亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的翻譯融合配偶體文庫(kù)和從中篩選的翻譯融合配偶體的制作方法

文檔序號(hào):432434閱讀:261來(lái)源:國(guó)知局

專(zhuān)利名稱(chēng)::用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的翻譯融合配偶體文庫(kù)和從中篩選的翻譯融合配偶體的制作方法用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的翻譯融合配偶體文庫(kù)和從中篩選的翻譯融合配偶體發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的領(lǐng)域是重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。特別是,本發(fā)明涉及快速篩選適合的翻譯融合配偶體(TFPs)的技術(shù),其中所述的翻譯融合配偶體(TFPs)能夠誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì),尤其是用常規(guī)重組制備方法難以生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。相關(guān)技術(shù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的重組體表達(dá)是廣泛應(yīng)用的用來(lái)生產(chǎn)大量用于研究目的或治療和其它商業(yè)用途的蛋白質(zhì)的方法。本領(lǐng)域公知多種重組體表達(dá)系統(tǒng),包括細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系統(tǒng),并且許多不同蛋白質(zhì)已在這些系統(tǒng)中成功生產(chǎn)。然而,還有許多蛋白質(zhì)使用現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)不易生產(chǎn),導(dǎo)致很少或沒(méi)有蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌。提高重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的分泌的方法,例如在宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)分泌因子、使用融合蛋白、其中該融合蛋白包含與良好分泌的蛋白質(zhì)融合的目標(biāo)蛋白質(zhì),以及添加合成的連接序列,已在特殊的目標(biāo)蛋白質(zhì)上取得一定成功。但是,還沒(méi)有對(duì)所有蛋白質(zhì)的分泌生產(chǎn)都確證有效的通用技術(shù)。在致力于鑒定分泌性蛋白質(zhì)和新信號(hào)序列的努力中已開(kāi)發(fā)了數(shù)個(gè)信號(hào)序列捕獲系統(tǒng)。美國(guó)專(zhuān)利6,228,590描述了一種篩選哺乳動(dòng)物信號(hào)序列的技術(shù),使用能與報(bào)告蛋白融合的含有哺乳動(dòng)物編碼序列的核酸轉(zhuǎn)化報(bào)告蛋白缺乏的酵母并檢測(cè)分泌了報(bào)告蛋白的細(xì)胞。一種使用缺乏轉(zhuǎn)化酶的酵母和轉(zhuǎn)化酶報(bào)告蛋白的類(lèi)似系統(tǒng)公開(kāi)于歐洲專(zhuān)利EP0907727中?;诮湍傅男盘?hào)序列捕獲已用于鑒定來(lái)自人DNA(Klein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7108(1996);Jacobs等人,Gene198:289(1997》、鼠DNA(Gallicioti等人,J.MembraneBiol.183:175(2001》、斑馬魚(yú)DNA(Crosier等人,Dev.Dynamics222:637(2001》、擬南芥DNA(Goo等人,PlantMol.Biol.41:415(1999》、馬鈴薯DNA(Surpili等人,AnaisdeAcademiaBrasileiradeCiencias74:599(2002))和白色念5朱菌DNA(Monteoliva等人,EukaryoticCell1:514(2002》的分泌蛋白。已開(kāi)發(fā)了使用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(Gallicioti等人,J.MembraneBiol.183:175(2001))和細(xì)菌宿主細(xì)胞(Ferguson等人,CancerRes.65:8209(2000))的類(lèi)似捕獲系統(tǒng)。已用于信號(hào)序列捕獲的報(bào)告蛋白包括轉(zhuǎn)化酶(Klein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7108(1996))、a-淀粉酶(美國(guó)專(zhuān)利6,228,590)、酸性磷酸酯酶(PH05)(Surpili等人,AnaisdeAcademiaBrasileiradeCiencias74:599(2002))和(3-內(nèi)酰胺酶(Ferguson等人,CancerRes.65:8209(2000》。證實(shí)翻譯融合配偶體(TFPs)對(duì)靶蛋白的分泌有效的方法公開(kāi)于WO2005/068658中。該方法包含(i)制備多個(gè)宿主細(xì)胞,所述的宿主細(xì)胞用包含核酸片段的文庫(kù)和編碼靶蛋白的核芬酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,其中編碼靶蛋白的核苷酸序列與編碼報(bào)告蛋白的核苷酸序列融合,其中所述的宿主細(xì)胞缺乏報(bào)告蛋白,和(ii)從宿主細(xì)胞中鑒定出TFP文庫(kù),其中該TFP文庫(kù)包含單獨(dú)誘導(dǎo)靶蛋白分泌的核酸片段。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種快速和有效的鑒定對(duì)誘導(dǎo)靶蛋白分泌有效的TFPs的自動(dòng)篩選方法。本發(fā)明允許宿主細(xì)胞分泌任何靶蛋白,包括使用常規(guī)重組表達(dá)系統(tǒng)不表達(dá)或僅低水平表達(dá)的l巴蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及鑒定靶蛋白特異的TFP的方法,所述方法包括(i)用多個(gè)線性載體和編碼靶蛋白的核酸序列共轉(zhuǎn)化多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞來(lái)制備多個(gè)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,其中每個(gè)所述的線性載體包含一個(gè)來(lái)自于核酸片段文庫(kù)中的核酸片段和一個(gè)編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核苷酸序列,和其中所述編碼耙蛋白的核酸序列在3'末端包含一個(gè)編碼N末端氨基酸的核苷酸序列,其中在所述線性載體內(nèi)所述報(bào)告蛋白上缺乏該N末端氨基酸;和在5'末端包含一個(gè)連接DNA;(ii)在允許所述線性載體和所述編碼靶蛋白的核酸序列體內(nèi)重組的有效條件下培養(yǎng)所述的多個(gè)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;(iii)從(ii)中的多個(gè)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中鑒定顯示報(bào)告蛋白活性的細(xì)胞;和(iv)從(iii)中鑒定的細(xì)胞中鑒定TFP;其中所述TFP包含誘導(dǎo)所述靶蛋白分泌的核酸片段。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及鑒定靶蛋白特異的TFP文庫(kù)的方法,所述方法包括(i)用多個(gè)線性載體和一個(gè)編碼靶蛋白的核酸序列共轉(zhuǎn)化多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞來(lái)制備多個(gè)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,其中每個(gè)所述的線性載體包含一個(gè)來(lái)自于核酸片段文庫(kù)中的核酸片段和一個(gè)編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核苷酸序列,和其中所述編碼靶蛋白的核酸序列在3'末端包含一個(gè)編碼N末端氨基酸的核苷S交序列,其中在所述線性載體內(nèi)所述報(bào)告蛋白上缺乏該N末端氨基酸;和在5'末端包含一個(gè)連接DNA;(ii)在允許所述線性載體和所述編碼靶蛋白的核酸體內(nèi)重組的有效條件下培養(yǎng)多個(gè)所述被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;(iii)從(ii)中的多個(gè)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中鑒定顯示報(bào)告蛋白活性的細(xì)胞;和(iv)從(iii)中鑒定的細(xì)胞中鑒定TFP文庫(kù);其中所述TFP文庫(kù)包含單獨(dú)誘導(dǎo)所述靶蛋白分泌的核酸片段。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的方法鑒定的一個(gè)TFP或TFPs文庫(kù)。本發(fā)明還包含編碼TFP的核酸片段或編碼TFPs的核酸片段文庫(kù)。本發(fā)明還包括一種核酸,該核酸包含編碼TFP的核苷酸序列和編碼靶蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的TFP制備靶蛋白的方法。本發(fā)明還涉及一種線性載體,該線性載體包括來(lái)自核酸片段文庫(kù)的核酸片段和編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還包含多個(gè)用線性載體和編碼本發(fā)明靶蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的上述和其它目的、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將在以下結(jié)合附圖的詳述中得到更好的理解。圖1顯示了刪除轉(zhuǎn)化酶基因的方法和可選標(biāo)記的敲除方法;圖2顯示了轉(zhuǎn)化酶活性的酶鐠分析(泳道1、2和3:野生型釀酒酵母菌Y2805;和泳道4、5和6:轉(zhuǎn)化酶缺失株(酉良酒酵母菌Y2805△suc2))。圖3以照片顯示了根據(jù)碳源酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況(SUC2:野生型釀酒酵母菌Y2805;和△suc2:轉(zhuǎn)化酶缺失抹(酉良酒酵母菌Y2805△suc2))。圖4顯示了轉(zhuǎn)化酶基因缺失的DNA印跡的結(jié)果(泳道1和2:釀酒酵母菌Y2805(ura3SUC2);泳道3和4:釀酒酵母菌Y2805△suc2U(URA3△suc2);和泳道5和6:釀酒酵母菌Y2805△suc2(ura3△suc2))。圖5以照片分別顯示了含有質(zhì)粒pYGAP-SNS-SUC2、pYGAP-HSA-SUC2和pYGAP-hlL2-SUC2的酵母細(xì)胞在葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。圖6顯示了含有多克隆位點(diǎn)以在GAL10啟動(dòng)子和成熟轉(zhuǎn)化酶基因間插入cDNA文庫(kù)的質(zhì)粒YGaINV的圖i普。圖7顯示了含有多克隆位點(diǎn)以在GAL10啟動(dòng)子和帶有三個(gè)不同讀碼框的成熟轉(zhuǎn)化酶基因間插入基因組DNA文庫(kù)的質(zhì)粒YGaF0INV、YGaFlINV和YGaF2INV的圖i脊。圖8顯示了用任意?1物合成cDNA文庫(kù)和在TFP選擇性載體YGaINV中構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法。圖9顯示了在TFP選擇性載體YGaF0INV、YGaFlINV和YGaF2INV中構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)的方法。圖10顯示了含有缺陷型SUC2的YGadV45和將TFP文庫(kù)亞克隆至YGadV45的質(zhì)粒圖譜。圖11顯示了使用TFP文庫(kù)中的轉(zhuǎn)化酶作為報(bào)告蛋白通過(guò)體內(nèi)重組的TFP選擇靶基因的方法。圖12顯示了使用TFP文庫(kù)中的雙報(bào)告蛋白,即脂肪酶和轉(zhuǎn)化酶作為報(bào)告蛋白通過(guò)體內(nèi)重組的TFP選擇靶基因的方法。圖13顯示了含有光環(huán)形成(haloforming)轉(zhuǎn)化抹的三丁酸甘油酯平板(A)直接來(lái)自轉(zhuǎn)化的光環(huán)形成平板(用三丁酸甘油酯的YPSGA)、(B)在三丁酸甘油酯平板上顯示不同光環(huán)大小的被選擇的轉(zhuǎn)化抹。圖14顯示了用選擇的9個(gè)TFPs構(gòu)建9個(gè)人IL2表達(dá)載體的方法。圖15顯示了人IL2表達(dá)載體的圖譜(A)pYGT9-IL2、(B)pYGT13-IL2和(C)pYGT17-IL2。圖16顯示了人IL2表達(dá)載體的圖譜(A)pYGT18-IL2,(B)pYGT19-IL2和(C)pYGT20-IL2。圖17顯示了人IL2表達(dá)載體的圖譜(A)pYGT21-IL2,(B)pYGT25-IL2和(C)pYGT27-IL2。圖18顯示了分泌人IL2的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE結(jié)果(泳道M:蛋白質(zhì)大小標(biāo)記;泳道l:含有pYIL-KRTl-4(WO2005/068658)作為IL2分泌對(duì)照的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道2:含有pYGT9-IL2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道3:含有pYGT21-IL2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道4:含有pYGT13-IL2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道5:含有pYGT17-IL2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道6:含有pYGT25-IL2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道7:含有pYGT19-IL2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道8:含有pYGT18-IL2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道9:含有pYGT27-IL2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清)。圖19顯示了用于人IL32a分泌的TFP選擇方法中獲得的38個(gè)酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE結(jié)果(泳道M:蛋白質(zhì)大小標(biāo)記;泳道N:作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞;泳道l-38:酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞)。圖20顯示了分泌人IL32a的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果(泳道M:蛋白質(zhì)大小標(biāo)記;泳道l:含有pYGT3-IL32a的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道2:含有pYGT21-IL32a的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道3:含有pYGT13-IL32a的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道4:含有pYGT25-IL32a的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道5:含有pYGT22-IL32a的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清和泳道6:含有pYGTll-IL32a的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清)。圖21顯示了(A)含有pYGT3-hlL32a的重組酵母菌株的分批補(bǔ)料發(fā)酵圖和(B)分析根據(jù)發(fā)酵時(shí)間分泌至培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果。圖22顯示了分泌人生長(zhǎng)激素的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE結(jié)果(泳道M:蛋白質(zhì)大小標(biāo)記;泳道N:作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道1:含有pYGTl-hGH的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道2:pYGT2-hGH;泳道3:pYGT3-hGH;泳道4:pYGT4-hGH;泳道5:pYGT5-hGH;泳道6:pYGT6-hGH;泳道7:pYGT7-hGH;泳道8:pYGT8-hGH;泳道9:pYGT9-hGH;泳道10:pYGT21-hGH;泳道11:pYGT13-hGH;泳道12:pYGT25-hGH;泳道13:pYGT17-hGH;泳道14:pYGT22-hGH;泳道15:pYGT32-hGH;泳道16:pYGT19-hGH;泳道17:pYGT27-hGH;泳道18:pYGTll-hGH;泳道19:pYGT40-hGH;泳道20:pYGT43-hGH;泳道21:pYGT44-hGH)。圖23顯示了(A)含有pYGT18-hGH的重組酵母菌抹的分批補(bǔ)料發(fā)酵的圖和(B)分析根據(jù)發(fā)酵時(shí)間分泌至培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果。圖24顯示了使用單向缺失方法從選擇的ORPs中構(gòu)建TFP文庫(kù)的方法。圖25顯示了隨機(jī)選擇的酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE結(jié)果,所述酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞用單向缺失的TFP文庫(kù)轉(zhuǎn)化,其中該單向缺失的TFP文庫(kù)用通過(guò)BLAST搜索選擇的ORFs構(gòu)建。圖26顯示了隨機(jī)選擇的酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE結(jié)果,所述酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞用單向缺失的TFP文庫(kù)轉(zhuǎn)化的,其中該單向缺失的TFP文庫(kù)由被選擇的35個(gè)ORFs構(gòu)建。圖27顯示了分泌人胰島素樣生長(zhǎng)因子的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡(抗MGF)結(jié)果(泳道M:蛋白質(zhì)大小標(biāo)記;泳道l:含有pYGa-MFa-hIGF的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液上清;泳道2:pYGa-Tla-IGF;泳道3:pYGa-T2a-IGF;泳道4:pYGa-T3a-IGF;泳道5:pYGa-T4a-IGF)。圖28顯示了用TFP載體轉(zhuǎn)化以分泌人胱天蛋白酶-1亞基PIO的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE結(jié)果(泳道M:蛋白質(zhì)大小標(biāo)記;泳道1:含有pYGTl-hP10的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道2:pYGT2-hP10;泳道3:pYGT3-hP10;泳道4:pYGT4-hP10;泳道5:pYGT5-hP10;泳道6:pYGT6-hP10;泳道7:pYGT7-hP10;泳道8:pYGT8-hP10;泳道9:pYGT9-hP10;泳道10:pYGT21-hP10;泳道11:pYGT13-hP10;泳道12:pYGT25-hP10;泳道13:pYGT17-hP10;泳道16:pYGT22-hP10;泳道18:pYGT18-hP10;泳道19:pYGT33-hP10;泳道20:pYGT19-hP10;泳道21:pYGT27-hP10;泳道22:pYGTll-hP10;泳道24:pYGT39陽(yáng)hP10;泳道25:pYGT40-hP10;泳道28:pYGT43-hP10;泳道29:pYGT44-hP10;泳道32:陰性對(duì)照)。圖29顯示了分泌人白細(xì)胞介素32y的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡(抗IL32)結(jié)果(泳道M:蛋白質(zhì)大小標(biāo)記;泳道C:作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道l:pYGTl-IL32y泳道2:pYGT2-IL32y;泳道3:pYGT3-IL32y;泳道4:pYGT4-IL32y;泳道5:pYGT5-IL32y;泳道6:pYGT6-IL32Y;泳道7:pYGT7-IL32Y;泳道8:pYGT8-IL32y;泳道9:pYGT9-IL32y;泳道10:pYGT21-IL32y;泳道11:pYGT13-IL32y;泳道12:pYGT25-IL32y;泳道13:pYGT17-IL32y;泳道16pYGT22-IL32y;泳道18:pYGT18-IL32y;泳道19:pYGT33-IL32y;泳道20pYGT19-IL32y;泳道21:pYGT27-IL32y泳道22:pYGTll-IL32y;泳道24pYGT39-IL32Y;泳道25:pYGT40-IL32Y;泳道28:pYGT43-IL32y;泳道29pYGT44-IL32y;泳道33:pYGT48-IL32y;泳道35:pYGT50-IL32y;泳道36pYGT51-IL32y;泳道37:pYGT52-IL32y;泳道39:pYGT54-IL32Y)。圖30顯示了分泌人白細(xì)胞介素-2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE結(jié)果(泳道M:蛋白質(zhì)大小標(biāo)記;泳道l:含有YGaSW-pSUN-IL2的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液上清;泳道2:YGaSW-pSED-IL2;泳道3:YGaSW-pUNK-IL2;泳道4:YGaSW-pMUC-IL2)。發(fā)明詳述本發(fā)明滿足了鑒定TFP的快速和有效的篩選技術(shù)的需求,特別適用于可最大分泌靶蛋白的靶蛋白。本發(fā)明對(duì)優(yōu)化任何蛋白質(zhì)的重組表達(dá)有效,尤其對(duì)由于在已知表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá)而不能大規(guī)模和/或低成本制備的蛋白質(zhì)的制備有效。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及鑒定靶蛋白特異的TFP的方法,所述方法包含(i)使用多個(gè)線性載體和編碼靶蛋白的核苷酸序列共轉(zhuǎn)化多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞來(lái)制備多個(gè)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,其中每個(gè)所述的線性載體包含一個(gè)來(lái)自于核酸片段文庫(kù)中的核酸片段和編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核香酸序列,和其中所述編碼靶蛋白的核普酸序列在3'末端包含一個(gè)編碼N末端氨基酸的核苷酸序列,其中在所述線性載體內(nèi)所述報(bào)告蛋白上缺乏該N末端氨基酸;和在5'末端包含一個(gè)連接DNA;(ii)在允許所述線性載體和所述編碼耙蛋白的核香酸序列體內(nèi)重組的有效條件下培養(yǎng)多個(gè)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;(iii)從(ii)中的多個(gè)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中鑒定顯示報(bào)告蛋白活性的細(xì)胞;和(iv)從(iii)中鑒定的細(xì)胞中鑒定TFP;其中所述TFP包含誘導(dǎo)所述靶蛋白分泌的核酸片段。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及鑒定靶蛋白特異的TFP文庫(kù)的方法,所述方法包含(i)用多個(gè)線性載體和編碼靶蛋白的核苷酸序列共轉(zhuǎn)化多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞來(lái)制備多個(gè)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,其中每個(gè)所述線性載體包含一個(gè)來(lái)自于核酸片段文庫(kù)的核酸片段和一個(gè)編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核苷酸序列,和其中所述編碼靶蛋白的核普酸序列在3'末端包含一個(gè)編碼N末端氨基酸缺失的核苷酸序列,其中在所述線性載體內(nèi)所述報(bào)告蛋白上缺乏該N末端氨基酸;和在5'末端包含一個(gè)連接DNA;(ii)在允許所述線性載體和所述編碼靶蛋白的核普酸序列體內(nèi)重組的有效條件下培養(yǎng)多個(gè)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;(iii)從(ii)中的多個(gè)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中鑒定顯示報(bào)告蛋白活性的細(xì)胞;和(iv)從(iii)中鑒定的細(xì)胞中鑒定TFP文庫(kù);其中所述TFP文庫(kù)包含單獨(dú)誘導(dǎo)所述靶蛋白分泌的核酸片段。核酸片段文庫(kù)可從任何類(lèi)型的DNA,包括基因組DNA、cDNA、合成DNA和重組DNA中獲得。除DNA外的核酸也可使用,包括RNA和非天然產(chǎn)生的核酸。19可從任何真核或原核生物,包括細(xì)菌、真菌(例如酵母)、植物和動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)中的DNA中鑒定TFPs。適合的細(xì)菌包括,但是不限于,埃希菌和桿菌屬。適合的酵母包括,但是不限于,念珠菌屬、德巴利酵母屬、漢森酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬、耶羅威亞酵母屬、酵母菌、許旺酵母屬和Arxula屬。具體種屬的實(shí)例包括產(chǎn)朊假絲酵母、博伊丁假絲酵母、白色念珠菌、產(chǎn)乳糖酶酵母、巴斯德畢赤酵母、木糖發(fā)酵酵母、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、多形漢森酵母、解脂耶氏酵母、西方許旺酵母和Arxulaadeninivorans。其它可作為DNA來(lái)源的真菌包括,但是不限于,曲霉屬、青霉屬、才艮霉屬和木霉屬。可作為DNA來(lái)源的植物包括,但是不限于,擬南芥、玉米、煙草和馬鈴薯。適合的動(dòng)物包括,但是不限于,人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓和猴。核酸片段可來(lái)源于生物體的完整基因組,例如完整基因組或cDNA文庫(kù)。這些片段還可來(lái)源于完整基因組的任何亞群,例如扣除文庫(kù)或限量文庫(kù)(sizedlibrary)。在一個(gè)實(shí)施方案中,核酸片段來(lái)源于預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù),例如包含已在先前篩選中鑒定了的TFPs文庫(kù)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)是已鑒定為對(duì)一個(gè)或多個(gè)靶蛋白有效TFPs的核心TFPs文庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)通過(guò)用多種包含核酸片段的文庫(kù)和編碼報(bào)告蛋白的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞、收集生長(zhǎng)的細(xì)胞、從細(xì)胞中分離出載體和從載體中分離出核酸片段,從而獲得包含單獨(dú)誘導(dǎo)報(bào)告蛋白分泌的核酸片段的TFP文庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)來(lái)源于在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了的序列,通過(guò)搜索(i)含有與那些預(yù)先鑒定了的一個(gè)或多個(gè)TFPs同源的前分泌(pre-secretion)信號(hào)的基因;(ii)包含分泌信號(hào)序列的基因;或(iii)編碼通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)的基因(例如細(xì)胞壁蛋白質(zhì)、分泌蛋白質(zhì)、質(zhì)膜蛋白質(zhì)、空泡蛋白質(zhì)、芽(bud)蛋白質(zhì))。在另一個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)改變預(yù)先鑒定了的TFPs,例如通過(guò)單向缺失、突變、添加功能序列(例如糖基化位點(diǎn))或TFPs間交換前(pre)和原(pro)信號(hào)序列獲得預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中,核酸片段的大小少于1000個(gè)堿基對(duì),例如少于700、500或300個(gè)石成基對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,核酸片段文庫(kù)通過(guò)酶裂解DNA、cDNA合成或重組DNA技術(shù)(例如單向缺失、誘變作用)構(gòu)建。本發(fā)明的線性載體可以是在被選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何載體。如本文所用,術(shù)語(yǔ)"載體"涉及能夠?qū)⒘硪粋€(gè)核酸運(yùn)送至其連接位置的核酸分子。一種載體是"質(zhì)粒",它是指能連接其它DNA片段的圓形雙鏈DNA環(huán)。另一種載體是病毒載體,其中其它DNA片段可連接到該病毒基因組中。某些載體能夠在其引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌的復(fù)制起始區(qū)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)一旦引入至宿主細(xì)胞后就整合至宿主細(xì)胞的基因組中從而隨著宿主基因組復(fù)制。本發(fā)明的載體能夠指導(dǎo)編碼與它們可操作性連接的靶蛋白的基因的表達(dá)。這些載體本文中稱(chēng)為"表達(dá)載體"。一般而言,在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本說(shuō)明書(shū)中,"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。但是,本發(fā)明也包括具有相同功能的其它形式的表達(dá)載體,例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。原核生物中蛋白質(zhì)的表達(dá)可用含有組成或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體進(jìn)行,它們能指導(dǎo)靶蛋白-報(bào)告蛋白融合的表達(dá)。適合的大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc(Amarann等人,Gene69:301-315(1988》和pET(Studier等人,GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(19卯)60-89)。為了在酵母細(xì)胞中表達(dá),適合的酵母表達(dá)載體包括,但是不限于,pYepSecl(BIadari等人,EMBOJ.6:229-234(1987》、pMFa(Kurjan等人,Cell30:933-943(1982》、pJRY88(Schultz等人,Gene54:113-123(1987》、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)和picZ(InvitrogenCorp.SanDiego,Cal.)。為了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá),可使用桿狀病毒表達(dá)載體??捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如SG9纟田胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人,Mol.Cell.Biol.3:2156-2165(1983》和pVL系列(Lucklow等人,Virology170:31-39(1989》。在另一個(gè)實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞而載體是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括pCDM8(Seed,Nature329:840(1987))和pMT2PC(Kaufman等人,EMBOJ.6:187-195(1987))。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí),表達(dá)載體的調(diào)控功能常常由病毒調(diào)控元件提供。例如,通常使用的啟動(dòng)子來(lái)源于多瘤腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。其它適合的用于原核和真核細(xì)胞兩者的表達(dá)系統(tǒng)參見(jiàn)例如Sambrook等人,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.第二版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989,第16和17章。優(yōu)選的載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、游離基因、病毒顆?;虿《竞驼系腄NA片段(例如通過(guò)同源重組整合至宿主基因組的片段)。優(yōu)選的病毒顆粒包括但不限于腺病毒、桿狀病毒、細(xì)小病毒、皰滲病毒、痘病毒、腺相關(guān)病毒、塞姆利基森林病毒、痘苗病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選的表達(dá)載體包括但不限于pcDNA3(Invitrogen)和pSVL(PharmaciaBiotech)。其它表達(dá)載體包括但不限于pSPORTTM載體、pGEM載體(Promega)、pPROEX載體(LTI,Bethesda,MD)、Bluescript載體(Stratagene)、pQE載體(Qiagen)、pSE420丁M(Invitrogen)和pYES2(Invitrogen)。在一個(gè)實(shí)施方案中,表達(dá)載體是復(fù)制型DNA構(gòu)建體,其中編碼靶蛋白的DNA序列可操作性的連接至能夠影響靶蛋白在適合的宿主中表達(dá)的適合的調(diào)控序列中。當(dāng)它們的功能彼此相關(guān)時(shí)DNA區(qū)域可操作性的連接。例如,啟動(dòng)子可操作性的連接于編碼序列如果該啟動(dòng)子能調(diào)控該編碼序列的轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增載體不需要表達(dá)調(diào)控域而更需要在宿主中進(jìn)行復(fù)制的能力,這通常由復(fù)制起始區(qū)決定和幫助轉(zhuǎn)化體識(shí)別的選擇基因。表達(dá)載體對(duì)調(diào)控序列的需要取決于選擇的宿主和選擇的轉(zhuǎn)化方法。一般來(lái)說(shuō),調(diào)控序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、控制轉(zhuǎn)錄的可選操縱子序列、多腺普酸化信號(hào)、編碼適合的結(jié)合核糖體的mRNA的序列和調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。這些調(diào)控序列描述于例如Goeddel,GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(19卯)。調(diào)控序列包括那些指導(dǎo)多種宿主細(xì)胞中的核苷酸序列組成型表達(dá)和那些僅在特定宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核香酸序列表達(dá)(例如組織特異性調(diào)控能夠序列)的調(diào)控序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)取決于所選擇的要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、預(yù)期的蛋白質(zhì)表達(dá)的水平等等這些因素。本發(fā)明的表達(dá)載體可?1入宿主細(xì)胞從而制備蛋白質(zhì)或肽,包括本文描述的核酸所編碼的融合蛋白或肽。優(yōu)選的載體優(yōu)選含有宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可以是原核、真核或病毒的。適合的原核序列的實(shí)例包括X噬菌體的PR和PL啟動(dòng)子(ThebacteriophageLambda,Hershey,AD.,Ed.,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY(1973),將其全文引入本文作為參考;LambdaII,Hendrix,R.W.,Ed"ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY(1980),將其全文引入本文作為參考);大腸桿菌的trp、recA、熱休克和lacZ啟動(dòng)子以及SV40早期啟動(dòng)子(Benoist等人,Nature,290:304-310(1981),將其全文引入本文作為參考)。對(duì)于酵母,適合的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于GAPDH、PGK、ADH、PH05、GAL1和GAL10。其它啟動(dòng)子包括但不限于小鼠乳腺瘤病毒、人免疫缺陷癥病毒長(zhǎng)末端復(fù)制、maloney病毒、巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子、EB病毒(EpsteinBarvims)、勞斯肉瘤病毒、人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸和人金屬硫蛋白。其它調(diào)控序列還可包括在優(yōu)選載體中。適合的調(diào)控序列的實(shí)例是噬菌體MS-2的復(fù)制酶基因和入噬菌體的cll基因的夏因-達(dá)爾加諾序列。此外,適合的表達(dá)載體可包括允許篩選轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的適當(dāng)標(biāo)記。選擇的宿主的轉(zhuǎn)化使用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和先前Sambrook等人描述的技術(shù)中的任意一種來(lái)進(jìn)行。復(fù)制起始區(qū)還可通過(guò)構(gòu)建載體以包括外源的起始區(qū)來(lái)提供或通過(guò)宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制提供。如果將載體整合入宿主細(xì)胞染色體,后者就足夠了。另外,相比使用含有病毒復(fù)制起始區(qū)的載體,本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用用選擇性標(biāo)記和靶蛋白DNA共轉(zhuǎn)化的方法來(lái)轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞。適合的標(biāo)記的一個(gè)實(shí)例是二氫葉酸還原酶(DHFR)或胸苷激酶(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,399,216)。編碼靶蛋白的核苷酸序列可用載體DNA利用常規(guī)技術(shù)重組,包括平末端或粘末端(staggered)連接、限制性酶消化來(lái)提供適當(dāng)?shù)哪┒?、適當(dāng)補(bǔ)平粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免非預(yù)期的連接以及用適當(dāng)連接酶連接。這些操作的技術(shù)先前由Sambrook等人公開(kāi)且在本領(lǐng)域內(nèi)公知。構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的方法公開(kāi)于例如Okayama等人,Mol.Cell.Biol.3:280(1983)、Cosman等人,Mol.Immunol.23:935(1986)、Cosman等人,Nature312:768(1984)、EP-A-0367566和WO91/18982,每篇均全文引入本文作為參考。本發(fā)明所用的宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何宿主細(xì)胞。適合的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、真菌、(例如酵母)、植物或動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng))細(xì)胞。適合的酵母細(xì)胞包括念珠菌屬、德巴利酵母屬、漢森酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬、耶羅威亞酵母屬、酵母菌、許旺酵母屬和Arxula屬。具體實(shí)例包括產(chǎn)朊假絲酵母、博伊丁假絲酵母、白色念珠菌、產(chǎn)乳糖酶酵母、巴斯德畢赤酵母、木糖發(fā)酵酵母、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、多形漢森酵母、解脂耶氏酵母、西方許旺酵母和Arxulaadeninivorans。其它適合的的真菌包括曲霉屬、青霉屬、根霉屬和木霉屬??捎米魉拗骷?xì)胞的細(xì)菌包括埃希菌屬、假單胞桿菌屬和桿菌屬。適合的植物宿主細(xì)胞包括擬南芥、玉米、煙草和馬鈴薯。動(dòng)物細(xì)胞包括人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、猴和昆蟲(chóng)。實(shí)例包括CHO、COSl、COS7、BSCl、BSC40、BMT10和Sf9細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞,核酸片段分離自酵母的基因組或cDNA。本發(fā)明的多聚核苷酸可引入宿主細(xì)胞作為環(huán)狀質(zhì)粒的部分或作為包含分離蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的線性DNA或病毒載體。本領(lǐng)域眾所周知且常規(guī)進(jìn)行的引入DNA至宿主細(xì)胞的方法包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔法、核注射或與載體例如脂質(zhì)體、膠束、血影細(xì)胞和原生質(zhì)體融合。任何可快速有效檢測(cè)的報(bào)告蛋白可用于本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施方案中,為了使篩選過(guò)程自動(dòng)化,報(bào)告蛋白具有確定選擇的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中,報(bào)告蛋白是分泌至細(xì)胞外間隙的蛋白質(zhì),例如轉(zhuǎn)化酶、蔗糖酶、纖維素酶、木聚糖酶、麥芽糖酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖苷酶(例如a-半乳糖普酶、(3-半乳糖苷酶、蜜二糖酶)、磷酸酶(例如PH05)、卩-內(nèi)酰胺酶、脂肪酶或蛋白酶。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,分泌蛋白允許細(xì)胞在特定底物上生長(zhǎng)。作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的報(bào)告基因系統(tǒng)的實(shí)例,CD2/新霉素-磷酸轉(zhuǎn)移酶(Ceo)基因可用作含有抗生素G418的培養(yǎng)基中的分泌報(bào)告基因以捕獲在小鼠胚胎干細(xì)胞中分泌通路基因(De-Zolt等人,NucleicAcidRes.34:e25(2006))。在一個(gè)實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞是酵母,報(bào)告蛋白是轉(zhuǎn)化酶,轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞根據(jù)它們?cè)谡崽腔蛎廴巧仙L(zhǎng)的能力來(lái)選擇。在另一個(gè)實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞是酵母,報(bào)告蛋白是蜜二糖酶,轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞根據(jù)它們?cè)诿鄱巧仙L(zhǎng)的能力來(lái)選擇。在另一個(gè)實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞是酵母,報(bào)告蛋白是淀粉酶(例如內(nèi)淀粉酶、外淀粉酶、p-淀粉酶或葡萄糖淀粉酶),酵母細(xì)胞是非淀粉分解的,轉(zhuǎn)化的細(xì)胞根據(jù)它們降解淀粉的能力來(lái)篩選。在另一個(gè)實(shí)施方案中,鑒定顯示報(bào)告蛋白活性的細(xì)胞的步驟通過(guò)使用具有生長(zhǎng)抑制因子抗性的報(bào)告蛋白來(lái)進(jìn)行,例如抗生素。在另一個(gè)實(shí)施方案中,報(bào)告蛋白是能夠視覺(jué)上檢測(cè)的蛋白質(zhì),例如綠色熒光蛋白或熒光素酶。在一個(gè)實(shí)施方案中,鑒定顯示報(bào)告蛋白活性的細(xì)胞的步驟通過(guò)使用兩個(gè)或多個(gè)報(bào)告蛋白例如脂肪酶和轉(zhuǎn)化酶來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的宿主細(xì)胞不顯示報(bào)告蛋白活性。在一個(gè)實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞不天然表達(dá)報(bào)告蛋白。在其它實(shí)施方案中,編碼報(bào)告蛋白的基因(們)已被全部或部分刪除或已突變以使得報(bào)告蛋白不表達(dá)或以無(wú)活性形式表達(dá)。使一個(gè)細(xì)胞缺乏一種特殊的蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)公知,并且任何此種方法可用來(lái)制備本發(fā)明的宿主細(xì)胞(前述Sambrook等人)。對(duì)于酵母來(lái)說(shuō),報(bào)告蛋白缺乏可使用公知的基因置換技術(shù)來(lái)引入(Rothstein,Meth.Enzymol.194:281(1991))。本發(fā)明的線性載體包含核酸片段和編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核苷酸序列。N末端氨基酸缺失可包含任意數(shù)目的氨基酸只要該缺失足夠基本上消除報(bào)告蛋白活性即可。例如,缺失可在報(bào)告蛋白N末端包含大約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50或更多氨基酸。本發(fā)明的方法可使用預(yù)期高水平重組表達(dá)的任何靶蛋白。靶蛋白可以是用來(lái)進(jìn)行研究目的或?yàn)樯虡I(yè)目的所制備的,例如治療或工業(yè)用途。靶蛋白可來(lái)自于任何植物、動(dòng)物或微生物,可天然產(chǎn)生或以任何途徑修飾,只要它能被核酸編碼即可。在一個(gè)實(shí)施方案中,靶蛋白是人蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,靶蛋白是細(xì)胞因子、血清蛋白、集落刺激因子、生長(zhǎng)因子、激素或酶。例如,靶蛋白可選自白細(xì)胞介素、凝結(jié)因子、干擾素-a、-(3或1、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組織生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子、TGFa、TGF卩、表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促卵泡激素、促曱狀腺激素、血管升壓素、色素性激素、曱狀旁腺激素、促黃體生成激素釋放激素、碳水化合物特異性酶、蛋白水解酶、脂肪酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶、免疫球蛋白、細(xì)胞因子受體、乳鐵蛋白、磷脂酶A2激活蛋白、胰島素、腫瘤壞死因子、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、腦啡肽、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、促紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、絨毛膜促性腺激素、組織纖溶酶原激活物、生長(zhǎng)激素釋放肽、胸腺體液因子、抗癌肽或抗菌肽。具體實(shí)例包括但不限于人白細(xì)胞介素-2、人白細(xì)胞介素-l卩、人白細(xì)胞介素-6、人白細(xì)胞介素-32a、-32(3或-32y、VII因子、VIII因子、IX因子、人血清白蛋白、人干擾素-a、-(3或-y、人粒細(xì)胞集落刺激因子、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、人生長(zhǎng)激素、人血小板衍生生長(zhǎng)因子、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人表皮生長(zhǎng)因子、人胰島素樣生長(zhǎng)因子、人神經(jīng)生長(zhǎng)因子、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩-1、人促卯泡激素、葡萄糖氧化酶、glucodase、半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、葡糖醛酸糖苦酶、門(mén)冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨基酶、過(guò)氧化物歧化酶、endotoxinase、過(guò)氧化氫酶、糜蛋白酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、膽紅素氧化酶、牛1-磷酸半乳糖尿甘酸轉(zhuǎn)移酶、水母綠色熒光蛋白、南極假絲酵母脂肪酶B、假絲酵母脂肪酶、真菌氯過(guò)氧化物酶、p-半乳糖苷酶、解離酶、a-半乳糖苦酶、(3-葡萄糖苷酶、海藻糖合酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、木聚糖酶、植酸酶、人乳鐵蛋白、人促紅細(xì)胞生成素、人對(duì)氧磷酶、人生長(zhǎng)分化因子15、人半乳凝素-3結(jié)合蛋白、人絲氨酸蛋白酶抑制劑、Kunitz2型、人Janus激酶2、人fms-like酪氨酸激酶3配體、人YM1&2、人CEMI、人二?;视王;D(zhuǎn)移酶、人瘦蛋白、人mL259、人蛋白水解酶3、人溶菌酶、人DEADbox蛋白41、人依托泊芬誘導(dǎo)蛋白24、鼠細(xì)胞凋亡蛋白酶l、牛血管生成因子和蚯到封l激酶。在一個(gè)實(shí)施方案中,靶蛋白是用常規(guī)重組生產(chǎn)方法難以生產(chǎn)的蛋白質(zhì),即根本不生產(chǎn)或僅低水平生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,靶蛋白是使用已知表達(dá)系統(tǒng)容易產(chǎn)生但希望獲得較高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)。編碼靶蛋白的核酸可使用本領(lǐng)域公知的常規(guī)技術(shù)從任何來(lái)源獲得,包括從基因組或cDNA文庫(kù)中分離出來(lái)、PCR擴(kuò)增或化學(xué)合成。本發(fā)明的方法使用的編碼靶蛋白的核普酸序列在5'末端包含連接DNA,該連接DNA用于用本發(fā)明的線性載體進(jìn)行體內(nèi)重組,并在3'末端包含編碼報(bào)告蛋白N末端部分的核苷酸序列,包括線性載體缺失的N末端氨基酸和足夠的其它氨基酸以允許編碼扭蛋白的核苷酸序列和線性載體在共轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞時(shí)在體內(nèi)重組。在一個(gè)實(shí)施方案中,編碼報(bào)告蛋白N末端部分的序列包含至少20個(gè)與線性載體內(nèi)編碼報(bào)告蛋白的序列重疊的堿基對(duì),例如至少30或40個(gè)堿基對(duì)。將5'連接子和3'報(bào)告蛋白序列加入至編碼乾蛋白的核苷酸序列可使用常規(guī)重組DNA技術(shù)來(lái)進(jìn)行,例如PCR和/或限制性酶切割和連接。本發(fā)明的連接DNA必須有足夠長(zhǎng)度和足夠與線性載體的部分核苷酸序列相同的序列以允許編碼靶蛋白的核苷酸序列和線性載體在共轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞時(shí)在體內(nèi)重組。在一個(gè)實(shí)施方案中,連接DNA的長(zhǎng)度超過(guò)20個(gè)堿基對(duì),例如長(zhǎng)度超過(guò)30或40個(gè)堿基對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,連接DNA與線性載體上的相應(yīng)序列有至少80%相同,例如至少85%、90%、95%或99%相同。在一個(gè)實(shí)施方案中,連接DNA編碼蛋白酶識(shí)別序列從而允許在TFP和靶蛋白的接點(diǎn)處斷裂。例如,連接DNA可編碼酵母樣kex2p-或Kex2-蛋白酶識(shí)別序列(例如包含Lys-Arg、Arg-Arg或Leu-Asp-Lys-Arg(SEQIDNO:214)的氨基酸序列)、哺乳動(dòng)物弗林(furin)蛋白酶識(shí)別序列(例如包含Arg-X-X-Arg的氨基酸序列)、Xa因子識(shí)別序列(例如包含Ile-Glu-Gly-Arg(SEQIDNO:215)的氨基酸序列)、腸激酶識(shí)別序歹'K例如包含Asp-Asp-Lys的氨基酸序列)、枯草桿菌蛋白酶識(shí)別序歹'J(例如包含Ala-Ala-His-Tyr(SEQIDNO:216)的氨基酸序列)、煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列(例如包含Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(SEQIDNO:217)的氨基酸序列)、遍在蛋白質(zhì)水解酶識(shí)別序列(例如包含Arg-Gly-Gly的氨基酸序列)或凝血酶識(shí)別序列(例如包含Arg-Gly-Pro-Arg(SEQIDNO:218)的氨基酸序列)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,連接DNA編碼親合標(biāo)簽、例如GST、MBP、NusA、硫氧還蛋白、遍在蛋白質(zhì)、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD或S-標(biāo)簽。在另一個(gè)實(shí)施方案中,連接DNA編碼限制性酶識(shí)別位點(diǎn),例如SfiI位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,連接DNA編碼限制性酶識(shí)別位點(diǎn)和蛋白酶識(shí)別序列(例如類(lèi)kex2p-蛋白酶-或kex-2p-識(shí)別序列)。本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的TFP或其衍生物或片段。在一個(gè)實(shí)施方案中,TFP選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP墨20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-1l(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP匿52(SEQIDNO:137)、TFP匿54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP-5(SEQIDNO:200)、TFP-6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)和PpTFP-4(SEQIDNO:90)組成的組或其衍生物或片段。本發(fā)明還涉及TFP文庫(kù),該TFP文庫(kù)包含兩種或多種通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的TFPs或其片段或衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中,TFP文庫(kù)包含鑒定為對(duì)特殊靶蛋白有效的TFPs。在另一個(gè)實(shí)施方案中,TFP文庫(kù)包含鑒定為對(duì)超過(guò)一個(gè)靶蛋白有效的TFPs。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,TFP文庫(kù)包含兩個(gè)或更多(例如4、6、8、10或12或更多)選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-11(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP-52(SEQIDNO:137)、TFP-54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP-5(SEQIDNO:200)、TFP-6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)和PpTFP-4(SEQIDNO:90)組成的組或其衍生物或片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中,TFP文庫(kù)包含六個(gè)或更多(例如8、10、12或15或更多)選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-1l(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP-52(SEQIDNO:137)、TFP-54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP-5(SEQIDNO:200)、TFP-6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP墨3(SEQIDNO:88)、PpTFP-4(SEQIDNO:90)、TFP-1(SEQIDNO:219)、TFP-2(SEQIDNO:221)、TFP-3(SEQIDNO:223)、TFP-4(SEQIDNO:225)和TFP32(SEQIDNO:208)組成的組的TFPs或其衍生物或片段。個(gè)實(shí)施方案中,核酸編碼的TFP選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-ll(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP陽(yáng)52(SEQIDNO:137)、TFP-54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP陽(yáng)5(SEQIDNO:200)、TFP-6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)和PpTFP-4(SEQIDNO:90)組成的組或其衍生物或片段。在一個(gè)實(shí)施方案中,核酸包含選自由SEQIDNOS:30、32、34、36、38、40、42、44、46、62、64、66、68、70、85、87、89、91、130、132、134、136、138、140、176、178、180、182、184、186、201、203、205或207組成的組的核苷S吏序列或其衍生物或片段。本發(fā)明還涉及編碼兩個(gè)或多個(gè)用本發(fā)明的方法鑒定的TFPs或其衍生物或片段的核酸文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中,該核酸文庫(kù)編碼鑒定為對(duì)特殊靶蛋白有效的TFPs。在另一個(gè)實(shí)施方案中,該核酸文庫(kù)編碼鑒定為對(duì)超過(guò)一個(gè)靶蛋白有效的TFPs。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,該核酸文庫(kù)編碼兩個(gè)或更多TFPs(例如4、6、8、10或12或更多),選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-1l(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP-52(SEQIDNO:137)、TFP-54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP-5(SEQIDNO:200)、TFP-6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP鄰EQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)和PpTFP-4(SEQIDNO:90)組成的組或其衍生物或片段。在一個(gè)實(shí)施方案中,核酸文庫(kù)包含兩個(gè)或更多(例如4、6、8、10或12或更多)SEQIDNOS:30、32、34、36、38、40、42、44、46、62、64、66、68、70、85、87、89、91、130、132、134、136、138、140、176、178、180、182、184、186、201、203、205或207的核香酸序列或其衍生物或片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中,核酸文庫(kù)編碼六個(gè)或更多(例如8、10、12或15或更多)TFPs,該TFPs選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-11(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP-52(SEQIDNO:137)、TFP-54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP鄰EQIDNO:200)、TFP陽(yáng)6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)、PpTFP-4(SEQIDNO:90)、TFP-1(SEQIDNO:219)、TFP-2(SEQIDNO:221)、TFP-3(SEQIDNO:223)、TFP-4(SEQIDNO:225)和TFP32(SEQIDNO:208)組成的組或其衍生物或片段。在一個(gè)實(shí)施方案中,核酸文庫(kù)包含六個(gè)或更多(例如8、10、12或15或更多)SEQIDNOS:30、32、34、36、38、40、42、44、46、62、64、66、68、70、85、87、89、91、130、132、134、136、138、140、176、178、180、182、184、186、201、203、205、29207、209、220、222、224或226的核苷酸序列或其衍生物或片段。術(shù)語(yǔ)"其片段",正如TFP所使用的,是指包括TFP氨基酸序列的任何部分的多肽,其中該片段基本上保留誘導(dǎo)與其融合的靶蛋白的分泌的能力。術(shù)語(yǔ)"其衍生物",正如TFP所使用的,是指由與TFP的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列組成的多肽,其中該多肽基本上保留誘導(dǎo)與其融合的靶蛋白分泌的能力。在一些實(shí)施方案中,該衍生物包含與TFP的氨基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。該衍生物還可包含對(duì)TFP氨基酸序列的增加、刪除、取代或組合。增加或取代還包括使用非天然產(chǎn)生氨基酸。取代優(yōu)選保守氨基酸取代。"保守氨基酸取代"是指氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族本領(lǐng)域內(nèi)已有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸),酸性側(cè)鏈(例如門(mén)冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天門(mén)冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、p-支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。術(shù)語(yǔ)"其衍生物",正如編碼TFP的核酸的所使用的,是指由與編碼TFP的核酸的核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列組成的核酸,其中該衍生物編碼的多肽基本上保留了誘導(dǎo)與其融合的靶蛋白分泌的能力。在一些實(shí)施方案中,該衍生物包含與編碼TFP的核酸的核苷酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、%%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列。該衍生物可能包含編碼TFP的核酸的核苷酸序列的添加、刪除、取代、或其組合。序列相同性通過(guò)比較兩個(gè)在比較區(qū)域進(jìn)行最佳排列的序列、確定相同氨基酸殘基或核苦酸在兩個(gè)序列中所處位置的數(shù)目以獲得匹配位置的數(shù)目、用比較區(qū)域(例如窗口大小)的位置的總數(shù)目除匹配位置的數(shù)目并使結(jié)果乘100來(lái)獲得序列相同性的百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算。一方面,當(dāng)長(zhǎng)度為IOO個(gè)氨基酸或核苦酸的四個(gè)空位引入可使對(duì)準(zhǔn)最大化時(shí),相同性百分比的計(jì)算是指兩個(gè)序列中的較小序列氨基酸殘基或核苷酸的百分?jǐn)?shù),其中所述的兩個(gè)序列以被比序列中的相同氨基酸殘基或核苷酸對(duì)準(zhǔn)(Dayhoff,inAtlasofProteinSequenceandStructure,Vol.5,p.124,NationalBiochemicalResearchFoundation,Washington,D.C.(1972),引入本文作為參考)。相同性的確定通常通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)同源性程序進(jìn)行。范例程序是Gap程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version830forUNIX,GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,Madison,WI)j吏用,f夫iLi殳置,應(yīng)用SmithandWaterman算法(Adv.Appl.Math.,1981,2:482-489,全文引入本文作為參考)。衍生物的實(shí)例包括但不限于缺失突變(例如單向缺失)、功能序列的增加(例如糖基化位點(diǎn)、限制性酶切位點(diǎn))和在TFPs中確定的前序列或原序列的刪除或增加(例如交換)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用常規(guī)誘變技術(shù)制備TFPs衍生物或編碼TFPs的核酸,例如上述引用的參考文獻(xiàn)所描述的那些,和鑒定基本上保留誘導(dǎo)與其融合的靶蛋白分泌能力的衍生物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"基本上保留誘導(dǎo)與其融合的靶蛋白分泌能力"是指保留原始TFP誘導(dǎo)與其融合的靶蛋白分泌能力至少50%的TFP片段或衍生物。在一些實(shí)施方案中,至少保留60、65、70、75、80、85、卯或95%誘導(dǎo)與其融合的靶蛋白分泌能力。誘導(dǎo)靶蛋白分泌的能力可通過(guò)本領(lǐng)域公知和前述的常規(guī)技術(shù)來(lái)確定。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及編碼TFPs的核酸片段文庫(kù),包含10個(gè)或更多由本發(fā)明的方法鑒定的核酸片段(例如50、100、500、1000或2000或更多),其中篩選中使用預(yù)先選擇的候選TFPs文庫(kù)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及編碼TFPs的核酸片段文庫(kù),包含10個(gè)或更多由本發(fā)明的方法鑒定的核酸片段(例如50或100或更多),其中篩選中使用的預(yù)先選擇的候選TFPs文庫(kù)是通過(guò)轉(zhuǎn)化多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞,收集生長(zhǎng)的細(xì)胞、從細(xì)胞中分離出載體、并從載體中分離出核酸片段而獲得的,其中所述的多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞用多種包含核酸片l殳的文庫(kù)和編碼報(bào)告蛋白的核苷酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化,從而獲得包含單獨(dú)誘導(dǎo)才艮告蛋白分泌的核酸片段的TFP文庫(kù)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及編碼TFPs的核酸片段文庫(kù),包含10個(gè)或更多本發(fā)明的方法鑒定的核酸片l殳(例如50、100、500或1000或更多),其中用于篩選的預(yù)先選擇的候選TFPs文庫(kù)來(lái)自于在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)搜索(i)含有與一個(gè)或多個(gè)先前鑒定的TFPs同源的前分泌信號(hào)的基因;(ii)包含分泌信號(hào)序列的基因,或(iii)編碼穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)的基因而鑒定的序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及編碼TFPs的核酸片段文庫(kù),包含10個(gè)或更多本發(fā)明的方法鑒定的核酸片段(例如50、100、500或更多),其中用于篩選的預(yù)先選擇的候選TFPs文庫(kù)通過(guò)改變先前鑒定的TFPs獲得。本發(fā)明還涉及包含編碼用本發(fā)明的方法鑒定的TFP的核苷酸序列和編碼靶蛋白的核苷酸序列的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中,TFP選自由TFP-9、TFP-13、TFP-17、TFP-18、TFP-19、TFP-20、TFP-21、TFP陽(yáng)25、TFP-27、TFP-ll、TFP-22、TFP-29、TFP-34、TFP-38、TFP-39、TFP-43、TFP-44、TFP-48、TFP-52、TFP-54、TFP-40、TFP墨50、TFP-51、TFP-57、TFP-58、TFP-59、TFP-5、TFP-6、TFP-7和TFP-8或其衍生物或片段組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中,靶蛋白選自IL-2、IL-32、人生長(zhǎng)激素和人胱天蛋白酶-1亞基PIO。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,TFP是TFP-9、TFP-13、TFP-17、TFP-18、TFP匿19、TFP-20、TFP-21,TFP-25、TFP-27、PpTFP-l、PpTFP-2、PpTFP-3、PpTFP-4或其衍生物或片段,并且革巴蛋白是IL-2。在另一個(gè)實(shí)施方案中,TFP是TFP-ll、TFP-22、TFP-29、TFP-34或TFP-38或其衍生物或片段,并且靶蛋白是IL-32cc。在另一個(gè)實(shí)施方案中,TFP是TFP-9、TFP-13、TFP-17、TFP-18、TFP-19、TFP-20、TFP-21、TFP-25、TFP-27、TFP-ll、TFP-22、TFP-29、TFP-34或TFP-38或其衍生物或片段,并且把蛋白是生長(zhǎng)激素。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的TFPs重組生產(chǎn)靶蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中,該方法包含制備載體,所述載體包含編碼耙蛋白的核苷酸序列,該核苷酸序列可操作性的連接至編碼TFP或其衍生物或片段的核苷酸序列、用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,并在宿主細(xì)胞生成和分泌靶蛋白的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中,TFP選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDN0:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-ll(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP-52(SEQIDNO:137)、TFP陽(yáng)54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP-5(SEQIDNO:200)、TFP-6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)和PpTFP-4(SEQIDNO:90)或其衍生物或片段組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中,靶蛋白選自IL-2、IL-32、人生長(zhǎng)激素和人胱天蛋白酶-1亞基PIO。靶蛋白可使用任何本領(lǐng)域已知表達(dá)系統(tǒng)重組生產(chǎn)。靶蛋白優(yōu)選重組表達(dá)例如在細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中。重組表達(dá)包括制備包含編碼靶蛋白的多核苷酸的載體、運(yùn)送載體至宿主細(xì)胞、在靶蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞和分離靶蛋白。制備重組載體和使用同樣的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、在宿主細(xì)胞中復(fù)制載體和表達(dá)生物活性外源多肽和蛋白質(zhì)的方法和材料在前面討論且描述于Sambrook等人,MolecularCloning,第三X反,ColdSpringHarborLaboratory,2001禾口Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,第三版,(2000),均引入本文作為參考?;?和"轉(zhuǎn)染"是指多種將外源核酸(例如DNA)引入宿主細(xì)胞的本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù),包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或電穿孔法。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適合方法可見(jiàn)于Sambrook等人(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.第二版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989)和其它實(shí)-驗(yàn)手冊(cè)。為了使哺乳動(dòng)物細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,眾所周知根據(jù)使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù),僅有很小部分的細(xì)胞可將外源DNA整合至其基因組中。為了鑒定和選擇這些整合體,編碼可選標(biāo)記(例如抗生素抗性)的基因通常隨著目的基因引入宿主細(xì)胞。多種可選標(biāo)記包括那些對(duì)藥物具有抗性的試劑,例如G418、潮霉素和曱氨喋呤。編碼可選標(biāo)記的核酸可用與編碼靶蛋白相同的載體引入宿主細(xì)胞或可用單獨(dú)載體引入。用引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可用藥物選擇來(lái)鑒定(例如結(jié)合有可選標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活而其它細(xì)胞死亡)。靶蛋白可從宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中分離出來(lái),通過(guò)本領(lǐng)域已知的純化方法例如常規(guī)色譜方法包括免疫親和層析法、受體親和層析法、疏水作用色譜法、凝集素親和層析法、尺寸排阻過(guò)濾法、陽(yáng)離子或陰離子交換色譜法、高壓液相色譜法(HPLC)、反相HPLC等等。其它純化方法還包括那些預(yù)期蛋白質(zhì)作為融合蛋白被表達(dá)和純化的方法,其中所迷的融合蛋白具有特珠標(biāo)簽、標(biāo)記或被特殊結(jié)合配偶體或試劑識(shí)別的螯合部分。經(jīng)純化的蛋白質(zhì)可斷裂以獲得預(yù)期蛋白,或可作為完整的融合蛋白被保存。作為斷裂過(guò)程的結(jié)果,融合組分的斷裂可生成具有其它氨基酸殘基的預(yù)期蛋白質(zhì)形式。如果被分離的耙蛋白在使用分離操作后沒(méi)有生物活性,可使用多種方法使多肽發(fā)生"重折疊"或轉(zhuǎn)化成其三級(jí)結(jié)構(gòu)并生成二硫鍵使之恢復(fù)生物活性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法包括在特定濃度促溶劑存在下將溶解的多肽的pH調(diào)節(jié)至通常大于7。促溶劑的選擇類(lèi)似于包涵體增溶作用的選擇,但是通常濃度較低且不必要和增溶作用使用同種促溶劑??赡苄枰褂眠€原劑或特殊比例的還原劑和其氧化形式以得到特殊氧化還原電位使蛋白質(zhì)的半胱氨酸橋形成中發(fā)生二硫鏈的轉(zhuǎn)移。一些常用的氧化還原對(duì)包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH)/二硫代谷胱甘肽、氯化銅、二硫蘇糖醇(DTT)/二噻烷DTT、2-巰基乙醇(bME)/二硫代-b(ME)。為了增加重折疊效率,使用助溶劑例如丙三醇、多種分子量的聚乙二醇和精氨酸可能是必須的。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及線性載體,所述的線性載體包含來(lái)自核酸片段文庫(kù)的核酸片段和編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中,該線性載體還包含編碼耙蛋白的核普酸序列。本發(fā)明還涉及多個(gè)用本發(fā)明的線性載體庫(kù)轉(zhuǎn)化的報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中,該宿主細(xì)胞還用編碼萃巴蛋白的核酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。下列實(shí)施例說(shuō)明但不限制本發(fā)明的方法和組合物。其他的對(duì)在臨床治療中一般遇到的各種條件和參數(shù)的適當(dāng)?shù)男薷暮透倪M(jìn)且它們是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的也在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。實(shí)施例1轉(zhuǎn)化酶缺乏的酵母突變體的制備為了快速篩選無(wú)法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的翻譯融合配偶體(TFP),建立了一種自動(dòng)篩選系統(tǒng),它使用酵母轉(zhuǎn)化酶作為報(bào)告蛋白來(lái)評(píng)價(jià)在蔗糖培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。為了正確稀選出有用的TFP,需要不具有轉(zhuǎn)化酶活性的酵母菌抹使用轉(zhuǎn)化酶基因作為報(bào)告基因。因此,野生型酵母的染色體SUC2基因被刪除。為了制備SUC2缺失盒,質(zhì)粒pRB58(Carlson等人,Cell20:145(1982))用EcoRI和Xhol消化,并使SUC2編碼基因恢復(fù)且將其引入pBluescriptKS+(Stratagene,USA)的EcoRI-XhoI位點(diǎn),從而生成pBIABX。如圖l所示,在兩個(gè)末端具有190bp重復(fù)序列(Tcl90)(Bae等人,Yeast21:437(2004》的URA3基因插入含在pBIABX中的SUC2基因的HindIII-XbaI位點(diǎn),從而生成pBIU。pBIU用EcoRI和Xhol消化,并根據(jù)醋酸鋰方法(Hill等人,NucleicAcidsRes.19:5791(1991))將其轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805(Mataura3SUC2pep4::HIS3GALIcanl)和Y2805Agall(Mataura3SUC2pep4::HIS3gallcanl)抹中(SKRhee,KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞Y2805Asuc2U(Matasuc2::URA3pep4::HIS3GALIcanl)、Y2805AgallAsuc2U(Matasuc2::URA3pep4::HIS3gallcanl)在缺乏尿嘧啶的選擇培養(yǎng)基中被選擇出來(lái)。為了評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化酶活性,分別在含有葡萄糖和蔗糖作為唯一碳源的兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)單一菌落。結(jié)果,與對(duì)照相比菌落在葡萄糖培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)但在蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)非常緩慢。為了研究分泌至培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化酶的數(shù)量,SUC2+抹和Asuc2林在YPD培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨和2%葡萄糖)中培養(yǎng)。培養(yǎng)液上清中含有的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分離,并且將凝膠在蔗糖溶液中培養(yǎng)30分鐘而后用染料TTC(2,3,5-三苯基-四氮唑鹽酸鹽)進(jìn)行酶譜分析。如圖2所示,發(fā)現(xiàn)Asuc2林失去大部分轉(zhuǎn)化酶活性。但是,該突變林具有在蔗糖培養(yǎng)基中以非常緩慢的速度生長(zhǎng)的問(wèn)題。相信這是由于線粒體功能的葡糖異生作用導(dǎo)致的細(xì)胞局部生長(zhǎng)。因此為了解決這一問(wèn)題,將抗菌素A,它是一種線粒體電子轉(zhuǎn)移抑制劑,添加至培養(yǎng)基中以阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)果,突變林的生長(zhǎng)在含有抗菌素A的YSPA(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、l|ig/ml抗菌素A和2%瓊脂)或YPSGA(l。/。酵母提取物、2。/。細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、l嗎/ml抗菌素A和2%瓊月旨)培養(yǎng)基中被完全抑制(圖3)。為了恢復(fù)選擇抹Y2805Asuc2U(Matasuc2::URA3pep4::HIS3GALIc肌l)和Y2805AgallAsuc2U(Matasuc2::URA3pep4::HIS3gallcanl)的尿嘧咬營(yíng)養(yǎng)缺陷,用含有TFP文庫(kù)的URA3載體,需要除去用于刪除SUC2基因的URA3基因。為此,將細(xì)胞在含有5-氟乳清酸(5-F0A)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)且選擇失去URA3基因的細(xì)胞,從而獲得了URA3敲除菌林,Y2805Asuc2(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3GALIcanl)和Y2805AgallAsuc2(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3gallcanl)(圖1)。進(jìn)行DNA印跡分析來(lái)證實(shí)染色體上的SUC2基因已刪除,正如所預(yù)期的,并且URA3基因從整合的轉(zhuǎn)座子中刪除(敲除)(圖4)。當(dāng)釀酒酵母菌Y2805的染色體DNA用EcoRI處理和使用SUC2基因作為探針用DNA印跡分析時(shí),檢測(cè)到大約4.3kb的片段。當(dāng)插入U(xiǎn)RA3基因(Y2805AgallAsuc2U)時(shí),該4.3kb的片段增加至大約5.0kb,而當(dāng)敲除URA3基因(Y2805AgallAsuc2U)時(shí)它減小至大約3.7kb。如圖4所示,如預(yù)期的一樣,顯然SUC2基因被刪除并失去了URA3基因(敲除)。實(shí)施例2使用轉(zhuǎn)化酶作為分泌報(bào)告蛋白的自動(dòng)篩選系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)使用兩種人治療蛋白質(zhì),即在酵母中良好分泌的人血清白蛋白(HSA)和酵母中幾乎不分泌的人白細(xì)胞介素-2(IL-2),根據(jù)融合了轉(zhuǎn)化酶的蛋白質(zhì)的表達(dá)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化酶缺失抹在蔗糖培養(yǎng)基中自動(dòng)篩選的可能性。構(gòu)建三個(gè)質(zhì)粒pYGAP-SNS-SUC2、pYGAP-HSA-SUC2和pYGAP-hlL2-SUC2來(lái)檢測(cè)在蔗糖培養(yǎng)基中的自動(dòng)選擇。為了構(gòu)建pYGAP-SUC2,其中pYGAP-SUC2含有在酵母GAPDH啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)化酶基因(SUC2,YIL162W)表達(dá)盒,首先構(gòu)建pST-SUC2,使用引物SUC-F(SEQIDNO.1)和SUC-R(SEQIDNO.2)擴(kuò)增來(lái)自pBIABX(圖l)的含有SUC2基因的PCR產(chǎn)物,將含有SUC2基因的PCR產(chǎn)物亞克隆至pST-Blue-l(Novagen,USA)中。用Pfu聚合酶(Stmtagene,USA)或Ex-TaqDNA聚合酶(TaKaRaKoreaBiomedicalInc.,Seoul,Korea)進(jìn)行PCR。PCR條件包括一次94。C5分鐘的循環(huán)和25次94°C30秒、55。C30秒和72°C2分鐘的循環(huán),隨后最后循環(huán)72°C7分鐘一次。將含有來(lái)自pST-SUC2的SUC2的EcoRI-Sall片段亞克隆至EcoRI-Sall消化的含有GAPDH啟動(dòng)子的YGAPa-HIR中以代替YEGa-HIR525的GAL10啟動(dòng)子(Sohn等人,ProcessBiochem.30:653(1995)),獲得的質(zhì)粒命名為pYGAP-SUC2。為了促進(jìn)外源基因和SUC2的融合以及通過(guò)酵母二肽蛋白酶Kex2p誘導(dǎo)被融合蛋白的體內(nèi)斷裂(Miz皿oK.等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.156:246(1988》,在分泌中,將一個(gè)用于Sfil和Notl兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的人工合成序列和編碼Kex2p斷裂位點(diǎn)的序列(Leu-Asp-Lys-Arg(SEQIDNO:214))通過(guò)PCR加入SUC2的分泌信號(hào)序列(19個(gè)氨基酸)和SUC2成熟序列(513個(gè)氨基酸)之間的結(jié)構(gòu)框架內(nèi)。兩個(gè)PCR片段,即含有GAPDH啟動(dòng)子和SUC2分泌信號(hào)序列的PCR-A和含有SUC2成熟部分的PCR-B分別從pYGAP-SUC2中進(jìn)行擴(kuò)增,其中PCR-A使用引IDNO:5)和SUC-R(SEQIDNO:2)擴(kuò)增。將這兩個(gè)片段亞克隆至pST-Blue-l并通過(guò)Sacl-Notl消化PCR-A和Notl-Sall消化PCR-B來(lái)恢復(fù)。酶消化的PCR-A和PCR-B共連接至Sacl-Sall消化的pYGAP-SUC2上,獲得的質(zhì)粒命名為pYGAP-SNS-SUC2。為了構(gòu)建質(zhì)粒pYGAP-HSA-SUC2,該質(zhì)粒在人血清白蛋白(HSA)和SUC2之間含有框架內(nèi)融合基因,HAS基因使用引物HAS-F(SEQIDNO:6)和HAS-R(SEQIDNO:7)從pYHSA5中進(jìn)行擴(kuò)增(Kang等人,J.Microbiol.Biotechnol.8:42(1998》且在pST-Blue-l中亞克隆。含有HAS基因的Sfil消化的DNA亞克隆至Sfil消化的pYGAP-SNS-SUC2載體中。獲得的質(zhì)粒命名為pYGAP-HSA-SUC2。為了構(gòu)建在人白細(xì)胞介素-2(hlL2)和SUC2間含有框架內(nèi)融合基因的質(zhì)粒pYGAP-ML2-SUC2,使用引物IL2-F(SEQIDNO:8)和IL2-R(SEQIDNO:9)從pT7-hlL2(JKJung,KoreaReasearchInstituteofBioscienceandBiotechnology)中擴(kuò)增ML2基因且將其亞克隆至pST-Blue-l。然后,通過(guò)將Sfil消化的ML2片段亞克隆至Sfil消化的pYGAP-SNS-SUC2載體中來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒pYGAP-hIL2-SUC2。表達(dá)人血清白蛋白和轉(zhuǎn)化酶的融合蛋白的pYGAP-HSA-SUC2載體、表達(dá)IL-2和轉(zhuǎn)化酶的融合蛋白的pYGAP-ML2-SUC2和僅表達(dá)轉(zhuǎn)化酶的pYGAP-SNS-SUC2分別轉(zhuǎn)化至缺失內(nèi)源性轉(zhuǎn)化酶基因從而不能在蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酵母菌株(Y2805Asuc2)中。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有葡萄糖作為唯一碳源的UD平板(0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)和含有蔗糖作為唯一碳源的YPSA培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、l嗎/ml抗菌素A和2。/。瓊脂)上且觀察每個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況(圖5)。當(dāng)細(xì)胞用表達(dá)轉(zhuǎn)化酶的pYGAP-SNS-SUC2轉(zhuǎn)化時(shí),它們?cè)趦煞N碳源中均正常生長(zhǎng)。類(lèi)似的,當(dāng)細(xì)胞用HAS與轉(zhuǎn)化酶的N末端融合的pYGAP-HSA-SUC2轉(zhuǎn)化時(shí),它們?cè)趦煞N碳源中均良好生長(zhǎng)。相反,當(dāng)細(xì)胞用IL2代替HSA進(jìn)行融合的pYGAP-hlL2-SUC2轉(zhuǎn)化時(shí),它們?cè)谄咸烟桥囵B(yǎng)基中正常生長(zhǎng)而在蔗糖培養(yǎng)基中幾乎不生長(zhǎng)。pYGAP-hlL2-SUC2轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能在蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)是由于IL-2無(wú)法由細(xì)胞分泌并導(dǎo)致與其融合的轉(zhuǎn)化酶分泌的阻斷。這些結(jié)果暗示使用轉(zhuǎn)化酶作為任何來(lái)源的DNA的分泌信號(hào)和融合配偶體(翻譯融合配偶體TFP)的報(bào)告蛋白的正向選擇系統(tǒng)能使不或幾乎不分泌的蛋白質(zhì)例如人IL2的分泌提高。實(shí)施例3構(gòu)建翻譯融合配偶體(TFP)文庫(kù)的載體的制備設(shè)計(jì)了數(shù)個(gè)載體用來(lái)從任何來(lái)源的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中構(gòu)建TFP庫(kù)。為了由cDNA構(gòu)建TFP文庫(kù),構(gòu)建了質(zhì)粒YGaINV(圖6)。使用兩個(gè)PCR引物,即SfiI-SUC-F(SEQIDNO:10)和SUC-Xho-R(SEQIDNO:ll)進(jìn)行PCR來(lái)擴(kuò)增來(lái)自pYGAP-ML2-SUC2的編碼轉(zhuǎn)化酶的DNA片段。PCR條件包括一次94°C5分鐘的循環(huán)和25次94°C30秒、55。C30秒和72°C2分鐘的循環(huán),最后循環(huán)72。C7分鐘一次。然后EcoRI-Sall消化的PCR片段連接至EcoRI-SaII消化的YEGoc-fflR525上,獲得的質(zhì)粒命名為YGaINV(圖6)。為了從部分消化的基因組DNA中構(gòu)建TFP文庫(kù),構(gòu)建三個(gè)載體YGaFOINV、YGaFlINV和YGaF2INV,其中每個(gè)載體含有SUC2基因的三個(gè)不同閱讀框中的一個(gè)(圖7)。使用一個(gè)常用的正向引物GallOO-F(SEQIDNO:12)和三個(gè)帶有不同閱讀框的反向引物Xho-FO-R(SEQIDNO:13)、Xho-Fl-R(SEQIDNO:14)和Xho-F2扁R(SEQIDNO:15)以YGaINV作為模板進(jìn)行三個(gè)不同的PCR擴(kuò)增。使用Pfu聚合酶(Stratagene,USA)完成PCR。PCR條件包括一次94°C5分鐘的循環(huán)和25次94°C30秒、55。C30秒和72°C2分鐘的循環(huán),最后循環(huán)72。C7分鐘一次。三個(gè)PCR片段從瓊脂糖凝膠上洗脫且用Sfil消化。然后將它們分別亞克隆至Sfil消化的YGaINV內(nèi)。獲得的三個(gè)質(zhì)粒命名為YGaFOINV、YGaFlINV和YGaF2INV(圖7)。實(shí)施例4構(gòu)建與酵母轉(zhuǎn)化酶融合的cDNA文庫(kù)為了構(gòu)建cDNA文庫(kù),將總的RNA從釀酒酵母菌Y2805(Mataura3his3pep4::HIS3canl)中分離出來(lái)。將酵母細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基(2。/。酵母提取物、1%細(xì)菌用蛋白胨和2%葡萄樣)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(mid-exponentialphase)。將總RNA用Elion等人描述(Elion等人,Cell39:633(1984》的方法分離出來(lái)。使用OligotexmRNA試劑盒(Qiagen,Germany)從總RNA中純化poly(A)+mRNA。cDNA使用SMARTcDNA合成試劑盒(BDBioscience,USA)從分離的mRNA中合成出來(lái)。一個(gè)特別設(shè)計(jì)的引物ASA24N6(SEQIDNO:16)代替SMART試劑盒中包括的引物用于合成cDNA的第一條鏈。由于引物ASA24N6設(shè)計(jì)含有一個(gè)Sfil識(shí)別位點(diǎn)和一個(gè)隨機(jī)六核苷酸序列,它用于根據(jù)SMART試劑盒操作手冊(cè)中描述的方法通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄作用由mRNA合成cDNA的第一條鏈(圖8)。由于引物ASA24N6是隨機(jī)的六核苷酸序列,因此它可隨機(jī)結(jié)合于mRNA的任何位置。因此,大多數(shù)使用此方法擴(kuò)增的cDNA的第一條鏈含有編碼酵母基因N末端部分的5,端部分序列。帶有5'端部分序列的cDNA第一條鏈文庫(kù)用作雙鏈cDNA合成的PCR模板,使用SMART試劑盒(BDBioscience,USA)5'端PCR引物和引物ASA24(SEQIDNO:17)。獲得的PCR產(chǎn)物包含大量的兩端帶有Sfil位點(diǎn)的cDNA的5'端部分片段。PCR條件包括如試劑盒推薦的一次95°C20秒的循環(huán)和20次95°C30秒、68。C6分鐘的循環(huán)。擴(kuò)增的cDNA用笨酚/氯仿/異戊醇(25:24:l)處理,并用2體積乙醇和0.1體積3M乙酸鈉(pH5.0)沉淀。獲得的cDNA用Sfil在50°C消化2小時(shí)然后用瓊脂糖凝膠電泳分離。0.5-lkbDNA使用凝膠提取試劑盒(Bioneer,Korea)從凝膠中分離。提取的DNA連接至Sfil消化的YGaINV載體上(圖6)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基(1%細(xì)菌用蛋白胨、0.5。/。酵母提取物、1。/。NaCl和50嗎/ml氨芐西林)上涂板且37°C培養(yǎng)過(guò)夜。大約5x104個(gè)大腸桿菌菌落混合至無(wú)菌蒸餾水中,使用質(zhì)粒分離試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)分離總質(zhì)粒,其中該總質(zhì)粒中含有與SUC2基因融合的隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA文庫(kù)。實(shí)施例5構(gòu)建與酵母轉(zhuǎn)化酶融合的基因組DNA文庫(kù)實(shí)施例4中構(gòu)建的TFP文庫(kù)是從cDNA文庫(kù)中獲得的,其中該cDNA文庫(kù)是從mRNA池中合成的。由于與幾乎不表達(dá)的基因的mRNA相比,高表達(dá)基因的mRNA通常很充足,因此,TFP文庫(kù)偏向于來(lái)自高表達(dá)基因。此外,一些基因在生長(zhǎng)時(shí)期中的某一點(diǎn)被完全抑制從而不能在TFP文庫(kù)中擴(kuò)增,即使它們是TFP的良好候選者。為了解決這些問(wèn)題,基因組DNA還用于構(gòu)建TFP文庫(kù)。如圖9中所示,釀酒酵母菌Y2805的基因組DNA用Sau3AI部分消化然后在70°C培養(yǎng)10分鐘使酶失活。在25。C,1小時(shí),用KIenow片段和0.2mMdTTP和dCTP補(bǔ)平DNA形成二堿基的互補(bǔ)端,然后將0.5-lkb的DNA從瓊脂糖凝膠中分離出來(lái)。此外,載體YGaF0INV、YGaFlINV、YGaF2INV(圖7)用Xhol消化。70°C滅活酶10分鐘后,用Klenow片段和0.2mMdTTP和dCTP補(bǔ)平載體形成二堿基互補(bǔ)端,然后從瓊脂糖凝膠中純化。每個(gè)載體用部分消化的基因組DNA連接然后分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基(1%細(xì)菌用蛋白胨、0.5%酵母提取物、1。/。NaCl和50嗎/ml氨節(jié)西林)上涂板且37°C培養(yǎng)過(guò)夜。將從三個(gè)不同載體獲得的大約2x105個(gè)大腸桿菌菌落倒入無(wú)菌蒸餾水中,使用質(zhì)粒分離試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)分離含有與SUC2基因融合的基因組DNA文庫(kù)的總質(zhì)粒。實(shí)施例6構(gòu)建分泌轉(zhuǎn)化酶的TFP文庫(kù)為了從實(shí)施例4和5中構(gòu)建的基因組和cDNA文庫(kù)中初選分泌轉(zhuǎn)化酶的TFP文庫(kù),將DNA文庫(kù)根據(jù)醋酸鋰方法(Hill等人,NucleicAcidRes.19:5791(1991))轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805AgallAsuc2(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3gallcanl)。Y2805Aga11Asuc2不能使用蔗糖和半乳糖作為碳源由于缺失這兩種基因。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在UD培養(yǎng)基(0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)和YPSGA培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2。/。細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3。/。半乳糖、l嗎/ml抗菌素A和2。/。瓊脂)上并在30。C培養(yǎng)4-6天。從cDNA和基因組DNA文庫(kù)分別獲得大約3000和1000個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。YPSGA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的所有轉(zhuǎn)化細(xì)胞用牙簽轉(zhuǎn)移至UD平板上且在30°C培養(yǎng)2天。使用玻璃珠從混合的細(xì)胞中分離出總DNA然后DNA用乙醇沉淀。為了得到含有TFP文庫(kù)的質(zhì)粒,將總DNA再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基(l。/。細(xì)菌用蛋白胨、0.5%酵母提取物、P/。NaCl和50嗎/ml氨千西林)上涂板且37°C培養(yǎng)過(guò)夜。大約獲得2x104個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞并用無(wú)菌蒸餾水收集,使用質(zhì)粒分離試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)分離總質(zhì)粒。從而構(gòu)建含有高達(dá)4000個(gè)單獨(dú)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化酶分泌的TFPs的TFP文庫(kù)。從該文庫(kù)中隨機(jī)選擇的質(zhì)粒的核苷酸序列顯示所有TFPs來(lái)源于單獨(dú)編碼不同分泌蛋白的酵母基因。實(shí)施例7通過(guò)體內(nèi)重組構(gòu)建適用于許多靶蛋白的TFP文庫(kù)載體實(shí)施例6中收集了大約4000個(gè)具有分泌轉(zhuǎn)化酶可能性的TFPs。為了開(kāi)發(fā)方便適用于任何靶基因的TFP文庫(kù)載體,設(shè)計(jì)出一個(gè)簡(jiǎn)單的體內(nèi)重組系統(tǒng)。首先構(gòu)建載體YGadV45(圖10),通過(guò)體內(nèi)重組用于將任何靶蛋白基因框內(nèi)插入TFP文庫(kù)和SUC2基因間。YGadV45包含缺陷型的SUC2(dSUC2),即N末端45個(gè)氨基酸缺失的SUC2,因此沒(méi)有轉(zhuǎn)化酶活性。此載體還設(shè)計(jì)在dSUC2前含有一個(gè)Notl和兩個(gè)Sfil識(shí)別序列,一個(gè)作為重組靶點(diǎn)的連接序列和一個(gè)Swal識(shí)別序列來(lái)通過(guò)體內(nèi)重組簡(jiǎn)單插入TFP庫(kù)和靶基因。使用正向引物INV45-F(SEQIDNO:18)和反向引物SUC-Xho-R(SEQIDNO:ll)和Pfu聚合酶(Stratagene,USA)根據(jù)模板YGaINV來(lái)進(jìn)行PCR。PCR條件包括一次94°C3分鐘的循環(huán)和25次94°C30秒、55°C30秒和72°C卯秒的循環(huán),最后循環(huán)72°C7分鐘一次。N末端修飾的缺陷型SUC2的基因片段從PCR中獲得。Notl-Sall消化的PCR片段亞克隆至NotI-SalI消化的載體YGaINV上(圖6),獲得的質(zhì)粒命名為YGadV45(圖10)。為了構(gòu)建YGadV45中的TFP文庫(kù),實(shí)施例6中得到的TFP文庫(kù)用Sfil消化且在瓊脂糖凝膠中分離。使用凝膠提取試劑盒(Bioneer,Korea)從凝膠中分離出大約0.5至lkb的DNA片段。純化的DNA亞克隆至Sfil消化的YGadV45上(圖IO)且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基(1%細(xì)菌用蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl和50嗎/ml氨千西林)上涂板且37°C培養(yǎng)過(guò)夜。大約5x104個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞用無(wú)菌蒸餾水收集來(lái)分離總質(zhì)粒。總質(zhì)粒使用質(zhì)粒分離試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)分離。分離的載體含有選自實(shí)施例6的與缺陷型的SUC2融合的TFPs。因此將此TFP文庫(kù)載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805AgallAsuc2中(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3gallcanl)在UD平板(0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上獲得數(shù)千個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而在YPSGA培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3%半乳糖、l昭/ml抗菌素A和2。/。瓊脂)上沒(méi)有轉(zhuǎn)化細(xì)胞。因此,它在YPSGA培養(yǎng)基上可以極大降低選擇的背景水平。僅具有包含TFP和SUC2間框內(nèi)插入靶基因的載體的細(xì)胞可以在正確體內(nèi)重組后在YPSGA上生長(zhǎng)。TPF文庫(kù)載體包含分別用于線性化和同源重組的一個(gè)罕見(jiàn)切割限制性酶Swal的位點(diǎn)和一個(gè)TFP文庫(kù)和dSUC2間的連接序列。實(shí)施例8從TFP文庫(kù)中自動(dòng)選擇分泌靶蛋白的最佳TFP為了通過(guò)體內(nèi)重組將靶蛋白框內(nèi)融合至實(shí)施例7中開(kāi)發(fā)的TFP文庫(kù)的載體內(nèi),靶基因必須在5,末端具有連接DNA和3'末端具有SUC2的N末端部分。為了將此序列添加至靶基因的末端,使用重疊延伸PCR。使用革巴點(diǎn)特異的正向引物KR-target-F(SEQIDN0:19)和靶點(diǎn)特異的反向引物Target-INV-R(SEQIDNO:20)進(jìn)行第一步PCR,從包含靶基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增編碼成熟蛋白質(zhì)的靶基因。還使用正向引物KR-Inv-F(SEQIDN0:21)和反向引物Inv500-R(SEQIDNO:22)單獨(dú)進(jìn)行另一PCR,從YGaINV(圖6)中擴(kuò)增將與靶基因的3'末端融合的SUC2的N末端部分。用Pfu聚合酶(Stratagene,USA)進(jìn)行PCR,PCR條件包括一次94°C3分鐘的循環(huán)和25次94°C30秒、55°C30秒和72°C90秒的循環(huán),最后循環(huán)72°C7分鐘一次。然后使用正向引物L(fēng)NK40(SEQIDNO:23)和反向引物Inv500-R(SEQIDNO:22)從第一步中擴(kuò)增的兩個(gè)DNA片段中進(jìn)行第二步PCR。獲得的片段(插入片段)分別在5'末端包含40個(gè)核苷酸的連接DNA和在3'末端包含編碼Kex2p識(shí)別位點(diǎn)(Leu-Asp-Lys-Arg(SEQIDNO:214))的500bp的DNA和轉(zhuǎn)化酶的N末端部分。為了進(jìn)行體內(nèi)重組,插入片段與實(shí)施例7中構(gòu)建的Swal消化的TFP文庫(kù)載體以2:1的比例混合且用于轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805AgallAsuc2中(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3gallcanl)(圖11)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在YPSGA培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3%半乳糖、1]ag/ml抗菌素A和2。/。瓊脂)上且培養(yǎng)5天。僅有插入片段和包含適合TFP的載體通過(guò)體內(nèi)重組的框內(nèi)融合可以支持細(xì)胞生長(zhǎng)在YPSGA培養(yǎng)基上。因此,使用這種方法,可通過(guò)在YPSGA培養(yǎng)基上簡(jiǎn)單選擇生長(zhǎng)細(xì)胞來(lái)獲得用于任何靶蛋白的最佳TFP。實(shí)施例9使用脂肪酶和轉(zhuǎn)化酶的二重報(bào)告蛋白系統(tǒng)自動(dòng)選4奪最佳TFP使用如實(shí)施例8中描述的轉(zhuǎn)化酶報(bào)告基因的自動(dòng)選擇系統(tǒng)對(duì)篩選用于把蛋白例如IL2的最佳TFP十分有效,其中在實(shí)施例2中發(fā)現(xiàn)IL2能完全阻斷轉(zhuǎn)化酶的分泌。由于許多菌落可在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng),因此從TFP文庫(kù)中選擇最佳TFP十分容易。然而,一些靶蛋白的融合即使連接弱TFP也不能完全阻斷轉(zhuǎn)化酶的分泌。這些遺漏的菌落也可在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因此大量菌落應(yīng)當(dāng)檢測(cè)其分泌水平來(lái)選擇最佳TFP。為了解決這個(gè)費(fèi)時(shí)的問(wèn)題,開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單的選擇方法,即使用成環(huán)報(bào)告蛋白脂肪酶在含有三丁酸甘油酯的平板上來(lái)鑒定具有高蛋白分泌水平的菌落。編碼脂肪酶(CalB,南極假絲酵母的脂肪酶B)的基因框內(nèi)融合至轉(zhuǎn)化酶的5'末端。使用此二重報(bào)告蛋白系統(tǒng),可在含有三丁酸甘油酯的YPSGA培養(yǎng)基中用轉(zhuǎn)化酶和脂肪酶活性同時(shí)選4奪轉(zhuǎn)化細(xì)胞。高水平分泌蛋白質(zhì)的菌落可用菌落周?chē)纬傻沫h(huán)的大小來(lái)筒單地確定。如圖12所示,二重報(bào)告基因的構(gòu)建通過(guò)三個(gè)PCR步驟來(lái)完成。含有CalB的lkb的PCR片段首先使用Ca舊正向引物KR-Ca舊-F(SEQIDNO:24)和反向引物CalB-Inv-R(SEQIDNO:25)從包含突變CalB基因的質(zhì)粒pLGK-Lipl4*(SYKim,Ph.D.thesis,YonseiUniversity,Korea,2001)中進(jìn)行擴(kuò)增。含有SUC2基因5'端部分的0.5kb的PCR片段使用正向引物KR-Inv-F(SEQIDNO:21)和反向引物Inv500-R(SEQIDNO:22)單獨(dú)從YGaINV中進(jìn)行擴(kuò)增(圖6)。用Pfii聚合酶(Stratagene,USA)進(jìn)行PCR,PCR條件包括一次94。C3分鐘的循環(huán)和25次94°C30秒、55°C30秒和72°C90秒的循環(huán),最后循環(huán)72°C7分鐘一次。然后使用正向引物KR-CalB-F(SEQIDNO:24)和反向引物Inv500-R(SEQIDNO:22)從第一步中擴(kuò)增的兩個(gè)DNA片段中進(jìn)行第二步PCR。靶基因的PCR使用正向引物KR-Target-F(SEQIDNO:19)和Target-CalB-R(SEQIDNO:26)從含有如實(shí)施例8中描述的靶基因的質(zhì)粒中單獨(dú)進(jìn)行擴(kuò)增。使用正向引物L(fēng)NK40(SEQIDNO:23)和反向引物Inv500-R(SEQIDNO:22)從把基因和融合了部分SUC2基因的CalB的混合物模板中進(jìn)行第三步PCR。獲得的DNA片段(插入片段)按順序由40個(gè)核普酸的連接子、靶基因、Kex2p斷裂位點(diǎn)(Leu-Asp-Lys-Arg(SEQIDNO:214))、CalB、Kex2p斷裂位點(diǎn)(Leu-Asp-Lys-Arg(SEQIDNO:214))和5Q0bp的SUC241基因的5'端部分組成。為了進(jìn)行體內(nèi)重組,PCR擴(kuò)增的插入片段與實(shí)施例7中構(gòu)建的Swal消化的TFP文庫(kù)載體以2:1的比例混合且用于轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805AgallAsuc2(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞分別涂布在YPSGA培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3%半乳糖、l嗎/ml抗菌素A和2。/。瓊脂)上用轉(zhuǎn)化酶活性來(lái)選擇和涂布在YPSGAT培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3%半乳糖、l嗎/ml抗菌素A、1%三丁酸甘油酯和2%瓊脂)上用轉(zhuǎn)化酶和脂肪酶活性來(lái)選擇。轉(zhuǎn)化平板在30。C培養(yǎng)5天。分泌靶蛋白、脂肪酶和轉(zhuǎn)化酶的菌落在YPSGA和YPSGAT平板上均可形成。如預(yù)期一樣,菌落周?chē)纬刹煌笮〉沫h(huán)。環(huán)的大小與分泌的脂肪酶活性大概成正比。因此,從轉(zhuǎn)化平板中很容易直接選擇出高分泌水平的菌落(圖13)。實(shí)施例10選自TFP文庫(kù)分泌人白細(xì)胞介素-2的新TFP為了使用本發(fā)明中開(kāi)發(fā)的方法鑒定最佳的TFPs,作為一種實(shí)例對(duì)一種幾乎不能分泌的蛋白質(zhì)人白細(xì)胞介素-2(WL2)進(jìn)行了試驗(yàn)。包含人IL2基因和500bp的SUC2基因的N末端部分的插入片段使用如實(shí)施例8所描述的PCR來(lái)擴(kuò)增(圖11)。使用正向引物KR-IL2-F(SEQIDNO:27)和反向引物IL2-INV-R(SEQIDNO:28)以pT7-hlL-2(JKJung,KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology)作為才莫豐反進(jìn)行PCR。為了擴(kuò)增與IL2基因的3'末端融合的SUC2的N末端部分,使用正向引物KR-Inv-F(SEQIDNO:21)和反向引物Inv500-R(SEQIDNO:22)從YGaINV中(圖6)單獨(dú)進(jìn)行了另一PCR。然后使用正向引物L(fēng)NK40(SEQIDNO:23)和Inv500-R(SEQIDNO:22)對(duì)第一步中擴(kuò)增的兩個(gè)DNA片段來(lái)進(jìn)行第二步PCR。獲得的片段(插入片段)按順序包含一個(gè)含有Kex2p識(shí)別序列(Leu-Asp-Lys-Arg(SEQIDNO:214》的40個(gè)核苷酸的連接DNA、IL2、另一個(gè)Kex2p識(shí)別序列和轉(zhuǎn)化酶的N末端部分。此片段與實(shí)施例7構(gòu)建的Swal消化的TFP文庫(kù)載體共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805AgallAsuc2(Mataura3suc2::Tcl卯pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在UD培養(yǎng)基(0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)和YPSGA培養(yǎng)基(P/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3%半乳糖、l嗎/ml抗菌素A和2%瓊脂)上且在30°C培養(yǎng)5天。大約2x104個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞從UD平板上獲得而大約100個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞從YPSGA上獲得。三十個(gè)隨機(jī)選擇的生長(zhǎng)在YPSGA上的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在YPD肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分離出總的DNA且再將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨千西林的LB培養(yǎng)基(l。/。細(xì)菌用蛋白胨、0.5%酵母提取物、1。/。NaCl和50嗎/ml氨千西林)上涂板且在37°C培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒(Bioneer,Korea)從每個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離出質(zhì)粒。為了分析每個(gè)TFP的序列,一個(gè)結(jié)合于GAL10啟動(dòng)子的測(cè)序引物GAL100-F(SEQIDNO:12)用于所有含有TFPs的質(zhì)粒。核苷酸序列由GenotechCo.(Taejon,Korea)使用自動(dòng)化測(cè)序設(shè)備(ABIPrism377;PEBiosystems,FosterCity,CA,USA)來(lái)確定。序列通過(guò)酵母菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(www.yeastgenome.org)的BLAST搜索來(lái)分析。結(jié)果,從生長(zhǎng)在YPSGA培養(yǎng)基中的30個(gè)菌落中分離出的質(zhì)粒中鑒定出九個(gè)新TFPs和一個(gè)已知TFP(TFP-3)(WO2005/068658)。被分離的質(zhì)粒分別命名為pYHTS-TFP9、pYHTS-'iP13、pYHTS-TFPi7、pYHTS-TFPi8、pYHTS-TFP19、pYHTS-TFP20、pYHTS-TFP21、pYHTS-TFP25和pYHTS-TFP27。這九個(gè)新TFPs概述于表1中。表1選擇分泌人白細(xì)胞介素-2的TFPs<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>實(shí)施例11使用選擇的TFPs分泌人IL2為了證實(shí)使用選擇的TFPs能分泌人IL2,使用PCR構(gòu)建了9個(gè)質(zhì)粒以除去每個(gè)TFP的5'-UTR和實(shí)施例10中選擇的質(zhì)粒的SUC2(圖14)。九個(gè)正向引物BamH-YGR-F(SEQIDNO:47)、BamH-SIM-F(SEQIDNO:48)、BamH-YNL-F(SEQIDNO:49)、BamH-ECM-F(SEQIDNO:50)、BamH-ATG-F(SEQIDNO:51)、BamH-GAS-F(SEQIDNO:52)、BamH-YOR-F(SEQIDNO:53)、BamH-OST-F(SEQIDNO:54)、BamH-UTH-F(SEQIDNO:55)和一個(gè)常用反向引物IL2-TGA-R(SEQIDNO:56)用于分別從質(zhì)粒pYHTS-TFP9、pYHTS-TFP13、pYHTS-TFP17、pYHTS層TFP18、pYHTS-TFP19、pYHTS-TFP20、pYHTS-TFP21、pYHTS-TFP25和pYHTS-TFP27中進(jìn)行PCR。九個(gè)PCR擴(kuò)增片段用BamHI和Sail消化且從瓊脂糖凝膠中分離出每一個(gè)。使用正向引物Sac-GAL-F(SEQIDNO:57)和反向引物GAL-BamH-R(SEQIDNO:58)從YEGa-HIR525中單獨(dú)進(jìn)行另一個(gè)PCR以擴(kuò)增GAL啟動(dòng)子(Sohn等人,ProcessBiochem.30:653(1995))。SacI-BamHI消化的GAL啟動(dòng)子和九個(gè)Bamffl-Sacl消化的片段共連接至Sacl-Sall消化的YEGa-HIR525上。獲得的質(zhì)粒分別命名為pYGT9-IL2(圖15A)、pYGT13-IL2(圖15B)、pYGT17-IL2(圖15C)、pYGT18-IL2(圖16A)、pYGT19網(wǎng)IL2(圖16B)、pYGT20-IL2(圖16C)、pYGT21-IL2(圖17A)、pYGT25-IL2(圖17B)和pYGT27-IL2(圖17C)。人IL2表達(dá)載體pYGT9-IL2(大腸桿菌DH5a/pYGT9-IL2,圖15A)和pYGT17-IL2(大腸桿菌DH5a/pYGT17-IL2,圖15C)于2005年7月21日存放于國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;韓國(guó),大田,宇松區(qū),歐洞52),登記號(hào)分別是KCTC10828BP和KCTC10829BP。所有構(gòu)建的載體的核苷酸序列證實(shí)具有正確的TFP和IL2間的框內(nèi)融合且每個(gè)載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805(Mataura3SUC2pep4::HIS3GAL1canl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在UD培養(yǎng)基(0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上涂板且在30。C培養(yǎng)3天。每個(gè)轉(zhuǎn)化的一個(gè)單獨(dú)菌落接種至YPDG肉湯培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)且在30。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40%。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍干燥沉淀且重懸于1xSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中用12%SDS-PAGE分析。凝膠染色劑(PhastGelBlueR,PharmaciaBiotech,USA)染色凝膠。如圖18所示,分泌的IL2水平在TFPs間非常不同但都可以將人IL2分泌至培養(yǎng)液上清中。含有TFP1-人IL2基因的質(zhì)粒pYIL-KRTl-4(WO2005/068658)用作對(duì)照。發(fā)現(xiàn)TFP9、13、21和27對(duì)人IL2的分泌十分有效(圖18)。實(shí)施例12選自TFP文庫(kù)分泌人白細(xì)胞介素-32的新TFP為了使用本發(fā)明中開(kāi)發(fā)的方法鑒定最佳的TFPs,作為一種實(shí)例對(duì)一種很少分泌的蛋白質(zhì)即新的人細(xì)胞因子,白細(xì)胞介素-32a(hlL32)(Kim等人,Immunity22:131(2005))進(jìn)行了試驗(yàn)。含有人IL32a基因和500bp的SUC2基因N末端部分的插入片段使用如實(shí)施例8所描述的PCR來(lái)擴(kuò)增(圖11)。使用正向引物KR-IL32a-F(SEQIDNO:59)和反向引物IL32a-INV-R(SEQIDNO:60)以pProExHTa-IL32a(DYYoon,KonkukUniversity,Korea)作為模板進(jìn)行PCR。為了擴(kuò)增與IL32a基因的3'末端融合的SUC2的N末端部分,使用正向引物KR-Inv-F(SEQIDNO:21)和反向引物Inv500-R(SEQIDNO:22)從YGaINV(圖6)中單獨(dú)進(jìn)行了另一PCR。然后使用正向引物L(fēng)NK40(SEQIDNO:23)和反向引物Inv500-R(SEQIDNO:22)對(duì)從第一步中擴(kuò)增的兩個(gè)DNA片段進(jìn)行第二步PCR。獲得的片段(插入片段)按順序包含一個(gè)含有Kex2p識(shí)別序歹'j(Leu-Asp-Lys-Arg(SEQIDNO:214))的40個(gè)核苷酸的連接DNA、IL32a、另一個(gè)Kex2p識(shí)別序列和轉(zhuǎn)化酶的N末端部分。將此片段與實(shí)施例7構(gòu)建的Swal消化的TFP文庫(kù)載體共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805AgallAsuc2(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在UD培養(yǎng)基(0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)和YPSGA培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3%半乳糖、l嗎/ml抗菌素A和2%瓊脂)上且在30°C培養(yǎng)5天。大約2x104個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞從UD平板中獲得而大約250個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞從YPSGA中獲得。隨機(jī)選擇三十八個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞在YPDG肉湯培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)中30。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40%。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍干燥沉淀且重懸于1xSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中并用12%SDS-PAGE分析(圖19)。根據(jù)大約20kDa處出現(xiàn)的蛋白質(zhì)條帶判斷大多數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以分泌人IL32a。其中,對(duì)顯示深色I(xiàn)L32a條帶的17個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行分析。每個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞在YPD肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng),分離出總DNA且將其再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基(l。/。細(xì)菌用蛋白胨、0.5%酵母提取物、P/。NaCl和50嗎/ml氨千西林)上涂板且在37°C培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒(Bioneer,Korea)從每個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離出質(zhì)粒。為了分析每個(gè)質(zhì)粒的序列,一個(gè)結(jié)合于GAL10啟動(dòng)子的測(cè)序引物GAL100-F(SEQIDNO:12)用于所有含有TFPs的質(zhì)粒。核苷酸序列由GenotechCo.(Taejon,Korea)使用自動(dòng)化測(cè)序設(shè)備(ABIPrism377;PEBiosystems,F(xiàn)osterCity,CA,USA)來(lái)確定。序列通過(guò)酵母菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(www.yeastgenome.org)的BLAST搜索來(lái)分析。結(jié)果從17個(gè)被選擇的酵母菌林中分離出的質(zhì)粒中鑒定出九個(gè)不同的TFPs。分離的質(zhì)粒命名為pYHTS-IL32-TFP3、pYHTS扁IL32-TFP11、pYHTS-IL32-TFP13、pYHTS-IL32-TFP21、pYHTS-IL32-TFP22、pYHTS-IL32-TFP25、pYHTS-IL32-TFP29、pYHTS-IL32-TFP34和pYHTS-IL32-TFP38。其中獲得的TFP3、TFP13、TFP2和TFP25通常作為用于人IL2的最佳TFPs(WO2005/068658)且出現(xiàn)在實(shí)施例10中(表1)。五個(gè)分離IL32a的新TFPs概述于表2中。表2分泌人白細(xì)胞介素-32a的新TFPs<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實(shí)施例13使用選擇的TFPs分泌人IL32a為了證實(shí)使用選擇的TFPs能分泌人IL32a,使用PCR構(gòu)建數(shù)個(gè)質(zhì)粒以除去每個(gè)TFP的5,-UTR和實(shí)施例12中選擇的質(zhì)粒的SUC2。六個(gè)正向引物BamH-CIS-F(SEQIDNO:71)、BamH-SED-F(SEQIDNO:72)、BamH-SIM-F(SEQIDNO:73)、BamH-YOR247W-F(SEQIDNO:74)、BamH-HSP-F(SEQIDNO:75)、BamH-OST-F(SEQIDNO:76)和一個(gè)常用反向引物IL32-TGA-R(SEQIDNO:77)用于分別從質(zhì)粒pYHTS-IL32-TFP3、pYHTS-IL32-TFP11、pYHTS-IL32-TFP13、pYHTS-IL32-TFP21、pYHTS-IL32-TFP22和pYHTS-IL32-TFP25中進(jìn)行PCR。六個(gè)PCR擴(kuò)增的片段用BamHI和Sail消化且從瓊脂糖凝膠中分離出每一個(gè)。另一擴(kuò)增GAL啟動(dòng)子的PCR使用正向引物Sac-GAL-F(SEQIDNO:57)和反向引物GAL-BamH-R(SEQIDNO:58)從YEGa-HIR525中進(jìn)行(Sohn等人,ProcessBiochem.30:653(1995))。SacI-BamHI消化的GAL啟動(dòng)子和六個(gè)BamHI-SacI消化的片段共連接至Sacl-Sall消化的YEGa-HIR525上。獲得的質(zhì)粒分別命名為pYGT3-IL32a、pYGTll-IL32a、pYGT13-IL32a、pYGT21-IL32a、pYGT22-IL32a和pYGT25-IL32a。所有構(gòu)建的載體的核香酸序列證實(shí)具有正確的TFP和IL32a間的框內(nèi)融合且每個(gè)載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805(Mataura3SUC2pep4::HIS3GAL1canl)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在UD培養(yǎng)基(0.67。/。無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上涂板且在30°C培養(yǎng)3天。每個(gè)轉(zhuǎn)化的一個(gè)單獨(dú)菌落接種至YPDG肉湯培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)且在30°C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40%。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍干燥沉淀且將其重懸于1xSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中并用12°/。SDS-PAGE分析。凝膠染色劑(PhastGd⑧BlueR,PharmaciaBiotech,USA)染色凝膠。分泌的IL32a使用hlL32a單克隆抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步分析。蛋白質(zhì)在CAPS緩沖液(2.2g/LCAPS、MeOH10%、NaOH調(diào)整至pHll)中以300mA卯分鐘轉(zhuǎn)移至PVDE膜(Millipore,USA)。然后用人IL32抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)(DYYoon,KonkkukUniversity,Korea)。膜在4°C下在含有5%脫脂奶的PBS(137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、2mMKH2P04、HC1調(diào)整至pH7.4)中封閉過(guò)夜。膜用含有0.05%吐溫-20的PBS沖洗3次然后用含有3%脫脂奶的PBS稀釋的一級(jí)抗體在室溫孵育1小時(shí)。然后沖洗3次膜且用含有3%脫脂奶的PBS稀釋的抗鼠二級(jí)抗體(SigmaChemicalCo.,USA)在室溫聘育1小時(shí)。膜如上沖洗且用SigmaFastNBT/BCIP(SigmaChemicalCo.,USA)顯影。如圖20所示,所有選擇的TFPs可將人IL32a分泌至培養(yǎng)液上清中。發(fā)現(xiàn)其中的TFP3、13、21和22對(duì)分泌人IL32a最佳。實(shí)施例14分批補(bǔ)料發(fā)酵以生產(chǎn)人IL32apYGT3-IL32a轉(zhuǎn)化的重組酵母菌抹在5-L廣口發(fā)酵罐中通過(guò)分批加料培養(yǎng)來(lái)評(píng)價(jià)分泌人IL32a的生產(chǎn)力。200ml接種培養(yǎng)液在1L培養(yǎng)瓶中使用基本培養(yǎng)基(0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.5%酪蛋白氨基酸和2%葡萄糖)培養(yǎng)。當(dāng)使用發(fā)酵培養(yǎng)基(4%酵母提取物、1%蛋白胨、2%葡萄糖)作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)液的OD600到達(dá)大約15時(shí),根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率以不同加液速率補(bǔ)充補(bǔ)料分批培養(yǎng)基(15。/。酵母提取物、30%葡萄糖)。培養(yǎng)液OD600達(dá)到大約130后,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率以不同加液速率額外補(bǔ)充半乳糖(30%半乳糖)。大約72小時(shí)培養(yǎng)期后,培養(yǎng)液OD600達(dá)到大約220(圖21A)。在給定時(shí)間點(diǎn)收集15^I培養(yǎng)基且通過(guò)SDS-PAGE估計(jì)分泌的蛋白質(zhì)(圖21B)。通過(guò)使用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑(Pierce,USA)和光密度計(jì)(GS700,Bio-Rad,USA)的蛋白質(zhì)直接測(cè)量法確定發(fā)現(xiàn)超過(guò)300mg/L的ML32a分泌至培養(yǎng)基中。實(shí)施例15使用酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST搜索以序列為基礎(chǔ)選擇TPFs為了從酵母基因組中基于序列選擇TFPs,18個(gè)選擇的TFPs(4個(gè)來(lái)自WO2005/068658、9個(gè)來(lái)自實(shí)施例10和5個(gè)來(lái)自實(shí)施例12)的前分泌信號(hào)的氨基酸序列用作酵母菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(www.yeastgenome.org)BLAST搜索的查詢(xún)序列。在BLASTP搜索中使用低期望閾值(IOO或1000),鑒定出數(shù)百個(gè)具有超過(guò)70%同源性的開(kāi)放閱讀框架(ORFs)。其中選擇接近N末端具有序列同源性的ORFs,然后進(jìn)一步進(jìn)行SignalP(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)分析來(lái)選擇具有分泌信號(hào)的ORFs。結(jié)果隨機(jī)選擇出18個(gè)ORFs作為T(mén)FP候選。通過(guò)搜索鑒定的18個(gè)選擇的ORFs是YGR279C(SCW4,細(xì)胞壁蛋白質(zhì))、YLR037C(DAN2,細(xì)胞壁甘露糖蛋白)、YLR110C(CCW12,細(xì)胞壁蛋白質(zhì))、YOR383C(FIT3,細(xì)胞壁甘露糖蛋白)、YIL011W(TLR3,細(xì)胞壁甘露糖蛋白)、YHR214W(假定的膜蛋白質(zhì))、YNL160W(YGP1,與細(xì)胞壁相關(guān)的分泌糖蛋白)、YGR296C-A(可疑的開(kāi)放讀碼框)、Y0L154W(ZPS1,假定的GPI錨蛋白質(zhì))、YPL187W(MFa,交配信息素a因子)、YHR214W(假定的膜蛋白質(zhì))、YKR013W(PRY2,未知功能蛋白質(zhì))、YHR139C(SPS100,孢子壁成熟所需蛋白質(zhì))、YIL169C(假定的未知功能蛋白質(zhì))、YOL155C(未定義ORF)、YMR325W(PAU19,假定蛋白質(zhì))、YDR134W(假定蛋白質(zhì))和YLR300W(EXG1,細(xì)胞壁主要外-l,3-p-葡聚糖酶)。分別使用釀酒酵母菌Y2805(Mataura3SUC2pep4::HIS3GAL1canl)的基因組DNA對(duì)每個(gè)ORF進(jìn)行擴(kuò)增,所使用的引物對(duì)為YGR279C使用YGR279C-F(SEQIDNO:92)和YGR279C隱R(SEQIDNO:93)、YLR037C使用YLR037C-F(SEQIDNO:94)和YLR037C-R(SEQIDNO:95)、YLR110C使用YLR110C-F(SEQIDNO:96)和YLR110C-R(SEQIDNO:97)、YOR383C使用YOR383C-F(SEQIDNO:98)和YOR383C-R(SEQIDNO:99)、YIL011W使用YIL011W-F(SEQIDNO:100)和YIL011W-R(SEQIDNO:101)、YHR214W使用YHR214W-F(SEQIDNO:102)和YHR214W-R(SEQIDNO:103、YNL160W使用YNL160W-F(SEQIDNO:104)和YNL160W-R(SEQIDNO:105)、YGR296C-A使用YGR296C-A-F(SEQIDNO:106)和YGR296C-A-R(SEQIDNO:107)、YOL154W使用YOU54W-F(SEQIDNO:108)和YOL154W-R(SEQIDNO:109)、YPL187W使用YPL187W-F(SEQIDNO:110)和YPL187W陽(yáng)R(SEQIDNO:lll)、YHR214W使用YHR214W-F(SEQIDNO:112)和YHR214W-R(SEQIDNO:113)、YKR013W使用YKR013W-F(SEQIDNO:114)和YKR013W-R(SEQIDNO:115)、YHR139C使用YHR139C-F(SEQIDNO:116)和YHR139C-R(SEQIDNO:117)、YIL169C使用YIL169C-F(SEQIDNO:118)和YIL169C-R(SEQIDNO:119)、YOL155C使用YOL155C-F(SEQIDNO:120)和YOL155C-R(SEQIDNO:121)、YMR325W使用YMR325W-F(SEQIDNO:122)和YMR325W-R(SEQIDNO:123)、YDR134W使用YDR134W-F(SEQIDNO:124)和YDR134W-R(SEQIDNO:125)和YLR300W使用YLR300W-F(SEQIDNO:126)和YLR300W-R(SEQIDNO:127)。用Pfu聚合酶(Strategene,USA)進(jìn)行PCR且PCR條件包括一次94°C3分鐘的循環(huán)和25次94°C30秒、55°C30秒和72°C2分鐘的循環(huán),最后循環(huán)72°C7分鐘一次。每個(gè)擴(kuò)增的PCR片段由GenotechCo.(Taejon,Korea)使用自動(dòng)測(cè)序設(shè)備(ABIPrism377;PEBiosystems,FosterCity,CA,USA)通過(guò)核苷酸測(cè)序來(lái)證實(shí)。為了從選擇的18個(gè)ORFs中篩選TFPs,對(duì)18個(gè)PCR片段的混合物進(jìn)行了單向缺失且用于在YGadV45中構(gòu)建TFP文庫(kù)(圖24)。使用引物SfiA-F(SEQIDNO:128)根據(jù)由18個(gè)ORFs組成的模板通過(guò)單向PCR獲得單鏈模板。用ExTaq(TakaraKorea,Korea)進(jìn)行PCR且PCR條件包括一次94°C3分鐘的循環(huán)和30次94°C30秒、55°C30秒和72°C2分鐘的循環(huán),最后72°C7分鐘循環(huán)一次。含有單鏈DNA的PCR產(chǎn)物使用PCR純化試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)純化。然后使用大腸桿菌DNA聚合酶I(NEB,England)和隨機(jī)六核苦酸引物ASA24N6(SEQIDNO:16)來(lái)進(jìn)行雙鏈DNA的再生。含有20^1模板DNA、1^1ASA24N6引物、3pi10x大腸桿菌DNApoll緩沖液、5^12.5mMdNTP和1^1大腸桿菌DNApoll的反應(yīng)混合物在37°C培養(yǎng)1小時(shí)。使用PCR純化試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)柱純化DNA,使用引物SfiA-F(SEQIDNO:128)和ASA24(SEQIDNO:17)來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的DNA再次柱純化、用Sfil消化和通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。0.5-1.0kb的Sfil消化的DNA亞克隆至Sfil處理的含有缺陷型SUC2(dSUC2)的YGadV45中。連接的DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨千西林的LB培養(yǎng)基(1%細(xì)菌用蛋白胨、0.5%酵母提取物、1。/。NaCl和50嗎/ml氨千西林)上涂板且在37。C培養(yǎng)過(guò)夜。大約1x104個(gè)大腸桿菌菌落混合至無(wú)菌蒸餾水且在YGadV45中含有18個(gè)ORFs的單向缺失的DNA片段文庫(kù)的總質(zhì)粒通過(guò)使用質(zhì)粒分離試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)分離。為了從18個(gè)ORFs的單向缺失的DNA片段文庫(kù)中篩選適合的TFPs,一個(gè)編碼人白細(xì)胞介素-2(hlL2)的基因插入該文庫(kù)和dSUC2之間。含有WL2基因和500bpSUC2的N末端部分的插入片段使用如實(shí)施例8中描述的方法使用PCR進(jìn)行擴(kuò)增(圖11)。此片段與含有18個(gè)ORFs的單向缺失的DNA片段文庫(kù)的Swal消化的載體共轉(zhuǎn)染至釀酒酵母菌Y2805AgallAsuc2(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在UD培養(yǎng)基(0.67。/。無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)和YPSGA培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3%半乳糖、l嗎/ml抗菌素A和2%瓊脂)上且在30。C培養(yǎng)5天。從UD平板上獲得大約2x104個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而在YPSGA中獲得大約數(shù)百個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。隨機(jī)選擇29個(gè)生長(zhǎng)在YPSGA上的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在YPDG肉湯培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)中培養(yǎng)且在30。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40%。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍干燥沉淀且重懸于lxSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中并用12%SDS-PAGE分析(圖25)。發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞將人IL-2分泌至培養(yǎng)液上清中。從每個(gè)分泌人IL-2的細(xì)胞中分離出總DNA且將其再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。使用質(zhì)粒提取試劑盒(Bioneer,Koi'ea)從每個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離出質(zhì)粒。為了分析每個(gè)TFP的序列,一個(gè)結(jié)合于GAL10啟動(dòng)子的測(cè)序引物GAL100-F(SEQIDNO:12)用于所有含有TFPs的質(zhì)粒。核苷酸序列由GenotechCo.(Taejon,Korea)使用自動(dòng)化測(cè)序設(shè)備(ABIPrism377;PEBiosystems,FosterCity,CA,USA)來(lái)確定。這些序列通過(guò)酵母菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(www.veastgenome.org)的BLAST搜索來(lái)分析。結(jié)果從分泌人IL-2的12個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離的質(zhì)粒中鑒定出六個(gè)新TFPs。分離的質(zhì)粒分別命名為pYIL-TFP39、pYIL-TFP41、pYIL-TFP43、pYIL-TFP44、pYIL匿TFP52和pYIL-TFP54。這六個(gè)新TFPs概述于表3中。表3基于序列選擇的ORFs中分泌人IL-2的TFPs<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實(shí)施例16通過(guò)單向缺失改變核心TFPs為了改變實(shí)施例10和11中使用IL-2和IL-32a選擇的14個(gè)TFPs(核心TFPs)和先前WO2005/068658中鑒定的3個(gè)TFPs的有效性,將17個(gè)基因組開(kāi)放閱讀框架(ORFs),即YAR066W用于TFP-l、YFR026C用于TFP-2、YJL158C用于TFP3、YGR106C用于TFP-9、YDR077W用于TFP-11、YIL123W用于TFP13、YNL1卯W用于TFP-17、YBR078W用于TFP18、YJL178C用于TFP-19、YMR307W用于TFP墨20、YOR247W用于TFP-21、YJL159W用于TFP-22、YOR085W用于TFP-25、YKR042W用于TFP-27、YEL060C用于TFP29、YLR390W-A用于TFP-34和YMR251W-A用于TFP-38進(jìn)行如實(shí)施例15中描述的PCR擴(kuò)增和單向缺失。每個(gè)開(kāi)放閱讀框架從釀酒酵母菌Y2805(Mataura3SUC2pep4::HIS3GALlcanl)基因組DNA中分別使用PCR引物對(duì)即YAR066W-F(SEQIDNO:141)和YAR066W-R(SEQIDNO:142)用于YAR066W、YFR026C-F(SEQIDNO:143)和YFR026C-R(SEQIDNO:144)用于YFR026C、YJL158C-F(SEQIDNO:145)和YJL158C陽(yáng)R(SEQIDNO:146)用于YJL158C、YGR106C-F(SEQIDNO:147)和YGR106C-R(SEQIDNO:148)用于YGR106C、YDR077W-F(SEQIDNO:149)和YDR077W-R(SEQIDNO:150)用于YDR077W.YIL123W-F(SEQIDNO:15i;)禾YIL123W-R(SEQIDNO:152)用于YIL123W、YNL190W-F(SEQIDNO:153)禾YNL190W-R(SEQIDNO:154)用于YNLl卯W、YBR078W-F(SEQIDNO:155)禾YBR078W-R(SEQIDNO:156)用于YBR078W、YJL178C-F(SEQIDNO:157)禾YJL178C-R(SEQIDNO:158)用于YJL178C、YMR307W-F(SEQIDNO:159)禾YM詣7W-R(SEQIDNO:160)用于YMR307W、YOR247W-F(SEQIDNO:161)禾YOR247W-R(SEQIDNO:162)用于YOR247W、YJL159W-F(SEQIDNO:163)禾YJL159W-R(SEQIDNO:164)用于YJL159W、YOR085W-F(SEQIDNO:165)禾YOR085W-R(SEQIDNO:166)用于YOR085W、YKR042W-F(SEQIDNO:167)禾YKR042W-R(SEQIDNO:168)用于YK腿2W、YEL060C-F(SEQIDNO:169)禾YEL060C-R(SEQIDNO:170)用于YEL060C、YLR390W-A-F(SEQIDNO:171)禾YLR390W-A-R(SEQIDNO:172)用于YLR390W-A、YMR251W-A-F(SEQIDNO:173)和YMR251W-A-R(SEQIDNO:174)用于YMR251W-A來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。用Pfo聚合酶(Strategene,USA)進(jìn)行PCR且PCR條件包括一次94°C3分鐘的循環(huán)和25次94°C30秒、55。C30秒和72。C2分鐘的循環(huán),最后72°C7分鐘循環(huán)一次。每個(gè)擴(kuò)增的PCR片段由GenotechCo.(Taejon,Korea)使用自動(dòng)測(cè)序設(shè)備(ABIPrism377;PEBiosystems,FosterCity,CA,USA)通過(guò)核苷酸測(cè)序來(lái)證實(shí)。為了從17個(gè)開(kāi)放閱讀框架中篩選出變化的TFPs,其中從這17個(gè)開(kāi)放閱讀框架中獲得了17個(gè)核心TFPs,對(duì)17個(gè)PCR片段混合物進(jìn)行單向缺失且將其用于在YGadV45中構(gòu)建TFP文庫(kù)(圖24)。使用引物SfiA-F(SEQIDNO:128)根據(jù)由17個(gè)ORFs組成的模板通過(guò)單向PCR獲得單鏈模板。用ExTaq(TakaraKorea,Korea)進(jìn)行PCR且PCR條件包括一次94°C3分鐘的循環(huán)和30次94°C30秒、55°C30秒和72°C2分鐘的循環(huán),最后72°C7分鐘循環(huán)一次。含有單鏈DNA的PCR產(chǎn)物使用PCR純化試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)純化。然后使用大腸桿菌DNA聚合酶I(NEB,England)和隨機(jī)六核香酸引物ASA24N6(SEQIDNO:16)來(lái)進(jìn)行雙鏈DNA的再生。含有20^1模板DNA、1^1ASA24N6引物、3^110x大腸桿菌DNApoll緩沖液、5^12.5mMdNTP和1^1大腸桿菌DNApoll的反應(yīng)混合物在37。C培養(yǎng)1小時(shí)。使用PCR純化試劑盒DNA(Bioneer,Korea)來(lái)柱純化DNA,并使用引物SfiA-F(SEQIDNO:128)和ASA24(SEQIDNO:17)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的DNA再次柱純化、用Sfil消化和通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。0.5-1.0kb的Sfil消化的DNA亞克隆至Sfil處理的含有缺陷型SUC2(dSUC2)的YGadV45。連接的DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨千西林的LB培養(yǎng)基(l。/。細(xì)菌用蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl和50嗎/ml氨千西林)上涂板且在37°C培養(yǎng)過(guò)夜。大約1x104個(gè)大腸桿菌菌落混合至無(wú)菌蒸餾水且在YGadV45中含有17個(gè)ORFs的單向缺失的DNA片段文庫(kù)的總質(zhì)粒通過(guò)使用質(zhì)粒分離試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)分離。將來(lái)自于核心TFPs的17個(gè)0RFs和實(shí)施例15中制備的18個(gè)ORFs的兩個(gè)單向缺失的文庫(kù)的DNAs組合用于進(jìn)一步分析。為了從35個(gè)ORFs的單向缺失的DNA片段文庫(kù)中篩選適合的TFPs,—個(gè)編碼人白細(xì)胞介素-2(ML2)的基因插入該文庫(kù)和dSUC2之間。含有人IL2基因和500bpSUC2的N末端部分的插入片段使用如實(shí)施例8中描述的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖11)。此片段與含有35個(gè)ORFs的單向缺失的DNA片段文庫(kù)的Swal消化的載體共轉(zhuǎn)染至釀酒酵母菌Y2805AgallAsuc2(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在UD培養(yǎng)基(0.67。/。無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)和YPSGA培養(yǎng)基(P/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3%半乳糖、l嗎/ml抗菌素A和2%瓊脂)上且在30。C培養(yǎng)5天。從UD平板上獲得大約2x104個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而從YPSGA中獲得大約數(shù)百個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。隨機(jī)選擇24個(gè)生長(zhǎng)在YPSGA上的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在YPDG肉湯培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)中培養(yǎng)且在30。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40y。。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍干燥沉淀且重懸于lxSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中并用12。/。SDS-PAGE分析(圖26)。大多數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞可將人IL-2分泌至培養(yǎng)液上清中但是它們之間具有不同水平。從每個(gè)分泌人IL-2的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離出總DNA且再將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。使用質(zhì)粒提取試劑盒(Bioneer,Korea)從大腸桿菌中分離出質(zhì)粒。為了分析每個(gè)TFP的序列,一個(gè)結(jié)合于GAL10啟動(dòng)子的測(cè)序引物GAL100-F(SEQIDNO:12)用于所有含有TFPs的質(zhì)粒。核苷酸序列由GenotechCo.(Taejon,Korea)使用自動(dòng)化測(cè)序設(shè)備(ABIPrism377;PEBiosystems,FosterCity,CA,USA)來(lái)確定。這些序列通過(guò)酵母菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(www.veastgenome.org)的BLAST搜索來(lái)分析。結(jié)果從分泌人IL-2的18個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離出的質(zhì)粒中鑒定出六個(gè)新TFPs。分離的質(zhì)粒分別命名為pYIL-TFP40、pYIL-TFP50、pYIL43-TFP51、pYIL-TFP57、pYIL-TFP58和pYIL-TFP59。這六個(gè)新TFPs概述于表4中。表4基于序列選擇的開(kāi)放閱讀框架(ORFs)中分泌人IL-2的TFPs<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>實(shí)施例17在核心TFPs間交換前(pre)和原(pro)信號(hào)序列人工合成TFPs迄今為止,來(lái)自于結(jié)合(mating)因子a(MFa)的酵母分泌信號(hào)已被廣泛用于酵母中各種重組蛋白質(zhì)的分泌(Romanos等人,Yeast8:423(1992))。該分泌信號(hào)包含19個(gè)氨基酸的前信號(hào)和66個(gè)氨基酸的原信號(hào)。原信號(hào)的準(zhǔn)確功能還不確定但是已知它對(duì)于一些蛋白質(zhì)的正確折疊和分泌十分重要。這一事實(shí)還在酵母中的一些重組蛋白質(zhì)分泌中進(jìn)行了研究(Chaudhuri等人,Eur.J.Biochem.206:793(1992))。在本發(fā)明中,兩個(gè)分泌信號(hào)TFP-3和TFP-22被鑒定為前-原(pre-pro)類(lèi)型。為了擴(kuò)大本發(fā)明中選擇的TFPs的用途,設(shè)計(jì)了具有不同起源的前和原信號(hào)的人工TFPs。使用TFP-l、2、3和4的前信號(hào)和一個(gè)常用的結(jié)合因子a的原信號(hào)構(gòu)建四個(gè)人工TFPs,并將獲得的TFPs命名為T(mén)FP-5、6、7和8。為了使這4個(gè)不同的前信號(hào)和一個(gè)常用的原信號(hào)間進(jìn)行融合,使用了重疊延伸PCR。分別使用引物對(duì)Tl-F(SEQIDNO:187)和Tl-R(SEQIDNO:188)、T2-F(SEQIDNO:189)和T2-R(SEQIDNO:190)、T3-F(SEQIDN。:191)和T3-R(SEQIDNO:192)、T4-F(SEQIDNO:193)和T4-R(SEQIDNO:194)根據(jù)質(zhì)粒pYIL-KRTFP1、2、3和4(WO2005/268658)進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增4個(gè)TFPs的4個(gè)不同的前信號(hào)。還使用引物MF-Pro-F(SEQIDNO:195)和MF-R(SEQIDNO:196)從質(zhì)粒YEGa-HIR525中單獨(dú)進(jìn)行另一PCR以擴(kuò)增大約l卯bp結(jié)合因子a的原信號(hào)。然后分別使用4個(gè)不同正向引物即T1陽(yáng)F(SEQIDNO:187)、T2-F(SEQIDNO:189)、T3-F(SEQIDNO:191)和T4-F(SEQIDNO:193)和一個(gè)常用反向引物MF-R(SEQIDNO:196)對(duì)第一步中擴(kuò)增的4組2個(gè)DNA片段、4個(gè)前信號(hào)和一個(gè)MFa原信號(hào)來(lái)進(jìn)行第二步PCRs用于4個(gè)不同的前-原信號(hào)。為了比較每個(gè)人工前-原信號(hào)序列與結(jié)合因子a的效率,結(jié)合因子a的前-原信號(hào)還使用引物MF-Pre-F(SEQIDNO:197)和MF-R(SEQIDNO"196)從YEGa-HIR525中進(jìn)行PCR擴(kuò)53增。選擇靶蛋白人胰島素樣生長(zhǎng)因子(hIGF)檢測(cè)前-信號(hào)序列。已報(bào)道結(jié)合因子a的原信號(hào)對(duì)在酵母中分泌人胰島素樣生長(zhǎng)因子十分必要(Chaudhuri等人,Eur.J.Biochem.206:793(1992))。人IGF基因使用引物KR-IGF-F(SEQIDNO:198)和IGF-R(SEQIDNO:199),人人cDNA文庫(kù)(ESChoi,KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology,Korea)進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增,然后使用LNK40(SEQIDNO:23)和IGF-R(SEQIDNO:199)進(jìn)行第二步PCR。含有IGF的DNA片段與使用5個(gè)正向引物,即Tl-F(SEQIDNO:187)、T2-F(SEQIDNO:189)、T3-F(SEQIDNO:191)、T4-F(SEQIDNO:193)、MF-Pre-F(SEQIDNO:197)和一個(gè)常用反向引物IGF-R(SEQIDNO:199)先前擴(kuò)增的5個(gè)含有前-原信號(hào)的PCR片段融合。所有融合的PCR產(chǎn)物用Sffl和Sail消化然后將其亞克隆至Sfil-Sall消化的載體YGalINV(圖6)中。獲得的質(zhì)粒分別命名為pYGa-Tla-IGF、pYGa-T2a-IGF、pYGa-T3a-IGF、pYGa-T4a-IGF和pYGa-MFa-IGF。將這五個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805(Mataura3pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在UD培養(yǎng)基(0.67。/。無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77gZl氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上。分離每個(gè)轉(zhuǎn)化的單一菌落并在YPDG(1。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)中30。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40%。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍干燥沉淀且將其重懸于1xSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中并用12%SDS-PAGE分析。分泌的IGF使用hIGF抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步分析(圖27)。所有檢測(cè)的前-原分泌信號(hào)可將人IGF分泌至培養(yǎng)液上清中但是具有不同效率。在5個(gè)前-原信號(hào)中,發(fā)現(xiàn)T3a(TFP-3的前信號(hào)和MFa的原信號(hào))和T4a(TFP-4的前信號(hào)和MFa的原信號(hào))對(duì)分泌人IGF有效。四個(gè)人工TFPs和一個(gè)新TFP概述于表5中。表5分泌人IGF的新TFPs<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>實(shí)施例18通過(guò)體內(nèi)重組構(gòu)建適用于許多把基因的被選擇的TFP載體本發(fā)明中選擇的三十五個(gè)TFPs(核心TFPs)(來(lái)自WO2005/068658的4個(gè)TFPs、實(shí)施例10和11中使用兩個(gè)報(bào)告蛋白選擇的14個(gè)TFPs、實(shí)施例15中BLAST搜索選擇的ORFs中的6個(gè)TFPs、實(shí)施例16中編碼預(yù)先選4奪的TFPs的單向缺失的ORFs中的6個(gè)TFPs、實(shí)施例17中人工設(shè)計(jì)的TFPs中的5個(gè)TFPs)可能對(duì)分泌其它蛋白質(zhì)有效。為了使大量的靶基因能使用這些載體,核心TFP載體使用靶基因通過(guò)體內(nèi)重組重建。為了構(gòu)建質(zhì)粒YGaSW,使用引物GAL100-F(SEQIDNO:12)和H77-1-R(SEQIDNO:78)從YGadV45(圖IO)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增含有EcoRI、2Sfil、Notl、含有一個(gè)Kex2p識(shí)別位點(diǎn)的連接DNA、Swal和Sail位點(diǎn)的170bp片段。將EcoRI-SalI消化的PCR片段亞克隆至EcoRI-SalI消化的YGadV45上,獲得的質(zhì)粒命名為YGaSW。此質(zhì)粒包含EcoRI、Sfil、Notl、Sfil的限制性酶切位點(diǎn)、一個(gè)40bp連接子和GAL10啟動(dòng)子和GAL7終止子之間的限制性酶切位點(diǎn)Swal和Sall。凝膠純化每個(gè)核心TFP且將其亞克隆至Sfil消化的YGaSW上,獲得的35個(gè)質(zhì)粒分別命名為YGaSW-TFPl、YGaSW-TFP2、YGaSW-TFP3、YGaSW-TFP4、YGaSW-TFP5、YGaSW-TFP6、YGaSW-TFP7、YGaSW-TFP8、YGaSW-TFP9、YGaSW-TFPll、YGaSW-TFP13、YGaSW-TFP17、YGaSW-TFP19、YGaSW陽(yáng)TFP20、YGaSW-TFP21、YGaSW-TFP22、YGaSW-TFP27、YGaSW-TFP29、YGaSW-TFP32、YGaSW-TFP34.YGaSW-TFP39,YGaSW-TFP40,YGaSW-TFP43,YGaSW-TFP44,YGaSW墨TFP50、YGaSW-TFP51、YGaSW-TFP52、YGaSW-TFP54,YGaSW-TFP58和YGaSW-TFP59。實(shí)施例19用于人生長(zhǎng)激素分泌而選擇的核心TFPs的評(píng)價(jià)檢測(cè)本發(fā)明選擇的核心TFPs對(duì)人生長(zhǎng)激素(hGH)的分泌。使用引物hGH-F(SEQIDYGaSW-TFP18、YGaSW-TFP25、YGaSW-TFP38、YGaSW-TFP48、YGaSW-TFP57、NO:79)和hGH-R(SEQIDNO:80)PCR擴(kuò)增從人cDNA文庫(kù)(ESChoi,KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology,Korea)中人GH基因且將其亞克隆至pST-Bluel(Novagen,USA)。獲得的質(zhì)粒命名為pST-hGH。使用引物KR-hGH-F(SEQIDNO:81)和hGH-Sal-R(SEQIDNO:82)對(duì)pST-hGH進(jìn)行第二步PCR。含有hGH基因的PCR產(chǎn)物用于使用引物L(fēng)NK40(SEQIDNO:23)和GT70-R(SEQIDNO:83)的第三步PCR以加入與實(shí)施例18中構(gòu)建的YGaSW-TFP載體相同的序列。擴(kuò)增的PCR片段與Swal消化的YGaSW-TFP載體以2:1混合且通過(guò)體內(nèi)重組轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805(Mataura3SUC2pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在UD培養(yǎng)基(0.67。/。無(wú)氨基酸酵母氮源、0."g/1氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上涂板在30°C培養(yǎng)3天。將每個(gè)轉(zhuǎn)化的單一菌落接種至YPDG肉湯培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)中且在30°C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40%。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍千燥沉淀且將其重懸于1xSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中并用12%SDS-PAGE分析。如圖22所示,大多數(shù)TFPs可將人生長(zhǎng)激素分泌至培養(yǎng)液上清中。其中具有pYGT21-hGH的菌抹被檢測(cè)到在補(bǔ)料發(fā)酵中的分泌水平。在所示時(shí)間點(diǎn)取樣的10pl培養(yǎng)液上清用SDS-PAGE分析(圖23)。大約500mg/l人生長(zhǎng)激素分泌至培養(yǎng)液上清中。實(shí)施例20用于分泌人胱天蛋白酶-1亞基P10而選擇的核心TFPs的評(píng)價(jià)檢測(cè)本發(fā)明中選擇的核心TFPs對(duì)人胱天蛋白酶-1亞基pl0(hP10)的分泌。使用引物KR-hP10-F(SEQIDNO:210)和hP10-Sal-R(SEQIDNO:211)對(duì)人cDNA文庫(kù)(ESChoi,KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology,Korea)中的人p10基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。含有hPIO基因的PCR產(chǎn)物用于使用引物L(fēng)NK40(SEQIDNO:23)和GT70-R(SEQIDNO:83)的第二步PCR以加入與實(shí)施例18中構(gòu)建的YGaSW-TFP載體相同的序列。擴(kuò)增的PCR片段與Swal消化的YGaSW-TFP載體以2:1混合且通過(guò)體內(nèi)重組轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805(Mataura3SUC2pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在UD培養(yǎng)基(0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上涂板并在30°C培養(yǎng)3天。每個(gè)轉(zhuǎn)化的單一菌落接種至YPDG肉湯培養(yǎng)基(P/。酵母提取物、2。/。細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)中且在30。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40%。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍干燥沉淀且將其重懸于1xSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中并用12%SDS-PAGE進(jìn)行分析。如圖28所示,僅含有前-原信號(hào)的4個(gè)人工TPFs可將hPIO分泌至培養(yǎng)液上清中。正如在hIGF中發(fā)現(xiàn)的情況一樣,原信號(hào)對(duì)在酵母中適當(dāng)分泌人胱天蛋白酶-1亞基P10是必須的。實(shí)施例21用于分泌人白細(xì)胞介素-32y而選擇的核心TFPs的評(píng)價(jià)檢測(cè)本發(fā)明中選擇的核心TFPs對(duì)人白細(xì)胞介素-32y(WL32Y)的分泌。使用引物KR-ML32g-F(SEQIDNO:212)和hlL32g-Sal陽(yáng)R(SEQIDNO:213)對(duì)pGMT墨I(xiàn)L32了(DYYoon,KonkukUniversity,Korea)中的編碼人白細(xì)胞介素32剪接變體y的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。含有hlL32y基因的PCR產(chǎn)物用于使用引物L(fēng)NK40(SEQIDNO:23)和GT70-R(SEQIDNO:83)進(jìn)行第二步PCR以加入與實(shí)施例18中構(gòu)建的YGaSW-TFP載體相同的序列。擴(kuò)增的PCR片段與Swal消化的YGaSW-TFP載體以2:1混合且通過(guò)體內(nèi)重組將其轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805(Mataura3SUC2pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在UD培養(yǎng)基(0.67。/。無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上涂板并在30°C培養(yǎng)3天。將每個(gè)轉(zhuǎn)化的單一菌落接種至YPDG肉湯培養(yǎng)基(l。/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)中且在30。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40。/。。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍干燥沉淀且將其重懸于1xSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中并用12%SDS-PAGE進(jìn)行分析。在所有檢測(cè)的TFPs中,TFP3和TPF27鑒定為對(duì)分泌人IL-32丫有效(圖29)。實(shí)施例22從釀酒酵母中選擇的巴斯德畢赤酵母的TFP文庫(kù)本發(fā)明的TFP選擇方法還可應(yīng)用于其它來(lái)源的基因組或cDNA問(wèn)庫(kù)。使用巴斯德畢赤酵母菌(P.pastoris)作為mRNA來(lái)源的實(shí)例。從巴斯德畢赤酵母菌GS115(Invitrogen,USA)中分離出總RNA來(lái)構(gòu)建cDNA文庫(kù)。酵母在YPD培養(yǎng)基(2。/。酵母提取物、1%細(xì)菌用蛋白胨和2%葡萄樣)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期指數(shù)期??俁NA用Elion等人描述(Elion等人,Cell39:6"(1984))的方法從巴斯德畢赤酵母中分離出來(lái)。使用OligotexmRNA試劑盒(Qiagen,Germany)從總認(rèn)A中純化poly(A)+mRNA。cDNA使用SMARTcDNA合成試劑盒(BDBioscience,USA)從分離的mRNA中合成出來(lái)。一個(gè)特別設(shè)計(jì)的引物ASA24N6(SEQIDNO:16)代替SMART試劑盒中包括的引物用于合成cDNA的第一條鏈,如實(shí)施例4中描述(圖8)。引物ASA24N6由于其隨機(jī)六核苷酸序列可隨機(jī)結(jié)合于mRNA的任何位置。因此大多數(shù)使用此方法擴(kuò)增的cDNA的第一條鏈含有編碼酵母基因N末端部分的5'端部分序列。帶有5,端部分序列的cDNA第一條鏈文庫(kù)用作合成雙鏈cDNA的PCR模板,其中使用SMART試劑盒(BDBioscience,USA)5'端PCR引物和引物ASA24(SEQIDNO:17)。使用此方法制備的PCR產(chǎn)物包含大量?jī)啥藥в蠸fil位點(diǎn)的cDNA的5'端部分片段。PCR條件包括如試劑盒介紹的一次95。C20秒的循環(huán)和20次95。C30秒、68。C6分鐘的循環(huán)。擴(kuò)增的cDNA用苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:l)處理,并用2體積乙醇和0.1體積3M乙酸鈉(pH5.0)沉淀。獲得的cDNA用Sfil在50。C消化2小時(shí)然后用瓊脂糖凝膠電泳分離。0.5-lkb的DNA使用凝膠提取試劑盒(Bioneer,Korea)從凝膠中分離出來(lái)。提取的DNA連接至Sfil消化的YGaINV載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨千西林的LB培養(yǎng)基(l。/。細(xì)菌用蛋白胨、0,5%酵母提取物、l%NaCl和50昭/ml氨千西林)上涂板且37°C培養(yǎng)過(guò)夜。大約4x104個(gè)大腸桿菌菌落混合至無(wú)菌蒸餾水中,并使用質(zhì)粒分離試劑盒(Bioneer,Korea)來(lái)分離含有合成的cDNA文庫(kù)的總質(zhì)粒,其中該cDNA文庫(kù)通過(guò)融合于SUC2基因的隨機(jī)引物合成。為了從巴斯德畢赤酵母菌種中選擇分泌轉(zhuǎn)化酶的TFP文庫(kù),將DNA文庫(kù)根據(jù)醋酸鋰方法(Hill等人,NucleicAcidsRes.19:5791(1991》轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805AgallAsuc2(Mataura3suc2::Tc190pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在UD培養(yǎng)基(0.67%無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)和YPSGA培養(yǎng)基(P/。酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%蔗糖、0.3%半乳糖、l嗎/ml抗菌素A和2%瓊月旨)上且在30°C培養(yǎng)4-6天。大約1000個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞從巴斯德畢赤酵母的cDNA文庫(kù)中獲得。隨機(jī)選擇生長(zhǎng)在YPSGA培養(yǎng)基上的五個(gè)不同轉(zhuǎn)化細(xì)胞且使用玻璃珠從每個(gè)菌落的培養(yǎng)細(xì)胞中分離出總DNA。然后用乙醇沉淀DNA。分離的DNA再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。大腸桿菌在含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基(l。/。細(xì)菌用蛋白胨、0.5%酵母提取物、1。/。NaCl和50嗎/ml氨千西林)上涂板且在37。C培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒(Bioneer,Korea)從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中分離出質(zhì)粒。為了分析每個(gè)從巴斯德畢赤酵母cDNA中獲得的TFP的序列,使用一個(gè)結(jié)合于GAL10啟動(dòng)子的測(cè)序引物GAL100-F(SEQIDNO:12)。核香酸序列由Ge加techCo.(Taejon,Korea)使用自動(dòng)化測(cè)序設(shè)備(ABIPrism377;PEBiosystems,FosterCity,CA,USA)來(lái)確定。這些序列用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST搜索檢觀'J。結(jié)果從5個(gè)選擇的菌落中分離的質(zhì)粒中鑒定出四個(gè)不同的巴斯德畢赤酵母TFPs。分離的質(zhì)粒命名為pYHTS-PpTEPl、pYHTS-PpTEP2、pYHTS-PpTEP3和pYHTS-PpTEP4。這四個(gè)分離自巴斯德畢赤酵母的TFPs概述于表6中。表6從巴斯德畢赤酵母中分離的TFPs<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實(shí)施例23使用人IL2評(píng)價(jià)來(lái)自巴斯德畢赤酵母的TFPs使用人IL-2來(lái)檢測(cè)表6中概述的四個(gè)巴斯德畢赤酵母TFPs在釀酒酵母菌中的分泌效率。對(duì)質(zhì)粒pYHTS-PpTFPl、pYHTS-PpTFP2、pYHTS-PpTFP3和pYHTS-PpTFP4中的每個(gè)PpTEP進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別使用引物對(duì)PpTFPl-F(SEQIDNO:227)和PpTFPl-R(SEQIDNO:228)、PpTFP2-F(SEQIDNO:229)和PpTFP2-R(SEQIDNO:230)、PpTFP3-F(SEQIDNO:231)和PpTFP3-R(SEQIDNO:232)、PpTFP4陽(yáng)F(SEQIDNO:233)和PpTFP4-R(SEQIDNO:234)對(duì)。用Sfil消化凝膠純化的PCR片段且亞克隆至Sfil消化的YGaSW載體(圖IO)上,獲得的質(zhì)粒分別命名為YGaSW-PpTFPl、YGaSW-PpTFP2、YGaSW-PpTFP3和YGaSW-PpTFP4。被擴(kuò)增的PCR片段含有人IL-2基因,其中人IL-2基因上含有與YGaSW-PpTFP載體相同的序列,將該被擴(kuò)增的PCR片段與Swal消化的YGaSW-PpTFP載體以2:1混合且通過(guò)體內(nèi)重組轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌Y2805(Mataura3SUC2pep4::HIS3gallcanl)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在UD培養(yǎng)基(0.67。/。無(wú)氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上涂板在30°C培養(yǎng)3天。每個(gè)轉(zhuǎn)化的單一菌落接種至YPDG肉湯培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2。/。細(xì)菌用蛋白胨、1%葡萄糖和1%半乳糖)中且在30。C培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)液上清(0.6ml)與冷丙酮混合至丙酮終濃度40%。在-20。C培養(yǎng)2小時(shí)后,蛋白質(zhì)通過(guò)10000xg離心15分鐘沉淀。冷凍干燥沉淀且重懸于1xSDS-PAGE樣品緩沖液(Bio-Rad,USA)中并用12%SDS-PAGE進(jìn)行分析。如圖30所示,所有PpTFPs可將人白細(xì)胞介素-2分泌至培養(yǎng)液上清中,顯示了這兩種酵母間TFP的相容性。根據(jù)本發(fā)明的完整描述,本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在不影響本發(fā)明的范圍或其任何實(shí)施方案的情況下,在廣泛和同等范圍的條件、成分和其它參數(shù)下可以進(jìn)行同樣的方案。本文所引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物全部是全文《i入本文作為參考。權(quán)利要求1.鑒定靶蛋白特異的翻譯融合配偶體(TFP)的方法,所述方法包括(i)用多個(gè)線性載體和一個(gè)編碼靶蛋白的核酸共轉(zhuǎn)化多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞來(lái)制備多個(gè)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,其中每個(gè)所述線性載體包含一個(gè)來(lái)自于核酸片段文庫(kù)中的核酸片段和一個(gè)編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核苷酸序列,和其中所述編碼靶蛋白的核酸在3’末端包含一個(gè)編碼N末端氨基酸的核苷酸序列,其中在所述線性載體內(nèi)所述報(bào)告蛋白缺乏該N末端氨基酸,并在5’末端包含一個(gè)連接DNA;(ii)在允許所述線性載體和所述編碼靶蛋白的核酸體內(nèi)重組的有效條件下培養(yǎng)所述的多個(gè)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;(iii)從(ii)中的多個(gè)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中鑒定出顯示報(bào)告蛋白活性的細(xì)胞;和(iv)從(iii)中鑒定的細(xì)胞中鑒定出TFP;其中所述TFP包含誘導(dǎo)所述靶蛋白分泌的核酸片段。2.鑒定靶蛋白特異的TFP文庫(kù)的方法,所述方法包括(i)用多個(gè)線性載體和一個(gè)編碼靶蛋白的核酸共轉(zhuǎn)化多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞來(lái)制備多個(gè)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,其中每個(gè)所述的線性載體包含一個(gè)來(lái)自于核酸片段文庫(kù)的核酸片段和一個(gè)編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核普酸序列,和其中所述編碼耙蛋白的核酸在3'末端包含一個(gè)編碼N末端氨基酸的核苷酸序列,其中在所述線性載體內(nèi)所述報(bào)告蛋白缺乏該N末端氨基酸,并在5'末端包含一個(gè)連接DNA;(ii)在允許所述線性載體和所述編碼靶蛋白的核酸體內(nèi)重組的有效條件下培養(yǎng)多個(gè)所述被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;(iii)從(ii)中的多個(gè)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中鑒定出顯示報(bào)告蛋白活性的細(xì)胞;和(iv)從(iii)中鑒定的細(xì)胞中鑒定出TFP文庫(kù);其中所述TFP文庫(kù)包含單獨(dú)誘導(dǎo)所述靶蛋白分泌的核酸片段。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述核酸片段文庫(kù)來(lái)自植物、細(xì)菌、酵母、真菌或動(dòng)物的基因組DNA或cDNA。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述核酸片段文庫(kù)來(lái)自重組DNA。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中所述酵母選自念珠菌屬、德巴利酵母屬、漢森酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬、耶羅威亞酵母屬、酵母菌、許旺酵母屬和Arxula屬。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其中所述酵母選自產(chǎn)朊假絲酵母、博伊丁假絲酵母、白色念珠菌、產(chǎn)乳糖酶酵母、巴斯德畢赤酵母、木糖發(fā)酵酵母、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、多形漢森酵母、解脂耶氏酵母、西方許旺酵母和Arxulaadeninivorans。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中所述真菌選自曲霉屬、青霉屬、根霉屬和木霉屬。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中所述細(xì)菌選自埃希菌屬、假單胞桿菌屬和桿菌屬。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中所述植物選自擬南芥、玉米、煙草和馬鈴薯。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中所述動(dòng)物選自人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓和猴。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述核酸片段文庫(kù)是預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法,其中所述的預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)是通過(guò)用包含核酸片段文庫(kù)和編碼報(bào)告蛋白的核酸的多個(gè)載體轉(zhuǎn)化多個(gè)報(bào)告蛋白缺乏的宿主細(xì)胞、收集生長(zhǎng)的細(xì)胞、從該細(xì)胞中分離出載體,和從該載體中分離出核酸片段,從而獲得包含單獨(dú)誘導(dǎo)報(bào)告蛋白分泌的核酸片段的TFP文庫(kù)來(lái)獲得。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法,其中所述預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)來(lái)源于在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)鑒定的序列,該序列通過(guò)搜索(i)含有與那些一個(gè)或多個(gè)預(yù)先鑒定了的TFPs同源的前分泌信號(hào)的基因;(ii)包含分泌信號(hào)序列的基因;或(iii)編碼穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)的基因而獲得。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法,其中所述的預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)是通過(guò)改變先前鑒定了的TFPs獲得的。15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法,其中所述的預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)是通過(guò)人工設(shè)計(jì)核酸片段獲得的,其中所述的核酸片段的前和原信號(hào)序列在先前鑒定了的TFPs之間進(jìn)行互換。16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法,其中所述的預(yù)先選定的候選TFPs文庫(kù)是核心TFPs文庫(kù),其中所述的核心TFPs是先前鑒定對(duì)一個(gè)或多個(gè)靶蛋白有效的TFPs的集合。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述的核酸片段大小少于1000個(gè),咸基對(duì)。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法,其中所述核酸片段大小少于700個(gè)堿基對(duì)。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中所述核酸片段大小少于500個(gè)堿基對(duì)。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法,其中所述核酸片段大小少于300個(gè)堿基對(duì)。21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述核酸片段文庫(kù)是通過(guò)DNA的酶斷裂構(gòu)建的。22.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述核酸片段文庫(kù)是通過(guò)cDNA合成構(gòu)建的。23.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述核酸片段文庫(kù)是通過(guò)重組DNA技術(shù)構(gòu)建的。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法,其中所述重組DNA技術(shù)包含單向缺失。25.根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述宿主細(xì)胞選自植物、細(xì)菌、真菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法,其中所述酵母選自念珠菌屬、德巴利酵母屬、漢森酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬、耶羅威亞酵母屬、酵母菌、許旺酵母屬和Arxula屬。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法,其中所述酵母選自產(chǎn)朊假絲酵母、博伊丁假絲酵母、白色念珠菌、產(chǎn)乳糖酶酵母、巴斯德畢赤酵母、木糖發(fā)酵酵母、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、多形漢森酵母、解脂耶氏酵母、西方許旺酵母和Arxulaadeninivorans。28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法,其中所述真菌選自選自曲霉屬、青霉屬、根霉屬和木霉屬。29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法,其中所述細(xì)菌選自埃希菌屬、假單胞桿菌屬和桿菌屬。30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法,其中所述植物選自擬南芥、玉米、煙草和馬鈴薯。31.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法,其中所述動(dòng)物選自人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、猴和昆蟲(chóng)。32,根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法,其中所述動(dòng)物細(xì)胞選自CHO、C0S1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10和Sf9。33.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞,且所述核酸片段是從酵母的基因組或cDNA中分離出來(lái)的。34.根據(jù)權(quán)利要求1-33中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述報(bào)告蛋白是分泌至細(xì)胞外間隙的蛋白質(zhì)。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法,其中所述報(bào)告蛋白選自轉(zhuǎn)化酶、蔗糖酶、纖維素酶、木聚糖酶、麥芽糖酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖香酶、磷酸酶、p-內(nèi)酰胺酶、脂肪酶或蛋白酶。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中所述半乳糖苷酶選自a-半乳糖苷酶、|3-半乳糖苷酶和蜜二糖酶。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法,其中所述報(bào)告蛋白是蜜二糖酶。38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中所述磷酸酶是PH05。39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中所述宿主細(xì)胞是酵母,所述報(bào)告蛋白是轉(zhuǎn)化酶且所述被轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞是根據(jù)它們?cè)谡崽腔蛎拮犹巧仙L(zhǎng)的能力來(lái)選擇的。40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中所述宿主細(xì)胞是酵母,所述報(bào)告蛋白是淀粉酶,所述酵母細(xì)胞是非淀粉分解酵母細(xì)胞,且所述被轉(zhuǎn)化細(xì)胞是通過(guò)其降解淀粉的能力來(lái)篩選的。41.根據(jù)權(quán)利要求1-33中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述鑒定細(xì)胞顯示報(bào)告蛋白活性的步驟是通過(guò)使用對(duì)生長(zhǎng)抑制因子具有抗性的報(bào)告蛋白來(lái)進(jìn)行的。42.根據(jù)權(quán)利要求1-41中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述鑒定細(xì)胞顯示報(bào)告蛋白活性的步驟是通過(guò)使用兩個(gè)或多個(gè)報(bào)告蛋白來(lái)進(jìn)行的。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法,其中所述鑒定細(xì)胞顯示報(bào)告蛋白活性的步驟是通過(guò)使用兩個(gè)報(bào)告蛋白來(lái)進(jìn)行的。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法,其中所述兩個(gè)報(bào)告蛋白是脂肪酶和轉(zhuǎn)化酶。45.根據(jù)權(quán)利要求1-44中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述靶蛋白來(lái)自植物、動(dòng)物或微生物。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法,其中所述靶蛋白是人類(lèi)蛋白質(zhì)。47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法,其中所述靶蛋白是細(xì)胞因子、血清蛋白、集落刺激因子、生長(zhǎng)因子、激素或酶。48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法,其中所述乾蛋白選自白細(xì)胞介素、凝結(jié)因子、干擾素-a、-p或-y、粒細(xì)胞集落刺激因子、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組織生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子、TGFa、TGF(3、表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促卵泡激素、促曱狀腺激素、血管升壓素、色素性激素、曱狀旁腺激素、促黃體生成激素釋放激素、碳水化合物特異性酶、蛋白水解酶、脂肪酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶、免疫球蛋白、細(xì)胞因子受體、乳鐵蛋白、磷脂酶A2激活蛋白、胰島素、腫瘤壞死因子、降《丐素、降鈣素基因相關(guān)肽、腦啡肽、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、促紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、絨毛膜促性腺激素、組織纖溶酶原激活物、生長(zhǎng)激素釋放肽、胸腺體液因子、抗癌肽或抗菌肽。49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法,其中所述靶蛋白選自人白細(xì)胞介素-2、人白細(xì)胞介素-l卩、人白細(xì)胞介素-6、人白細(xì)胞介素-32a、-32卩或-32y、VII因子、VIII因子、IX因子、人血清白蛋白、人干擾素-a、-p或-y、人粒細(xì)胞集落刺激因子、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、人生長(zhǎng)激素、人血小板衍生生長(zhǎng)因子、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人表皮生長(zhǎng)因子、人胰島素樣生長(zhǎng)因子、人神經(jīng)生長(zhǎng)因子、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩-1、人促卵泡激素、葡萄糖氧化酶、glucodase、半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、葡糖醛酸糖苷酶、門(mén)冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨基酶、過(guò)氧化物歧化酶、endotoxinase、過(guò)氧化氫酶、糜蛋白酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、膽紅素氧化酶、牛1-磷酸半乳糖尿苷酸轉(zhuǎn)移酶、水母綠色萸光蛋白、南極假絲酵母脂肪酶B、假絲酵母脂肪酶、真菌氯過(guò)氧化物酶、(3-半乳糖苷酶、解離酶、a-半乳糖香酶、p-葡萄糖香酶、海藻糖合酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、木聚糖酶、植酸酶、人乳鐵蛋白、人促紅細(xì)胞生成素、人對(duì)氧磷酶、人生長(zhǎng)分化因子15、人半乳凝素-3結(jié)合蛋白、人絲氨酸蛋白酶抑制劑、Kunitz2型、人Janus激酶2、人FMS樣酪氨酸激酶3配體、人YM1&2、人CEMI、人二?;视王;D(zhuǎn)移酶、人瘦蛋白、人mL259、人蛋白水解酶3、人溶菌酶、人DEAD盒蛋白41、人依托泊苷誘導(dǎo)蛋白24、鼠細(xì)胞凋亡蛋白酶l、牛血管生成因子和蟲(chóng)丘賴(lài)圳激酶。50.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法,其中所述把蛋白是使用常規(guī)重組生產(chǎn)方法難以制備的蛋白質(zhì)。51.根據(jù)權(quán)利要求1-50中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述連接DNA長(zhǎng)度大于20個(gè);威基對(duì)。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法,其中所述連接DNA長(zhǎng)度大于30個(gè)堿基對(duì)。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法,其中所述連接DNA長(zhǎng)度大于40個(gè)堿基對(duì)。54.根據(jù)權(quán)利要求1-53中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述連接DNA編碼一個(gè)蛋白水解酶識(shí)別序列從而允許在TFP和靶蛋白的連接處斷裂。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法,其中所述連接DNA編碼酵母kex2p識(shí)別序列。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法,其中所述連接DNA編碼包含Lys-Arg或Arg-Arg的氨基酸序列。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法,其中所述連接DNA編碼包含Leu-Asp-Lys-Arg(SEQIDNO:214)的氨基酸序列。58.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法,其中所述連接DNA編碼哺乳動(dòng)物弗林蛋白酶識(shí)別序列。59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法,其中所述連接DNA編碼包含Arg-X-X-Arg的氨基酸序列。60.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法,其中所述連接DNA編碼Xa因子識(shí)別序列。61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法,其中所述連接DNA編碼包含Ile-Glu-Gly-Arg(SEQIDNO:215)的氨基酸序列。62.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法,其中所述連接DNA編碼腸激酶識(shí)別序列。63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法,其中所述連接DNA編碼包含Asp-Asp-Lys的氨基酸序列。64.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法,其中所述連接DNA編碼枯草桿菌蛋白酶識(shí)別序列。65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法,其中所迷連接DNA編碼包含Ala-Ala-His-Tyr(SEQIDNO:216)的氨基酸序列。66.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法,其中所述連接DNA編碼煙草蝕紋病毒蛋白水解酶識(shí)別序列。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法,其中所述連接DNA編碼包含Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(SEQIDNO:217)的氨基酸序列。68.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法,其中所述連接DNA編碼凝血酶識(shí)別序列。69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法,其中所述連接DNA編碼包含Arg-Gly-Pro-Arg(SEQIDNO:218)的氨基酸序列。70.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法,其中所述連接DNA編碼遍在蛋白質(zhì)水解酶識(shí)別序列。71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法,其中所述連接DNA編碼包含Arg-Gly-Gly的氨基酸序列。72.根據(jù)權(quán)利要求1-71中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述連接DNA編碼親和標(biāo)記物。73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法,其中所述親和標(biāo)記物選自GST、MBP、NusA、硫氧還蛋白、遍在蛋白質(zhì)、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD和S標(biāo)記物。74.根據(jù)權(quán)利要求1-73中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述連接DNA編碼限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法,其中所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)用于Sfil。76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法,其中所述連接DNA還編碼kex2p樣蛋白水解酶或kex2p識(shí)別序列。77.由權(quán)利要求1-76中任一權(quán)利要求所述的方法鑒定的TFP或其片段或衍生物。78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的TFP,其中所述TFP選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP墨17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-11(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP-52(SEQIDNO:137)、TFP-54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP-5(SEQIDNO:200)、TFP-6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)和PpTFP-4(SEQIDNO:90)組成的組或其衍生物或片段。79.TFP文庫(kù),所述TFP文庫(kù)包含一個(gè)或多個(gè)由權(quán)利要求1-76中任一權(quán)利要求所述的方法鑒定的TFPs或其片段或衍生物。80.根據(jù)權(quán)利要求76所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含兩個(gè)或多個(gè)TFPs,所述的TFPs選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-11(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP-52(SEQIDNO:137)、TFP-54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQ1DNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP-5(SEQIDNO:200)、TFP陽(yáng)6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)和PpTFP-4(SEQIDNO:90)組成的組或其片l炎或書(shū)亍生物。81.根據(jù)權(quán)利要求80所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含四個(gè)或更多個(gè)所列的TFPs或其片段或衍生物。82.根據(jù)權(quán)利要求80所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含六個(gè)或更多所列TFPs或其片段或衍生物。83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含八個(gè)或更多所列TFPs或其片段或衍生物。84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含十個(gè)或更多所列TFPs或其片段或衍生物。85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含十二個(gè)或更多所列TFPs或其片段或衍生物。86.根據(jù)權(quán)利要求79所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含六個(gè)或更多TFPs,所述TFPs選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO鄰、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP陽(yáng)20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-11(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP陽(yáng)52(SEQIDNO:137)、TFP-54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP-5(SEQIDNO:200)、TFP-6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)、PpTFP-4(SEQIDNO:90)、TFP-1(SEQIDNO:219)、TFP-2(SEQIDNO:221)、TFP-3(SEQIDNO:223)、TFP-4(SEQIDNO:225)和TFP32(SEQIDNO:208)組成的組或其片段或衍生物。87.才艮據(jù)權(quán)利要求86所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含八個(gè)或更多所列TFPs或其片段或衍生物。88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含十個(gè)或更多所列TFPs或其片段或衍生物。89.根據(jù)權(quán)利要求88所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含十二個(gè)或更多所列TFPs或其片段或衍生物。90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的TFP文庫(kù),其中所述TFP文庫(kù)包含十五個(gè)或更多所列TFPs或其片段或衍生物。91.核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含10個(gè)或更多由權(quán)利要求12所述的方法鑒定的核酸片段。92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含50個(gè)或更多由權(quán)利要求12所述的方法鑒定的核酸片段。93.根據(jù)權(quán)利要求92所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含100個(gè)或更多由權(quán)利要求12所述的方法鑒定的核酸片段。94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含500個(gè)或更多由權(quán)利要求12所述的方法鑒定的核酸片段。95.根據(jù)權(quán)利要求94所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含1000個(gè)或更多由權(quán)利要求12所述的方法鑒定的核酸片段。96.根據(jù)權(quán)利要求95所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含2000個(gè)或更多由權(quán)利要求12所述的方法鑒定的核酸片段。97.核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含10個(gè)或更多由權(quán)利要求13所述的方法鑒定的核酸片段。98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含50個(gè)或更多由權(quán)利要求13所述的方法鑒定的核酸片段。99.根據(jù)權(quán)利要求98所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含100個(gè)或更多由權(quán)利要求13所述的方法鑒定的核酸片段。100.核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含10個(gè)或更多由權(quán)利要求14所述的方法鑒定的核酸片段。101.根據(jù)權(quán)利要求100所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含50個(gè)或更多由權(quán)利要求14所述的方法鑒定的核酸片段。102.根據(jù)權(quán)利要求101所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含100個(gè)或更多由權(quán)利要求14所述的方法鑒定的核酸片段。103.根據(jù)權(quán)利要求102所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含500個(gè)或更多由權(quán)利要求14所述的方法鑒定的核酸片段。104.根據(jù)權(quán)利要求103所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含1000個(gè)或更多由權(quán)利要求14所述的方法鑒定的核酸片段。105.核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含10個(gè)或更多由權(quán)利要求15所述的方法鑒定的核酸片段。106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含50個(gè)或更多由權(quán)利要求15所述的方法鑒定的核酸片段。107.根據(jù)權(quán)利要求106所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含100個(gè)或更多由權(quán)利要求15所述的方法鑒定的核酸片段。108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的核酸片段文庫(kù),其中所述的核酸片段文庫(kù)包含500個(gè)或更多由權(quán)利要求15所述的方法鑒定的核酸片段。109.包含編碼TFP或其片段或衍生物的核苦酸序列和編碼耙蛋白的核酸序列的核酸,其中所述TFP選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP-11(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)、TFP-39(SEQIDNO:129)、TFP-43(SEQIDNO:131)、TFP-44(SEQIDNO:133)、TFP-48(SEQIDNO:135)、TFP-52(SEQIDNO:137)、TFP-54(SEQIDNO:139)、TFP-40(SEQIDNO:175)、TFP-50(SEQIDNO:177)、TFP-51(SEQIDNO:179)、TFP-57(SEQIDNO:181)、TFP-58(SEQIDNO:183)、TFP-59(SEQIDNO:185)、TFP-5(SEQIDNO:200)、TFP-6(SEQIDNO:202)、TFP-7(SEQIDNO:204)、TFP-8(SEQIDNO:206)、PpTFP-l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)和PpTFP-4(SEQIDNO:90)組成的組。110.根據(jù)權(quán)利要求109所述的核酸,其中所述耙蛋白選自IL-2、IL-32、人生長(zhǎng)激素和人胱天蛋白酶-1亞基P10。111.根據(jù)權(quán)利要求109所迷的核酸,其中所述TFP選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、PpTFP陽(yáng)l(SEQIDNO:84)、PpTFP-2(SEQIDNO:86)、PpTFP-3(SEQIDNO:88)、PpTFP-4(SEQIDNO:90)組成的組且所述耙蛋白是IL-2。112.根據(jù)權(quán)利要求109所述的核酸,其中所述TFP選自由TFP-ll(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)組成的組且所述耙蛋白是IL-32a。113.根據(jù)權(quán)利要求109所述的核酸,其中所述TFP選自由TFP-9(SEQIDNO:29)、TFP-13(SEQIDNO:31)、TFP-17(SEQIDNO:33)、TFP-18(SEQIDNO:35)、TFP-19(SEQIDNO:37)、TFP-20(SEQIDNO:39)、TFP-21(SEQIDNO:41)、TFP-25(SEQIDNO:43)、TFP-27(SEQIDNO:45)、TFP墨11(SEQIDNO:61)、TFP-22(SEQIDNO:63)、TFP-29(SEQIDNO:65)、TFP-34(SEQIDNO:67)、TFP-38(SEQIDNO:69)組成的組,且所述耙蛋白是生長(zhǎng)激素。114.制備靶蛋白的方法,其中包含制備載體,所述載體包含編碼所述靶蛋白的核香酸序列,所述核苷酸序列可操作性的連接于編碼由權(quán)利要求1-76中任一方法鑒定的TFP或其片段或衍生物的核香酸序列,用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,和在產(chǎn)生所述靶蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。115.根據(jù)權(quán)利要求114所述的方法,其中所述載體包含權(quán)利要求107所述的核酸。116.根據(jù)權(quán)利要求115所述的方法,其中所述靶蛋白選自IL-2、IL-32、人生長(zhǎng)激素和人胱天蛋白酶-1亞基P10。117.線性載體,其中所述線性載體包含一個(gè)來(lái)自于核酸片段文庫(kù)的核酸片段和一個(gè)編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核苦酸序列。118.根據(jù)權(quán)利要求117所述的線性載體,其中還包含一個(gè)編碼靶蛋白的核苷酸序列。119.用多個(gè)線性載體和一個(gè)編碼把蛋白的核酸轉(zhuǎn)化的多個(gè)報(bào)告蛋白缺失的宿主細(xì)胞,其中每個(gè)所述線性載體包含一個(gè)來(lái)自于核酸片段文庫(kù)的核酸片段和一個(gè)編碼N末端氨基酸缺失的報(bào)告蛋白的核苷酸序列,和其中所述編碼靶蛋白的核酸在3'末端包含一個(gè)編碼N末端氨基酸的核苦酸序列,其中在所述線性載體內(nèi)所述報(bào)告蛋白缺乏所述的N末端氨基酸,并在5'末端包含一個(gè)連接DNA。全文摘要本發(fā)明涉及快速篩選適當(dāng)?shù)姆g融合配偶體(TFPs)的技術(shù),所述的翻譯融合配偶體能夠誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)特別是使用常規(guī)制備方法難以生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的分泌生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101310023SQ200680033245公開(kāi)日2008年11月19日申請(qǐng)日期2006年7月13日優(yōu)先權(quán)日2005年7月15日發(fā)明者孫廷薰,尹成淑,崔毅星,田昌秀,申美景,裴貞勛申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院
網(wǎng)友詢(xún)問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1