專利名稱：魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及魚腥藍細菌基因工程技術領域，具體涉及魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因，本發(fā)明還涉及該基因的克隆方法及其在抗百草枯除草劑轉基因植物中的應用。
背景技術：
雜草控制是農業(yè)生產(chǎn)管理中的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的雜草控制主要通過不斷耕耘及人 エ除草進行。上個世紀四十年代，隨著對雜草的化學控制技術的深入發(fā)展，一系列用于雜草控制的化學除草劑開始大量出現(xiàn)。目前應用最廣泛的除草劑包括苯氧羧酸類的ニ四滴及其衍生物；苯甲酸類如百草敵等；有機磷類如草甘膦及其衍生物；聯(lián)吡啶類如百草枯等?？钩輨┺D基因作物通過增加作物對特定除草劑的耐受能力，能夠一次性高效殺滅雜草，進行無耕種植，減少水土流失；尤其在草坪エ業(yè)、育種育苗領域有著傳統(tǒng)除草劑難以比擬的優(yōu)勢。同時抗除草劑作物也能極大減輕除草劑本身對于作物的影響，增加農業(yè)產(chǎn)量。世界上第一個抗除草劑轉基因作物是1996年美國出現(xiàn)的抗草甘膦轉基因大豆，此后抗除草劑轉基因油菜、棉花、玉米、甜菜、苜蓿等陸續(xù)推出商用種植。抗除草劑轉基因作物的物質基礎是抗除草劑的基因資源的分離和運用。以抗草甘膦為例，目前已經(jīng)運用的主要有超表達EPSPs (5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)或超表達草甘膦氧化酶和草甘膦N-乙酰轉移酶來解除草甘膦對作物的毒性等。目前商品化最為廣泛的是美國孟山都公司所擁有的Roundup Ready作物。目前全球已經(jīng)有超過50個抗除草劑轉基因作物進行了商業(yè)種植，主要的除草劑與抗性基因搭配為草甘膦一CP^psps，草丁膦-pat或者bar，辛酰鹵苯腈-—bxn，磺酰脲類-surB?！鞍俨菘荨庇置翱藷o蹤”，是世界上用量第二大的除草剤，僅次于草甘膦。它具有非選擇性和觸殺特性，因此被廣泛用于農業(yè)和園藝除草以及棉花、大豆等的催枯。百草枯的作用機理是通過干擾光合植物的光合反應中心I(PSI)附件的電子傳遞，并介導生成活性氧(Reactive oxygen species)組分，對細胞產(chǎn)生致死效應。目前認為細胞主要通過增加對百草枯的外排能力或者降低其吸收能力來降低細胞內的百草枯濃度，從而提升對環(huán)境百草枯的抗性。目前尚無抗百草枯轉基因作物的報道。涉及百草枯抗性的相關基因主要是ー 些編碼ABC型轉運子的基因如大腸桿菌的emrB、emrE等(Prosecka, Orlov et al. 2009)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種來自魚腥藍細菌的2-酮基-肌醇脫氫酶基因，以及該基因的克隆方法及其在抗百草枯除草劑轉基因植物中的應用。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因，該基因是由1116個核苷酸組成，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。上述魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因所編碼的多肽，由371個氨基酸組成， 其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。多肽的分子量大小約為41. 22千道爾頓(kDa)。
上述魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因的克隆方法包括以下步驟(1)分離魚腥藍細菌總DNA ；(2)根據(jù)魚腥藍細菌的基因組序列，設計上下游引物上游引物為 GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG ；下游引物為 GCCCTCGAGGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分別引入NdeI和B10I核酸內切酶酶切位點；(3)以魚腥藍細菌總DNA為模板，利用上下游引物進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；(4)回收 PCR 產(chǎn)物；(5)將PCR產(chǎn)物利用NdeI和)(hoi核酸內切酶連入克隆載體pBSpetE中，構建重組質粒；(6)用重組質粒轉化大腸桿菌，進行培養(yǎng)、活化。該基因在光合模式生物藍細菌中進行超量表達，能夠顯著提高轉基因菌株對除草劑百草枯的抗性，掲示了該基因在構建抗除草劑轉基因植物中的廣闊應用前景。利用本發(fā)明所構建的轉基因光合細菌對除草劑百草枯的抗性得到顯著提高，這為開展抗除草劑轉基因作物提供了新的候選基因資源。


圖1 是本發(fā)明實施例中構建克隆載體pBSpetE1580和超表達載體 pRL25TpetE1580 的示意圖；圖2 是本發(fā)明實施例分離轉基因藍細菌中的重組質粒的酶切后的凝膠電泳圖；Μ:是分子量標準；1 重組質粒經(jīng)過NotI和B10I雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖3 是本發(fā)明實施例中轉基因藍細菌對百草枯抗性測試的直觀圖；圖4 是本發(fā)明實施例中轉基因藍細菌對百草枯抗性的統(tǒng)計圖。
具體實施方案以下是結合附圖和實施例對本發(fā)明作的進ー步闡述。需要說明的是，本發(fā)明的實施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。有關DNA的標準操作方法和所使用的藥品均參考《分子克隆實驗指南》所描述的內容(參見J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，北京)。實施例1魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因的克隆以魚腥藍細菌的總DNA為模板，擴增得到2-酮基-肌醇脫氫酶編碼基因(申請人將其命名為1580，下同)。將1580基因連接入克隆載體pBSpetE中，然后進行測序和序列分析，具體步驟為(1)魚腥藍細菌總DNA的分離離心收集約20mL的藍細菌菌體，加入400 μ L TE 緩沖液(pH7.5)，150yL 的玻璃珠(Sigma G-9143)，20 μ LlO % 的 SDS，以及 450 μ L 苯酚 /氯仿(1 1)混合物，全速振蕩三次，毎次lmin，毎次間隔放置在冰上冷卻，然后全速 (13，OOOrpm)離心混合物1分鐘，取上清，用等體積的苯酚/氯仿(1 1)反復抽提，直至苯酚/氯仿交界處看不到變性的蛋白質，取上清，加入1/10體積的3M NaAc,混合，再加入2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，混合，全速(13，OOOrpm)離心5min，加入70%乙醇洗滌一次，沉淀干燥，最后溶于50 μ L水中，利用紫外分光光度計進行DNA濃度測量，在-20°C保存?zhèn)溆茫? 根據(jù)魚腥藍細菌的基因組序列，設計上下游引物上游引物為 GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG ；下游引物為 GCCctcgagGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分別引入NdeI和B10I核酸內切酶酶切位點；(3)以魚腥藍細菌總DNA為模板，利用與上下游引物進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物。 擴增反應的具體條件為利用高保真PCR試劑盒，加入終濃度為lpmol/μ L的上下游引物； 25pmol/μ L的dNTP，25pmol/μ L的Mg2+及試劑盒所附帯的相關反應緩沖液和DNA聚合酶； 混勻以后，將反應管置于PCR儀上，按照下列程序進行PCR反應95°C預變性5分鐘；95°C 預變性30秒，57°C預變性45秒，68°C預變性1分鐘，進行25個循環(huán)；68°C 5分鐘，4°C 5分鐘；(4)回收PCR產(chǎn)物采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物；(5)如圖1所示，將PCR產(chǎn)物利用Nde I和)(ho I核酸限制性內切酶連入克隆載體 PBSpetE中，構建具有氨芐青霉素抗性的重組質粒pBSpetE1580 ；(6)用重組質粒轉化大腸桿菌，進行培養(yǎng)、活化用pBSpetE1580轉化大腸桿菌 E. coli TG1，并涂布在氨芐青霉素抗性平板(Ampr，終濃度為lOOug/ml)。將抗性平板置于 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-12h，待轉化子長到一定大小以后，將菌落接入5ml的液體LB培養(yǎng)基 (LB培養(yǎng)基配方胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉0. 5%，pH 7. 0)活化培養(yǎng)。實施例2轉基因魚腥藍細菌的構建(1)魚腥藍細菌超表達載體的構建本發(fā)明使用ー個藍細菌高效啟動子petE作為1580啟動子，然后選擇ー個多拷貝質粒pRL25T作為表達載體，將1580置于petE驅動下，通過pRL25T，實現(xiàn)在光合細菌藍細菌中的高效表達(Sii，Li et al. 2007)，具體實施步驟為將實施例1中的重組克隆pBSpetE1580置于petE啟動子之后，如圖1所示；接下來，利用核酸內切酶NotI和B10I將petE和1580 —起切下來；然后用相同的酶消化 PRT25T，進行酶連，生成具有卡那霉素抗性的魚腥藍細菌超表達載體pRL25TpetE1580。(2)轉基因藍細菌的分離和鑒定將上述超表達載體利用藍細菌三親本雜交技術轉入藍細菌，實現(xiàn)其超量表達。具體方法如下首先將超表達載體pRL25TpetE1580轉化大腸桿菌E. coli HB101/pRL623，然后在添加卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板上獲取轉化子，并挑取單菌落接入具有同樣抗生素的20毫升液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)期。同吋，在終濃度為100 μ g/mL Amp (氨芐西林) 的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)大腸桿菌E. coli J53/RP4 20mL至對數(shù)生長期后期。魚腥藍細菌因生長周期長，需提前培養(yǎng)，以確保進行三親本雜交試驗時藍細菌也處于對數(shù)生長期。等量混合培養(yǎng)好的兩種大腸桿菌，5000rpm離心5min，除去培養(yǎng)基；然后加入不含有抗生素的LB 30ml，輕微懸浮菌體，然后5000rpm離心5min ；去除培養(yǎng)基后，加入Iml的不含有抗生素的LB，輕微懸浮待用；通過5000rpm離心5min，收集IOml左右藍細菌培養(yǎng)物，然后將藍細菌加入已經(jīng)混合好的大腸桿菌中。光照靜置培養(yǎng)1-2小時后均勻地涂布在不含抗生素的BGll平板上。平板在觀で光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時后，在培養(yǎng)基下加入100 μ g/mL的新霉素，繼續(xù)培養(yǎng)，大約7 10天(或更長時間約2周)后，轉基因藍細菌單菌落將會產(chǎn)生，然后將單菌落轉接到新鮮的含對應抗生素的平板上進行活化，最后接入液體BGll培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)。將獲取的轉基因藍細菌按照實施例1所提供的方案分離藍細菌總DNA，然后將總 DNA轉入大腸桿菌E. coli TGl，然后在含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上篩選菌落，將獲取的菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)后分離質粒DNA。對分離出來的質粒DNA進行酶切驗證，結果如圖2所示，表明轉基因藍細菌中含有我們在本實施例中轉入的重組質粒，將轉基因藍細菌命名為0E1580。申請人:將上述含有2-酮基肌醇脫氫酶基因的大腸桿菌工程菌(拉丁文名稱為 Escherichia coli TGl)命名為GC1101，申請人于2011年6月24日將該工程菌送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO M2011214。重組大腸桿菌(工程菌)GCllOl的生物學及遺傳學特性①生物學特性菌體直桿狀，營養(yǎng)體呈鏈狀或單生，長1-3微米，寬0. 4-0. 7微米， 革蘭氏染色陰性，無芽胞，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中容易分散。生長溫度范圍為15-46°C，最適生長溫度為37°C。兼性厭氧，在有氧條件下生長良好。在含0. 5% NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長，最適生長 PH為6. 8-8. 0。在葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木膠糖、阿拉伯膠等培養(yǎng)基中產(chǎn)酸產(chǎn)氣，甲基紅反應陽性。②遺傳學特性本發(fā)明是以大腸桿菌E. coli TGl為出發(fā)菌株得到的基因工程菌， 含有本發(fā)明得到的2-酮基肌醇脫氫酶基因片段1580。經(jīng)繼代培養(yǎng)，2-酮基肌醇脫氫酶基因1580能夠在工程菌中穩(wěn)定存在，對受體菌的生長無重大影響。實施例3轉基因魚腥藍細菌的抗百草枯活性測試將轉基因藍細菌和作為對照的原始野生型藍細菌一起活化培養(yǎng)得到約400ml的培養(yǎng)物，至0D750 = 0. 3左右，分裝到7個50ml小三角瓶中。然后分別加入百草枯至終濃度為0，0· 2，0· 4，0· 6，0· 8，1. 0，1. 2 μ M，繼續(xù)光照培養(yǎng)6天，取樣觀察。本實施例進行了多次平行試驗，其中一次試驗結果如圖3所示，野生型藍細菌在含有百草枯終濃度0. 2 μ M以后就開始死亡；而突變體可以耐受的百草枯濃度達到1. 2μΜ。多次平行試驗的統(tǒng)計結果如圖 4所示，同野生型相比，轉基因藍細菌可以耐受更高濃度的百草枯，這說明1580具有顯著提升緑色植物對百草枯耐受的潛力。
權利要求
1.魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.權利要求1所述的魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因所編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因的克隆方法，其特征在于包括以下步驟(1)分離魚腥藍細菌總DNA；(2)根據(jù)魚腥藍細菌的基因組序列，設計上下游引物上游引物為 GCCCATATGTTGGCAAAAAATGAG ；下游引物為 GCCCTCGAGGGAAATAGGTTATAAGTC，在上下游引物中分別引入Nde I和XhoI核酸內切酶酶切位點；(3)以魚腥藍細菌總DNA為模板，利用上下游引物進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；(4)回收PCR產(chǎn)物；(5)將PCR產(chǎn)物利用NdeI和BioI核酸內切酶連入克隆載體pBSpetE中，構建重組質粒；(6)用重組質粒轉化大腸桿菌，進行培養(yǎng)、活化。
4.根據(jù)權利要求1所述的魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因在抗百草枯除草劑轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因、該基因的克隆方法及其應用。本發(fā)明魚腥藍細菌2-酮基-肌醇脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示，所編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明以魚腥藍細菌的總DNA為模板，利用上下游引物擴增得到2-酮基-肌醇脫氫酶編碼基因。該基因在光合模式生物藍細菌中進行超量表達，能夠顯著提高轉基因菌株對除草劑百草枯的抗性，揭示了該基因在構建抗除草劑轉基因植物中的廣闊運用前景。
文檔編號A01H5/00GK102559711SQ201110221829
公開日2012年7月11日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權日2011年8月4日
發(fā)明者張巨源, 支遙, 汪方奎, 王莉, 陳雯莉 申請人:華中農業(yè)大學