專利名稱：表達(dá)靶向內(nèi)腔的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的制作方法
表達(dá)耙向內(nèi)腔的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物本發(fā)明涉及在植物細(xì)胞的類囊體內(nèi)腔(thylakoid lumen)中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的 構(gòu)建物和方法。植物質(zhì)體(plastid)(葉綠體、淀粉體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體等)源自稱為前質(zhì)體的 共同前體，這些植物質(zhì)體負(fù)責(zé)重要化合物，例如氨基酸、復(fù)雜的碳水化合物、脂肪 酸和色素的產(chǎn)生。植物細(xì)胞通常含有500-10,000個拷貝的120-160千堿基的小環(huán)狀 質(zhì)體基因組，其含有單拷貝和復(fù)制的DNA區(qū)段。因此，可工程改造植物細(xì)胞使 之含有最多達(dá)20,000個拷貝的特定感興趣基因，從而可能極高水平地表達(dá)外來 基因并累積重組蛋白質(zhì)最高達(dá)細(xì)胞可溶性總蛋白質(zhì)的40y。(DeCosa等，2001， Nat.Biotechnol.19， 71-74)。此外，葉綠體轉(zhuǎn)基因品系中未見基因沉默的報道， 雖然轉(zhuǎn)錄物的累積水平比細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因植物高169倍(Lee等，2003， Mol. Breeding, 11, 1-13)。另外，大多數(shù)植物的質(zhì)體是母體遺傳的。所以與細(xì)胞核 中表達(dá)的異源基因不同，質(zhì)體中表達(dá)的異源基因不能經(jīng)花粉傳播。因而極大限 制了此種轉(zhuǎn)基因在環(huán)境中的散播和傳播至毗鄰植物的風(fēng)險。就結(jié)構(gòu)而言，葉綠體是復(fù)雜的細(xì)胞器，其包含三種不同的可溶相(soluble phase)。葉綠體為雙層膜的包膜(double-membrane envelope)所包圍，該包膜封閉 形成膜間隙(intermembrane space)。主要的可溶相是間質(zhì)，這是(發(fā)生)碳固定、氨 基酸合成和許多其它途徑的部位。主膜(dominant membrane)是捕捉光并合成ATP 的廣泛交聯(lián)的類囊體網(wǎng)絡(luò)。類囊體的膜封閉第三可溶相，形成類囊體內(nèi)腔，其中容 納了許多外源性光合成蛋白質(zhì)以及許多其它蛋白質(zhì)(C. Robinson等，2001， Traffic 2:245-251)。只有少數(shù)葉綠體蛋白質(zhì)在該細(xì)胞器內(nèi)編碼與合成。大多數(shù)葉綠體蛋白質(zhì)在細(xì) 胞核中編碼，在細(xì)胞質(zhì)中合成為前體蛋白并在翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)入葉綠體亞區(qū)室之一。由 于必須通過所存在的不同膜系統(tǒng)，因而需要特定的可能特別復(fù)雜的細(xì)胞分選信號。已表征了使蛋白質(zhì)靶向葉綠體的類囊體內(nèi)腔的兩種不同分泌途徑。第一條途 徑是涉及細(xì)菌中SecYEG輸出機(jī)制的Sec-依賴性途徑。第二條途徑是pH-依賴性機(jī)制，其特征在于轉(zhuǎn)運(yùn)肽(transitpeptide)中有兩個連續(xù)的保守性精氨酸，即Tat(雙生 精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶)途徑。經(jīng)Sec途徑靶向內(nèi)腔的蛋白質(zhì)通常以未折疊的狀態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)，而 經(jīng)Tat途徑輸入的蛋白質(zhì)可以折疊狀態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)。類囊體的加工蛋白酶加工通過任一途 徑輸入內(nèi)腔的蛋白質(zhì)，切除所轉(zhuǎn)運(yùn)肽的羧基端部分(C. Robinson等，traffic2001， 2:245-251)。葉綠體的類囊體內(nèi)腔可能是累積某些重組蛋白質(zhì)的最佳植物細(xì)胞區(qū)室，因為 其氧化穩(wěn)定性高并含有特定蛋白酶(Z. Adams等，TRENDS in Plant science,第7 巻，No 10， 2002)。盡管如此，很少考慮將其用于重組蛋白質(zhì)的靶向和累積。美國專利US 6，512，162將抑肽酶編碼序列與petA基因融合，從而使融合的 petA::抑肽酶蛋白能耙向植物細(xì)胞的類囊體膜。尸e"是編碼細(xì)胞色素f(petA)蛋 白的葉綠體基因組的基因，已有報道說該蛋白是含有位于葉綠體類囊體膜中的 跨膜區(qū)的多肽，其N-末端區(qū)域在類囊體內(nèi)部空間(intrathylakoidspace)中，而15 個氨基酸的C末端序列在基質(zhì)中(SJ. Rothstein等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 第82巻，第7955-7959頁，1985)。因此，petA::抑肽酶融合蛋白中的抑肽酶應(yīng) 位于基質(zhì)中，其中抑肽酶編碼序列與細(xì)胞色素f(petA)編碼序列的3'末端相連。因此，仍需要能明確將感興趣肽定位于葉綠體類囊體內(nèi)腔中的方法和手段。本發(fā)明首次提供利用細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)腔靶向信號序列，使由整合入 葉綠體基因組中的轉(zhuǎn)基因編碼的重組蛋白質(zhì)耙向葉綠體類囊體內(nèi)腔的有用核酸序 列。這種方案利用整合入葉綠體基因組中的轉(zhuǎn)基因的高水平表達(dá)，從而使大量重 組蛋白質(zhì)累積在具有特定特征，特別是氧化還原特性、含有蛋白酶和折疊活性的細(xì) 胞區(qū)室中。此外，采用此方案可能在植物葉綠體中產(chǎn)生具有非甲硫氨酸N-末端的重組蛋 白質(zhì)。附圖簡述 '

圖1:質(zhì)粒pAPR20的圖譜本發(fā)明的主題是一種嵌合型基因，其包含按照轉(zhuǎn)錄方向以功能方式彼此相連的a) 在植物質(zhì)體中有功能的啟動子，b) 細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)的甲硫氨酸N-末端內(nèi)腔靶向信號肽的編碼核酸序列， 其翻譯性融合于，C)編碼某肽的異源核酸序列，d)任選在植物細(xì)胞的質(zhì)體中具有活性的終止子。靶向葉綠體類囊體內(nèi)腔區(qū)室的細(xì)胞核編碼蛋白質(zhì)具有特征性的二連轉(zhuǎn)運(yùn)肽(bipartite transit peptide),其由基質(zhì)靶向信號肽和內(nèi)腔靶向信號肽構(gòu)成?；|(zhì)靶向 信息位于該轉(zhuǎn)運(yùn)肽的氨基端部分。內(nèi)腔靶向信號肽位于該轉(zhuǎn)運(yùn)肽的羧基端部分，其 含有靶向內(nèi)腔的所有信息。內(nèi)腔靶向信號肽顯示與細(xì)菌信號肽極其相似，可分成荷 電的N-末端結(jié)構(gòu)域、疏水核心和極性更高的C-末端結(jié)構(gòu)域，其結(jié)束于相對此末端 切割位點的-3位和-1位含有的短鏈殘基(von Heijne等，Eur. J. Biochem. 80， 535-545， 1989)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列或相應(yīng)基因的核酸序列來預(yù)測 細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)腔耙向信號肽。作為非限制性例子的SignalP (Nielsen等，Int. J. Neural Syst 8:581-599， 1997) 是預(yù)測二連轉(zhuǎn)運(yùn)肽和內(nèi)腔蛋白質(zhì)(lumenal protein)的內(nèi)腔靶向信號肽的合適工 具?？蓪嵤┑牧硪环椒ㄊ抢密浖argetP (Emanuelsson等，J Mol Biol 300:1005-1016， 2000)，從而能大規(guī)模預(yù)測細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位和 通過手工篩檢TargetP-預(yù)測的葉綠體蛋白質(zhì)中的雙生-精氨酸基序進(jìn)行研究 (Kieselbach等，Photosynthesis research, 78:249-264,2003)。近年來高等植物葉綠體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究成功鑒定了本發(fā)明可能使用的許多 細(xì)胞核編碼的內(nèi)腔蛋白質(zhì)(Kieselbach等，F(xiàn)EBS LETT 480:271-276， 2000; Peltier 等，Plant Cell 12:319-341 ， 2000; Bricker等，Biochim. Biophys Acta 1503:350-356， 2001)、其內(nèi)腔耙向信號肽。Kieselbach等，Photosynthesis research, 78:249-264， 2003報道了鼠耳芥屬04m6Wo;w^)的約80種蛋白質(zhì)以及菠菜和豌豆的同源蛋白 質(zhì)。具體地說，納入本說明書作為參考的該出版物的表2披露了以登錄號鑒別 的85種葉綠體內(nèi)腔蛋白質(zhì)。此外，近來發(fā)表的大米基因組草圖(Goff等，Science 296:92-100， 2002)是可能用于本發(fā)明的內(nèi)腔靶向信號肽合適來源。技術(shù)人員熟知質(zhì)體中的正常翻譯始于甲硫氨酸。細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)腔 靶向信號肽可能含有甲硫氨酸作為N-末端氨基酸，或不含。按照本發(fā)明，編碼甲硫氨酸的ATG翻譯起始密碼子框內(nèi)融合于編碼內(nèi)腔耙向 信號肽的核酸分子的5'端，或?qū)⑦@種內(nèi)腔靶向信號肽替換為沒有起始甲硫氨酸的 N-末端氨基酸?？梢詮?，例如植物來源產(chǎn)生的基因組DNA或DNA文庫分離編碼內(nèi)腔靶向信 號肽的核酸分子?；蛘撸刹捎弥亟MDNA技術(shù)(例如，PCR)或化學(xué)合成方法制備 它們?？衫帽景l(fā)明的分子或這些分子的各部分或這些分子的逆向互補(bǔ)鏈(視情況 而定)，例如通過標(biāo)準(zhǔn)方法雜交(參見，例如Sambrook等，1989，《分子克隆， 實驗室手冊》(Molecular Cloning, A Laboratory Manual),第二版，冷泉港實驗 室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),紐 約州)來鑒定和分離這種核酸分子?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)，特別是例 如Sambrook等(1989，《分子克隆，實驗室手冊》(Molecular Cloning, a Laboratory Manual), Nolan C編，紐約冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))所述的那些技術(shù)從細(xì)胞核編碼的蛋白質(zhì)獲得本發(fā)明的甲硫氨酸 N-末端內(nèi)腔靶向信號肽。細(xì)胞核編碼的蛋白質(zhì)可經(jīng)由兩種不同的分泌途徑通過類囊體膜耙向進(jìn)入葉綠 體類囊體內(nèi)腔區(qū)室。第一條途徑是Sec-依賴性途徑，第二條途徑是Tat途徑 (Robinson等，Plant Mol Biol 38， 209-221， 1998; Cline等，Annu. Rev. Cell dev. Biol. 12， 1-26， 1996)。本發(fā)明人已證明來自利用Sec依賴性途徑的細(xì)胞核所編碼 蛋白質(zhì)，或利用Tat途徑的細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)腔靶向信號肽均適合于本發(fā) 明。因此，本發(fā)明涉及上述嵌合型基因，其中編碼內(nèi)腔靶向信號肽的核酸序列來 自利用Sec依賴性途徑或利用Tat途徑的細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)，從而能轉(zhuǎn)運(yùn)通過類 囊體膜。 .、在本發(fā)明的一個實施方式中，編碼甲硫氨酸N-末端內(nèi)腔靶向信號肽的核酸序 列選自以下組a) 編碼含有SEQ ID NO: 2或4所示氨基酸序列的肽的核酸分子；b) 編碼氨基酸序列與SEQ ID NO: 2或4所示氨基酸序列有至少70%、至少80%、至少90%、 95%或99%相同性的肽的核酸分子；c) 含有SEQIDNo: 1或3所示核苷酸序列的核酸分子；d) 其核酸序列與a)或c)所述核酸序列有至少50%、至少60%、至少70%、 80%或90%相同性的核酸分子；e) 其核苷酸序列因遺傳密碼的簡并性而不同于a)、 b)、 c)或d)所示核酸分子的核酸分子；和f) 代表a)、 b)、 c)、 d)或e)所示核酸分子的片段、等位基因變體和/或衍生物 的核酸分子。按照本發(fā)明，術(shù)語"相同性"應(yīng)理解為表示與其它蛋白質(zhì)/核酸的氨基酸/核苷 酸相對應(yīng)的氨基酸/核苷酸數(shù)目，以百分比表示。最好借助計算機(jī)程序通過比較SEQ IDNO:l、 SEQIDNO:2、 SEQ. ID NO: 3或SEQ ID NO: 4與其它蛋白質(zhì)/核酸 來測定相同性。如果與另一序列作比較的序列長度不同，相同性的測定方法是 比較較短序列與較長序列中相同氨基酸的數(shù)目來確定相同性百分比。優(yōu)選利用 熟知且公眾可獲得的計算機(jī)程序ClustalW (Thompson等，Nucleic Acids Research 22 (1994)， 4673-4680)測定相同性。通過歐洲分子生物學(xué)實驗室 (Meyerhofstrasse 1 ， D 69117 海德堡，德國)的 Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) 禾卩 Toby Gibson(Gibson⑨EMBL-Heidelberg.DE)可以獲得已公開的ClustalW。還可以從不同的 因特網(wǎng)址，包括IGBMC (遺傳學(xué)與分子及細(xì)胞生物學(xué)研究所(Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire)， B.P.163, 67404 Illkirch Cedex ， 法 國 ； ftp:〃ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) 禾B EBI (ftp:〃ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及EBI的所有鏡像因特網(wǎng)址(歐洲生物信息 學(xué)研究院(European Bio informatics Institute),威爾克姆特拉斯特基因組園區(qū) (Wellcome Trust Genome Campus)，辛克斯頓(Hinxton)，劍橋CB 10 ISD ，英國) 下載ClustalW。優(yōu)選利用1.8版本的ClustalW計算機(jī)程序測定本發(fā)明蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì) 之間的相同性。如此操作時，以下參數(shù)必須設(shè)定為KTUPLE=1， TOPDIAG=5， WINDOW=5, PAIRGAP=3， GAPOPEN=10， GAPEXTEND=0.05， GAPDIST=8， MAXDIV-40, MATRIX=GONNET， ENDGAPS(OFF)， NOPGAP， NOHGAP。優(yōu)選利用1.8版本的ClustalW計算機(jī)程序測定，例如本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列和其它核酸分子的核苷酸序列之間的相同性。如此操作時，以下參數(shù)必須設(shè)定為KTUPLE=4， TOPDIAGS=4， PAIRGAP=5， DNAMATRIX: IUB， GAPOPEN=10， GAPEXT=5, MAXDIV=40， TRANSITIONS:未加權(quán)的。按照本發(fā)明，術(shù)語"以功能方式彼此連接"或"操作性連接"表示組成性嵌 合型基因(component chimeric gene)的特定元件彼此相連的方式使得它們作為一個 單位起作用，從而能表達(dá)編碼序列。例如，如果某啟動子能促進(jìn)某編碼序列表達(dá)， 則稱該啟動子以功能方式連接于該編碼序列。按照本發(fā)明，術(shù)語"以功能方式彼此連接"包括了多順反子排列的情況，其 中啟動子不直接與編碼序列相連。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)，尤其是例如Sambrook等(1989，《分子克隆，實驗室手冊》，Nolan C編，紐約冷泉港實驗室出版社)所述的方法 將各種組件裝配成本發(fā)明的嵌合型基因。確切地說，該嵌合型基因中要包含哪種調(diào) 節(jié)元件取決于它們要在其中起作用的植物和質(zhì)體的類型本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇哪 種調(diào)節(jié)元件可在給定的植物中起作用并提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。例如，可將 Shine-Dalgarno (SD)共有序列GGAGG置于該基因上游?；蛘?，可將5'非翻譯 區(qū)(UTR)插入啟動子和基因之間(Staub J.M.和Maliga P.， 1993， EMBO J. 12， 601-606)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在質(zhì)體中較高水平地表達(dá)轉(zhuǎn)基因需要利用5'非 翻譯區(qū)(5，UTR)和3'非翻譯區(qū)(3，UTR)的調(diào)控信號(De Cosa B.， Moar W.， Lee S.B.， Miller M.和Daniell H.， 2001， Nat. Biotechnol. 19， 71-74)。本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知可能的5'UTR和3，UTR。例如，基因的啟動子(Genbank Z00044 的核苷酸1596-1819)包含內(nèi)源性5，UTR。可使16S核糖體操縱子Prm的啟動子 與r6c丄基因的核糖體結(jié)合位點區(qū)域(5'UTRrbcL)相連。例如，在植物細(xì)胞的質(zhì)體中具有功能的啟動子中，特別述及的是編碼PSII的 Dl多肽的戸M基因(Staub等，1993 EMBO Journal 12(2):601-606)和調(diào)節(jié)核糖體 RNA操縱子的組成型/Vt"啟動子(Staub等，1992 Plant Cell 4:39-45)。原則上 說，得自質(zhì)體植物基因或細(xì)菌基因的任何啟動子均能起作用，本領(lǐng)域技術(shù)人員 知道選擇哪種可用的啟動子來獲得所需表達(dá)模式(組成型或可誘導(dǎo)型)。本發(fā)明的合適啟動子是煙草的iVm啟動子，該啟動子與Ad基因中提供核糖體結(jié)合位點的5'非翻譯序列部分相連(Svab等，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. 90:913-917)。另一合適啟動子是編碼psn的Di多肽的基因的光依賴性(light-dependent)啟動子(StaubJ.M.和Maliga P. ， 1993， EMBO J. 12， 601-606)。例如，在植物細(xì)胞質(zhì)體中具有活性的終止子中，特別述及的是戸W基因、r6c丄 基因(編碼RuBisCO的大亞基)和基因(編碼煙草核糖體蛋白質(zhì)) (Shinozaki等，1986， EMBO J. 5:2043-2049; Staub J旦禾口 Maliga P.， 1993， EMBO J. 12， 601-606)的終止子。按照本發(fā)明，術(shù)語"翻譯性融合于"應(yīng)表示核酸序列的融合方式使它們代表 一個開放讀框，從而在轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生一種信使RNA，其在翻譯時編碼一種多肽。按照本發(fā)明，編碼細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)的甲硫氨酸N-末端內(nèi)腔靶向信號肽的 核酸序列翻譯性融合于異源核酸序列，這表示第二核酸序列不是天然融合于編碼內(nèi) 腔靶向信號肽的第一核酸序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，編碼某種肽的異源核酸序列衍生自真核生物， 其融合于編碼內(nèi)腔靶向信號肽的核酸序列。在本發(fā)明的另一實施方式中，根據(jù)煙草(iWcoaam7 ^6fl^m)的葉綠體密碼子選 擇，設(shè)計的編碼甲硫氨酸N-末端內(nèi)腔靶向信號肽的核酸序列和/或異源核酸分子能 優(yōu)化葉綠體表達(dá)。煙草的葉綠體密碼子選擇見www.Kazusa.or.jp/codon，根據(jù)葉 綠體密碼子選擇表中的頻率，在整個編碼序列上將密碼子隨機(jī)分配給各氨基酸 殘基(Nakamura等，2000， Nucl. Acids Res. 28， 292)。在本發(fā)明還有另一實施方式中，編碼某肽的異源核酸序列編碼含有非甲硫 氨酸N-末端的肽。可以從，例如真核生物或其它來源產(chǎn)生的基因組DNA或DNA文庫分離編碼 某肽的異源核酸分子?；蛘?，可采用重組DNA技術(shù)(例如，PCR)或化學(xué)合成方法 制備它們。可利用本發(fā)明分子或這些分子的各部分或這些分子的逆向互補(bǔ)鏈(視情 況而定)，例如通過標(biāo)準(zhǔn)方法雜交(參見，例如Sambrook等，1989，《分子克隆， 實驗室手冊》，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約州)來鑒定和分離 這種核酸分子。在本發(fā)明還有另一實施方式中，編碼某肽的異源核酸序列編碼抑肽酶蛋白質(zhì)。抑肽酶是可從牛的器官或組織，例如胰腺、肺或肝臟提取的一種蛋白酶抑制劑。已 知抑肽酶能抑制各種絲氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纖溶酶和激肽 釋放酶，其可治療性用于治療心肌梗塞、中風(fēng)綜合征、超溶纖維蛋白的 (hyperfibrinolytic)和急性胰腺炎，以及用于減少心臟外科手術(shù)相關(guān)的血液損失 (Bidstmp等，1989， Cardiovasc Surg. 44:640-645)。抑肽酶的核酸序列和氨基酸 序列可見Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫(瑞士生物信息學(xué)研究院(Swiss Institute of Bioinformatics)與歐洲生物信息學(xué)研究院EMBL分院(the EMBL outstation - the European Bioinformatics Institute)合<乍；http:〃us.expasy.org/sprot)， 登錄號為 P00974。按照本發(fā)明，鑒定的抑肽酶蛋白為SEQIDNO:6。本發(fā)明另一實施方式的嵌 合型基因中的異源核酸序列編碼含有抑肽酶蛋白片段的肽，該肽顯示具有與抑肽酶 蛋白相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)活性，或其所編碼肽的氨基酸序列與SEQ IDNO:6有至少70。/。、 至少80%、至少卯％、， 95%或99%的相同性。在本發(fā)明的其它實施方式中，所述異源核酸序列的核酸序列與SEQ ID NO: 5 有至少50%、至少60%、至少70%或至少75%的相同性。與其它分子同源的核酸分子或多肽及這些分子的組成型衍生物通常是這些分 子的變體，這些變體包含修飾但能執(zhí)行相同的生物學(xué)功能。為此目的，可以修飾不 參與酶活性的氨基酸殘基。在本發(fā)明中，可釆用體外檢驗，例如Nct-苯甲?；?D,L-精氨酸-對硝基苯胺 鹽酸鹽試驗(Lavens等，1993, J. Immunol. Methods, 166(1)， 93-102;西格瑪 -阿爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)，產(chǎn)品號B 4875，按照生產(chǎn)商手冊進(jìn)行試驗)， 根據(jù)所述多肽或所述核酸分子所編碼多肽抑制絲氨酸蛋白酶的能力來評估該核酸 分子或其所編碼多肽的生物學(xué)功能。所述變異，例如突變可以是天然方式發(fā)生的或 通過誘變引入的。所述變體還可以是合成制備的序列。等位變體可以是天然產(chǎn)生的 變體，也可以是合成制備的變體或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。因遺傳密碼簡 并性而與本發(fā)明核酸分子不同的核酸分子構(gòu)成了特定形式的衍生物。包含編碼抑肽酶的異源核酸分子和因遺傳密碼簡并性而與天然分子的核苷酸 序列不同的序列的嵌合型基因也是本發(fā)明的主題。包含編碼酶活性有所不同的抑肽酶變體的異源核酸分子的嵌合型基因也是本發(fā)明的主題。本發(fā)明還涉及指定用于轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體的載體，其特征在于含有至少兩條與待 轉(zhuǎn)化植物原質(zhì)體系中序列的同源序列，所述同源序列側(cè)接至少一個本發(fā)明嵌合型基 因。這些序歹i」(組成性嵌合型基因的上游(LHRR)和另一下游(RHRR)元件)能雙重 同源重組在含毗連區(qū)域LHRR和RHRR的原質(zhì)體系的基因間區(qū)域中。本發(fā)明的兩條同源重組序列可以毗連，從而能將此嵌合型基因插在原質(zhì)體系 的非編碼(基因間)序列處。在一具體實施方式
中，該序列是質(zhì)體核糖體RNA操縱 子的一部分。在另一具體實施方式
中，所述非編碼序列包含^c丄基因的3'端(編碼 mBisCO的大亞基)，另一同源序列包含""D基因的5，端(編碼乙酰輔酶A羧化酶 的亞基之一)。更具體地說，LHRR片段對應(yīng)于煙草原質(zhì)體系的核苷酸 57764-59291(Shinozaki等，1986 -Genbank Z00044)。 RHRR片段對應(yīng)于煙草原 質(zhì)體系的核苷酸59299-60536。為獲得質(zhì)體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化DNA必需先通過細(xì)胞壁、質(zhì)膜和細(xì)胞器的雙層膜然后 到達(dá)基質(zhì)。在這方面，轉(zhuǎn)化質(zhì)體基因組的最常用技術(shù)是粒子轟擊(Svab和Maliga， 1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2月1日，90(3):913-917)。在單細(xì)胞藻類萊茵衣藻(C7 /am>^owowcw re&/zflW"/)中首次進(jìn)行了利用高速 微粒的質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Boynton等，1988)。目前，在高等植物中，通常在煙草(Nicotiana tabacum)中進(jìn)行穩(wěn)定的質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Svab和Maliga， 1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87， 8526-8530; Svab禾口 Maliga， 1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2月1日， 90(3):913-917)。轉(zhuǎn)化大米(Khan M.S.禾口 Maliga， 1999， Nat. Biotechnol. 17， 910-915)、擬南芥04m6Wo;x^ Aa/Z謹(jǐn))(Sikdar等，1998， Plant Cell Reports 18:20-24)、馬鈴薯(Sidorov等，1999， Plant J. 19(2):209-216)、歐洲油菜(&a^/ca "a; ^) (Chaudhuri等，1999， WO 00/39313)和番茄(Ruf等，2001， Nat. Biotechnol. 19， 870-875)的質(zhì)體已見報道。己獲得了煙草、番茄、馬鈴薯和大豆的高產(chǎn)轉(zhuǎn)質(zhì)體 植物(WO 04/053133)。近年來，轉(zhuǎn)化浮萍(duckweed)質(zhì)體已見報道(WO 05/005643)。可利用選擇性標(biāo)記來選擇轉(zhuǎn)化的質(zhì)體和細(xì)胞，即將嵌合型基因摻入它們原質(zhì) 體系中的那些細(xì)胞(即轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞)，還可能獲得高產(chǎn)、同質(zhì)的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物。術(shù)語"同質(zhì)"表示所有細(xì)胞含有相同類型的原質(zhì)體系，并且只含該原質(zhì)體系。當(dāng)轉(zhuǎn)質(zhì)伴植物 的所有細(xì)胞只含轉(zhuǎn)化原質(zhì)體系的拷貝時，它們是同質(zhì)的。例如，在可用作選擇性標(biāo)記的基因中，特別述及的是兩種嵌合型基因，即編 碼賦予壯觀霉素和鏈霉素抗性的氨基糖苷3"腺苷轉(zhuǎn)移酶的基因(Svab等， 1993， Proc. Natl. Acad. Sci. 90:913-917)和編碼賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸 轉(zhuǎn)移酶的基因(Carrer等，1993， Mol. Gen. Genet. 241:49-56)。其它合適的 候選選擇性標(biāo)記包括賦予甜菜堿醛抗性的基因，例如編碼甜菜堿醛脫氫酶的基 因(Daniell等，2001， Curr. Genet. 39:109-116)，賦予除草劑耐受性的基因，例 如賦予雙丙氨膦(bialaphos)抗性的6ar基因(White等，1990， Nucleic Acid Res. 18(4):1062)，和賦予草甘磷抗性的EPSPS基因(US 5 188 642)?；蛘呖衫脠蟮?基因，即編碼易于鑒定的酶，例如GUS (P-葡糖醛酸酶)(Staub J.M.和MaligaP.， 1993， EMBOJ. 12， 601-606)或綠色熒光蛋白(GFP， Sidorov等，1999， Plant J. 19(2):209-216)的基因，編碼色素的基因，或編碼調(diào)節(jié)色素產(chǎn)生的酶的基因。專 利申請WO 91/02071、 WO 95/06128、 WO 96/38567、 WO 97/04130和WO 01/64023描述了這種基因。編碼選擇性標(biāo)記的基因可以是編碼賦予壯觀霉素和鏈霉素抗性的氨基糖苷3" 腺苷轉(zhuǎn)移酶的基因(Svab等，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. 90:913-917)。因此，本發(fā)明還涉及將核酸分子整合入它們的原質(zhì)體系中的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物細(xì)胞， 或轉(zhuǎn)質(zhì)體植物和/或其后代，所述核酸分子包含按照轉(zhuǎn)錄方向以功能方式彼此相連的以下部分在質(zhì)體中具有活性的啟動子序列，細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)的甲硫氨酸 N-末端內(nèi)腔靶向信號肽的編碼核酸序列，所述核酸序列翻譯融合于編碼某肽的異 源核酸序列，和任選在植物細(xì)胞質(zhì)體中具有活性的終止子。在本發(fā)明的一個實施方式中，編碼某肽的異源核酸序列衍生自真核生物，其 融合于編碼內(nèi)腔靶向信號肽的核酸序列。本發(fā)明還涉及屬于浮萍科(Lemnaceae)、煙草屬植物、馬鈴薯植物、番琉植物、大豆植物或藻類的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物和/或后代。在一具體實施方式
中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物是煙草植物。 在另一實施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明植物的可收獲植物部分，例如葉片，其中這些可收獲部分含有本發(fā)明的植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的方法，其中a) 用至少一種嵌合型基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述嵌合型基因包含按照轉(zhuǎn)錄方向 以功能方式彼此相連的以下部分在質(zhì)體中具有活性的啟動子序列，細(xì)胞核所編碼 蛋白質(zhì)的甲硫氨酸N-末端內(nèi)腔靶向信號肽的編碼核酸序列，所述核酸序列翻譯融 合于編碼某肽的異源核酸序列，和任選的在植物細(xì)胞質(zhì)體中具有活性的終止子；b) 從步驟a)獲得的植物細(xì)胞再生植物，和c) 如果需要，從步驟b)獲得的植物產(chǎn)生其它植物。按照技術(shù)人員已知的方法，例如采用《植物細(xì)胞培養(yǎng)方法》(Plant Cell Culture Protocols) 1999， R.D. Hall編，休瑪娜出版社(Humana Press), ISBN 0-89603-549-2所述的方法，可再生步驟a)獲得的植物細(xì)胞產(chǎn)生完整的植物。例如，可通過無性繁殖(例如，利用插枝、塊莖或愈傷組織培養(yǎng)和全植物再生) 或有性繁殖，按照本發(fā)明方法中步驟c)產(chǎn)生其它植物。為此，優(yōu)選在受控條件下進(jìn) 行有性繁殖，即使具有特定特征的所選擇植物彼此雜交和繁殖。本發(fā)明還涉及在植物細(xì)胞中制備感興趣蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括以下步 驟用本發(fā)明嵌合型基因轉(zhuǎn)化質(zhì)體，在適合于表達(dá)該嵌合型基因以及隨后信號肽切除的條件下培養(yǎng)含有所述轉(zhuǎn)化質(zhì)體的植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及在植物質(zhì)體中產(chǎn)生非甲硫氨酸N-末端肽的方法，所述方法包括 以下步驟a) 用嵌合型基因轉(zhuǎn)化質(zhì)體，所述嵌合型基因包含按照轉(zhuǎn)錄方向以功能方式彼此相連的以下部分在質(zhì)體中具有活性的啟動子序列，細(xì)胞核所編碼蛋白質(zhì)的甲硫氨酸N-末端內(nèi)腔靶向信號肽的編碼核酸序列，所述核酸序列翻譯融合于編碼某肽、的異源核酸序列，和任選的在植物細(xì)胞質(zhì)體中具有活性的終止子，其中所述異源核酸序列編碼非甲硫氨酸N-末端肽；b) 在適合于表達(dá)該嵌合型基因以及隨后信號肽切除的條件下培養(yǎng)含有所述轉(zhuǎn) 化質(zhì)體的植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及在植物質(zhì)體中產(chǎn)生非甲硫氨酸N-末端肽的上述方法，其中所述 非甲硫氨酸N-末端蛋白質(zhì)是抑肽酶。本發(fā)明還涉及制備感興趣肽的方法，所述方法包括以下步驟從本發(fā)明轉(zhuǎn)質(zhì) 體植物細(xì)胞，或本發(fā)明轉(zhuǎn)質(zhì)體植物和/或其后代，或本發(fā)明轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的可收獲部分提取感興趣的肽。這種方法還優(yōu)選包括先收獲所培養(yǎng)的植物和/或這種植物的各部分，例如葉片，再提取感興趣肽的步驟。該方法還最優(yōu)選包括先培養(yǎng)本發(fā)明植物再收獲的步驟。 本發(fā)明還涉及制備感興趣肽的上述方法，其中所述感興趣肽是抑肽酶。 技術(shù)人員知道提取抑肽酶的方法。可采用許多方法分離抑肽酶， 一般包括沉淀方法和/或利用DEAE-纖維素或親和技術(shù)的層析步驟。美國專利US 5,164,482和 J.D. Altman等，1991， Protein Eng， 4(5):593-600描述了這種方法的實例。 以下非限制性實施例具體說明了本發(fā)明。實施例1:編碼利用Sec-依賴性途徑轉(zhuǎn)運(yùn)通過類囊體膜的甲硫氨酸-N-末端內(nèi) 腔靶向信號肽的核酸序列在Kieselbach等，2003， Photosynthesis research, 78:249-264所鑒定的內(nèi)腔 蛋白質(zhì)中，選擇功能未知擬南芥AT5g52970基因，其編碼經(jīng)Sec-依賴性途徑分 泌至內(nèi)腔的蛋白質(zhì)。在信號肽切除后氨基末端帶正電(精氨酸或賴氨酸)的內(nèi)腔 蛋白質(zhì)中選擇該基因。進(jìn)行這種預(yù)選能提高進(jìn)一步精確加工融合蛋白并除去抑 肽酶(以精氨酸打頭的氨基酸序列)的概率。根據(jù)翻譯融合于甲硫氨酸N-末端內(nèi) 腔靶向信號肽的編碼核酸序列的異源核酸序列，也可以不預(yù)選或依據(jù)其它標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)選。利用SignalP軟件(Nielsen等，Int. J. Neural Syst. 8:581-599， 1997)預(yù)測 AT5g52970所編碼蛋白質(zhì)的二連轉(zhuǎn)運(yùn)肽。刪除能輸入葉綠體的該二連轉(zhuǎn)運(yùn)肽的 預(yù)測氨基末端序列，加入甲硫氨酸作為翻譯起始、點，從而獲得SEQ ID NO: 2 所示的LSP1序列。實施例2:編碼利用Tat途徑轉(zhuǎn)運(yùn)通過類囊體膜的甲硫氨酸-N-末端內(nèi)腔耙向 信號肽的核酸序列在Kieselbach等，2003, Photosynthesis research, 78:249-264所鑒定的內(nèi)腔 蛋白質(zhì)中，選擇編碼經(jīng)Tat途徑分泌至內(nèi)腔的親免素樣(immunophilin-like)蛋白 質(zhì)的擬南芥ATlg20810基因。在信號肽切除后在氨基末端帶正電(精氨酸或賴 氨酸)的內(nèi)腔蛋白質(zhì)中選擇該基因。進(jìn)行這種預(yù)選能提高進(jìn)一步精確加工融合蛋白并除去抑肽酶(以精氨酸打頭的氨基酸序列)的概率。根據(jù)翻譯融合于編碼甲 硫氨酸N-末端內(nèi)腔靶向信號肽的核酸序列的異源核酸序列，也可以不預(yù)選或依 據(jù)其它標(biāo)準(zhǔn)預(yù)選。利用SignalP軟件(Nielsen等，Int. J. Neural Syst. 8:581-599， 1997)預(yù)測 ATlg20810所編碼蛋白質(zhì)的二連轉(zhuǎn)運(yùn)肽。刪除能輸入葉綠體的該二連轉(zhuǎn)運(yùn)肽的 預(yù)測氨基末端序列，加入甲硫氨酸作為翻譯起始點，從而獲得SEQ ID NO: 4 所示的LSP2序列。實施例3: LSP/抑肽酶融合蛋白的編碼序列根據(jù)煙草質(zhì)體密碼子選擇(www.kazusa.or.ip/codon)，設(shè)計能編碼與抑肽酶在 氨基末端相融合的LSP1或LSP2(即分別是LSP1::抑肽酶和LSP2:鄰肽酶)的合成序 列，從而能優(yōu)化葉綠體表達(dá)。根據(jù)葉綠體密碼子選擇表中的頻率，將密碼子隨機(jī) 分配給各氨基酸殘基。實施例4:葉綠體轉(zhuǎn)化載體pAPR20和pAPR21將LSP1::抑肽酶和LSP2::抑肽酶編碼序列引入衍生自pBluescript質(zhì)粒(斯特 拉特基因公司(Stratagene))的葉綠體轉(zhuǎn)化載體，分別是載體pAPR20和pAPR21。 pAPR20如圖1所示。pAPR21與pAPR20相同，除了 LSP2取代了 LSP1。這些載體含有煙草基因組，LHRR-Nt(l)和RHRR-Nt(l)的區(qū)域，從而能將轉(zhuǎn) 基因靶向整合在Ac丄和flccD基因之間。LHRR片段對應(yīng)于煙草原質(zhì)體系的核苷酸 57764-59291(Shinozaki等，1986 - Genbank Z00044)。 RHRR片段對應(yīng)于煙草原質(zhì) 體系的核苷酸59299-60536。如Svab和Maliga (1993)所述，嵌合型可選擇標(biāo)記基因aa^4編碼大觀霉素抗 性。將其表達(dá)置于16S核糖體操縱子的啟動子(Prrn(p)-Nt: Genbank Z00044的核 苷酸102561-102677)控制下，該啟動子后是AA基因的核糖體結(jié)合位點 (5'UTRrbcL-Nt: Genbank Z00044的核苷酸57569-57584)。轉(zhuǎn)錄終止子 3'psbA-Nt(2)來自戸M基因(反向的Genbank Z00044的核苷酸146-533)。將LSP::抑肽酶融合(蛋白)編碼序列置于戸W基因啟動子(PpsbA-Nt(2): 反向的Genbank Z00044的核苷酸1596-1819)的控制下。轉(zhuǎn)錄終止子3'rbcL-Nt(2)來自Ac丄基因(反向的Genbank Z00044的核苷酸59036-59246)。 此載體的其余元件衍生自pBluescript載體。實施例5:葉綠體轉(zhuǎn)化無菌條件下用補(bǔ)加了蔗糖(3。/o)和植物凝膠(phytagar)(7 g/l)的MS培養(yǎng)基 (Murashige和Skoog， 1962)培養(yǎng)煙草(var. PBD6)植物。按照Finer等(1992)所述 技術(shù)用實驗室構(gòu)建的粒子槍(particle gun)轟擊3-5 cm的葉片遠(yuǎn)軸側(cè)(abaxial side)。在CaCl2(0.8-1.0 M)和亞精胺(14-16 mM)存在下，用金微粒吸附載體 pAPR23的DNA(每次轟擊5微克)。將處理的葉片置于補(bǔ)加了萘乙酸(naphtalene acetic acid) (ANA; 0.05 mg/l)、 6-芐基氨基嘌呤(BAP; 2 mg/l)的相同MS培養(yǎng) 基中2天。然后將葉片切成平均長5mm見方的方塊，用補(bǔ)加了 500 mg/1鹽酸 壯觀霉素的上述含激素培養(yǎng)基培養(yǎng)來選擇轉(zhuǎn)質(zhì)體植物。每10天用新鮮選擇培 養(yǎng)基再次培養(yǎng)葉片。4-6周后，分離無色外植體(bleachedexplant)上出現(xiàn)的綠化 愈傷組織或小植株，轉(zhuǎn)移至補(bǔ)加了 500 mg/l鹽酸壯觀霉素且不含激素的MS培 養(yǎng)基(3。/。蔗糖和7g/l植物凝膠)中。再生的枝條一旦生根，即轉(zhuǎn)移至溫室中。實施例6:所選品系的PCR分析采用PCR分析用壯觀霉素選擇的pAPR20和pAPR21所產(chǎn)生的第一種植物來 檢測轉(zhuǎn)基因是否存在于煙草葉綠體基因組的預(yù)定位置。該分析利用兩種不同的引物 對(1)和(2)。第一對(l)引物能證實(轉(zhuǎn)基因)整合在預(yù)定位點，其中一個引物位于轉(zhuǎn)化載體 pAPR20或pAPR21中存在的LHRR片段前的Ac丄基因中(orbcL52F: 5'-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3')，第二個引物以反向位于AADA編碼區(qū)開始處 (aadA10R: 5'- gttgatacttcggcgatcaccgcttc-3')。觀察到約1.8 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物證實已 整合。第二對(2)引物能擴(kuò)增包含LSP::抑肽酶融合(基因)的片段，其中一個引物位于 戸M啟動子的末端(psbA230F: 5'-tttgtagaaaactagtgtgcttggg-3')，第二個引物以反 向位于終止子3'rbcL中(5'-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3')。觀察到約550 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物證實煙草葉綠體基因組中存在LPS::抑肽酶表達(dá)盒。擴(kuò)增包括30輪循環(huán)(94°C、 45秒，54°C、 60秒，72。C120秒)。對于該兩對引物之一，3種所選植物(APR20-1-2、 APR21-19-1和APR21-19-2)的PCR反應(yīng)呈陽性，證明它們是轉(zhuǎn)質(zhì)體，如預(yù)計的一樣整合了 pAPR20和pAPR21的表達(dá)盒。實施例7:抑肽酶的Western印跡分析在變性條件下通過SDS-PAGE分析抑肽酶的表達(dá)，然后進(jìn)行Western印跡。 將Tris-HCl 25mM、 NaCl 100 mM、 Triton X100 0.5%、甘油10%， pH8用作提 取緩沖液，從轉(zhuǎn)基因植物的液氮研磨葉片中提取可溶性總蛋白。然后通過 SDS-PAGE(12y。丙烯酰胺)分離各提取物的20微克可溶性蛋白(以布拉德福德試驗 (Bradford assay)定量測定)，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。該實驗還包括標(biāo)準(zhǔn)量的抑肽酶(200 ng;西格瑪公司(Sigma))以及野生煙草提取物。轉(zhuǎn)移后，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說 明書(羅氏公司(Roche))用封閉試劑封閉膜，然后在4T:用抗抑肽酶的小鼠單克 隆抗體溫育過夜。洗滌后，用抗小鼠免疫球蛋白并與堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二單 克隆抗體(西格瑪公司A3562)溫育膜。利用拜爾萊得公司(Biorad)(免疫星公司 (Immim-Star))的試劑盒顯示免疫復(fù)合物，用膠片記錄所產(chǎn)生的化學(xué)光 (chimioluminescence)。該實驗的結(jié)果明確顯示對于兩種類型的構(gòu)建物(pAPR20 禾口pAPR21)，可加工和切割LSP::抑肽酶融合蛋白，因為western印跡觀察到一 條獨特條帶精確遷移到與真品標(biāo)準(zhǔn)抑肽酶相同的位置。因此，能高效切除通過 Sec(pAPR20品系)或Tat途徑(pAPR21品系)將抑肽酶定位于內(nèi)腔的所選擇信號 肽。對于pAPR21品系，估計表達(dá)水平約是可溶性總蛋白質(zhì)的0.1-0.2%，對于 pAPR20品系約是0.5%。實施例8:重組抑肽酶的電噴霧LC/MS分析用PBS緩沖液從pAPR20和pAPR21載體所產(chǎn)生植物的轉(zhuǎn)基因葉片提取重組 抑肽酶，利用單克隆抗體免疫純化。分離的蛋白質(zhì)經(jīng)Ziptip層析柱處理(ziptiped) 以除去鹽，用Ionics EP- 10+ LC/MS/MS儀器分析。將分別對應(yīng)于pAPR20和pAPR21的樣品的LC/MS電噴霧圖譜與抑肽酶標(biāo)準(zhǔn)品的電噴霧圖譜作比較。對應(yīng)于pAPR20的樣品的LC/MS電噴霧圖譜顯示一個保留時間為3.31分 鐘的峰。該多電荷離子獲得的平均分子量是6532 ±2道爾頓。與標(biāo)準(zhǔn)抑肽酶相 比，質(zhì)量的差異有16道爾頓或一個氧原子的質(zhì)量。分離的抑肽酶看來被氧化。 對應(yīng)于pAPR21的樣品的LC/MS電噴霧圖譜顯示一個保留時間為3.36分鐘的 峰。該多電荷離子獲得的平均分子量是6516±1道爾頓。其質(zhì)譜就像標(biāo)準(zhǔn)抑肽 酶。這些實驗明確顯示植物中(planta)切割發(fā)生在信號肽與成熟抑肽酶之間的預(yù)計 位點，在N-末端精氮酸開始，還顯示其在氨基酸水平對應(yīng)于真品抑肽酶。樣品 pAPR20中的增補(bǔ)質(zhì)量(supplementary mass)是16，可能對應(yīng)于一個殘基的氧化， 可能是獨特的所編碼甲硫氨酸。實施例9:重組抑肽酶預(yù)與胰蛋白酶結(jié)合為檢測轉(zhuǎn)基因葉綠體中所產(chǎn)生的重組抑肽酶是否處于活性構(gòu)象，用PBS緩 沖液制備載體pAPR20和pAPR21所產(chǎn)生品系的葉片提取物，37'C使對應(yīng)于20 微克可溶性總蛋白質(zhì)的樣品與各種用量的胰蛋白酶(O、 28、 112、 450或1800 納克)溫育30分鐘。然后在非還原條件下采用SDS-PAGE分離樣品，利用抗抑 肽酶的單克隆抗體進(jìn)行western分析。對于兩種類型的提取物，該分析顯示一 旦向樣品中加入胰蛋白酶，即出現(xiàn)較高分子量的條帶。該新條帶對應(yīng)于抑肽酶 與胰蛋白酶的復(fù)合物。當(dāng)加入足夠胰蛋白酶時，沒有殘留游離的抑肽酶，只檢 測到該復(fù)合物。該實驗顯示含有載體pAPR20和pAPR21的質(zhì)體轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的所有重組 抑肽酶處于活性構(gòu)象，從而能結(jié)合胰蛋白酶。
權(quán)利要求
1. 一種嵌合型基因，其包含按照轉(zhuǎn)錄方向以功能方式彼此相連的a)在植物質(zhì)體中具有功能的啟動子，b)細(xì)胞所核編碼蛋白質(zhì)的甲硫氨酸N-末端內(nèi)腔靶向信號肽的編碼核酸序列，其翻譯融合于，c)編碼某肽的異源核酸序列，d)任選在植物細(xì)胞質(zhì)體中具有活性的終止子。
2. 如權(quán)利要求1所述的嵌合型基因，其特征在于，編碼內(nèi)腔靶向信號肽的所 述核酸序列來自利用Sec-依賴性途徑或Tat途徑轉(zhuǎn)運(yùn)通過類囊體膜的細(xì)胞核編碼蛋 白質(zhì)。
3. 如權(quán)利要求1-2中任一項所述的嵌合型基因，其特征在于，編碼某肽的 所述異源核酸序列編碼抑肽酶蛋白質(zhì)。
4. 一種指定用于轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體的載體，其特征在于，所述載體含有至少兩條 與待轉(zhuǎn)化植物原質(zhì)體系中序列同源的序列，所述同源序列側(cè)接至少一個如權(quán)利要求 1-3中任一項所述的嵌合型基因。
5. —種轉(zhuǎn)質(zhì)體植物細(xì)胞，其特征在于，所述植物細(xì)胞含有至少一個如權(quán)利 要求1-3中任一項所述的嵌合型基因。
6. —種包含如權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)質(zhì)體植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物和/或其后代。
7. 如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物和/或其后代，其特征在于，它們?yōu)樵孱悺?浮萍科、煙草屬植物、馬鈴薯、番茄或大豆植物。
8. 如權(quán)利要求6-7中任一項所述植物的可收獲部分，所述部分包含如權(quán)利 要求5所述的植物細(xì)胞。
9. 一種在植物細(xì)胞中制備感興趣蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟a) 用如權(quán)利要求1-2中任一項所述的嵌合型基因轉(zhuǎn)化質(zhì)體；b) 在適合于表達(dá)該嵌合型基因以及隨后信號肽切除的條件下培養(yǎng)含有所述轉(zhuǎn) 化質(zhì)體的植物細(xì)胞。
10. —種在植物質(zhì)體中產(chǎn)生非甲硫氨酸N-末端肽的方法，所述方法包括以下步驟a) 用如權(quán)利要求1-2中任一項所述的嵌合型基因轉(zhuǎn)化質(zhì)體，其中所述異源核酸序列編碼非甲硫氨酸N-末端肽；b) 在適合于表達(dá)該嵌合型基因以及隨后信號肽切除的條件下培養(yǎng)含有所述轉(zhuǎn) 化質(zhì)體的植物細(xì)胞。. '
11. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述非甲硫氨酸N-末端蛋白質(zhì)是抑肽酶。
12. —種制備感興趣肽的方法，所述方法包括以下步驟從如權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)質(zhì)體植物細(xì)胞，或如權(quán)利要求6-7中任一項所述轉(zhuǎn)質(zhì)體植物和/或其后代，或 如權(quán)利要求8所述轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的可收獲部分提取感興趣的肽。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述感興趣的肽是抑肽酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)質(zhì)體植物細(xì)胞的類囊體內(nèi)腔中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的構(gòu)建物和方法。此外，本發(fā)明涉及能在類囊體內(nèi)腔中表達(dá)感興趣基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物細(xì)胞和植物。
文檔編號C12N15/82GK101263229SQ200680033582
公開日2008年9月10日 申請日期2006年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日
發(fā)明者G·提索特-萊庫埃勒, H·嗄納德, M·杜巴爾德 申請人:拜爾農(nóng)科股份有限公司