專利名稱：連續(xù)培養(yǎng)產醇細菌的裝置和培養(yǎng)該細菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及連續(xù)培養(yǎng)產醇細菌(包括運動發(fā)酵單胞菌(Z;womo"ay moW/^)等厭氧細菌和賦予了醇發(fā)酵機能的大腸桿菌，不包括酵母)的裝置和 方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種技術，該技術用于在向發(fā)酵罐連續(xù)或分 批地提供基質進料液時，以作為發(fā)酵罐廢氣的二氧化碳的流量變化為指標， 來預測發(fā)酵罐內的基質消耗，由此控制基質液進料速度和發(fā)酵液取出速度， 從而使發(fā)酵罐中的基質濃度為 一定的低濃度。
背景技術：
發(fā)酵工業(yè)利用微生物發(fā)酵，以進行微生物產生的各種氨基酸、有機酸、 乙醇、丙酮和丁醇、核酸相關物質的發(fā)酵或者微生物菌體本身的生產。在 碳水化合物作為主要基質的這些發(fā)酵工業(yè)生產中，通過分批操作進行發(fā)酵 操作。因此，除發(fā)酵本身外，必須反復進行培養(yǎng)基的制備、裝置準備(滅菌)、 種子發(fā)酵、發(fā)酵之后的洗滌和清潔等操作，以至于發(fā)酵罐的凈操作時間短 并且操作效率低下。為了解決此問題，在酵母乙醇發(fā)酵中，引入了級聯(lián)操作(cascade operation),其中由數(shù)個發(fā)酵罐串聯(lián)進行發(fā)酵生產。但是，這并不是最終的 解決方案。此外，在分批操作中，為了監(jiān)測發(fā)酵過程，必須人工進行頻繁 的糖濃度分析等，因而人員保證和工廠運轉管理成了負擔。在所有的發(fā)酵操作中，都必須避免由于發(fā)酵液中的高基質濃度引起的 抑制效應，以有效地利用基質，并且保持殘留糖濃度盡可能低，使基質損 失最小。此外，為了使從停止發(fā)酵后的液體中分離產物更加容易，也為了 盡可能降低廢水處理的成本負擔，必須使細菌未消耗的基質盡可能少地流 向生物分離工程。通過以下方法將建立起穩(wěn)定連續(xù)的操作在連續(xù)的基質進料和發(fā)酵液 取出下，保持基質濃度低并且?guī)缀鹾愣ǎ瑢е聶C械操作效率的很大提高。 在該操作模式中，可以減少糖濃度的分析作業(yè)，從而節(jié)約人力，并且削減勞動力成本和夜間工作。本發(fā)明人在文獻l(特開2003-274934號公報)中提出了厭氧細菌例如運 動發(fā)酵單胞菌的連續(xù)乙醇發(fā)酵方法。該方法使用以下原理實現(xiàn)了連續(xù)發(fā)酵 伴隨著菌體代謝的發(fā)酵液的pH變化量表示基質消耗量和乙醇產量。在該方法中，為了修正發(fā)酵液的酸-堿平衡，計算堿(例如氨、氫氧化鈉 或其它石咸)添加量的累積，并且通過取出與石威添加量體積相對應的發(fā)酵液， 使發(fā)酵罐中的發(fā)酵液量保持恒定，以形成連續(xù)發(fā)酵。但是，當將該方法應 用于糖蜜等含有許多不明雜質的廉價工業(yè)原料時，pH變化量未必與基質消 耗相對應，因此有些情況下采用該方法進行連續(xù)發(fā)酵是困難的。 [文獻1]特開2003-274934號/>報發(fā)明內容從以上來看，本發(fā)明的目的是提供基質損失少的產醇細菌連續(xù)發(fā)酵裝 置及其相關技術，在使用運動發(fā)酵單胞菌等厭氧細菌的乙醇連續(xù)發(fā)酵中， 即使是在糖蜜、食品工業(yè)廢物、食品工廠廢液等廉價但含有許多雜質的基 質中，其仍能夠正確地預測糖消耗量和殘留糖濃度，將發(fā)酵液的基質濃度 保持在一定的低水平。本發(fā)明人正在研究開發(fā)克服上述問題的技術，并且注意到可以通過精 確測定從厭氧性細菌的連續(xù)乙醇發(fā)酵中排出的二氧化碳來精確確定基質消 耗，所述連續(xù)乙醇發(fā)酵使用糖蜜作為工業(yè)用原材料。我們完成了下述的連 續(xù)培養(yǎng)方法當發(fā)酵罐中的基質將用光至枯竭時，檢測到二氧化碳流量降 低，以此為指標，控制基質進料和發(fā)酵液取出，從而該系統(tǒng)達到長時間穩(wěn) 定的連續(xù)發(fā)酵，同時在發(fā)酵液中保持一定的低的基質濃度。本發(fā)明的第一方面提供產醇細菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，包括將基質液進 料到培養(yǎng)產醇細菌的發(fā)酵罐中，同時從所述發(fā)酵罐中取出 一定體積的發(fā)酵液，所取出的發(fā)酵液的體積根據進料到發(fā)酵罐的基質液的體積確定；和當 從所述發(fā)酵罐釋放的二氧化碳流量值低于預定范圍時，就觸發(fā)將基質液進 料到所述發(fā)酵罐中。根據該方案，在基質基本用光至枯竭的培養(yǎng)階段，進行基質液進料和 發(fā)酵液取出，從而使得基本上不產生因未被細菌利用而引起的基質損失。 如下文所述的實施例中所示，當發(fā)酵使用糖蜜等富含雜質的工業(yè)生產原料時，該系統(tǒng)能夠長時間穩(wěn)定地進行連續(xù)發(fā)酵，同時將發(fā)酵罐的基質濃度保 持在一定的低水平。此外，基質液進料至發(fā)酵罐的工作時間和單位時間內基質液進料到發(fā) 酵罐的進料速度希望保持恒定。因此，對于一次的基質液進料量，希望預先計算進料前數(shù)小時發(fā)酵液 中的基質消耗，由其估計上述進料時間和進料速度，以使基于此添加的基 質全部都被微生物消耗，在發(fā)酵罐內基本無殘留。所述的預定范圍優(yōu)選根據二氧化碳流量的閾值確定。根據本發(fā)明，因為被消耗而引起的基質損失非常小，并且使用糖蜜等 含有豐富不確定雜質的廉價工業(yè)原料時，連續(xù)發(fā)酵也能夠持續(xù)長時間，同 時將發(fā)酵罐內的基質濃度保持在一定的低水平。


[圖1]圖1是根據本發(fā)明的一種實施方式的連續(xù)發(fā)酵裝置的示意流程圖；[圖2]圖2是根據本發(fā)明實施方式的進料控制處理的流程圖；[圖3]圖3是顯示本發(fā)明實施方式中菌體濃度、殘余糖量、二氧化碳流量值和基質液進料狀態(tài)的變化的圖表；[圖4]圖4是顯示本發(fā)明實施方式中濁度、乙醇積累量、二氧化碳流量值和殘余糖量的變化的圖表；[圖5]圖5是顯示對比例1的培養(yǎng)結果的圖表；[圖6]圖6是顯示本發(fā)明的實施例5的培養(yǎng)結果的圖表；和[圖7]圖7是顯示本發(fā)明的實施例6的培養(yǎng)結果的圖表。[符號的說明]1 發(fā)酵罐 2攪拌器3 消泡器4 流量計 5控制器 6 接口7 CPU8 ROM9 法度計10 pH計11基質液罐12基質液進料泵13中和劑罐14中和劑進料泵15循環(huán)泵16錯流過濾單元17切換閥18取出泵19取出液罐具體實施方式
下面結合

本發(fā)明優(yōu)選的實施方式。在詳細說明具體構成之前， 本實施方式的要點概括如下。該實施方式涉及能夠應用于厭氧的產醇微生物例如運動發(fā)酵單胞菌的 發(fā)酵裝置，其可以使用各種可同化發(fā)酵資源作為基質液。通過首先將基質 液以預設的進料速度和一定的時間首次加到發(fā)酵罐中來開始連續(xù)發(fā)酵，所 述預設的進料速度是在發(fā)酵初期求得的。預設的進料速度通過菌體濃度和 糖消耗速度之間的關系確定，所述菌體濃度和糖消耗速度之間的關系是通 過在指定的微生物菌抹、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件下進行分批發(fā)酵的發(fā)酵試 驗測定的。接下來的基質液的添加通過由質流傳感器檢測二氧化碳釋放的 降低而進行，所述二氧化碳釋放的降低由發(fā)酵罐內基質枯竭而引起。從而 使得發(fā)酵罐的基質濃度總是保持在低水平范圍內。以下通過參考圖1描述本發(fā)明實施方式的連續(xù)發(fā)酵裝置。發(fā)酵罐1培 養(yǎng)厭氧細菌例如運動發(fā)酵單胞菌。在該發(fā)酵裝置中，發(fā)酵罐的總體積小， 為3升，并且因為它不是壓力容器所以難以控制該容器的內壓，故未實施 內壓控制。但是，優(yōu)選使用壓力容器發(fā)酵罐，并且可引入發(fā)酵罐的內壓控 制。將發(fā)酵罐1的溫度調節(jié)為指定值，并且通過設置在發(fā)酵罐1中的攪拌器2來引入溫和攪拌以一定速度攪拌發(fā)酵罐1的內容物。
發(fā)酵罐1的排出管通過消泡器連接至流量計4。流量計4可選自質流傳 感器、廢氣流量計和壓力計，它檢測發(fā)酵罐1釋放的二氧化碳流量值。將 通過流量計4檢測到的二氧化碳流量值輸入到控制器5的接口 6。當然，可 以檢測響應二氧化碳流量值的任何物理量。
控制器5控制圖1中所示的整個連續(xù)培養(yǎng)裝置。該控制器5的接口 6 接收濁度計9(優(yōu)選激光法度計(laser turbidimeter))的濁度值和pH計10的pH 值，所述濁度計測定發(fā)酵罐1中的濁度，所述pH計測定發(fā)酵罐1中的pH 值。CPU7是控制器5的主要單元，它執(zhí)行存儲在ROM8中用于操作控制的 計算機程序。計算機程序包括進料控制程序，其根據圖2中所示的流程圖 運行。此外，CPU7通過合適的接口 6將控制信號輸出到基質液進料泵12、 中和劑進料泵14、循環(huán)泵15、切換閥17和取出泵18,形成連續(xù)發(fā)酵的全 部操作控制。
基質液罐11存儲下文中所述的實施例中提及的基質液。當基質進料命 令從接口 6傳送至基質液進料泵12時，基質液從基質液罐11以預設的速 度和時間進料至發(fā)酵罐l。結果，增加了發(fā)酵罐1中的殘余糖量。
中和劑罐13存儲中和劑例如氨等。通過發(fā)酵罐1中發(fā)酵的進行，伴隨 著孩史生物的生長，發(fā)酵罐中的pH下降。在該實施方式中，CPU7向中和劑 進料泵14輸出中和劑進料信號來控制發(fā)酵罐1中的pH值，從而使pH總是 保持在4.5至6.0左右的一定值(因條件而異)。
循環(huán)泵15連接至發(fā)酵罐1,其根據接口 6的循環(huán)指示信號將發(fā)酵罐1 的發(fā)酵液取出壓送至錯流過濾單元16。錯流過濾單元16將一部分取出的發(fā) 酵液送回至發(fā)酵罐l，并將濾液引入到切換閥17—端的輸入端口。此外， 切換閥17的其它的輸入端口連接至發(fā)酵罐1的發(fā)酵液。
根據接口 6的切換信號，切換閥17的一個/其它輸入端口與輸出端口相 連。根據來自接口 6的取出信號，取出泵18將來自切換閥17的輸出端口 的濾液/發(fā)酵液壓送至取出液罐19。由此，將含有乙醇的發(fā)酵液取出至取出 液罐19中?？捎秒x心分離器代替錯流過濾單元16。
參考圖2,說明通過控制器5進行的基質液進料控制的各過程。在該過 程中，重要的是，當從發(fā)酵罐1釋放的二氧化碳流量值降低至低于預設的 下限值時，控制器5向基質液進料泵12 (進料單元)輸出基質進料信號，將基質液進料到發(fā)酵罐1。
循環(huán)泵15、錯流過濾單元16、切換閥17和取出泵18相當于用于從發(fā) 酵罐1取出發(fā)酵液的取出單元，并且控制器5控制該取出單元，從而使得 取出發(fā)酵液的量與基質液進料泵12將基質進料到發(fā)酵罐1的進料量相等。 CPU7參考濁度計9的濁度，并且當發(fā)酵罐l的發(fā)酵液菌體濃度偏低時，由 錯流過濾單元16取出濾液(切換閥17如圖1中所示工作)，而當菌體濃度偏 高時，從發(fā)酵罐l取出發(fā)酵液(切換閥工作狀態(tài)與圖l相反)，使得發(fā)酵罐1 中發(fā)酵液菌體濃度保持一定。
參考圖2和圖3進行說明。首先，如圖2中的步驟1所示，制備菌種、 基質液，并將其加入發(fā)酵罐1。在步驟2中，等待時間T0、 二氧化碳流量 閾值Th、進料時間Tl和進料速度R1是預設的。這些預設值是根據條件設 定的，必要時可適當進行修正。在圖3中1 = 10時，發(fā)酵開始。
進料速度R1的值根據預先求得的菌體濃度和糖消耗速度之間關系式來 設定，以使發(fā)酵液的基質濃度保持在枯竭之前的低水平，所述進料速度R1 值存儲在ROM8中。
在發(fā)酵的開始階段，培養(yǎng)基中菌體濃度低(圖3 (a》而基質豐富(圖3 (b))。 其后，作為產醇細菌的特征，即使基質還有剩余，增殖也會停止。因而， 為了增加菌體濃度，循環(huán)培養(yǎng)液，取出濾液再補充相當?shù)呐囵B(yǎng)基，進行濃 縮培養(yǎng)，提高菌體濃度。當菌體濃度達到預設值時，啟動濁度控制，接進 入連續(xù)發(fā)酵。
隨著微生物的積極生長，菌體濃度增加，并且發(fā)酵罐1中剩余的糖濃 度降低。此外，發(fā)酵的過程增加二氧化碳流量值(圖3(c))。此時，CPU7監(jiān) 視是否已過等待時間T0(步驟3),在等待時間過去之前不進行基質液進料。
如圖3(C)中所示，當在t時刻的首次基質液進料完成后又過去等待時間 T0時，CPU7在步驟4中檢查二氧化碳流量值是否低于其閾值Th。例如， 在時間t = t0+T0， 二氧化碳流量值高于閾值Th,則此時CPU7確認在步驟 8中不應結束操作，然后返回步驟4的操作，再次重復上述檢查。
在時間t:tl，發(fā)酵罐1中的基質幾乎用光，二氧化碳流量值急劇降低 至低于閾值Th。這觸發(fā)操作從步驟4切換至步驟5。因此，CPU7通過接口 6將基質液進料信號輸出到基質液進料泵12，并且基質液進料泵12開始進 行從基質液罐11至發(fā)酵罐1的進料，進料速度為Rl(步驟5),并且進料持續(xù)預設時間Tl(步驟6)。結果，如圖3(b)中所示，發(fā)酵罐1中的殘余糖量從 幾乎為0的水平增加。即，在時間t = tl時重復基質液進料，就可以以接近 限制(制限)基質濃度的低基質濃度持續(xù)運轉。
使用葡萄糖作為基質的乙醇發(fā)酵的二氧化碳產生和發(fā)酵之間的關系通 ?？杀硎緸槿缦禄瘜W定量關系。
C6H1206-> 2C2H5OH + 2C02(1)
從該方程式看出，l摩爾葡萄糖產生2摩爾二氧化碳和2摩爾乙醇，因 而當乙醇生成由于糖類耗盡而停止時，就不再產生二氧化碳。因此，以二 氧化碳釋放量的降低為指標可以高可信性地檢測基質耗盡。
在該連續(xù)發(fā)酵裝置中，通過濁度計9將菌體濃度保持恒定，但是，實 際進行進料，有些情況下，基質消耗變得比輸入到控制器中的預定值高或 低。因此，優(yōu)選對基質液進料的設定時間(夕^ $ y夕、')進行微調。
然后，自時刻tl經過預設時間Tl后，CPU7指示基質液進料泵12停 止基質液進料(步驟7),該基質液進料泵12停止基質進料。然后如圖3(b) 中所示，殘余糖量再次降低，在時刻t2 二氧化碳流量值也降低至低于閾值 Th。
以后，在時刻t2， t3, t4…,重復相同的操作(步驟3 8)。
由此，在第二次之后(在時刻tl之后)，當流量計4檢測到從發(fā)酵罐1
內基質耗盡時釋放的二氧化碳量急劇降低并且達到闊值Th時，開始進料基質液。
如上所述，通過不斷地檢查由微生物產生的二氧化碳，可以連續(xù)進料 基質液以避免糖類等基質耗盡，容易地將發(fā)酵罐中的基質濃度限制在5 g/L 以下的低水平。在使用含有豐富雜質的糖蜜作為工業(yè)原材料的發(fā)酵中，依 賴于pH的控制方法不能有效地用于連續(xù)發(fā)酵。但是，本發(fā)明能夠克服該問 題，并且該方法能夠應用于比現(xiàn)有技術更為廣泛的材料費用低廉的發(fā)酵中。
實施例
下面詳細描述本發(fā)明的實施例，當然本發(fā)明不限于這些實施例。 (實施例1)
按規(guī)定濃度制備YM broth (Difco laboratories, Detroit)培養(yǎng)基，然后將 10 ml培養(yǎng)基分加到試管中，并且將其在115。C高壓滅菌10 min。接種運動發(fā)酵單胞菌NRRLB-14023， 30。C靜置發(fā)酵18h，以此作為種子菌。
對于主發(fā)酵，將巴西產糖蜜用自來水稀釋5.3倍，并且將其在120。C高 壓滅菌10min。將2升培養(yǎng)基倒入已滅菌的小型發(fā)酵罐(總體積3升)中， 然后接種根據上述方法培養(yǎng)的100ml種子發(fā)酵液，并且在30。C開始發(fā)酵， 同時以100rpm攪拌。隨著菌體增殖發(fā)酵液pH降低，因此使用pH計在線 監(jiān)測pH值，并使用1N氨水將pH保持在5.5。
在發(fā)酵開始15h之后，細胞增殖達到頂峰，因此進行發(fā)酵液的循環(huán)濃 縮，增加菌體濃度。使發(fā)酵液流過安裝在發(fā)酵罐外部的錯流過濾單元(Pall JapanLtd., 0.45 mp, 0.11112濾筒)，取出濾液，并且補充與開始發(fā)酵時相同 的培養(yǎng)基，以在保持發(fā)酵罐液量一定的同時，提高菌體濃度。
通過該方法，在發(fā)酵開始約24h時，菌體濃度達到4g/L。然后，如圖 4中所示，在255 h連續(xù)發(fā)酵的所有階段，通過激光濁度計(ASRLtd.， Model LA-301)控制菌體濃度在4.0±0.2 g/L。當菌體濃度恒定之后，用葡萄糖/蔗糖 分析儀分析發(fā)酵液中的剩余基質濃度，葡萄糖和蔗糖的濃度總計為10g/L。 使用糖蜜制備基質液，所述糖蜜與發(fā)酵開始時的巴西產糖蜜相同，用自來 水將其稀釋5.7倍，然后在120。C高壓滅菌10 min,以950 g/h的速度進料4 h。
在進料4h之后，停止進料，然后微生物很快消耗掉發(fā)酵液中的少量剩 余基質，并且進料停止約15 min之后，觀察到二氧化碳釋放的急劇降低。 當二氧化碳釋放量達到設定值0.08L/min時，認為基質已經耗盡，并且再次 進行基質液的進料。實際上，當二氧化碳釋放降低至下限時，分析儀測得 的殘余糖濃度幾乎為0 g/L。該操作是通過控制程序自動進行的。
由此，通過如下方法進行連續(xù)發(fā)酵使用控制程序以1,000 g/h的進料 速度進料4 h，然后暫停進料直到二氧化碳釋放急劇降低，并且當二氧化碳 流量值達到閾值時再進行進料。基于由進料停止到二氧化碳釋放急劇下降 的時間，能夠推測進料中的發(fā)酵液殘余糖濃度。當該時間較長時，判斷殘 余糖濃度高，稍減進料速度；反之，稍增進料速度。以上述方式進行微調。
但是，可以根據發(fā)酵方式或基質種類等發(fā)酵條件、微生物菌林的性能 等，調節(jié)基質液進料的設定值。在該實施例中，每次進料的進料時間都為4 h,但是，如前述，所述進料時間不必限于此，只要在菌體活性未發(fā)生大變 化的時間內，可以盡可能地延長進料時間以避免損失時間。在圖4中，通過濁度控制狀態(tài)(上)、質量流量計檢測到的二氧化碳釋放 (下)、發(fā)酵罐中的乙醇濃度以及殘余糖濃度來顯示發(fā)酵過程。通過上述的控
制程序，穩(wěn)定的發(fā)酵持續(xù)了 255 h。在此期間，進料中的發(fā)酵液殘余糖濃度 維持在葡萄糖和蔗糖合計為約10.0±5g/L。此外，發(fā)酵液中的平均乙醇濃度 為約68 g/L。經過230 h的凈連續(xù)發(fā)酵時間，收獲含有68 g/L乙醇的220升 發(fā)酵液。
(實施例2)
用作種子的菌體、培養(yǎng)基、發(fā)酵方法、發(fā)酵條件以及用于主發(fā)酵的裝 置與實施例1中所用的相同。
通過向玉米淀粉糖化液中加入CSL (玉米漿)來制備主發(fā)酵培養(yǎng)基和基質液。
將玉米淀粉懸浮于自來水中形成200 g/L的漿液，然后在攪拌下將pH 調節(jié)至6.0，然后加入0.5 |il/g淀粉的Termamyl 120L(Novo),并將該漿液在 90。C的水浴上液化處理1小時。然后冷卻反應的液體，將pH調節(jié)至4.5, 并加入0.6 jil/g淀粉的Dextrozyme(Novo),并且將其在60°C的恒溫箱中糖化 處理24h。獲得葡萄糖濃度為178g/L的糖化液。
用水稀釋該糖化液，使葡萄糖濃度為130 g/L，并加入5g/L的用離心 機除去了固體成分的CSL(SaneiTokaK.K.)。調節(jié)pH，并高壓滅菌，將其作 為培養(yǎng)基、基質液。
用于發(fā)酵的步驟和控制程序與實施例1中所述相同。
進料速度為950g/h, —次進料的進料時間與實施例1同為4h,以及二 氧化石友釋放的閾值為0.08 L/min，這也與實施例1相同。
發(fā)酵穩(wěn)定地持續(xù)長時間，經過200h的連續(xù)運轉，得到了 180升發(fā)酵液， 其中含乙醇58g/L。
(實施例3)
用作種子的菌體、培養(yǎng)基、發(fā)酵方法、發(fā)酵條件以及用于主發(fā)酵的裝 置與實施例1中所用的相同。
向木薯淀粉糖化液中添加糖蜜，以此作為主發(fā)酵培養(yǎng)基和基質液。 將木薯淀粉(Thailand)以200 g/L的濃度懸浮于自來水中，并將該漿料 的pH在攪拌下調節(jié)至6.0,然后加入0.5 pl/g淀粉的Termamyl 120L (Novo), 并將該漿液在90。C的水浴上液化處理1小時。然后冷卻反應的液體，將pH調節(jié)至4.5,并加入0.6 (il/g淀粉的Dextrozyme(Novo)，并且將其在60°C的 恒溫箱中糖化處理24h。獲得葡萄糖濃度為175 g/L的糖化液。用水稀釋該 糖化液，使葡萄糖濃度為130 g/L，并以1:1的比例混合實施例1中所用的 糖蜜的5.7倍稀釋液，調節(jié)pH,高壓滅菌，以此作為培養(yǎng)基、基質液。用于發(fā)酵的步驟和控制程序與實施例1中所述相同。進料速度l，OOO g/h, —次進料的進料時間為4 h,這與實施例1相同， 二氧化碳釋放的闊值為0.08 L/min，這也與實施例1相同。發(fā)酵穩(wěn)定地持續(xù)長時間，經過200h的連續(xù)運轉，得到了 175升發(fā)酵液， 其中含乙醇58g/L。(實施例4)用作種子的菌體、培養(yǎng)基、發(fā)酵方法、發(fā)酵條件以及用于主發(fā)酵的裝 置與實施例1中所用的相同。主發(fā)酵培養(yǎng)基、基質液為模型新鮮垃圾糖化液(乇r A生3、、;、糖化液)， 其以新鮮垃圾為原料，已發(fā)酵。將米飯(白米)250g、甘藍59g、煮熟的胡蘿卜50g、香蕉(可食用部分)50 g和生魚片50 g混合，并在榨汁機-混合器(juicer-mixer)上用少量的水將其粉 碎、果汁化，然后加入總量為1升的水進行稀釋。在攪拌下將pH調節(jié)至 4.5,然后加入0.6 jil/g淀粉的Dextrozyme (Novo),并且將其在60°C的恒溫 箱中糖化處理24h。得到糖化后的葡萄糖濃度為85 g/L的糖化液，高壓滅 菌，以此作為培養(yǎng)基、基質液。進料速度1，200g/h， 一次進料的進料時間為4h，這與實施例l相同， 二氧化碳釋放的閾值為0.08 L/min，這也與實施例1相同。發(fā)酵穩(wěn)定地持續(xù)長時間，經過150h的連續(xù)運轉，得到了 150升發(fā)酵液， 其中含乙醇41 g/L。如以上實施例所述，使用糖蜜等含有大量未知雜質的工業(yè)原材料的連 續(xù)發(fā)酵，能夠持續(xù)長時間，并且顯然在發(fā)酵進行的過程中，發(fā)酵罐中的基 質濃度保持在一定的低水平。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有顯著的優(yōu)勢。關于(3-內酰胺類抗生素的效果，下面描述對比例1和實施例5、 6。實 施例5和6的相同點如下。對于使用運動發(fā)酵單胞菌的連續(xù)乙醇發(fā)酵，將加入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基 高壓滅菌，然后冷卻，作為初始培養(yǎng)基。此外，將青霉素G鉀溶于冷卻的已滅菌的水中，并將其加到培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中的濃度為5-20IU/ml,并 且加入種子菌(種子)，開始發(fā)酵。與實施例l相同，通過分批培養(yǎng)使菌體濃度提高，并且通過菌體濃縮 使細胞濃度增加至目標值。當細胞濃度達到目標值時，連續(xù)添加基質液， 進行連續(xù)發(fā)酵，其中，按與初始培養(yǎng)基相同的步驟在所述基質液中加入終 濃度為5-20 IU/ml的青霉素G鉀。對于用于菌體濃縮的錯流過濾單元16，同樣添加終濃度為5-20 IU/ml 的青霉素G鉀，30。C溫育2h。通過這種方法完全殺滅殘存在錯流過濾單元 16的膜內或連接管隱蔽處的污染菌。這是實施例5、 6和實施例1 -4之間不同之處。如實施例5、 6中所詳 細描述的，通過這樣的處理，使用運動發(fā)酵單胞菌的連續(xù)乙醇發(fā)酵成功地 持續(xù)了 350h之久，而沒有任何污染菌的滲透和增殖，以常規(guī)(常時)最大 速度進行了乙醇的發(fā)酵生產。這種技術不但對運動發(fā)酵單胞菌有效，也對 能夠進行醇發(fā)酵的基因重組大腸桿菌有效。在本發(fā)明中，抗生素不限于僅僅是青霉素，以氨芐西林為代表的對革 蘭氏陽性細菌有效的p-內酰胺類抗生素均可以獲得同樣的效果。下面描述對比例1，然后再描述實施例5和6。(對比例1)根據規(guī)定濃度制備YM broth (Difco laboratories, Detroit)培養(yǎng)基，然后 將10 ml培養(yǎng)基分加到試管中，115。C高壓滅菌10 min。接種運動發(fā)酵單胞 菌NRRLB- 14023, 3(TC靜置發(fā)酵18h，以此作為種子菌。對于主發(fā)酵，將由結晶葡萄糖140g/L、酵母提取物5g/L、味液(大豆 片(soybean flake)酸解產物)0.5 vol。/。組成的培養(yǎng)基調節(jié)至pH 5.5,并且將其 在120。C高壓滅菌20 min。將2升培養(yǎng)基倒入已滅菌的小型發(fā)酵罐中(總體 積3升)，然后接種根據上述方法培養(yǎng)的100 ml種子發(fā)酵液，并且在30°C 培養(yǎng)，同時以100rpm攪拌。隨著菌體增殖，發(fā)酵液pH降低，所以使用pH 計10監(jiān)測pH值，并使用1 N氨水將pH保持在5.5。圖5顯示對比例1的發(fā)酵過程。接種之后，通過分批培養(yǎng)開始菌體增 殖，當細胞濃度超過lg/L時，通過錯流過濾單元開始菌體濃縮，使用基質 液補加基質，同時從培養(yǎng)體系中取出除去了菌體的液體，來增加細胞濃度。在培養(yǎng)開始約40 h時，菌體濃度達到約5 g/L的目標值，發(fā)酵進行到使用圖1中所示的系統(tǒng)的連續(xù)^f莫式。如圖5中所示，直到培養(yǎng)開始80 h(連續(xù) 發(fā)酵40h時)，菌體濃度保持大致6 g/L，乙醇濃度保持高于60g/L，但是它 有下降的趨勢，二氧化碳釋放量也傾向于降低，其為約250 ml/min(相當于 約10 mmol/min)，乙醇生產速度保持在約30 g/h。但是，在連續(xù)發(fā)酵40h之后，二氧化碳釋放以及乙醇濃度急劇降低， 并且氨的消耗快速增加，以至于成為異常發(fā)酵。在培養(yǎng)的第120h時，發(fā)酵 變得失去控制，發(fā)酵的連續(xù)性停止。認為在培養(yǎng)40h時(連續(xù)模式開始時) 滲入了乳酸菌，并且在第80小時后其生長旺盛。實際上，培養(yǎng)100h的發(fā) 酵液在瓊脂平板上培養(yǎng)時，觀察到大量的乳酸菌落。(實施例5)根據規(guī)定濃度制備YM broth (Difco laboratories, Detroit)培養(yǎng)基，然后 將10ml培養(yǎng)基分加到試管中，115。C高壓滅菌10min。接種運動發(fā)酵單胞 菌NRRLB- 14023， 30。C靜置發(fā)酵18h,以此作為種子菌。對于主發(fā)酵，將由結晶葡萄糖140g/L、酵母提取物5g/L、味液(大豆 片酸解產物)0.5 vol。/。組成的培養(yǎng)基調節(jié)至pH5.5,并且將其在120。C高壓滅 菌20min。將培養(yǎng)用的最初培養(yǎng)基、菌體濃縮用的基質液、連續(xù)發(fā)酵基質液 高壓滅菌，并冷卻，然后加入青霉素G鉀至濃度為5IU/ml。將2升培養(yǎng)基倒入已滅菌的小型發(fā)酵罐(總體積3升)中，然后接種 根據上述方法培養(yǎng)的100 ml種子發(fā)酵液，并且在30。C培養(yǎng)，同時以100rpm 攪拌。隨著菌體增殖，發(fā)酵液pH降低，所以使用pH計10監(jiān)測pH值，并 使用1N氨水將pH保持在5.5。使用的系統(tǒng)與圖1中所示的實施例1中的系統(tǒng)相同。如對比例1中所 述，以往的發(fā)酵受到污染的損害，可以確信，污染菌保留在用過的過濾單 元16的內部。因此，為了絕對地除去保留在過濾單元的所有部件中的污染 菌，將用過的濾筒分解洗凈，并且浸泡在堿溶液中數(shù)日。然后用青霉素處 理該濾筒以完全殺滅剩余的污染菌。即，用青霉素洗滌圖1中所示的系統(tǒng) 的所有部分，并將該青霉素處理的濾筒裝配到發(fā)酵罐1，用于菌體濃縮循環(huán)。圖6示出培養(yǎng)結果。接種之后，通過分批培養(yǎng)使菌體增殖，當細胞濃 度超過l g/L時，通過錯流過濾單元16開始濃縮菌體，補加基質，即進料 添加了終濃度為5IU/ml的青霉素的基質液。此外，通過從培養(yǎng)體系中取出 除去了細胞的液體使細胞濃度增加。在培養(yǎng)開始約30 h時，菌體濃度達到5 g/L的目標值，發(fā)酵進入到圖1 中所示的系統(tǒng)的連續(xù)模式。用于連續(xù)發(fā)酵的基質液由140 g/L紅糖(三溫糖)、5 g/L酵母提取物和 5ml/L味液組成，將其調節(jié)至pH5.5,并且在120°C高壓滅菌20 min。在基 質液冷卻之后，添加青霉素G鉀至終濃度為5 IU/ml。圖6示出了實施例5的連續(xù)發(fā)酵結果。發(fā)酵成功地無任何污染地進行 150h之久，在整個發(fā)酵時程中，乙醇的發(fā)酵生產是令人滿意的。在連續(xù)發(fā) 酵的始終，菌體濃度保持在5±0.5 g/L, 二氧化碳釋放量為約350 ml/min (約 15mmol/min),乙醇生產速度為約42 g/h，保持了非常高的生產速度。如圖 6中看出，基質液進料和發(fā)酵液取出的速度穩(wěn)定，在培養(yǎng)中無變化，連續(xù)發(fā) 酵以穩(wěn)定狀態(tài)持續(xù)了長時間。在發(fā)酵的所有階段，發(fā)酵液的乙醇濃度為65±5 g/L (約8.2%)。注意到，在用青霉素清潔錯流過濾單元16并將青霉素用于 基質液時，觀察到了顯著的效果，導致沒有污染影響的長時間連續(xù)發(fā)酵。(實施例6)用作種子的菌體、培養(yǎng)基、發(fā)酵方法和發(fā)酵條件與實施例1中所用的 相同。初始培養(yǎng)基、用于細胞濃縮的基質液以及連續(xù)發(fā)酵基質液的組成及制 備方法同前。即，用水稀釋玉米淀粉酶糖化液，并且添加5 ml/L的CSL (玉 米漿)，將pH調節(jié)至5.5,然后將糖化液的糖濃度調節(jié)至140 g/L，接著在 120。C高壓滅菌20 min。冷卻之后，加入終濃度5 IU/ml的青霉素G鉀，用 于培養(yǎng)。防止污染的方法尤其是用青霉素清潔錯流過濾單元16的方法如前 面所述。圖7示出實施例6的發(fā)酵結果。所用的系統(tǒng)與實施例1相同。接種之 后，通過分批培養(yǎng)使菌體增殖，當細胞濃度超過lg/L時，通過錯流過濾單 元16開始濃縮菌體，補加基質，即進料添加了終濃度為5 IU/ml的青霉素 的基質液。此外，通過從培養(yǎng)體系中取出除去了細胞的液體使細胞濃度增 加。在培養(yǎng)27 h時，菌體濃度達到約6 g/L的目標值，發(fā)酵進入到圖1中所 示的系統(tǒng)的連續(xù)模式。連續(xù)發(fā)酵的基質液由前述玉米淀粉酶糖化液(糖濃度 140g/L)和5ml/L的CSL(玉米漿)組成，調節(jié)至pH5.5,然后在120。C高壓 滅菌20min。冷卻之后，加入終濃度5 IU/ml青霉素G鉀。如圖7中所示，發(fā)酵成功地無任何污染地進行350h之久，在整個發(fā)酵 時程中，乙醇的發(fā)酵生產是令人滿意的。在連續(xù)發(fā)酵的始終，菌體濃度保 持在6±0.5 g/L, 二氧化石友釋》文量為約500 ml/min (約21 mmol/min)，乙醇生 產速度為約58g/h,在整個培養(yǎng)時間內保持了非常高的生產速度。如圖7下看出，基質液進料和發(fā)酵液取出的速度穩(wěn)定，在培養(yǎng)中無變 化，連續(xù)發(fā)酵以穩(wěn)定狀態(tài)持續(xù)了長時間。在發(fā)酵的所有階段，發(fā)酵液的乙 醇濃度為65±5 g/L(約8.2%)。注意到，在用青霉素清潔錯流過濾單元16并 將青霉素用于基質液時，觀察到了顯著的效果，導致沒有污染影響的長時 間連續(xù)發(fā)酵。
權利要求
1.產醇細菌的連續(xù)培養(yǎng)裝置，包括培養(yǎng)產醇細菌的發(fā)酵罐；將基質液進料到所述發(fā)酵罐的供給單元；用于檢測從所述發(fā)酵罐釋放的二氧化碳的流量值或其函數(shù)值的計量器；和控制單元，其根據所述計量器的輸出控制所述供給單元，其中當從所述發(fā)酵罐釋放的二氧化碳的流量值低于預定范圍時，所述控制單元以此為觸發(fā)條件，使所述供給單元將基質液進料至所述發(fā)酵罐。
2. 權利要求1所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，其中所述供給單元將基質液進料 到所述發(fā)酵罐的時間和將基質液在單位時間里進料到所述發(fā)酵罐的進料速 度是恒定的。
3. 權利要求1所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，其中所述預定范圍根據二氧化碳 流量值的閾值確定。
4. 權利要求1所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，還包括取出單元，用于從所述發(fā) 酵罐取出發(fā)酵液，其中所述控制單元控制所述取出單元，使得所述取出單元從所述發(fā)酵 罐取出一定量的發(fā)酵液，所述取出的發(fā)酵液的量根據由所述供給單元進料 到所述發(fā)酵罐的基質液的量來確定。
5. 產醇細菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，包括 將基質液進料到培養(yǎng)產醇細菌的發(fā)酵罐；并且，從所述發(fā)酵罐取出一定體積的發(fā)酵液，所述取出的發(fā)酵液的體 積根據進料到所述發(fā)酵罐的基質液的量來確定；和當從所述發(fā)酵罐釋放的二氧化碳流量值達到低于預定范圍時，以此為 觸發(fā)條件，將基質液進料到發(fā)酵罐。
6. 權利要求5所述的產醇細菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，其中將基質液進料到 所述發(fā)酵罐的時間和將基質液在單位時間里進料到所述發(fā)酵罐的進料速度 是恒定的。
7. 權利要求5所述的產醇細菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，其中所述預定范圍根 據二氧化碳流量值的閾值確定。
8. 權利要求5所述的產醇細菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，還包括添加(3-內酰胺 類抗生素。
9. 權利要求8所述的產醇細菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，其中所述(3-內酰胺類 抗生素是青霉素。
10. 權利要求8所述的產醇細菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，其中所述(3-內酰胺 類抗生素在清洗連續(xù)發(fā)酵裝置的包括發(fā)酵罐在內的至少一部分時添加。
11. 權利要求8所述的產醇細菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，其中所述P-內酰胺類 抗生素在包括發(fā)酵罐的連續(xù)發(fā)酵裝置運轉時添加。
全文摘要
一種連續(xù)培養(yǎng)裝置，其中使用厭氧細菌，甚至是借助于含有高比例雜質的基質進行乙醇連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵液的基質濃度在低水平保持恒定，以保證減少的基質損失。提供一種連續(xù)培養(yǎng)裝置，其包括用于培養(yǎng)產醇細菌的發(fā)酵罐(1)；用于將基質液進料到發(fā)酵罐的供給泵(12)；用于檢測從發(fā)酵罐放出的二氧化碳氣體的流速值的流量計(4)；和能夠基于流量計的輸出控制供給泵的控制單元(5)；其中當二氧化碳氣體的流速值低于給定的范圍時，控制單元根據流速值觸發(fā)供給泵將基質液供給到發(fā)酵罐。供給泵每次供給基質液的速度保持恒定。
文檔編號C12M1/00GK101268179SQ200680034108
公開日2008年9月17日 申請日期2006年9月8日 優(yōu)先權日2005年9月15日
發(fā)明者島崎敬士, 河野明彥, 石崎文彬 申請人:尼克弗公司