括， 例如，Norwalk病毒、披膜病毒、黃熱病毒、呼腸孤病毒、乳多空病毒、 嗜肝DNA病毒以及肝炎病毒。
載體可以包含選擇標記，例如用于真核細胞培養(yǎng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶、組氨醇脫氫酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、單純皰疹 病毒胸苷激酶、腺苷脫氨酶、谷胺酰胺合成酶、和次黃嘌呤鳥噤呤磷酸 核糖基轉(zhuǎn)移酶；用于釀酒酵母(51. c^MWs/fle)的TRP1;大腸桿菌中的 四環(huán)素、利福平或氨節(jié)青霉素抗性。
優(yōu)選地所述載體為表達載體，其中編碼本發(fā)明多肽的序列被置于適 當?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的控制之下，從而允許所述多肽的產(chǎn)生或合 成。因此，所述多核苷酸包含在表達盒中。更具體地，所述載體包含復 制起點、與所述編碼多核苷酸操作性連接的啟動子、核糖體結(jié)合位點、 RNA剪接位點(當使用基因組DNA時)、多聚腺苷化位點和轉(zhuǎn)錄終止 位點。它還可以包含增強子。啟動子的選擇將依賴于在其中表達多肽的 細胞。
依據(jù)所述表達栽體的一個有利的實施方案，所述靶向DNA構(gòu)建體 包含與本發(fā)明l-Crel大范圍核酸酶變體的切割位點附近區(qū)域具有同源
性的序列。
依據(jù)所述表達載體的另一個有利的實施方案，所述靶向DNA構(gòu)建 體包含
a )與依據(jù)要求保護的大范圍核酸酶變體的切割位點附近區(qū) 域具有同源性的序列，以及
b)其側(cè)翼為a)中序列的待引入序列。
本發(fā)明的主題還是細胞，其特征在于它被如前定義的多核苷酸或被 如前定義的載體修飾。
本發(fā)明的主題還是轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于它包含如前定義的多核 苷酸，或如前定義的載體。
本發(fā)明的主題還是非人的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其特征在于它包含如前 定義的多核苷酸或如前定義的載體。
編碼如本發(fā)明所定義多狀的多 員已知的任何方法來制備。例如，它們利用聚合酶鏈式反應(yīng)使用特異性 引物從cDNA模板進行擴增。優(yōu)選地，選擇所述cDNA的密碼子以有利 于所述蛋白質(zhì)在期望表達系統(tǒng)中表達。
包含所述多核苷酸的重組載體可以通過眾所周知的重組DNA和遺 傳工程技術(shù)而獲得并引入到宿主細胞中。
本發(fā)明的異源二聚體大范圍核酸酶通過表達兩種如前定義的多肽 而產(chǎn)生；優(yōu)選地所述多肽在適于所述多肽共表達的條件下在宿主細胞中 共表達，所述宿主細胞被兩種表達載體^務(wù)飾，其中每種表達栽體包含編 碼如前定義不同多肽的多核苷酸片段，或者所述宿主細胞被包含如前定 義兩種多核苷酸片段的雙重表達載體修飾，并且從宿主細胞培養(yǎng)物中回 收所述異源二聚體大范圍核酸酶。
本發(fā)明的主題還有如前定義的大范圍核酸酶變體、 一種或兩 種多核苷酸(優(yōu)選都包括在一個表達載體中(雙重表達栽體)或分別包 括在不同表達載體中)、細胞、轉(zhuǎn)基因植物、非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物在分 子生物學、體內(nèi)或體外遺傳工程以及體內(nèi)或體外基因組工程中用于非治 療性目的的用途。
非治療性目的包括例如(i)在包裝細胞系中進行特異基因座位的基 因打靶，用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)，(ii)在農(nóng)作物植物中進行特異基因座位的基
因打耙，用于品系改良和代謝工程，(m)乾向重組，用于去除遺傳修
飾農(nóng)作物中的標記物，(iv)靶向重組，用于去除遺傳修飾微生物菌林
中的標記物(例如用于抗生素生產(chǎn))。
依據(jù)所述用途的一個有利的實施方案，它用于在包含DNA靶序列 的目的位點引入雙鏈斷裂，從而誘導DNA重組事件，DNA丟失或細胞 死亡。
依據(jù)本發(fā)明，所述雙鏈斷裂用于修復特定序列，修飾特定序列， 恢復突變基因位置處的功能基因，削弱或激活目的內(nèi)源基因，在目的位 點引入突變，引入外源基因或其一部分，失活或刪除內(nèi)源基因或其一部 分，使染色體臂易位或者使DNA不祐J務(wù)復以及降解。
依據(jù)所述用途的另 一個有利的實施方案，所述I-CVeI大范圍核酸酶、 多核苷酸、載體、細胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物與如前定 義的耙向DNA構(gòu)建物相結(jié)合。
本發(fā)明的主題還是遺傳工程方法，其特征在于它包括以下步驟在 位于載體上的目的位點斷裂雙鏈核酸，所述載體包含如前定義的I-CVd 大范圍核酸酶變體的DNA靶標，這是通過將所述載體與如前定義的 大范圍核酸酶變體接觸，從而謙導與表現(xiàn)出與所述I-Q^1大范圍 核酸酶變體切割位點附近序列具有同源性的另 一種載體的同源重組。
本發(fā)明的主題還有基因組工程的方法，其特征在于它包括以下步 驟1)通過將所述切割位點與所述I-CVeI大范圍核酸酶變體接觸，從 而雙鏈斷裂基因組基因座位，該基因座位包含如前定義的大范圍 核酸酶變體的至少一個識別和切割位點；2)在適于與靶向DNA構(gòu)建體 同源重組的條件下維持所述斷裂基因組基因座位，所述靶向DNA構(gòu)建 體包含待引入所述基因座位的序列，該基因座側(cè)翼為有與靶基因座位具 有同源性的序列。
本發(fā)明的主題還是基因組工程的方法，其特征在于它包含以下步 驟1)通過將所述切割位點與所述I-CVeI大范圍核酸酶變體接觸，雙 鏈斷裂基因組基因座位，該基因座位包含如前定義的大范圍核酸 酶變體的至少一個識別和切割位點；2)在適于與染色體DNA同源重 組的條件下維持所述斷裂基因組基因座位，所述染色體DNA與切割位 點附近區(qū)域具有同源性。
本發(fā)明的主題還是組合物，其特征在于它包含至少一種如前定義的 大范圍核酸酶變體、多核苷酸或載體。
在所述組合物的一種優(yōu)選實施方案中，它包含靶向DNA構(gòu)建體， 該靶向DNA構(gòu)建體包含修復目的位點的序列，所述目的位點側(cè)翼是與 靶基因座位具有同源性的序列。
本發(fā)明的主題還是至少一種如前定義的大范圍核酸酶變體、 多核苷酸或載體用于制備藥物的用途，所述藥物用于預防、改善或治療 有此需要的個體中的遺傳性疾病，所述藥物通過任意方式施用給所述個 體。
本發(fā)明的主題還是至少一種如前定義的大范圍核酸酶變體、 多核苷酸或載體用于制備藥物的用途，所述藥物用于預防、改善或治療 有此需要的個體中由提呈DNA中間體的傳染因子引起的疾病，所述藥 物通過任意方式施用給所述個體。
本發(fā)明的主題還是至少一種如前定義的I-CVd大范圍核酸酶變體、 多核苷酸或載體的用途，體外用于在生物來源產(chǎn)品或者意在生物應(yīng)用的 產(chǎn)品中抑制增殖、失活或消除提呈DNA中間體的傳染因子，或者用于 消毒目標對象。
在一個具體實施方案中，所述傳染因子為病毒。
除了前述的特征，本發(fā)明還包含從以下說明以及附圖中得出的其它 特征，說明書包括舉例說明本發(fā)明的I-CVel大范圍核酸酶變體及其應(yīng)用 的實施例，其中附圖中
-

圖1舉例說明試驗的基本原理。(a)與其DNA靶標結(jié)合的1-C"4 的結(jié)構(gòu)。(b)顯示選用于隨機化的殘基44、 68、 70以及D75與相互作 用堿基對的結(jié)構(gòu)的放大。(c)文庫和靶標的設(shè)計。標明了 I-Od的殘基 Q44、 R68和R70與DNA耙標的相互作用(上方)。與所述DNA耙標
直接或間接相互作用的其它氨基酸殘基未示出。1-C"'I單體的44位精 氨酸殘基(R)與靶序列的-5位鳥嘌呤直接相互作用，而44位谷氨酰 胺(Q)殘基和70位精氨酸(R)殘基分別與互補鏈的+4位腺嘌呤和 +3位鳥嘌呤直接相互作用。本文所描述的耙標(C1221, SEQ ID NO: 12 ) 是源自I-Od天然乾標(C1234, SEQ ID NO:65 )的回文序列，并被I-OeI 所切割(Chevalier et al.， 2003,預先引用)。切割位置用箭頭注明。在 文庫中，殘基44、 68和70用ADEGHKNPQRST替換。因為I-Od是 同源二聚體，所以所述文庫用回文耙標進行篩選。產(chǎn)生了 64個源自±3、
±4和±5位替換的回文乾標。顯示了這些把標的一些實例(下方；SEQ ID NO: 1至7)。
-圖2舉例說明研究中4吏用的耙標。A.兩個源自天然I-Oel耙標 (本文稱為C1234, SEQ ID NO:65 )的回文耙標。所述I-Od天然靶標 含有兩個回文序列，用灰色框顯示 一方面為-8至-12和+8至+12位核 苷酸，另一方面為-5至-3和+3至+5位核苷酸。垂直虛線，從此編碼核 苷酸堿基，其代表回文序列的對稱軸?？梢詮奶烊话袠搜苌鷥蓚€回文序 列，即C1221 ( SEQ ID NO: 12 )和C4334 ( SEQ ID NO:66 )。 二者均 在體外和在酵母中被I-CVd所切割。僅顯示每個靶位點的一條鏈。B. 64 個靶標。這64個靶標(SEQ ID NO: 1至64 )源自C1221 ( SEQ ID NO: 12 )，并被I-Od所切割(C1234, SEQ ID NO:65 )( Chevalier et al., 2003, 預先引用)，所述C1221是源自I-Oel天然靶標的回文序列。它們對應(yīng) 于得自在-5、 -4、 -3、 +3、 +4和+5位進行替換的所有24&卩回文序列。
-圖3舉例說明變體的篩選。(a)用表達大范圍核酸酶的以 基因作為標記的載體轉(zhuǎn)化酵母，并單獨地與轉(zhuǎn)化有報告質(zhì)粒的以2TW^ 基因作為標記的酵母進行接合。在所述報告質(zhì)粒中，LacZ報告基因被 含有目的位點的插入片段打斷，其側(cè)翼是兩個直接重復。在二倍體 (丄五tZ2 7T W)中，大范圍核酸酶(白色橢圓)切割乾位點誘導兩個 LacZ重復之間發(fā)生同源重組，得到有功能的P-半乳糖苷酶基因(灰色 橢圓)，這可用X-Gal染色監(jiān)測。(b)試驗流程。使用PCR構(gòu)建I-OeI 變體的文庫，將其克隆到復制型酵母表達載體中并轉(zhuǎn)化入釀酒酵母菌株 FYC2-6A (廣《吵城&"風to3扁:)。所述64個回文乾標被克隆到
基于LacZ的酵母報告栽體中，并且所得克隆轉(zhuǎn)化入菌林FYBL2-7B
(廁化，w/^巡W,印"私/et^A , /"^I2W:)。使用機器人輔助在濾膜上劃網(wǎng)格
進行表達大范圍核酸酶變體的單個克隆與攜帶報告質(zhì)粒的單個克隆之間的接合。在初步高通量篩選后，陽性克隆的ORF通過PCR進行擴增 并測序。從2100個陽性克隆中鑒定出410種不同變體，并以低密度進 行檢測，以建立完整的模式，并且驗證了 350個克隆。同時，294個突 變體被再次克隆入酵母載體，并在二次篩選中進行檢測，結(jié)果證實了那 些獲得的未再次克隆的突變體。然后，在類似的基于CHO的分析中并 最終在體外分析所選克隆的切割活性。
一圖4表示編碼I-CVel N75骨架蛋白的cDNA序列以及用于Ulib2 文庫構(gòu)建的簡并引物。A.所述骨架蛋白(SEQIDNO:69)的編碼序列 (CDS )從第一個堿基對至第501個堿基對，并且"終止，，密碼子TGA (未示出)在第501個堿基對后。除了D75N突變以外，該蛋白還包含 不改變其活性的突變；在該蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO:70)中，N末端 前兩個殘基是曱硫氨酸和丙氨酸(MA)，并且C末端三個殘基為丙氨 酸、丙氨酸和天冬氨酸(AAD)。 B.簡并引物(SEQIDNO:67、 68)。
一圖5表示pCLS0542大范圍核酸酶表達載體圖。該大范圍核酸 酶表達栽體以LEU2作為標記。編碼大范圍核酸酶變體的cDNA 克隆到已用7Vt^T和五flgJ消化的該載體中，以侵j皮i秀導型Gall0啟動子 驅(qū)動表達所述變體。
-圖6表示pCLS0042報告載體圖。該報告載體以7T^W和L/iL43 作為標記。LacZ辜聯(lián)重復具有800bp的同源性，并且被1,3kb的DNA 分離開。它們被啟動子和終止子序列所包圍。靶位點被克隆到 位點。
-圖7舉例說明292個具有經(jīng)修飾特異性的l-Orl大范圍核酸酶 變體的切割特征。所述變體來源于I-CVdN75骨架蛋白。通過存在于第 44、 68和70位的氨基酸(前三列)來定義蛋白質(zhì)。氨基酸的編號依據(jù) pdb登記碼lg9y。通過在-5至-3位的核苷酸來定義靶標。對于每種蛋 白質(zhì)，顯示出64個靶標中每一個的觀察到切割(1 )或未觀察到切割(0 )。
-圖8舉例說明I-Oe[變體切割模式的8個實例。所述大范圍核 酸酶針對圖2B中描述的64個耙標各檢測4次。不同靼標的位置在左上 部框中標出。來源于I-OdN75骨架蛋白的變體根據(jù)第44、 68和70位 氨基酸來識別(例如KSS是K44、 S68、 S70和N75,或者K44/S68/S70 )。 所述氨基酸的編碼方式依據(jù)pdb碼lg9y。 QRR對應(yīng)于IOel N75。被切割的靶標在框旁邊注明。
-圖9舉例說明變體的切割模式。突變體用三個字母表示，對應(yīng) 于第44、 68和70位的殘基。針對來自天然乾標的64個靶標以 及一系列對照靶標檢測每個突變體。靶標圖標注在右上部框內(nèi)。(a)野 生型l-Ot，I (I-CW'1)和N75 ( QRR )蛋白以及7種I-CVd N75 蛋白的衍生物在酵母中(左側(cè))和哺乳動物細胞中(右側(cè))的切割模式。 對于酵母而言，顯示最初的原始數(shù)據(jù)(filter )。對于CHO細胞而言， 顯示定量的原始數(shù)據(jù)(ONPG測量)，高于0.25的值用方框框住，高于 0.5的值用中灰色高亮顯示，高于l的值用深灰。LacZ:陽性對照。0: 無靶標。Ul、 U2和U3: 3個不同的未切割對照。(b)體外切割。針對 一組2或4個靶標檢測和4個突變體，所述耙標包括在酵母和 CHO中產(chǎn)生最強信號的靶標。如方法部分所述，與2nM線性化底物在 37。C消化l小時。顯示I-CVel與兩個不同靶標的原始數(shù)據(jù)。帶有g(shù)gg和 cct的耙標，沒有檢測到對其的切割。
-圖10表示統(tǒng)計分析。(a)被切割的靶標被I-CVeI變體切割 的靶標用灰色表示。切割每個靶標的蛋白質(zhì)的數(shù)目顯示在下方，并且灰 色著色程度與在酵母中這些切割蛋白得到的平均信號強度成比例。(b) 對7個聚類中3個的分析。對于每個突變體聚類(聚類1、 3和7)，計 算每個靶標的累計強度，并且柱形圖(左側(cè)柱圖)以降序顯示經(jīng)標準化 的強度。對于每個聚類，每種類型在每個位置(44、 68和70)的氨基 酸的數(shù)目在右欄中顯示為帶編碼柱狀圖。氨基酸顏色代碼的圖注在圖底 部。(b)酵母中突變體和靶標數(shù)據(jù)的層級聚類。使用Eudidean距離和 Ward's方法(Ward, J. H., American statist. Assoc., 1963， 58， 236-244 ) 用層級聚類分析將突變體和靶標進行聚類。使用R軟件包中的hclust 命令進行聚類分析。重新排序突變體和靶標的系統(tǒng)樹狀圖以優(yōu)化聚類的 位置，并且所述突變體的系統(tǒng)樹狀圖以推導出的聚類在高度為8處切割。 QRR突變體和GTC靶標用箭頭標注。灰階反映了信號的強度。
-圖11舉例說明雜合或嵌合位點的實例gtt ( SEQ ID NO: 79 ) 和ctt ( SEQ ID NO: 77 )是兩個源自IOd位點的回文位點。該gtt/ctt 雜合位點(SEQ ID NO: 80)顯示了頂部鏈上-5、 -4、 -3位的gtt序列以 及底部鏈上5、 4、 3位的cct序列。
-圖12舉例說明異源二聚體變體的切割活性。用KTG和QAN
變體共轉(zhuǎn)化酵母。靶標結(jié)構(gòu)顯示于頂部的框中具有單個gtt、 cct或gcc 半位點的耙標用粗體顯示；具有兩個這些半位點的靶標用粗體并且灰色 高亮顯示，該靶標預期會被同源和/或異源二聚體切割；0:無靶標。結(jié) 果顯示于下面的三個框上。僅對于分別被KTG和QAN切割的gtc/cct 和gtt/gte觀察到意料之外的微弱信號。
-圖13表示異源二聚體變體的切割活性的定量分析。(a)選定突 變體共同轉(zhuǎn)化酵母。為了更清楚，只顯示了相關(guān)的雜合靶標的結(jié)果。 aac/acc靶標總是作為不相關(guān)靶標的實例而顯示。對于KTG x AGR雜 交，回文的tac和tct靶標序列(雖然未示出)分別被AGR和KTG切 割。RRN突變體對cat靶標的切割非常低，并且在酵母中不能定量。(b) CHO細胞中的瞬時共轉(zhuǎn)染。對于(a)和(b)，黑色柱單獨第一個突 變體的信號；灰色柱單獨第二個突變體的信號；條紋柱通過共表達 或共轉(zhuǎn)染得到的信號。
-圖14舉例說明組裝的異源二聚體ARS-KRE在所選小鼠染色體 17的DNA乾標上的活性。用等摩爾的靶標LagoZ質(zhì)粒、ARS和KRE表 達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-Kl細胞系，并測量P-半乳糖苷酶活性。用所述LagoZ 質(zhì)粒和I-S"I、 I-Orl、 ARS或KRE重組質(zhì)粒或空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細胞作為 對照。
本文以下的實施例僅舉例說明本發(fā)明，并不限制其范圍。其它使 用適當引物由序列不同于SEQ ID NO: 69的cDNA獲得的變體仍是本發(fā) 明的一部分。
實施例1:篩選新的功能性內(nèi)切核酸酶
所述用于生產(chǎn)大范圍核酸酶變體的方法以及哺乳動物或酵母細胞 中基于切割誘導重組的分析在國際PCT申請WO 2004/067736中已描 述，它們被用于篩選具有改變特異性的變體。這些分析得到功能性LacZ 報告基因，該報告基因可以通過標準方法監(jiān)測(圖3a)。
A) 材料和方法
a)突變體文庫的構(gòu)建
如前所述(Epinat et al" N.A.R.， 2003， 31， 2952-2962 )，合成wt和l-Ot'l D75N (或N75 )的開放讀碼框(SEQ ID NO:69,圖 4A)。通過將第75位密碼子替換為aac而引入突變D75N。通過使用來 自Sigma的簡并引物以及所述D75N基因作為DNA模板進行 PCR來產(chǎn)生大范圍核酸酶文庫的多樣性，其中簡并引物在第44、 68和 70位帶有密碼子VVK (18個密碼子，氨基酸ADEGHKNPQRST),這些
位置與位于3至5位的堿基直接相互作用。這些引物使得44、 68和70
位殘基可發(fā)生理論多樣性為12的突變。簡要地說，使用正向引物
(:5,-gtttaaacatcagctaagcttgacctttwkgtgacttcaaaagacccag-3，， SEQ ID NO: 67:)和反向引物
(5，-gatgtagttggaaacggatccrabbatcmbbtacgtaaccaacgcc-3，， seq IDnO: 68:)在50jxl PCR
反應(yīng)中擴增PCR片段合并PCR產(chǎn)物，用乙醇沉淀然后重懸于50^1 10mM Tris。將PCR產(chǎn)物克隆入含有I-Odt D75N基因的pET表達載 體中，該表達載體已用適當?shù)南拗菩悦高M行消化。栽體和插入片段DNA 的消化分兩步進行(單酶消化)，在其間DNA樣品被提取出來(使用經(jīng) 典的基于苯酚氯仿異戊醇的方法)并用乙醇沉淀。10pg消化后載 體DNA用于連接反應(yīng)，其中插入片段DNA為5:1過量。用所得載體通 過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI細胞。為了得到超過文庫的理論多樣性的 許多細胞克隆，產(chǎn)生了 6xi0"個克隆。從平板刮下細菌克隆，并且提取 和純化對應(yīng)的質(zhì)粒載體。
通過亞克隆含有完整I-Od D75N ORF的A^ I-五agl DNA片段， 該文庫^f皮再次克隆入酵母pCLS0542載體(圖5)。在該基于2p的可復 制并以Z^t/2基因為標記的栽體中，變體在半乳糖誘導型啟動子 (Epiimt et al.，先前引用)的控制下。在向大腸桿菌電穿孔后，獲得7 乂104個克隆，其代表了 DNA水平理論多樣性(183 = 5832 )的12倍。 將DNA提取出來并轉(zhuǎn)化入釀酒酵母菌林FYC2-6A (M/4ra、 ^p7Zl63、 /^2Z/、 /i"3Zl2^ )。 4吏用菌落挑取工具(QpixII， GENETIX)挑取出 13824個菌落，并生長在144個微量滴定板中。
b)靶標克隆的構(gòu)建
C1221 24bp回文序列(:tcaaaacgtcgtacgacgttttga， SEQ ID NO: 12:)是
近乎回文的天然靼標(:tcaaaacgtcgtgagacagtttgg， SEQ ID NO: 65 )的半位
點的重復。C1221在酵母和哺乳動物細胞中體外和離體都如I-Orl天然
把標一樣被高效切割。如下產(chǎn)生64個回文乾標64對寡核苷酸 (:ggcatacaagtttcaaaacnnngtacnnngttttgaoaatcgtctgtca (seq ID NO: 72)以及反向互補序
列)對應(yīng)于64個DNA靶標的兩條鏈，在所述寡核苷酸每側(cè)具有12bp 非回文的額外序列，從Sigma定購所述寡核苷酸，退火并克隆入 PGEM-T Easy ( PROMEGA )。然后，從64個pGEM-T衍生載體的每 個中切出 400bp的片段，并克隆入前述酵母栽體 pFL39國ADH-LACURAZ ( Epinat et al.,先前引用)中，該載體也叫 pCLS0042 (圖6)，得到了 64個酵母報告載體。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的經(jīng)典方法進行切除、消化和連接的步驟。在pCLS0042的位 點插入靼序列。該64個回文耙標描述于圖2B中(-5至-3位和+3至+5 位，SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 64 )。
c) 酵母菌株和轉(zhuǎn)化
將大范圍核酸酶表達變體的文庫和A44/R68/L70變體轉(zhuǎn)化入 FYC2-6A (M4Tcr、吵M6丄/ew2A 、 / WZA，)菌林中。
將所述耙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌林FYBL2-7B: (Af」ra, imi3ZU5J、
對于轉(zhuǎn)化，可以使用經(jīng)典的化學/熱激方案，常規(guī)地每pgDNA產(chǎn) 生106個獨立轉(zhuǎn)化體；在亮氨酸缺乏的合成培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體(Gietz and Woods, 2002 )。
d) 酵母中大范圍核酸酶表達克隆的接合和篩選
I-CVd變體克隆以及酵母報告菌林貯存在甘油(20 o/。)儲備液中， 并在新微板中進行復制。突變體以網(wǎng)格方式培養(yǎng)在覆蓋有尼龍濾膜的 YPD培養(yǎng)板上，并使用高網(wǎng)格密度(大約20個點/cm2)。在同樣的濾膜 上進行第二次網(wǎng)格培養(yǎng)，針對每個變體點樣由64或75個不同的帶報告 基因的酵母菌林組成的第二層。簡要地說，每個報告菌林在尼龍膜上點 樣13824次，并且在每一個該點上^C點樣13 824個表達變體大范圍核酸 酶酵母克隆中的一個。將膜放在固體瓊脂YPD豐富培養(yǎng)基上，并在30'C 孵育過夜，使之發(fā)生接合。然后，將濾膜轉(zhuǎn)移至缺乏亮氨酸和色氨酸并 以半乳糖(1% )為碳源(并以G418用于共表達實驗)的合成培養(yǎng)基， 在37。C孵育5天，以選擇攜帶表達和靶標載體的二倍體。5天后，將濾 膜放在固體瓊脂糖培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基在0.5M磷酸鈉緩沖液(pH 7.0 )、 0.1%SDS、 6%二甲基曱酰胺(DMF)、 7mM(3-巰基乙醇、1%瓊脂糖中
含有0.02%的X-Gal,并在37。C孵育，以檢測P-半乳糖苷酶活性。在孵 育2天后依據(jù)染色情況鑒定陽性克隆。通過掃描對結(jié)果進行分析，并使 用專用軟件進行定量。對第二次篩選來說，對292個所選陽性克隆使用 同樣的步驟，但是在同樣的膜上對每個突變體進行4次檢測(參見圖8 和9a)。
d)初步篩選結(jié)果的序列以及再克隆
在酵母中初步篩選所鑒定的陽性克隆的開放讀碼框(ORF)通過 PCR進4亍擴增并測序。然后使用Gateway方案(Invitrogen )將ORF 再次克隆。通過對酵母菌落進行PCR來擴增ORF (Akada et al., Biotechniques， 28， 668-670， 672-674 )，使用以下引物來自PROLIGO
的 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc (SEQ ID NO: 73)和 ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc (SEQ ID NO: 74)pcR產(chǎn)物克隆
入(i)攜帶半乳糖誘導型啟動子、作為選擇標記的Zj^72或KanR以 及2n復制起點的酵母gateway表達載體，以及(ii)來自NOVAGEN 的pET24d(+)載體。所得克隆通過測序(MILLEGEN)來驗證。
B)結(jié)果
I-CVd是二聚體歸巢內(nèi)切酶，其切割22bp的假回文靶標。分析與 其天然靶標相結(jié)合的I-Od的結(jié)構(gòu)已顯示出，在每個單體中8個殘基與 7個堿基建立了直接相互作用(Jurka et al.， 1998，先前引用)。殘基 Q44、 R68、 R70與3至5位(以及-3至-5位，圖1)的三個連續(xù)堿基 對相接觸。使用窮舉蛋白質(zhì)文庫對比耙標文庫方法以局部地改造DNA 結(jié)合界面的該部分。首先，將所述I-Oel骨架從D75突變?yōu)镹，從而降 低文庫中由堿性殘基R68和R70的替換引起的可能的能量限制，以滿 足I-Od結(jié)構(gòu)中被包埋的D75的氫受體潛能。D75N突變體的同源二聚 體(從大腸桿菌細胞中純化，其中使用pET表達載體使之過表達)顯 示出切割I(lǐng)-Od歸巢位點。該D75N突變不影響蛋白結(jié)構(gòu)，但是降低了 在過表達實驗中的的毒性。接著，第44、 68和70位,皮隨機改變， 并且如圖1和2B所述，并產(chǎn)生通過由所切割的回文耙標中±3、 士4和士5位的替換而得到的64個回文耙標(Chevalier etal,， 2003，先 前引用)。最后，蛋白質(zhì)文庫中的突變體對應(yīng)于在三個殘基位置由vvk 密碼子編碼的12種氨基酸的任意一種獨立組合。結(jié)果，蛋白質(zhì)文庫的 最大(理論)多樣性為123或1728。然而，對核酸而言,該多樣性為183
或5832。
所得文庫被克隆入攜帶丄五J72營養(yǎng)缺陷型標記基因的酵母復制型 表達載體，并轉(zhuǎn)化入leu2突變體單倍體酵母菌林(FYC2-6A)中。所 述64個靶標被克隆入適當?shù)慕湍笀蟾嬖泽w中并轉(zhuǎn)化入單倍體菌林 (FYBL2-7B)中，得到64個檢測林。
使用機器人輔助的接合方案以從我們的文庫中篩選大量的大范圍 核酸酶。通用的篩選策略描述于圖3b中。13,8247個大范圍核酸酶表達 克隆(大約2.3倍于理論多樣性)以高密度(20個點/cm2)被點樣在尼 龍濾膜上，并針對64個靶標菌林中每一種單獨進行檢斷884,608個點)。 2100個顯示出針對至少一個靶標有活性的克隆被分離出來(圖3b)，并 且PCR擴增編碼大范圍核酸酶的ORF并測序。410個不同的序列:帔鑒 定出來，并且相似數(shù)目的對應(yīng)克隆被選作進一步分析。將點樣密度降低 至4個點/cm2,并且對每個克隆針對64個報告菌林進行一式四份地檢 測，從而創(chuàng)造出完整的特征語(如圖8和9a)。 350個陽性克隆可以被 證實。然后，為了避免含有多于一個克隆的菌林的可能性，突變體的 ORF通過PCR進行擴增，并再次克隆入酵母載體中。得到的質(zhì)粒被單 個轉(zhuǎn)化回到酵母中。得到294個這樣的克隆，并以低密度進行檢測(4 個點/cm2)。觀察到與初步篩選的差異主要是弱信號，28個弱的切割酶 現(xiàn)在顯示為陰性。只有一個陽性克隆顯示出與在初步篩選中觀察到的不 同特征謙。
實施例2:具有不同切割模式的卜^el大范圍核酸酶變體
來自實施例1的驗證的克隆顯示了非常不同的基序。這些新基序 中的某些與最初的骨架蛋白具有一些相似性，而許多其它的則完全不 同。各種才莫式的實例，包括野生型10d和I-C"，IN75，示于圖8和9a。 整體結(jié)果(僅針對292個具有經(jīng)修飾特異性的變體)總結(jié)于圖7。
歸巢核酸內(nèi)切酶通?？梢栽谒鼈兊陌行蛄兄写嬖谝恍┖啿⑿?，我 們的第一個發(fā)現(xiàn)之一就是初始的I-C"4自身切割酵母中7種不同靶標。 我們得到的突變體中有許多也遵循這樣的規(guī)則，切割序列的數(shù)目范圍從 1至21個，平均為5.0個切割序列(標準偏差=3.6 )。有趣的是，在50 個突變體中(14%)，特異性被改變以致它們只切割一個靶標。37個(11 % )切割兩個靶標，61個(17% )切割3個乾標以及58個(17% )切
割4個耙標。對于5個靶標和以上的，百分率低于10%?？傆?，38個 靶標被突變體所切割(圖10a)。值得注意的是，在土3位為A的靶標上 幾乎沒有觀察到,皮切割，并且在±5、 ±4、 ±3位為tgn和cgn的靶標 從不被切割。
這些結(jié)果不限制本發(fā)明的范圍，因為圖7僅顯示從292個變體(291 個來自從完整文庫中可獲得的1728 (或123)個I-CVd大范圍核酸酶變 體)獲得的結(jié)果。
實施例3:新的大范圍核酸酶可以切割新的靶標，同時保持高活性和窄 特異性。
A) 材料和方法
a) 構(gòu)建靶克隆
如實施例1所述，將所述64個回文靼標克隆入pGEM-T Easy (PROMEGA)。然后，如前所述(Epinatetal.，先前引用)，切除400bp 的PvmII片段，并克隆入哺乳動物載體pcDNA3.1-LACURAZ-AURA。 參照以下克隆75個雜合靶序列設(shè)計寡核苷酸使之含有兩個不同的每 種突變體回文序列的半位點(PROLIGO)。
b) 初始篩選結(jié)果的再次克隆
在酵母中初步篩選所鑒定的陽性克隆的開放讀碼框(ORF)被再 次克隆入(i) CHO gateway表達栽體pCDNA6.2 ，參照供應(yīng)商 (INVITROGEN )的說明書，以及(ii)來自NOVAGEN的pET 24d(+) 載體。得到的克隆通過測序(MILLEGEN)來驗證。
c) 哺乳動物細胞分析
將來自American Type Culture Collection ( ATCC )的CHO-K1 細胞系培養(yǎng)在補充有10%胎牛血清的Ham's F12K培養(yǎng)基中。對于瞬時 "單鏈退火(SSA， Single Strand Annealing )，，分析而言，在轉(zhuǎn)染前一天 將細胞以每孔13.103個細胞接種于12孔板中。在第二天用400ng DNA 使用EFFECTENE轉(zhuǎn)染試劑盒(QIAGEN )進行共轉(zhuǎn)染。使用等摩爾 量的靼LagoZ質(zhì)粒和表達質(zhì)粒。第二天，更換培養(yǎng)基并且將細胞再孵 育72小時。用PBS漂洗CHO-K1單層細胞一次。然后用150pl加入用于P-半乳糖苷酶液體分析的裂解/暴露(revelation)緩沖液(100ml裂 解緩沖液(Tris誦HCl 10mMpH7.5、 NaCl 150mM、 Triton X100 0.1 % 、 BSA0.1mg/ml、蛋白酶抑制劑)和900ml暴露緩沖液(10ml的Mg 100X 緩沖液(MgCl2 100mM、 |3-巰基乙醇35%)、 110ml ONPG ( 8mg/ml) 以及780ml的辨酸鈉0.1 M pH7.5 ))在冰上裂解所述細胞30分鐘。卩-半乳糖苷酶活性通過測定415nm處光密度進行分析。整個過程在自動 Velocity 11 BioCel平臺上進行。p-半乳糖苷酶活性被計算成以蛋白質(zhì)濃 度、孵育時間和轉(zhuǎn)染效率進行標準化的相對單位。
d) 蛋白質(zhì)表達和純化
在大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS細胞中使用pET-24d(+)載體 (NOVAGEN )過表達帶His標簽的蛋白質(zhì)。用IPTG ( 0.3mM )在25°C 進行誘導。在含有蛋白酶抑制劑(Complete EDTA-free片，Roche )和 5% (v/v)甘油的50mM磷酸鈉(pH8 )、 300mM氯化鈉溶液中將細胞 進行超聲處理。細胞裂解物以100000g離心60分鐘。然后使用負載鈷 的5ml Hi國Trap螯合HP柱(Amersham Biosciences )對His標簽蛋白 質(zhì)進行親和純化。在用線性梯度的咪唑(高至0.25M咪唑，然后為0.5M 咪唑、0,3MNaCl和50mM磷酸鈉(pH8 )的平臺期)進行洗脫期間收 集凡個級分。富含蛋白質(zhì)的級分(通過SDS-PAGE測定)施加到第二 個柱。該粗純化樣品調(diào)整至pH6，并施加到用20mM磷酸鈉(pH6.0 ) 平衡的5ml HiTrap Heparin HP柱(Amersham Biosciences )。結(jié)合蛋白 質(zhì)用20mM磷酸鈉以及1M氯化鈉的氯化鈉連續(xù)梯度進行洗脫。純化級 分進行SDS-PAGE并濃縮(10kDa截留分子量centriprep Amkon Ultra 系統(tǒng))，冷凍在液氮中并貯存在-80。C。純化蛋白質(zhì)i PBS或10mM Tris-HCl ( pH 8 )緩沖液中4吏用PD10柱(Sephadex G誦25M， Amersham Biosciences)進4亍脫鹽處理。
e) 體外切割分析
帶有單個大范圍核酸酶DNA靶切割位點的pGEM質(zhì)粒首先用 Xmnl進行線性化處理。于37。C在lOmM Tris-HCl( pH 8 )、50mM NaCl、 10mMMgCl2、 lmM DTT和50pg/ml BSA中進行切割分析。2nM用作 靶標底物濃度。在25pl終體積反應(yīng)中，用于每種蛋白質(zhì)的稀釋范圍在O 和85nM之間。1小時后通過加入5fU的45 %甘油、95mM EDTA ( pH 8 )、 1.5 % ( w/v ) SDS、 1.5mg/ml蛋白酶K和0.048 % ( w/v )溴酚藍(6XBuffer Stop )并在37。C孵育30分鐘從而終止反應(yīng)。消化物在瓊脂糖電 泳凝膠上跑膠，并在渙化乙錠染色后將片段定量，以計算切割的百分比。
B)結(jié)果
選擇8個代表性突變體(屬于6個不同的聚類，參見以下)用于 進一步表征(圖9)。首先，通過使用如先前報道中所述的基于將表達大 范圍核酸酶的載體和靶標載體瞬時共轉(zhuǎn)染的分析將酵母中的數(shù)據(jù)在哺 乳動物細胞中驗證。該8個突變體ORF和64個靼標被克隆入適當?shù)妮d 體中，并使用機器人輔助的基于微量滴定板的方案將每種所選變體與64 個不同^^艮告質(zhì)粒的每一種共轉(zhuǎn)染入CHO細胞。大范圍核酸酶誘導的重 組通過標準定量ONPG分析進行測量，該ONPG分析測定功能性(3-半 乳糖普酶基因的恢復。在5個獨立實驗中發(fā)現(xiàn)特征模式可以定性及定量 重復。如圖9a所示，在酵母和CHO細胞中幾乎總是觀察到強的和中等 的信號(ADK除外)，因此驗證了酵母HTS方法的關(guān)聯(lián)性。然而，在 酵母中觀察到的弱信號在CHO細胞中常常檢測不到，可能因為檢測水 平的不同(參見QRR和靼標gtg、 gct和ttc)。也在大腸桿菌中產(chǎn)生4 種突變體并且通過金屬親和層析進行純化。對它們針對野生型位點及其 同類位點的相對體外切割效率進行測定。在寬范圍突變體濃度下在標準 條件下估計切割程度(圖9b)。類似地，分析了 I-Od野生型(wt)針 對這些靶標的活性。在許多情況下，不能實現(xiàn)對底物100 0/。切割，可能 反映出這些蛋白質(zhì)可能有^f艮少或沒有轉(zhuǎn)換的事實(Perrin et al.， EMBO J" 1993, 12， 2939-2947; Wang et al.， Nucleic Acids Res.， 1997， 25， 3767-3776)。通常，體外分析證實了從酵母和CHO細胞中獲得的數(shù)據(jù)， 但是令人驚奇地，gtt靶標被高效地切割。
從酵母和CHO中獲得的特征模式明顯看出特異性轉(zhuǎn)移 偏好的gtc靶標不被切割或幾乎不被切割，而新的靼標則觀察到信號。 這種特異性轉(zhuǎn)換通過對QAN、 DRK、 RAT和KTG的體外分析得到證 實，如圖9b所示。另外，這四個在酵母和CHO中展示不同水平活性 (圖9a)的突變體顯示出在體外切割17-60%的其偏好靶標(圖9b)， 這與的動力學(13畫25nM達到最大切割的一半)相似。因此，通 過改造，活性大部分被保留。第三，切割靶標的數(shù)目在突變體之間有所 不同:強的切割酶如QRR、 QAN、 ARL和KTG具有在l-Ot，l所觀察 范圍的切割謙(酵母中為5-8個可檢測信號，CHO中為3-6個)。與切割較弱的突變體比較特異性比較困難。例如，DRK中觀察到單個弱信 號，但是這可能代表從更加復雜模式中減弱而得的僅有的可檢測信號。 然而，強切割變體的表現(xiàn)顯示出改造保留了非常窄的特異性。
實施例4:層級聚類定義7個i-￡ rel變體家族。
A) 材料和方法
使用來自R軟件包的hchist進行聚類分析。我們使用從初始、低 密度篩選得到的定量數(shù)據(jù)。變體和耙標均使用Euclidean距離和Ward's 方法(Ward, J.H.， American Stat. Assoc., 1963, 58， 236-244 )的標準層 級聚類分析法進行聚類分析。突變體和靶標的系統(tǒng)樹圖被重新排序以優(yōu) 化聚類的位置，并且在高度為8時切割突變體系統(tǒng)樹狀圖來定義聚類。
B) 結(jié)果
然后，使用層級聚類分析來確定是否可以在變體的眾多且多樣的 切割模式中定義家族。因為初步和二次篩選給出合適的結(jié)果，所以來自 第一輪的酵母低密度篩選的定量數(shù)據(jù)用于分析以允許較大的樣品大小。 變體和乾標均使用Euclidean距離和Ward's方法(Ward, J.H.，先前引 用)的標準層級聚類分析法進行聚類分析，并定義了 7個聚類(圖10b )。 顯示了對其中3個的詳細分析(圖10c )，并且結(jié)果總結(jié)于表I中。
表I:聚類分析
三個優(yōu)選靶標 第4位 優(yōu)選的氨基酸
， 核苦酸
聚類 實例
(圖3a)序列%切割(%}，446870
gU46.2g0.5Q
gtc18.332.0肌5%
77個蛋白質(zhì)9tg13.6t82.4(62/77)
2=78.1C15.1
2 QRRgtt13.4g0QR
gtc".8a4.9100.0%100.0%
8個蛋白質(zhì)tct".4t56.9(8/8)(8/8)
c38.2
3 ARLgat27.9g2.4AR
tat23.238B.963.0%33.8。/。
65個蛋白質(zhì)gag15.7t5.7(41/65)(22/65)
66.8C3.0
4 AGRgac22.7g0.3A&NRR
51.6% &
tac14.5391.935.4%48.4%67.7%
31個蛋白質(zhì)gat13.4t6.6(16&11/3"15/3121/31
￡- 50.6C1.2
5 ADKgat29.21g1.6
DRKtat15.4373.8
81個蛋白質(zhì)gac".4t13.4
Z> 56.05.9C11.2
6 KTGcct30.190K
RAT19.634.062.7%
51個蛋白質(zhì)toc13.96.3(32/51)
S= 63.6C89.7
"7cct20.8g0K
tct19.60.291.9。/。
37個蛋白質(zhì)lcc15.3t14.4(34/37)
S= 55.7C85.4
i依據(jù)切割指數(shù)的頻率，如圖10e所述
2在每個位置，標明在該聚類的多于1/3中存在的殘基
對于每個聚類而言，可以基于信號的頻率和強度而鑒定一組優(yōu)選 的靶標(圖10c)。所述每個聚類的三個優(yōu)選乾標標于表1中，以及它們
的切割頻率。這些頻率的總計為該聚類之特異性的量度。例如，在聚類
1中，三個優(yōu)選靶標(gtt/c/g )，占所觀察切割的78.1%,其中g(shù)tt單獨 占46.2 % ，顯示出非常窄的特異性。實際上，該聚類包括幾種蛋白質(zhì)，如QAN其大多切割gtt (圖9a)。相反地，在聚類2中三個優(yōu)選靼標僅 代表所有觀察信號的36.6%。依據(jù)在該聚類中觀察到的相對較廣且多樣 的模式，QRR切割5種靶標(圖9a )，而其它聚類成員的活性不限于這 5種靶標。
在每個聚類中所發(fā)現(xiàn)殘基的分析顯示出對第44位Q的強烈偏好 在聚類l和2中占絕對優(yōu)勢，但是A和N在聚類3和4中更常出現(xiàn)， 并且在聚類6和7中更偏好K。同時，這些偏好性與±4位DNA的強 堿基優(yōu)先性相關(guān)聯(lián)，在聚類1和2中大多數(shù)為t:a堿基對，在聚類3、 4 和5中為a:t，以及在聚類6和7中為c:g(參見表I)。與其靶標結(jié)合的
的結(jié)構(gòu)顯示出Q44殘基與底部鏈的-4位(以及頂部鏈的+4位， 參見圖lb和lc)相互作用。這些結(jié)果提示該相互作用在我們的突變體 中很大程度上是保守的，并且顯示出"編碼"，其中Q44會建立與腺噤 呤的接觸，A44 (或更少出現(xiàn)的N44)與胸腺嘧啶的接觸，以及K44與 鳥嘌呤的接觸。這樣的相關(guān)性在68位和70位沒有觀察到。
實施例5:變體可以組裝成功能性異源二聚體從而切割新DNA靶序列
A) 材料和方法
所述75個雜合靶序列如下進行克隆設(shè)計寡核苦酸使之含有兩個 每個突變體回文序列的不同的半位點(PROLIGO)。通過PCR擴增單 鏈寡核苷酸獲得的雙鏈把DNA使用Gateway方案(INVITROGEN ) 克隆到酵母和哺乳動物報告栽體中。將酵母報告載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌 林FYBL2-7B (M4rcr、歸3Z^5J、 一ZU3、 /ew2Z^、 )中。
B) 結(jié)果
變體是能夠切割回文位點的同源二聚體。為了檢測可切割耙標列 表是否可以通過產(chǎn)生可以切割雜合切割位點(如圖11所述)的異源二 聚體而得以擴展，選擇具有獨特特征模式的變體的亞組并將其克 隆到兩個不同的以或iL4iV基因為標記的酵母載體中。然后，將 在44、 68和/或70位具有突變以及75位為N的突變體的組合與一組回 文和非回文的嵌合DNA靶標共表達在酵母中。一個例子顯示在圖12中 將K44、 T68、 G70、 N75 (KTG)和Q44、 A68、謂、N75 ( QAN) 突變體共表達，導致兩個嵌合靶標gtt/gcc和gtt/cct的切割，所述嵌合
靶標不凈皮單獨任一突變體所切割?；匚男蛄術(shù)tt、 cct和gcc乾標(以及 KTG和QAN的其它靶標)也被切割，可能由于同源二聚體的形成所導 致，但是不相關(guān)的靶標則不被切割。另外，gtt、 cct或gcc半位點不足 以發(fā)生切割，因為這些靶標是完全抗性的(參見圖12中g(shù)gg/gcc、gat/gcc、 gcc/tac，以及許多其它)。意料之外的切割僅在gtc/cct和gtt/gtc中分別 對于KTG和QAN同源二聚體觀察到，但是信號非常弱。因此，有效 的切割需要兩個突變體單體的協(xié)同結(jié)合。這些結(jié)果表明異源二聚體種類 的良好特異性水平。
總之，14個不同蛋白質(zhì)的總共112種組合在酵母中進行了檢測， 并且37.5%的組合(42/112)顯示出對其預期的嵌合靶標的陽性信號。 在圖13a中顯示了 6個實例的定量數(shù)據(jù)，并且對于相同的6種組合，用 一組相關(guān)靶標在CHO細胞的瞬時共轉(zhuǎn)染實驗中證實了結(jié)果(圖13b)。 作為一般規(guī)則，當兩個表達蛋白之一作為同源二聚體表現(xiàn)出強的信號時 總是獲得功能性異源二聚體。例如，兩種低活性突變體DRN和RRN， 與強的切割酶如KTG或QRR形成功能性異源二聚體(圖13a和13b)， 而將同樣的弱突變體共表達則不能檢測到嵌合靶標的切割。
實施例6:組裝的異源二聚體對天然DNA耙標的切割
A)材料與方法
a) 基因組搜索
被變體潛在切割的天然靶標通過掃描公共數(shù)據(jù)庫而被識 別，對于匹配咖咖1^"111^^加&模式的基因組序列，其中n為a、 t、 c
或g ( SEQ ID NO:78 )。在小鼠17號染色體中鑒定到天然DNA靶序列
caaaactatgta印gggttttg (SEQ ID NO: 75)
i亥 DNA序歹'J蜂皮分另'J +刀割tcaaaac敏tg幽gttttga (SEQ ID NO: 76)和 tcaaaac幽tg紹gggttttga(SEQIDNO: 77)序列的兩種變體的組合潛在切割。
b) 大范圍核酸酶變體的分離
如實施例1所述，4吏用序列tcaaaac敏tgast5gttttga (SEQ IDNO: 76)或序歹'J toaaaacseigtg^gggttttga (SEQ ID NO: 7"作為乾標，通過酵母中切割誘導的重組
分析來選擇變體。
C)靶標質(zhì)粒的構(gòu)建
設(shè)計寡核苷酸使之含有各自突變體回文序列的兩個不同半位點
(PROLIGO)。使用Gateway方案(INVITROGEN),將通過PCR擴 增單鏈寡核苷酸得到的雙鏈靶標DNA克隆到哺乳動物報告栽體 pcDNA3.1-LACURAZ-AURA中，如前所述(Epinat et al"先前引用)， 從而得到靼LagoZ質(zhì)粒。
d) 大范圍核酸酶表達載體的構(gòu)建
如實施例l所述，在酵母中進行篩選時所鑒定克隆的開放閱讀框 (ORF)通過對酵母菌落PCR而擴增，并分別克隆到CHO表達載體 pCDNA6.2 (INVITROGEN )中。在CMV啟動子的控制下表達I-Od 變體。
e) 哺乳動物細胞分析
用等摩爾量的靶LagoZ質(zhì)粒和表達質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染CHO-K1細 胞系，并且如實施例3和5所述測量P-半乳糖苷酶活性。
B)結(jié)果
被I-Od變體潛在切割的天然DNA靶標通過進行基因組搜索與 模式caaaacnnnnnnnnnngttttg(SEQIDNO: S)匹配的序列來鑒定。將隨機選捧的
在小鼠17號染色體中鑒定的DNA序列(SEQIDNO:78)克隆到報告 質(zhì)粒中。該DNA乾標被變體A44,R68，S70,N75 ( ARS )和 K44,R68,E70,N75 ( KRE )的組合潛在地切割。
這兩種變體在CHO細胞中的共表達導致如圖14所顯示的功能性 異源二聚體蛋白質(zhì)的形成。實際上，當變體單獨表達時，雖然 KRE蛋白顯示了殘余活性，但是對小鼠DNA靶標的切割活性幾乎不能 檢測到。相反地，當這兩種變體與帶有潛在靶標的質(zhì)粒一起共表達時， 可以測量到強的P-半乳糖苷酶活性。所有這些數(shù)據(jù)表明異源二聚化發(fā)生 在CHO細胞中，并且異源二聚體是有功能的。
這些數(shù)據(jù)表明通過組裝同源二聚體變體而形成的異源二聚體蛋白 質(zhì)將天然存在的DNA靶序列的列表擴展至所有潛在的雜合可切割靶 標，這些靶標從所有可能的變體組合得到。
而且，這些數(shù)據(jù)表明，了解其同源二聚體各自的DNA靶標，則可以 預測可被變體組合切割的DNA序列。另外，靶標的1和2 (以及-1和-2 ) 位核苷酸可以不同于gtac,表明它們在DNA/蛋白質(zhì)相互作用中起較小作 用。
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權(quán)利要求
1.制備具有經(jīng)修飾的切割特異性的I-CreI大范圍核酸酶變體的方法，所述方法包括(a)參照I-CreI pdb登記碼1g9y，將氨基酸Q44、R68和/或R70替換為選自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T和Y的氨基酸；(b)選擇步驟(a)中獲得的針對雙鏈DNA靶標中-5至-3位而言具有至少一個下列R3三聯(lián)體切割模式的I-CreI大范圍核酸酶變體，所述-5至-3位對應(yīng)于下式I的R35’-R1CAAAR2R3R4R’4R’3R’2TTTGR’1-3’，其中R1不存在或存在；并且當存在時代表包含1至9個核苷酸的核酸片段，所述核酸片段對應(yīng)于隨機核酸序列或?qū)?yīng)于位于從-20至-12位(從5’向3’)的I-CreI大范圍核酸酶歸巢位點的片段，R1至少對應(yīng)于所述歸巢位點的-12位，R2代表核酸雙聯(lián)體ac或ct并且對應(yīng)于所述歸巢位點的-7至-6位，R3代表對應(yīng)于所述-5至-3位的核酸三聯(lián)體，選自g、t、c和a，并排除以下的三聯(lián)體gtc、gcc、gtg、gtt和gct，R4代表核酸雙聯(lián)體gt或tc并且對應(yīng)于所述歸巢位點的-2至-1位，R’1不存在或存在；并且當存在時代表包含1至9個核苷酸的核酸片段，所述核酸片段對應(yīng)于隨機核酸序列或?qū)?yīng)于位于從+12至+20位(從5’向3’)的I-CreI大范圍核酸酶歸巢位點的片段，R’1至少對應(yīng)于所述歸巢位點的+12位，R’2代表核酸雙聯(lián)體ag或gt并且對應(yīng)于所述歸巢位點的+6至+7位，R’3代表對應(yīng)于所述+3至+5位的核酸三聯(lián)體，選自g、t、c和a；當R3和R’3是非回文序列時，R’3不同于gac、ggc、cac、aac以及agc，R’4代表核酸雙聯(lián)體ga或ac并對應(yīng)于所述歸巢位點的+1至+2位。
2. 依據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述核酸三聯(lián)體113優(yōu)選地選自下列三聯(lián)體ggg， gga, ggt， ggc, gag, gaa， gat， gac， gta， gcg, gca， tgg, tg^ tgt, tgc, tag, taa， tat, tac, ttg， tta, ttt, ttc， tcg， tca， tct, tcc, agg, aga, agt, agc, aag, aaa, aat, aac, atg, ata， att, atc, acg， aca, act, acc， cgg, cga, cgt， cgc, cag， caa, cat, cac， ctg, cta， ctt, etc， ccg, cca， cct和ccc，更優(yōu)選地選自以下三聯(lián)體ggg, ggt, ggc， gag， gat, gac, gta, gcg, gca, tag,taa， tat， tac, ttg， ttt， ttc' tcg， tct, tcc, agg, aag， aat， aac， att， ate, act acc, cag， ca^ cac， ctt，ctc,ccg,cct和a"
3.依據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于步驟(b)獲得的I-OrfA44/A68/A/70, A44/A68/G70， A44/A68/H70, A44/A68/K70,大范圍核酸酶變體選自A44/A68/N70,A44/D68/H70,A44/G68/N70,A44服8/H70,A44/H68/S70，A44/K68/K70,A44/K68/T70，A44/N68/K70，A44/N68/T70，A44/Q6謝70，A44/R68/E70，A44/R68/N70，A4條8/G70，A44/S68/S70,A44脂/K70，A44/T68/T70,A44/A68/Q70,A44/D68/K70，A44/G68/P70,A44/H68/K70，A44/H68H70,A44/K6,70,A4頓68/A70，A4頓6,0，A44/Q68/A70,A44/Q軀70，A44/R68/G70,A44/R68/R70，A44雄/K70，A44/S68/T70，A44/T68/N70,D44/D68/H70，A44/A68/R70, A44/D68/R70, A44/G68/R70， A44服廳70， A44/K68/A70, A44/K68/Q70, A4頓68/E70， A4頓闊70, A44/Q飾70, A44/Q68/S70, A44/R68/H70， A44/R68/S70， A44/S6認70, A44/T68/A70, A44/T68/Q70， D4頓68/S70，A44/A68/S70，A44/G68/H70，A44/H68/A70，A44/H68/Q70，A44/K68/G70，A44/K6塑0，A44/N68/G70,A4頓68/R70，A44/Q68/G70，A44麵/A70,A44/R68/K70，A44/R68/T70,A44/S68/Q70，A44/T68/G70,A44/T68/R70,D44/R68/A70,A44/A68/T70' A4德8/K70， A44/H68/G70, A44服8/R70, A44/K6謹0， A44/K68/S70， A4頓68/H70， A44/N68/S70， A44/Q68/H70, A44脇/D70, A44/R68/L70， A44歸/A70， A44/S68/R70, A44脂/H70, A44/T68/S70， D44/R68/K70,權(quán)利要求書D機6謝70,D44歸/Q70,D44/R6窗0，D44/R68/S70,D44/R68/T70,E44/H68/H70,E44鐘/A70,E4德薩0，E4秦8/N70,E4德8/S70，E4德8/T70，E44/S68/T70,G44鵬/K70,G44/Q68/H70,G44/R68/Q70，G44/R68/RJ0，G44/T68/D70，G44/T68/P70,G44簡簡，H44/A68/S70,H44鐘/T70,H44/R68/A70,H44/R68/D70，H44/R68/E70,H44/R68/G70，H44/R6,0,H44鏡/R70，H44/R68/S70,H44/R68/T70,H44/S68/G70，H44膽/S70,H44/S68/T70，H44/T68/S70,H44/T68/T70，K44/A68/A70,K44/A68/D70，K44/A68/E70,K44/A68/G70,K44/A68/H70,K44/A6,70，K44/A68/Q70，K44/A6固0，K44/A68/T70,K44/D68/A70,K44/D68/T70，K德68/G70,K44/E68/N70,K44/E68/S70，K44/G68/A70,K44/G68/G70，K44/G68/N70,K44/G68/S70,K44/G68A70,K44服8/D70，K44/H68簡，K44/H68/G70,K44/H68/N70，K44/H68/S70,K44/H68/T70,K44/K68/A70,K44/K6畫0,K44/K68/H70,K44/K68/T70,K44/N68/A70,K4頓68/D70,K44/N68/E70,K4頓68/G70,K44腿8/H70,K44/N68/N70，K44/N68/Q70，K44/N68/S70,K44/N68/T70，K44/P68/H70,K44/Q68/A70，K44/Q6薩0，K44/Q68/E70，K44/Q68/S70,K44/Q68/T70,K44/R68/A70，K44/R68/D70，K44/R68/E70,K44/R68/G70,K44/R68/H70，K44/R68/N70，K44/R68/Q70,K44/R68/S70,K44/R68/T70,K44/S68/A70，K44/S68/D70,K44/S68/H70,K44/S68/N70,K德68/S70,K44/S68/T70,K44/T68/A70，K44/T68/D70,K44/T68/E70,K44/T68/G70，K44/T68/H70,K44/T6謂0，K44/T68/Q70，K44/T68/S70，K44脂/T70,N44/A68/H70,N44/A68/R70,N44/H68/N70，N44/H68/R70,N44/K68/G70，N44/K6簡0，N44/K68/R70,N44/K6S/S70,N44/N68/R70,N44/P68/D70,N44/Q68/H70，N44/Q68/R70,N44/R68/A70,鹿/R68/D70，N4娜諸0，N44/R68/G70,N4德窗0，N44/R68/K70，N44鍵/N70，N44/R6諮0，N44/R68/S70,N44雄/T70，N4楊8/G70，N44/S68/H70,N44/S68/K70，N4楊8/R70，腦/T68/H70,N44/T68/K70，N44簡/Q70，N44/T68/R70,N44/T68/S70,P44/N68/D70,P44/T68/T70，Q44/A68/A70，Q44/A68/H70，Q44/A68/R70,Q44/G68/K70，Q44/G6脂0，Q痕68/G70，Q44/N68/A70，Q權(quán)68/H70,Q44惡8/S70,Q44/P6諮0，Q44/Q68/G70，Q44/R68/A70,Q44鵬/D70,Q44/R68/E70,Q44/R68/G70，Q44/R68/H70,Q44/R68/N70,Q44/R68/Q70,Q44/R68/S70,Q44/S68/H70，Q44/S68/R70,Q4機8脂，Q44/麗A70，Q44腦/G70,Q44脂/H70，Q44/T68/R70,諸/A68/G70,R44/A68/T70,R44/G68/T70,腿廳/D70'R44/H68/T70,R44/N6S/T70,R4救68/A70,R44/R68/D70,R44腿婦，R機68/G70，R44/R68/N70,R4傷即0，R44雌/S70，諸/R68/T70,R44/S68/G70，R4德,70，R4德8/S70,R44/S68/T70,S44/D68/K70,S4傷8/R70，S44雌/G70，S44雄/N70，S44/R6諮0，S機68/S70,T44/A68/K70,T44/A68/R70,T44/H68/R70,T44/K68/R70，T4傷8/P70,T44/N68/R70，T44/Q68/K70，T44/Q68/R70，T44/R68/A70,T44/R68/D70，T44/R68/E70，T4德8/G70，T44/R68/H70，T44/R68/K70,T44/R6,0,T44/R68/Q70,T44/R68/R70,T44/R68/S70,T44/R68/T70,T44/S68/K70，T44/S68/R70, T44/T68/K70:和T44/T68/R70.。
4. 依據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的方法,其特征在于選擇所迷I-Cn4 大范圍核酸酶變體的步驟(b)在酵母細胞體內(nèi)進行。
5. 通過依據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的方法可獲得的大范圍核酸 酶變體在體外或體內(nèi)為非治療性目的用于切割包含至少^-:Mbp部分回文 序列的雙鏈核酸靶標的用途，其中至少在+/-8至11位的所述序列為回^ 列，并且在-5至-3位的核苷酸三聯(lián)體和/或+3至+5位的核苷酸三聯(lián)體分別 不同于gtc、 gcc、 gtg、 gtt和gct、以及gac、 ggc、 cac、 aac和agc。
6. 依據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征在于所述I-OeI大范圍核酸酶變 體選自A44/A68/A70，A44/A68/G70，A44/A68/H70，A44/A68/K70，A44/A6認70,A44/A68/Q70，A44/A68/R70,A44/A68/S70，A44/A68/T70，A44/D68/H70,A44/D68/K70，A44/D68/R70，A44/G68/H70，A44/G68/K70，A44/G68/N70，A44/G68/P70,A44/G68/R70，A44服8/A70,A44服8/G70,A44服8/H70,A44服8/K70,A44/H68/N70,A4德8/Q70,A44/H68/R70,A44/H68/S70,A44/H證70,A44/KL68/A70，A44認/G70,A44/K68/H70，A44/K68/K70,A44/K6薩0,A44/K68/Q70，A44/K68/R70，A44/K68/S70，A44/K68/T70,A4頓68/A70,A4頓68/E70,A44務(wù)8/G70,A44/N6歸0，A44/N68/K70,A4頓68/N70,A44/N68/Q70,A4頓68/R70,A4頓68/S70,A44飾8/T70，A44/Q68/A70,A44/Q68yD70，A44/Q68/G70，A44/Q,70,A4，謝70,A44/Q證70,A44/Q68/S70,A44/R68/A70，A44扁歸，A44/R68/E70,A44/R維70,A44/R68/H70,A4德8/K70,A44編/L70,A44/R麵70,A44鵬簡,A44/R68/S70,A4德8/T70,A44/S68/A70,A44/S68/G70，A44/S68/K70，A44/S6,70，A4德8/Q70，A44/S68/R70,A44/S68/S70,A標68/T70,A44/T68/A70，A44/T68/G70,A44脂/H70，A44/T68/K70，A44脂歸,A44/T68/Q70，A44/T68/R70，A44腳/S70,A44/T6S/T70,D44/D68/H70，D44/N68/S70,D44/R68/A70,D44/R68/K70,D44/R6薩0，D44鍾/Q70,D44/R6訪0，D44/R68/S70,D44/R68/T70,E44服薩0,E44/R6衡0'E44/R68/H70,E44/R68/N70,E44/R68/S70，E44/R68/T70，E44/S68A70,G44/H68/K70,G44/Q68/H70,G44/R68/Q70,G44/R6脂0，G術(shù)68/D70,G44/T6諮0，G44/T68/R70，H44/A68/S70,H德68/T70，H4德8/A70，H44/R68/D70,H4像68/E70，H44/R68/G70,H44/R68/N70,H44/R6面0，H44/R68/S70，H44/R68/T70,H4德8/G70,H44/S68/S70,H44/S68/T70,H44/T68/S70,H44/T68/T70，K44/A68/A70,K44/A68/D70,K44/A68/E70，K44/A68/G70,K44/A6S/H70,K44/A6謝70,K44/A68/Q70，K44/A68/S70，K44/A68/T70,K44/D68/A70，K44/D68nT70，K44/E68/G70，K44/E68/N70,K44/E68/S70,K44賜8/線K44/G68/G70,K44/G68/N70,K44/G68/S70，K44/G68/T70，K44/H68/D70,K44/H68/E70，K44/H68/G70,K44/H6簡0，K44/H68/S70,K4頓68/T70，K44/K68/A70,K44/K68/D70,K44/K68/H70,K44/K68/T70,K44/N68/A70，K44飾8/D70,K44/N68/E70,K44/N68/G70,K44藤8/H70,K4頓68/N70,K44雄8/Q70,K44/N68/S70，K44飾8/T70，K44/P68/H70,K44/Q68/A70,K44/Q68/D70,K44/Q68/E70，K44/Q68/S70，K44/Q68/T70,K44/R68/A70，K44細/D70,K44/K68/E70，K44/R68/G70,K44/R68/H70,K44鍵/N70,K44/R68/Q70,K44/R68/S70，K44腦/T70,K44/S68/A70,K144/S68/D70，K4德8/N70，K44腿/S70,K44/S68/T70，K44/T68/A70,K44/T68歸，K術(shù)68/E70，K44/T68/G70，K44/T6,0,IC44簡/N70,K44/T68/Q70，K44/T68/S70,K44脂/T70，N44/A68/H70,N44/A68/R70，N44/H68緒0，N44/H68/R70,N44/K68/G70,N44/K68/H70,N44/K6萌0，N44/K68/S70，N44/N68/R70，N44脂/D70，N44/Q68/H70，N44/Q68/R70,N44/R68/A70,N44/R68/D70,N44艦/E70，N44/R68/G70,簡/R6菌0，N44/R68/K70，N44/R6S/N70，菌/R6面0，N44/R68/S70,N44/R68/T70，N44/S68/G70,N4德8/H70,N44/S68/K70,<formula>complex formula see original document page 7</formula>
7. 依據(jù)權(quán)利要求5或6的用途，其特征在于所述l-Oel大范圍核酸酶變體為同源二聚體。
8. 依據(jù)權(quán)利要求5和6任一項的用途，其特征在于所述l-CVa大范圍核酸酶變體為異源二聚體。
9. 依據(jù)權(quán)利要求5至8任一項的用途，其特征在于所述DNA靶標 的+/-3至5位的序列為回文序列。
10. 依據(jù)權(quán)利要求5至8任一項的用途，其特征在于所述DNA靶標 的+/-3至5位的序列為非回文序列。
11. 依據(jù)權(quán)利要求5至10任一項的用途，其特征在于-11至-8位和 +8至+11位的所述回文序列分別為caaa和tttg。
12. 依據(jù)權(quán)利要求5至11任一項的用途，其特征在于所述I-Od大 范圍核酸酶變體進一步包含75位的突變。
13. 依據(jù)權(quán)利要求12的用途，其特征在于所述突變?yōu)镈75N或D75V。
14. 依據(jù)權(quán)利要求5至13任一項的用途，其特征在于所述l-Orl大 范圍核酸酶變體在44位具有丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)，用于切割 在-4位包含核苷酸a和/或在+4位包含t的DNA靶標。
15. 依據(jù)權(quán)利要求5至13任一項的用途，其中所述大范圍核酸酶變 體在44位具有賴氨酸(K)，用于切割在-4位包含核苷酸c和/或在+4位包含g的耙標。
16. 依據(jù)權(quán)利要求6至13任一項的用途，其中所述大范圍核酸酶變 體在44位具有谷氨酰胺(Q )，用于切割在-4位包含核苷酸t(yī)和/或在+4 位包含a的靼標。
17. 通過依據(jù)權(quán)利要求1至4的制備方法可獲得的大范圍核 酸酶變體；其選自A44/A68/A70,A44/A68/G70,A44/A68/H70,A44/A68/K70,A44/A6謝70，A44/A68/Q70，A44/A68/S70,A44/A68/T70，A44/D68/H70,A44雄/K70，A44/D68/R70,A44/G68/H70,A44/G68/K70,A44/G68/N70,A44/G68/P70，A44/H68/A70,A44/H68/G70，A44/H68/H70,A44/H68/K70，A44服,0，A44/H68/Q70，A44服8/S70，A44/H68/T70,A44/K68/A70，A44/K68/G70，A44/K68/H70,A44/K68脂0，A44/K68/Q70,A44/K68/R70，A44/K68/S70，A44/K68/T70,A44/N68/A70,A44/N68/E70,A44扁8/G70,A4頓68/H70,A44/N68/K70，A4頓6,70，A44/N68/Q70，A44馬8/R70,A4頓68/S70，A44/N68/T70，A44/Q68/A70,A44/Q68/D70,A44/Q68/G70，A44/Q68/H70，A44/Q6謝70，A44/Q68/S70，A44/R68/E70,A44/R68/K70,A44麵/L70，A44/S68/A70，A44/S68/G70，A44/S68/N70,A44/S6&/Q70,A44/S68/R7D,A標68/S70,A44/S68/T70,A44/T68/A70,A44/T68/G70,A44/T68/H70,A44/T68緒0，A傳68/Q70，A4麵8/S70,A44/T68/T70,D44/D68/H70，D44/N68/S70，D44/R68/A70，D4德睛0，歸雌/Q70,D44/R68/R70,D44歸/S70，D44/R68/T70,E44/H68/H70,E44/R68/A70，E44/R68/H70，E44誠緒0，E44雌/S70，E4德8/T70，E44/S68/T70，G44服8/K70，G44/Q68/H70,G4德8/Q70，G44/T68/D70,G44/T68/P70,G44/T6,0,H44/A68/S70，H44/A68/T70'H4德8/D70,H44/R68/E70,H44/R68/G70，H44/R6謝70，H44/R68/R70,H44腦/S70,H44/S68/G70,H4德8/S70,H祖68/T7D，H44簡/S70,H44簡/T70，K44/A68/A70,K44/A6薩0，K44/A68/E70,K44/A68/G70,K44/A68/H70,K44/A68/N70，K44/A68/Q70，K44/D68/A70,K44/D68/T70,K4概8/G70，K44細/S70,K44/G68/A70,K44/G68/G70,K44/G68/N70，K44/G68/S70,K44/G68/T70,K44服8/D70，K44/H68/E70,K44/H68/G70,K44/H68/N70,K44/H68/S70,K44/H68/T70，K44/K68/A70,K44/K68/D70,K44/K68/H70，K44/K68/T70，K4頓68/A70，K4頓68/D70,K4頓68/E70，K44/N68/G70,K44艦薩0，K4頓68/N70，K4頓68/Q70,K44/N68/S70，K44/N68/T70,K44歸/H70,K44/Q68/A70，K44/Q6薩0,K44/Q68/E70，K44/Q68/S70，K44/Q68/T70,K44雄/A70，K44/R68/D70,K44/R68/E70,K44觸/G70,K44/R68/H70,K44/R68/N70，K44/R68/S70,K4楊8/A70，K44纖/D70,K44/S68/H70,K44/S6謝70,K44纖/S70,K44/S68/T70,K44簡/A70，K44/T68/D70,K44/T6脂0，K44/T68/G70，K44/T68/H70，K44/T68/N70，K44/T68/Q70，K44/酉S70,K44/T68/T70,N44/A68/H70,N44/H6謝70,固服膨O,N44/K168/G70，N44/K68/H70,麗/K68/R70,N44/K68/S70，N44/P68/D70，N44/Q68/H70，N44/R68/A70,麗/R68/D70,N44/R68/E70，N44/R68/K70,N44/S68/G70，N44/S68/H70,N術(shù)68/K70,N44/S68/R70,N44簡/H70，N44/T68/K70，N44簡/Q70，N44/T纖70，P44親8/D70，P44/T68/T70,Q44/G68/K70,Q44/G68/R70,Q44/K68/G70，Q44/N68/A70，Q44/N68/H70,Q44/N68/S70,Q44/P68/P70,Q44/Q68/G70,Q44/R6蒙0，Q44/R68/E70,Q44/R68/G70,Q44/R68/Q70,Q4條8/S70,Q44/T68/A70,Q44/T68/G70，Q44/T68/H70，R44/A68/G70,R44/A68/T70，R44/G68/T70，R44/H68/D70，R44/H6脂0,諸/N68/T70,R44/R68/A70，R44/R6&/D70,R44麵/E70,R44/R68/G70,R44/R68/Q70,R44/R68/S70，R44/R68/T70,R德68/G70，R44/S68/N70，R標68/S70，R44/S68/T70,S44/D68/K70，S44/R68/R70,S44腕/S70，T44/A68/K70， T44/N68/P70, T44/N68/R70, T44/R68/E70, T44/R68/Q70,和 T44/S68/K70,。
18. 依據(jù)權(quán)利要求17的I-Oel大范圍核酸酶變體，其在44位具有 丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)并切割在-4位包含核苷酸3和/或在+4位 包含t的靶標。
19. 依據(jù)權(quán)利要求17的I-Oel大范圍核酸酶變體，其在44位具有 賴氨酸(K)并切割在-4位包含核苷酸c和/或在+4位包含g的靶標。
20，依據(jù)權(quán)利要求17的I-Od大范圍核酸酶變體，其在44位具有 谷氨酰胺(Q),用于切割在-4位包含核苷酸t(yī)和/或在+4位包含a的靶 標。
21. 依據(jù)權(quán)利要求17至20任一項的I-CVeI大范圍核酸酶變體，其 為同源二聚體。
22. 依據(jù)權(quán)利要求17至20任一項的I-Od大范圍核酸酶變體，其 為由兩個單體組成的異源二聚體，其中每個單體來自如權(quán)利要求17至 20任一項的不同變體。
23. —種多核苷酸，其特征在于它編碼依據(jù)權(quán)利要求17至22任一 項的大范圍核酸酶變體。
24. —種表達盒，其包含依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸和調(diào)節(jié)序列。
25. —種表達栽體，其特征在于它包含依據(jù)權(quán)利要求24的表達盒。
26. 依據(jù)權(quán)利要求25的表達栽體，其特征在于它進一步包含靶向 DNA構(gòu)建體。
27. 依據(jù)權(quán)利要求26的表達載體，其特征在于所述靶向DNA構(gòu)建 體包含與依據(jù)權(quán)利要求17至22任一項的大范圍核酸酶變體的切 割位點鄰近區(qū)域具有同源性的序列。
28. 依據(jù)權(quán)利要求27的表達栽體，其特征在于所述靶向DNA構(gòu)建 體包含a) 與依據(jù)權(quán)利要求17至22的變體的切割位點鄰近區(qū)域具有同源性 的序列，以及b) 側(cè)翼為如a)中序列的待引入序列。
29. —種細胞，其特征在于它被依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或者被 依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項的載體所修飾。
30. —種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于它包含依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷 酸或者依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項的載體。
31. —種非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其特征在于它包含依據(jù)權(quán)利要求 23的多核苷酸或依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項的載體。
32. 依據(jù)權(quán)利要求17至22任一項的I-Od大范圍核酸酶變體、依 據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸、依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項的載體、依 據(jù)權(quán)利要求29的細胞、依據(jù)權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)基因植物、依據(jù)權(quán)利要求 31的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物用于分子生物學、用于體內(nèi)或體外遺傳工 程、以及用于體內(nèi)或體外基因組工程的用途。
33. 依據(jù)權(quán)利要求32的用途，用于在包含DNA靶標序列的目的位 點誘導雙鏈核酸斷裂，從而誘導DNA重組事件、DNA喪失或細胞死亡。
34. 依據(jù)權(quán)利要求32或33的用途，其特征在于所述雙鏈核酸斷裂 用于修復特定序列，修飾特定序列，恢復功能性基因代替突變基因，減弱或激活內(nèi)源目的基因，向目的位點中引入突變，引入外源基因或其一部分，失活或缺失內(nèi)源基因或其一部分，將染色體臂易位，或使DNA 不被修復和降解。
35. 依據(jù)權(quán)利要求32至34任一項的用途，其特征在于所述I-Orl 大范圍核酸酶變體、多核苷酸、載體、細胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人類轉(zhuǎn)基 因哺乳動物與權(quán)利要求26中定義的靶向DNA構(gòu)建體相結(jié)合。
36. —種遺傳工程方法，其特征在于它包括以下步驟在位于載體 上的目的位點斷裂雙鏈核酸，所述栽體包含依據(jù)權(quán)利要求17至22的 l-O't'l大范圍核酸酶變體的DNA靼標，這是通過所述載體與如上定義 的大范圍核酸酶變體相接觸，從而誘導與表現(xiàn)出與所述I-Od 大范圍核酸酶變體切割位點鄰近序列具有同源性的另 一種載體的同源 重組。
37. —種基因組工程方法，其特征在于它包括以下步驟l)通過將 所述切割位點與所述I-Od大范圍核酸酶變體相接觸，從而雙鏈斷裂基 因組基因座位，所述基因座位包含依據(jù)權(quán)利要求17至22的大范 圍核酸酶變體的至少一個識別和切割位點；2 )在適于與乾向DNA構(gòu)建 體同源重組的條件下維持所述已斷裂基因組基因座位，該耙向DNA構(gòu) 建體包含待引入所述基因座位的序列，側(cè)翼為與靶基因座位具有同源性 的序列。
38. —種基因組工程方法，其特征在于它包括以下步驟l)通過將 所述切割位點與所述I-OeI大范圍核酸酶變體相接觸，從而雙鏈斷裂基 因組基因座位，所述基因座位包含依據(jù)權(quán)利要求17至22的I-CVd大范 圍核酸酶變體的至少一個識別和切割位點；2 )在適于與染色體DNA進 行同源重組的條件下維持所述已斷裂基因組基因座位，該染色體DNA 與切割位點的鄰近區(qū)域具有同源性。
39. —種組合物，其特征在于它包含依據(jù)權(quán)利要求17至22的至少 一種大范圍核酸酶變體、依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或依據(jù)權(quán) 利要求25至28任一項的載體。
40. 依據(jù)權(quán)利要求39的組合物，其特征在于所述組合物進一步包含 靶向DNA構(gòu)建體，該靼向DNA構(gòu)建體包含修復目的位點的序列，其側(cè) 翼為與所靶向基因座位具有同源性的序列。
41. 依據(jù)權(quán)利要求17至22的至少一種l-Ox4大范圍核酸酶變體、 依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或者依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項的載體 用于制備藥物的用途，所述藥物用于預防、改善或治愈有此需要的個體中的遺傳性疾病，所述藥物通過任何方式施與所述個體。
42. 依據(jù)權(quán)利要求17至22的至少一種I-CVeI大范圍核酸酶變體、 依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或者依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項的栽體 用于制備藥物的用途，所述藥物用于預防、改善或治愈有此需要的個體 中的由提呈DNA中間體的傳染因子引起的疾病，所述藥物通過任何方 式施與所述個體。
43. 依據(jù)權(quán)利要求17至22的至少一種l-Ox'l大范圍核酸酶變體、 依據(jù)權(quán)利要求23的多核苷酸或者依據(jù)權(quán)利要求25至28任一項的載體 的用途，其在體外用于在生物來源產(chǎn)品或意圖生物應(yīng)用的產(chǎn)品中抑制其 擴增、滅活或消除提呈DNA中間體的傳染因子，或者用于消毒目標對 象。
44. 依據(jù)權(quán)利要求41至43任一項的用途，其特征在于所述傳染因 子為病毒。
全文摘要
制備具有經(jīng)修飾的切割特異性的1-CreI大范圍核酸酶變體的方法，通過所述方法可獲得的變體及其或者用于切割新DNA靶標或者用于非治療目的的遺傳工程和基因組工程的應(yīng)用。編碼所述變體的核酸、包含所述核酸的表達盒、包含所述表達盒的載體、被所述載體轉(zhuǎn)化的細胞或生物，植物或非人動物。
文檔編號C12N9/22GK101198694SQ200680012709
公開日2008年6月11日 申請日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月15日
發(fā)明者弗雷德里克·帕克, 菲利普·迪沙托 申請人:賽萊克蒂斯公司