專利名稱：核酸擴(kuò)增的檢測(cè)的制作方法
核酸擴(kuò)增的檢測(cè)本申請(qǐng)基于2005年7月15日提交的序列號(hào)60/699,950的美國(guó)臨時(shí)專 利申請(qǐng)和2005年12月9日提交的序列號(hào)60/749，003的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)， 并根據(jù)美國(guó)法典第35編第119條要求它們的權(quán)益，由此它們各自通過引 用并入本申請(qǐng)。引言核酸檢測(cè)可通過多種測(cè)定形式進(jìn)行。所述測(cè)定可為定性的，例如當(dāng)用 于評(píng)估生物樣品時(shí)。然而，許多種生物應(yīng)用可通過檢測(cè)靶核酸的能力得以 改進(jìn)而不需要麻煩的印跡技術(shù)或光學(xué)方法通常所需的昂貴和精密的儀器。附圖簡(jiǎn)述

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案描述與作為擴(kuò)增子模板的多核苷酸 序列雜交的示例擴(kuò)增探針的示意圖。圖2是描述切割來自雜交的核酸絡(luò)合物的側(cè)翼部分(flap moiety)的 示意圖。圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案描述使用檢測(cè)寡核苷酸檢測(cè)聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的示意圖。圖4是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案描述在擴(kuò)增過程中能夠自身引發(fā) 其自身延伸的核S交序列的用途的示意圖。圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案描述包括含有標(biāo)簽序列的發(fā)夾環(huán)的 核酸序列的示意圖。圖6是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案描述在擴(kuò)增過程中與檢測(cè)寡核普酸 互補(bǔ)的可切割標(biāo)簽序列的用途的示意圖。圖7是描述借助于切割的標(biāo)簽和電極表面的相互作用檢測(cè)遠(yuǎn)距離切割 位點(diǎn)的標(biāo)簽序列的示意圖。圖8是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)的示意圖。圖9顯示了通過與對(duì)照反應(yīng)比較進(jìn)行的擴(kuò)增子的電泳分析所證實(shí)的， 標(biāo)簽序列的存在不影響靶序列的PCR擴(kuò)增，如實(shí)施例1所述。圖IO顯示了標(biāo)簽序列的電化學(xué)檢測(cè)，如實(shí)施例1所述。圖11顯示了標(biāo)簽序列的電化學(xué)檢測(cè)的另一個(gè)實(shí)例，如實(shí)施例2所述。圖12是描述在電極上經(jīng)靜電結(jié)合的氧化還原反應(yīng)(redox)中心的標(biāo) 簽;f全測(cè)的示意圖，如實(shí)施例4所述。圖13是描述介導(dǎo)劑化合物的電化學(xué)反應(yīng)的伏安圖，如實(shí)施例7所述。圖14是化合物L(fēng)和l的整合電荷(integrated charge)與DNA濃度的曲 線圖，如實(shí)施例7所述。圖15顯示了化合物21的擴(kuò)增4果針的循環(huán)伏安圖，如實(shí)施例10所述。圖16顯示了化合物7的擴(kuò)增探針的循環(huán)伏安圖，如實(shí)施例IO所述。圖17顯示了標(biāo)簽序列1、 2和3的切割和未切割的標(biāo)簽序列的檢測(cè)之 間的差異，如實(shí)施例11所述。各實(shí)施方案的說明該說明涉及用于檢測(cè)靶多核苷S臾序列的系統(tǒng)的方法。所述方法可包括 在有效使探針形成探針-靶絡(luò)合物的條件下使所述探針與包含至少一種靶 多核苦酉餅列的樣品接觸，其中所述探針自身包含靶互補(bǔ)片段和可檢測(cè)標(biāo) 簽。然后可從所述探針切割所述可檢測(cè)標(biāo)簽，隨后釋放的標(biāo)簽與偶聯(lián)至電 極的標(biāo)簽互補(bǔ)物結(jié)合。由于固定化的標(biāo)簽固定在電極上的標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò) 合物而檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)可與樣品中靶多核苷酸序列的存在相關(guān)聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，該說明包括一種用于檢測(cè)核酸擴(kuò)增的方法。在該 方法中，參考圖1，擴(kuò)增探針I(yè)O與作為用于多核苦酸擴(kuò)增過程的擴(kuò)增子模 板或靶的多核苷酸序列12雜交。擴(kuò)增探針10包括互補(bǔ)多核苦酸序列14和一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)標(biāo)簽16。在擴(kuò)增過程中，酶作用切割互補(bǔ)序列的一個(gè)或 多個(gè)檢測(cè)標(biāo)簽。對(duì)切割的檢測(cè)標(biāo)簽的檢測(cè)又檢測(cè)切割事件，并因此檢測(cè)擴(kuò) 增子模板的復(fù)制，如圖1所示。本文所使用的"雜交"，是指兩個(gè)多核苷S吏序列通過兩個(gè)序列的堿基間 的氫鍵結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。即使兩個(gè)序列非完全和嚴(yán)格互補(bǔ)，但其 中 一個(gè)序列可被認(rèn)為"互補(bǔ)，，于另 一序列，條件是這兩個(gè)序列包括足以使所 產(chǎn)生的雜交物在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下穩(wěn)定的互補(bǔ)區(qū)域。能夠與擴(kuò)增子模板至 少大體上選擇性雜交的任何互補(bǔ)序列是用于該方法目的的合適的互補(bǔ)序 列。通常，所述互補(bǔ)序列由核苷酸和/或其類似物組成，具有足以賦予擴(kuò)增探針至少一些結(jié)合特異性的長(zhǎng)度。所述互補(bǔ)序列可包括RNA或DNA,或 其混合物或雜交物。所述互補(bǔ)序列可包括天然核酸聚合物(生物來源)或 合成的核酸聚合物(人工修飾或制備的)。所述互補(bǔ)序列可具有任何合適的天然和/或人工結(jié)構(gòu)。核酸可包括磷酸 二酯骨架，使得核酸在中性pH的水溶液中具有負(fù)電荷。磷酸二酯骨架通 常包括交替的糖和磷酸根部分(phosphate moieties )的糖-磷酸根骨架，核 苷酸堿基(通常，噪呤或嘧咬基團(tuán))與各糖部分(sugarmoiety)連接。骨 架中可包括任何糖，其中包括核糖(對(duì)于RNA)、脫氧核糖(對(duì)于DNA)、 阿拉伯糖、己糖、2'-氟代核糖和/或糖的結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容中的 核酸分析物和/或4笨針可為包括任何合適的可選骨架的類似物。示例的可選 骨架可帶有比磷酸二酯骨架少的負(fù)電荷并且可基本不帶電荷(不帶正電荷 也不帶負(fù)電荷)。示例的可選骨架可包括磷酰胺、磷硫酰、二硫代磷酸酯、 O-曱基亞磷酰胺(methylphosphoroamidite )、肽核酸(包括N-(2-氨乙基)甘 氨酸骨架單元)、鎖核酸(參見，例如Koshkin等，Tetrahedron 54:3607-30 (1998), WO 98/39352, WO 99/14226， WO 00/56746，以及WO 99/60855，由 此它們各自通過引用并入本申請(qǐng))、帶正電荷的骨架、非核糖骨架等。帶 有人工骨架和/或部分(moieties)的核酸可適于例如增加或減小總電荷， 增加或減小堿基配對(duì)穩(wěn)定性，增加或減小化學(xué)穩(wěn)定性，或改變被試劑作用 的能力，等等。在示例的實(shí)施方案中，帶有減小的負(fù)電荷的核酸^果^h (例 如肽核酸)可用于基于磷酸二酯的分析物以增加用于檢測(cè)所述分析物的光學(xué)元件的靈敏度。所述互補(bǔ)序列任選含有 一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基或連接鍵或含有非共 價(jià)或共價(jià)連接的標(biāo)記。例如，所述修飾的堿基可為天然存在的修飾的堿基 或合成的改變的堿基。在核酸包括修飾的核苷酸堿基的情況中，所述堿基包括但不限于腺嘌呤、胞嗜啶、鳥。票呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、肌苷、2-氨 基腺嘌呤、2-硫胸腺嘧啶、3-甲基腺嘌呤、C5-溴尿嘧啶、C5-氟尿嘧啶、 C5-碘尿嘧啶、C5-曱基胞嘧啶、7-去氮腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、8-氧腺嘌 呤、8-氧鳥嘌呤、2-硫胞嘧啶、4-乙酰胞苷、5-(羧基羥基曱基)尿甙、2'-0-曱基胞苷、5-羧基曱基氨基曱基-2-硫尿苷、5-羧基曱基氨基曱基尿苷、二 氫尿苷、2'-0-曱基假尿苷、P-D-半乳糖Q核苷、2'-0-曱基鳥苷、N6-異戊 歸腺苷、l-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、l-甲基鳥苷、l-曱基肌苷、2,2-二曱 基鳥苷、2-曱基腺苷、2-曱基鳥苷、3-曱基胞苷、5-曱基胞苷、N6-曱基腺 苷、7-曱基鳥苷、5-曱氨基曱基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿苷、P-D-甘 露糖基Q核苷、5-曱氧基羰基曱基-2-硫尿苷、5-曱氧基羰基曱基尿苷、5-曱氧基尿苷、2-曱硫基-N6-異戊烯腺苷、N-((9-P-D-呋喃核糖基-2-曱硫嘌呤 -6-基)氨曱?；?蘇氨酸、N-((9-(3-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-曱基氨曱?；? 蘇氨酸、尿苷-5-氧乙酸曱酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、Q 核苦、5-曱基-2-硫尿苦、2-硫胞苷、5-曱基-2-硫尿芬、2-硫尿苷-4-硫尿普、 5-甲基尿苷N-((9-(3-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-氨甲?；?蘇氨酸、2'-0-曱基 -5-曱基尿芬、2'-0-甲基尿苷、wybutosine、 3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷以 及(acp3)u。除了存在一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)標(biāo)簽，所述探針還可包括反應(yīng)性官能團(tuán)，或 被偶聯(lián)的物質(zhì)取代，以便于例如未切割的探針從組分混合物部分或完全去 除。特別地，所述探針可被修飾以便于未切割的探針從切割的檢測(cè)標(biāo)簽分離。例如，所述互補(bǔ)探:針可在3'端使用生物素被修飾，使得切割的互補(bǔ)探 針可被鏈霉親和素修飾的表面或基質(zhì)固定化。通過檢測(cè)切割的檢測(cè)標(biāo)簽，可檢測(cè)靶擴(kuò)增子的復(fù)制?？墒褂眠m于本發(fā) 明目的的任何方法進(jìn)行探針切割。用于進(jìn)行探針切割的示例的非限制性實(shí)例包括如本文進(jìn)一步詳細(xì)描述的5'-核酸酶方法(例如Gelfand等，美國(guó)專利5,210,015和5,487,972), INVADERtm方法(例如，Prudent等，美國(guó)專利 5,985,557、 5,994,069以及6,0卯，543),以及FEN-LCR方法(例如Bi等，美 國(guó)專利6,511,810)。在INVADER類格式中，提供了一對(duì)寡核苷酸，所述 寡核苷酸結(jié)合靶多核苷酸中的鄰近序列而形成切割絡(luò)合物，其中第一寡核 香酸的耙互補(bǔ)部分的3'端與第二寡核苷酸的靶互補(bǔ)部分的5'端緊鄰或重 疊。該絡(luò)合物被含有側(cè)翼內(nèi)切核酸酶活性(還已知為5'核酸酶活性)的酶 識(shí)別，所述酶在鄰近第一纟笨針的靶互補(bǔ)片段的3'端核苷酸的5'端互補(bǔ)核苷 酸的5'側(cè)切割第二寡核苷酸。在其中第一探針含有與其靶互補(bǔ)序列的3'端 連接的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)的核苷酸的實(shí)施方案中，在5'端互補(bǔ)核苷酸的3'側(cè) 發(fā)生第二探針的切割。在某些實(shí)施方案中，切割的第二探針可被新的未切 割的探針可取代而產(chǎn)生另外的切割的探針。在FEN-LCR方法中，第一和 第二寡核苷酸可在第二寡核苷酸被切割以后連接在一起，產(chǎn)生線性或指數(shù)擴(kuò)增的擴(kuò)增子的新拷貝?？捎糜诒景l(fā)明的其他方法包括例如Walder (美國(guó) 專利5,403,71 l)和Duck(美國(guó)專利5,011,769)所公開的探針切割方法，例如， 其中使用RNA酶H切割含有RNA的探針，或其中可通過合適的內(nèi)切核酸 酶例如大腸桿菌(E.coli)的內(nèi)切核酸酶IV切割含有無石成基(abasic )亞單 位的探針。探針切割方法的另一個(gè)實(shí)例是當(dāng)其被修飾包括可切割的探針與 擴(kuò)增的耙結(jié)合時(shí)的重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA),例如Piepenburg等(PLoS Biology 4:1115-1121 (2006))和coworkers (例如，美國(guó)專利乂>布 2005/0112631和PCT公布WO 03/072805)所描述的。其他切割方法和酶還 公開于美國(guó)專利5,869,245 (Yeung)和5,698,400 (Cotton等)中。在所有情況 中，探針切割產(chǎn)生可檢測(cè)標(biāo)簽，所述標(biāo)簽含有一個(gè)或多個(gè)電化學(xué)部分、一 個(gè)或多個(gè)用于隨后纟企測(cè)的結(jié)合對(duì)，或者可^f吏用例如本文所述的與可纟企測(cè)標(biāo) 簽相互作用的電化學(xué)部分檢測(cè)。沖全測(cè)標(biāo)簽可包4舌一個(gè)或多個(gè)可^r測(cè)標(biāo)記18。對(duì)于可^r測(cè)標(biāo)記，是指可 被檢測(cè)和/或定量的任何部分。檢測(cè)標(biāo)簽可被直接或間接檢測(cè)。在檢測(cè)標(biāo)簽 被直接檢測(cè)的情況中，檢測(cè)標(biāo)簽任選包括可檢測(cè)標(biāo)記，例如電化學(xué)部分?？蛇x地，檢測(cè)標(biāo)簽可被間接檢測(cè)，例如通過檢測(cè)標(biāo)簽與另外的檢測(cè)試 劑相互作用。例如，檢測(cè)標(biāo)簽可包括特異性結(jié)合對(duì)的成員，例如標(biāo)記抗體的半抗原，或被互補(bǔ)序列標(biāo)記的核酸序列。檢測(cè)標(biāo)簽可包括例如地高辛部 分，其可用作電化學(xué)部分標(biāo)記的抗體的靶。另外的檢測(cè)試劑可包括電化學(xué)在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括任選在電化學(xué)部分的存在下經(jīng)電化學(xué) 檢測(cè)的乾擴(kuò)增。所述電化學(xué)部分可作為檢測(cè)標(biāo)簽上的標(biāo)記被結(jié)合，或作為 與檢測(cè)標(biāo)簽相互作用的檢測(cè)試劑存在。所述電化學(xué)部分可為可將電子轉(zhuǎn)移 至電極或自電極轉(zhuǎn)移電子的任何部分。部分的選擇取決于所選探針的特定 組成。特別優(yōu)選的部分包括過渡金屬絡(luò)合物。合適的過渡金屬絡(luò)合物包括例如，Ru2+(2，2，- 二吡啶)3(Ru(bpy)32+) ， Ru2+(4,4，- 二曱基畫2,2'畫二吡 啶)3(Ru(Merbpy)32+)， Ru2+(5,6--曱基-1，10-菲咯啉)3 (Ru(Me2-phen)32+)， Fe2+(2,2'-二吡啶)3(Fe(bpy)32+)， Fe2+(5-氯菲咯啉)3 (Fe(5-Cl-phen)32+), Os2+(5-氯菲咯啉)3 (Os(5-Cl-phen)32+), 032+(2,2'-二吡啶)2(咪唑基)，二氧化錸1+磷 化氫，以及二氧化錸 比啶(Re02 (Py)41+)。某些可用作部分的陰離子絡(luò)合物 為Ru(bpy)((S03)2-bpy)22-和Ru(bpy)((C02)2-bpy)22-，某些可用作部分的兩 性離子絡(luò)合物為Ru(bpy)2((S03)2-bpy)和Ru(bpy)2((C02)2-bpy)，其中， (S03)2-bpy2-為4,4'-二磺酸根合-2,2'-二吡啶，(C02)2-bpy2-為4，4'-二羧基-2，2'誦 二p比咬。吡啶、聯(lián)吡咬(bypyridine )以及菲咯啉基團(tuán)的合適的取代衍生物 可與任何前面的金屬一起應(yīng)用于絡(luò)合物中。其中，合適的取代衍生物包括 但不限于4-氨基吡咬、4-二曱基吡咬、4-乙?；拎ぁ?-硝基吡啶、4,4'-二氨基-2,2'-二p比咬、5,5'-二氨基-2，2'-二吡啶、6,6'-二氨基-2,2'-二吡啶、4,4'-二乙烯二胺-2,2'-二吡啶、5，5'-二乙烯二胺-2，2'-二吡咬、6,6'-二乙烯二胺-2,2'-二吡啶、4,4 '-二羥基-2，2'-二吡啶、5,5'-二羥基-2，2'-二吡啶、6,6'-二羥基-2，2'-二吡咬、4,4',4"-三氨基-2,2',2"-三吡咬、4,4'，4"-三乙烯二胺-2,2'，2"-三吡咬、 4,4',4"-三羥基-2,2'，2'-三吡啶、4，4',4"-三硝基-2,2'，2"-三吡啶、4,4',4 "-三苯基 -2,2'，2"-三他咬、4,7-二氨基-1,10-菲咯啉、3,8-二氨基-1,10-菲咯啉、4,7-二 乙烯二胺-l，10-菲咯啉、3，8-二乙烯二胺-1，10-菲咯啉、4,7-二羥基-1,10-菲咯 啉、3,8-二羥基-1,10-菲咯啉、4,7-二硝基-1,10-菲咯啉、3，8-二硝基-1，10-菲 咯啉、4，7-二苯基-1,10-菲咯啉、3,8-二苯基-1,10-菲咯啉、4,7-二精胺-1,10-菲咯啉、3,8-二精胺-1,10-菲咯啉、二吡啶并[3，2-a:2'，2'-c]吩。秦，以及6，6'-二氯-2，2'-二吡啶。為了便于檢測(cè)，由探針切割產(chǎn)生的檢測(cè)標(biāo)簽可從未切割的探針分離。 分離步驟可通過簡(jiǎn)單的擴(kuò)散，其中檢測(cè)標(biāo)簽或互補(bǔ)序列在適當(dāng)?shù)奈恢眠B接 或結(jié)合，使得切割的產(chǎn)物可擴(kuò)散?？蛇x地，或另外， 一種或多種切割的產(chǎn) 物，或未切割的纟笨針可從反應(yīng)混合物機(jī)械分離。 一方面，互補(bǔ)序列包括官 能團(tuán)，例如生物素，其^^于從反應(yīng)混合物去除互補(bǔ)序列，并因此去除未切 割的探針。在使用生物素部分官能化互補(bǔ)序列的情況中，將反應(yīng)混合物與 鏈霉親和素包被的珠混合，或使反應(yīng)混合物通過鏈霉親和素修飾的基質(zhì)， 可例如捕獲互補(bǔ)序列和未切割的探針并便于檢測(cè)未切割的檢測(cè)標(biāo)簽。在某些實(shí)施方案中，4企測(cè)標(biāo)簽包括標(biāo)簽序列。所述標(biāo)簽序列可包括多 核苷酸，并可包括上述用于互補(bǔ)序列的任何核酸組合物。在某些實(shí)施方案 中，選擇所述標(biāo)簽序列使得其不與擴(kuò)增子模板雜交或與其結(jié)合。另外，所 述標(biāo)簽序列通常通過由酶作用切割的連接與互補(bǔ)探針連接。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽序列可通過便于核酸擴(kuò)增、特別是擴(kuò)增子才莫板的擴(kuò)增例如PCR的酶切 割。例如，可通過DNA聚合酶的5'核酸酶活性容易地從探針切割所述標(biāo) 簽序列。在某些實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽序列和所述互補(bǔ)序列均為DNA序 列。例如，所述標(biāo)簽序列可包括約14至約40個(gè)堿基。可選地，所標(biāo)簽序 列可包括約14至約20個(gè)堿基。在該方法的一個(gè)特別方面，所述標(biāo)簽序列 為19個(gè)堿基長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，可使用含有5'-內(nèi)切核酸酶或5'-外切核酸酶活性 的酶從合適的雜交絡(luò)合物去除側(cè)翼部分而產(chǎn)生所述標(biāo)簽序列，所述酶例如 具有所述活性的側(cè)翼內(nèi)切核酸酶或DNA聚合酶。例如，所述絡(luò)合物可具 有圖2所示的方案中A示例的形式。圖2中被指定為A的絡(luò)合物("切割絡(luò)合物")包括作為或含有靶序列 ("擴(kuò)增子模板")的多核苷g臾鏈("靶鏈")，本文以從左至右的3'至5'方 向描述。與擴(kuò)增子模板的3'側(cè)雜交的是具有絡(luò)合物A左側(cè)的5'端和3'端(未 標(biāo)記)的上游多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，上游多核香酸可在聚合酶鏈 式反應(yīng)(PCR)過程中通過引物延伸原位產(chǎn)生。在其他實(shí)施方案中，上游 多核苷酸可作為無進(jìn)一步修飾或延伸的完整物質(zhì)提供。在擴(kuò)增子模板的右 (5')側(cè)雜交的是含有結(jié)合模板的片段和標(biāo)簽序列(或簡(jiǎn)單地稱"標(biāo)簽")的可切割探針，其中，結(jié)合模板的片段與擴(kuò)增子模板中的互補(bǔ)序列雜交， 標(biāo)簽序列不與擴(kuò)增子模板雜交而與可切割探針的結(jié)合模板的片段的5'端連 接。如上所述的切割絡(luò)合物與合適的酶的反應(yīng)提供了包括擴(kuò)增子模板、上 游多核苷酸以及來自可切割探針的結(jié)合模板的片段的切割絡(luò)合物(圖2中指定為B)。還產(chǎn)生了標(biāo)簽序列，如本文進(jìn)一步所述，其可從用于隨后檢測(cè)的絡(luò)合物釋放。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)簽序列可在5'核酸酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生。提供了含有與待擴(kuò)增的雙鏈體靶序列的相對(duì)末端互補(bǔ)的第 一 引物和第二 引物的反應(yīng)混合物，使得第 一引物可通過聚合酶介導(dǎo)的？ 1物延伸引發(fā)與第 一引物所雜交的擴(kuò)增子模板鏈互補(bǔ)的鏈的合成，并且第二引物可通過聚合 酶介導(dǎo)的引物延伸引發(fā)擴(kuò)增子模板鏈或其拷貝的聚合酶介導(dǎo)的合成。所述 反應(yīng)混合物還包括如上所述的切割探針，所述切割探針具有結(jié)合擴(kuò)增子模 板的片段，所述片段結(jié)合位于第一和第二引物結(jié)合的序列之間的擴(kuò)增子模板中的互補(bǔ)序列。當(dāng)存在三磷酸核苷酸時(shí)，優(yōu)選在其3'端致使所述切割探 針非可延伸，例如通過使用氫、氟、氨基或其他非羥基部分取代3'端核苷 酸亞單位的核糖或脫氧核糖的3'羥基，或通過使用封閉基團(tuán)例如3'氨基、 3'氟、3'H、 3'畫磷酸根、3'曱基、3'叔丁基或3'三苯曱基封閉3'羥基。例如，當(dāng)?shù)谝灰锖颓懈?笨針均與擴(kuò)增子才莫板鏈雜交時(shí)，可在三磷酸 核苷酸(NTP)例如ATP、 CTP、 GTP或TTP或其類似物的存在下使用具 有5'核酸酶活性的依賴模板的DNA聚合酶延伸所述引物。當(dāng)延伸所述引 物使得其3'端與所述切割探針的5'端鄰近或重疊時(shí)(見上述A的方案I)， 聚合酶的核酸酶活性切割所述探針，由此從所述切割絡(luò)合物釋放側(cè)翼部分 (見B的方案n)。由于所述引物延伸通過和經(jīng)過所述切割的切割探針， 聚合酶可在其他位點(diǎn)切割探針的結(jié)合模板的片段，直至所述結(jié)合模板的片 段的剩余部分從擴(kuò)增子模板解離。然后，所延伸的引物可作為第二引物的 模板起作用以復(fù)制原始(最初的)擴(kuò)增子模板鏈。在上述PCR實(shí)施例中使用的引物和探針可具有適于產(chǎn)生本發(fā)明方法 檢測(cè)的可檢測(cè)側(cè)翼的多種長(zhǎng)度和構(gòu)象中的任何長(zhǎng)度和構(gòu)象。通常，引物可 為約18至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，或20至25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，但是也可以使用在這些范圍之外的長(zhǎng)度。例如，當(dāng)引物含有相對(duì)于所使用的DNA或RNA 具有增強(qiáng)的堿基配對(duì)親和力的一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物(例如鎖核酸 (LNA)或肽核酸(PNA)時(shí)，可使用較短的長(zhǎng)度。探針的結(jié)合模板的片 段可同樣為任何合適的長(zhǎng)度，例如，通常在8和30個(gè)核苷酸之間。當(dāng)探 針還含有多核苷酸側(cè)翼部分時(shí)，根據(jù)所需的檢測(cè)特異性和靈敏度，所述側(cè) 翼部分可含有任何長(zhǎng)度的多核苷酸序列，例如10至40個(gè)核苷酸?？蓪⒌谝灰锖偷诙镌O(shè)計(jì)成產(chǎn)生任何所需長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物，通常 至少30或至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且達(dá)200、 300、 500、 1000或更多個(gè) 核苷酸長(zhǎng)度?？梢砸匀魏魏线m的濃度提供探針和引物。例如，可以以通常 少于或等于500 nM的濃度提供正向引物和反向引物，例如從20 nM至500 nm，或50至500nM，或乂人100至500 nM，或/人50至200 nM。在某些實(shí)施方案中，通常以小于或等于1000nM的濃度提供探針，例 如，從20nM至500nM,或50至500nM,或從100至500nM,或從50 至200 nM。對(duì)于NTP、酶、引物和探針的濃度的示例條件還可見于美國(guó) 專利No. 5,538,848 (由此通過引用并入)，或可^f吏用可商購(gòu)獲得的反應(yīng)成 分實(shí)現(xiàn)(例如，可乂人Applied Biosystems， Foster City, CA獲得)。在該方法的 一方面，通過使其與可檢測(cè)標(biāo)簽結(jié)合而修飾所述標(biāo)簽序 列?？墒褂秒娀瘜W(xué)活性部分或特異性結(jié)合對(duì)成員在5'端標(biāo)記所述標(biāo)簽序列。 可選地，所述標(biāo)簽序列在^L切割后可與^r測(cè)試劑結(jié)合或以其它方式變得與 檢測(cè)試劑結(jié)合。如上所述，所述切割的標(biāo)簽序列可于溶液中檢測(cè)或在捕獲 或固定后^r測(cè)。任選地，該方法包括防止未切割的標(biāo)簽序列干擾切割的標(biāo) 簽序列;險(xiǎn)測(cè)的分離步驟。前述教導(dǎo)方法還應(yīng)用于不含有多核苷酸序列的標(biāo)簽。在該方法的一方面，在酶切割之后，所述標(biāo)簽序列一皮捕獲和/或固定。 在所述標(biāo)簽序列包括可檢測(cè)標(biāo)簽的情況中，然后檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)簽。在隨后 使用檢測(cè)試劑標(biāo)記標(biāo)簽序列的情況中，所述才企測(cè)試劑可標(biāo)記固定化的標(biāo)簽 序列或與其絡(luò)合。所述標(biāo)簽序列可由于特異性或非特異性相互作用而^:固定。例如，所 述標(biāo)簽序列可使用特異性結(jié)合對(duì)成員衍生，所述特異性結(jié)合對(duì)成員特異性結(jié)合或互補(bǔ)于特異性結(jié)合對(duì)的其他成員的特定空間和極性結(jié)構(gòu)。典型的特 異性結(jié)合對(duì)可包括配體和受體，并且可包括但不限于下列配對(duì)抗原-抗體、生物素-親和素、生物素-鏈霉親和素、IgG—A蛋白、IgG—G蛋白、碳水 化合物-凝集素、酶-酶底物、DNA-反義DNA,以及RNA-反義RNA。在所述標(biāo)簽序列是或包括核酸序列的情況中，所述標(biāo)簽序列自身可被割的標(biāo)簽序列可被自身固定于表面或其他基質(zhì)的捕獲反義寡核苷酸捕獲 和固定。反義寡序列作為捕獲序列(標(biāo)簽互補(bǔ)物)使用，可使得該方法多種多 樣，例如，通過設(shè)計(jì)多種互補(bǔ)探針，各探針具有特征性標(biāo)簽序列。各自和 分別互補(bǔ)于所選的標(biāo)簽序列的捕獲寡核苷酸的陣列可用于在多個(gè)分離的 檢測(cè)區(qū)集中和捕獲各標(biāo)簽序列。在與耙序列21互補(bǔ)的互補(bǔ)序列20包括互補(bǔ)多核苷酸序列22的情況 中，所述標(biāo)簽序列可配制成包括與圖3所示的另外的檢測(cè)寡核苷酸23的 序列互補(bǔ)的另外的序列。通過在PCR循環(huán)過程中允許PCR反應(yīng)混合物冷 卻，另外的檢測(cè)寡核苷酸可與切割的標(biāo)簽序列以及可仍舊與互補(bǔ)探針結(jié)合 的標(biāo)簽序列雜交。新形成的切割的標(biāo)簽序列和另外的檢測(cè)寡核苷酸的雙鏈 體24在自由3'端延伸，導(dǎo)致形成較穩(wěn)定的雙鏈DNA，而帶有未切割的標(biāo) 簽序列的雙鏈體仍舊無生產(chǎn)性，且只是在隨后溫度增加后解離。所述標(biāo)簽序列的延伸產(chǎn)生與在遠(yuǎn)距離的檢測(cè)部分固定化的序列互補(bǔ) 的新序列。 一方面，固定化的序列26是肽核酸(PNA)序列，使得它可 不干擾PCR過程?？扇缟纤鐾ㄟ^標(biāo)簽序列自身(通常在3'或5'端)上的 可4企測(cè)標(biāo)簽28的存在，或通過隨后可4企測(cè)標(biāo)簽和標(biāo)簽序列的結(jié)合，或標(biāo) 簽序列與固定化序列的結(jié)合，來檢測(cè)延伸的標(biāo)簽序列的結(jié)合。另外，圖3 還用于非PCR實(shí)施方案。一方面，固定化的序列是固定化于金電極30上的PNA序列，切割的 和延伸的標(biāo)簽序列的存在借助于所述標(biāo)簽序列的5'端的可檢測(cè)有電活性的 標(biāo)i己28來才企測(cè)。另一方面，標(biāo)簽序列32包括所選的形成穩(wěn)定的環(huán)-莖結(jié)構(gòu)34的反向重 復(fù)序列，如圖4所示。因此，當(dāng)從互補(bǔ)探針切割標(biāo)簽序列時(shí)，所述標(biāo)簽序 列的3'端能夠自引發(fā)其自身延伸36。自引發(fā)過程可產(chǎn)生與固定化序列38 互補(bǔ)的新序列，所述固定化序列38可為PNA序列并可固定化于電極40。另一方面，本發(fā)明公開內(nèi)容提供了使用含有包括zipcode序列的發(fā)夾 環(huán)的探針。其示意圖示于圖5A-5C。探針41使用具有電極活性的標(biāo)記42 標(biāo)記并可包括通過間隔子(spacer) 43連接在一起的兩個(gè)多核苷酸序列。 探針3'端的羥基通常被3'封閉基團(tuán)例如乙?；蛄姿岣鶊F(tuán)保護(hù)免受3'外 切核酸酶消化(如圖5A所示)。探針還可包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列 被5'核酸酶活性(例如在PCR過程中的DNA聚合酶的5'核酸酶活性)切 割而產(chǎn)生未結(jié)合的標(biāo)簽序列(如圖5B所示)。切割的側(cè)翼具有3'-OH基 團(tuán)。隨后，切割的側(cè)翼的3'端可#13'外切核酸酶消化，例如外切核酸酶m (如圖5C所示)。外切核酸酶III具有雙鏈特異性3'-5'脫氧核糖核酸外切 酶活性但還作用于具有少于4個(gè)堿基的3'突出端。如果需要，在消化步驟 之后，外切核酸酶III可通過在80。C加熱而失活。3'外切核酸酶消化在間隔 子43終止，所述間隔子43可僅為例如有機(jī)連接子。在所述間隔子的另一 側(cè)是探針獨(dú)有的標(biāo)簽序列44。因此，在切割的側(cè)翼上的標(biāo)簽序列成為單鏈 之后，它可與互補(bǔ)的固定化序列45雜交，例如結(jié)合電極表面46的互補(bǔ)的 固定化序列(如圖5D所示)。未切割的4采針的標(biāo)簽序列由于具有發(fā)夾環(huán) 不能用于雜交。因此，在檢測(cè)之前不需要分離切割和未切割的探針。在熱 循環(huán)之后，可將3 '端外切核酸酶添加至PCR反應(yīng)，或者可將其儲(chǔ)存于包 括電極的檢測(cè)室。如本文所述，可于的電極上電化學(xué)檢測(cè)捕獲的側(cè)翼。另一方面，添加與標(biāo)簽序列54互補(bǔ)但較長(zhǎng)的檢測(cè)寡核苷酸52,并且 當(dāng)進(jìn)行標(biāo)簽序列切割時(shí)，在使用檢測(cè)寡核香酸對(duì)切割的標(biāo)簽序列進(jìn)行退火 后，所產(chǎn)生的3'-OH基團(tuán)可以被延伸與檢測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)，如圖6中雜交 絡(luò)合物56所示?？蓹z測(cè)標(biāo)記可連接至標(biāo)簽序列(如圖3中28所示)或可 ;險(xiǎn)測(cè)標(biāo)記可連接至;f企測(cè)寡核普酸(如圖6中58所示)。如上所述，新序 列可互補(bǔ)于并因此結(jié)合固定化序列60,所述固定化序列60可為PNA序列 并且可固定于電才及62。標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物可通過多種合適的機(jī)制中的任何機(jī)制檢測(cè)。 通常，在檢測(cè)條件下選擇通過特異性共價(jià)或非共價(jià)相互作用(例如通過氫 鍵結(jié)合、離子配對(duì)或范德華吸引力)與標(biāo)簽互補(bǔ)物結(jié)合或形成全l^物的標(biāo) 簽，所述特異性共價(jià)或非共價(jià)相互作用與僅被動(dòng)相互作用或擴(kuò)散進(jìn)入或擴(kuò) 散通過尺寸排阻孔基質(zhì)或屏障相對(duì)。標(biāo)簽和標(biāo)簽互補(bǔ)物之間的這種特異性 相互作用可提供額外的特異性水平以增加信噪比。另外，檢測(cè)條件還可任選包括來自電化學(xué)部分的信號(hào)可由其擴(kuò)增的電化學(xué)介質(zhì)或基質(zhì)。在電化學(xué) 活性部分存在于標(biāo)簽或標(biāo)簽互補(bǔ)物的情況中，這樣的部分可作為介質(zhì)起作 用?？蛇x地， 一種或多種電化學(xué)介質(zhì)可存在于溶液中。這樣的介質(zhì)的實(shí)例 為抗壞血酸。然而，當(dāng)電化學(xué)部分自身提供合適的信號(hào)時(shí)，所述介質(zhì)不為 本發(fā)明的操作所需。在某些實(shí)施方案中，探針共價(jià)連接至與其中發(fā)生探針切割的溶液接觸 的表面或基質(zhì)。在PCR實(shí)施方案中，變性的擴(kuò)增子能夠與互補(bǔ)探針雜交。 然后，合適的引物可退火至擴(kuò)增子，并且擴(kuò)增子序列的延伸可繼續(xù)。在延伸過程中，酶活性可導(dǎo)致互補(bǔ)探針切割。例如，在通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的情況中，互補(bǔ)探針由聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性切割。在使用 一種或多種標(biāo)簽序列標(biāo)記互補(bǔ)探針的情況中，互補(bǔ)探針的切割 導(dǎo)致標(biāo)簽序列的釋放。然后，反應(yīng)的程度可通過反應(yīng)溶液中標(biāo)簽序列的存 在或定量來測(cè)定。在標(biāo)簽序列是或包括電化學(xué)活性標(biāo)記的情況中，反應(yīng)的 進(jìn)展可電化學(xué)檢測(cè)。在于遠(yuǎn)距離位點(diǎn)檢測(cè)標(biāo)簽序列的情況中，以增加遠(yuǎn)距離檢測(cè)位點(diǎn)和標(biāo) 簽序列之間相互作用的方式修飾標(biāo)簽序列、遠(yuǎn)距離位點(diǎn)或二者是有幫助 的。在標(biāo)簽序列包括電化學(xué)活性標(biāo)記的情況中，遠(yuǎn)距離檢測(cè)位點(diǎn)可為電極 表面。可選地，標(biāo)簽序列可集中于遠(yuǎn)距離表面，并隨后與電化學(xué)活性標(biāo)記 結(jié)合。例如，在標(biāo)簽序列包括多核苷酸的情況中，電化學(xué)活性標(biāo)記可選擇 性結(jié)合多核苷酸，例如在電化學(xué)活性部分摻入結(jié)合多核苷酸的插入劑的情況中(如實(shí)施例2所述)。在標(biāo)簽序列包括電化學(xué)活性標(biāo)記的情況中，可直4妻;險(xiǎn)測(cè)所述標(biāo)記，或 經(jīng)一個(gè)或多個(gè)中間氧化還原(redox)活性物檢測(cè)所述標(biāo)記。所述氧化還原活性物可使電子從電極表面穿梭至電化學(xué)活性標(biāo)記，或使電子穿梭至另一 種氧化還原活性穿梭物。標(biāo)簽序列可通過包括一個(gè)或多個(gè)捕獲部分而修飾，以增強(qiáng)與遠(yuǎn)距離部 位的相互作用。 一方面，所述遠(yuǎn)距離部位包括金金屬表面，并且所述捕獲 部分包括巰基或二硫化物官能團(tuán)。含硫基團(tuán)和金表面之間的親和力導(dǎo)致標(biāo) 簽序列的結(jié)合。標(biāo)簽序列可包括聚合結(jié)構(gòu)或樹枝狀結(jié)構(gòu)，包括多個(gè)含巰基 的官能團(tuán)，以使與金表面的結(jié)合最大化。電化學(xué)活性基團(tuán)可摻入巰基化的 標(biāo)簽序列，或可在吸附至金表面之前或之后與標(biāo)簽序列結(jié)合(見實(shí)施例7 )。例如，如圖7A所示，可使用PCR室64，其中所述室包括惰性固體基 質(zhì)66和遠(yuǎn)離固體基質(zhì)的電極67。與所需擴(kuò)增子互補(bǔ)的多個(gè)核酸鏈58可結(jié) 合或以其它方式固定于固體基質(zhì)。所述互補(bǔ)鏈可被聚陰離子部分70官能 化，其中所述聚陰離子部分可摻入多個(gè)巰基或二硫化物官能團(tuán)，或表現(xiàn)結(jié) 合金表面親和力的其他官能團(tuán)。如圖7B所示，在擴(kuò)增過程中，互補(bǔ)鏈68與擴(kuò)增子72雜交，聚陰離 子部分70從所述鏈被切割，并自發(fā)進(jìn)行至金電極表面的化學(xué)吸附，如圖 7C所示。然后，隨后檢測(cè)試劑74的添加可用于將電化學(xué)部分運(yùn)輸至所吸 附的巰基化標(biāo)簽序列，如圖7D所示。例如，電化學(xué)活性基團(tuán)可摻入基于聚氧化乙烯的親水樹枝狀聚合物。 所述樹枝狀聚合物可摻入多個(gè)氧化還原活性位點(diǎn)(參見實(shí)施例6 )。另 一方 面，電化學(xué)活性部分可摻入多個(gè)正電荷以經(jīng)離子和/或靜電相互作用與固定 化的核酸序列相互作用(參見實(shí)施例3 )。本發(fā)明所選方法可設(shè)計(jì)成用于實(shí)時(shí)檢測(cè)(例如監(jiān)測(cè)在選擇的時(shí)間段內(nèi) 或多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)內(nèi)的檢測(cè)信號(hào)，或檢測(cè)在各循環(huán)中或之后的選定點(diǎn)的信 號(hào))，或用于終點(diǎn)檢測(cè)，其中在擴(kuò)增完成之后檢測(cè)信號(hào)，并將其與初始信 號(hào)或閾信號(hào)比較以確定靶多核苦酸的存在、不存在或量。例如，圖3所述 通過7的實(shí)施方案可有利于實(shí)時(shí)檢測(cè)或終點(diǎn)檢測(cè)，而其他實(shí)施方案可較適 于終點(diǎn)4全測(cè)。另外，盡管本i描述了使用固定于表面的探針的某些方案，這些方案 還可適用于溶液中，如實(shí)施例8所述。用于電化學(xué)檢測(cè)的化合物和方法的 其他指導(dǎo)原則可見于歐洲專利EP 733058 B和EP 871642 B以及PCT公布WO 98/20162 (Meade， Kayyam,等)。 微流控技術(shù)本文公開的方法和材料可結(jié)合多種儀器或設(shè)備中的任何儀器或設(shè)備 使用。在本發(fā)明的有利方面，所公開的方法可結(jié)合微流控設(shè)備實(shí)施。微流 控設(shè)備是利用納升或甚至皮升水平的小體積流體的設(shè)備。微流控設(shè)備可利 用以不同幾何形狀設(shè)置的多種微通道、微孔和/或閥，以制備、運(yùn)輸和/或 分析樣品。這些微通道、微孔和/或閥可具有毫米(mm)至微米Oxm)或甚至納 米(nm)范圍的尺寸。非限制地，微流控設(shè)備還可稱為"中尺度"設(shè)備，或"微 型機(jī)械"設(shè)備。微流控設(shè)備可依賴多種力來使流體運(yùn)輸通過所述設(shè)備，其中 所述力包括注射、泵、施加的抽吸、毛細(xì)管作用、滲透作用以及熱膨脹和 收縮等。在一個(gè)實(shí)施例中，微流體設(shè)備可依賴于有效的電滲以有助于含水 樣品、試劑以及緩沖液的運(yùn)輸。多種微流體設(shè)備描述于授予Kricka等的美 國(guó)專利No. 5,296,375(1994),授予Wilding等的美國(guó)專利No. 5,498,392(1996),以及Wilding等的國(guó)際公布No. WO 93/22053,它們各自 通過引用并入本申請(qǐng)?？捎糜跈z測(cè)靶多核苦酸序列的微流體設(shè)備通常包括其中形成多個(gè)微 流體室和通道的基質(zhì)，以及附著于所述基質(zhì)表面的覆蓋物。該設(shè)備通常包 括入口和一個(gè)或多個(gè)室，所述入口設(shè)置成接收含有至少一種靶多核苷酸序 列的樣品，所述室設(shè)置用于使探針與生物樣品接觸，其中所述探針含有如 上所述的耙互補(bǔ)片段和可檢測(cè)標(biāo)簽。所述微流體設(shè)備可包括一個(gè)或多個(gè) 室，所述室設(shè)置用于使所述樣品經(jīng)受聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、從所述探針切割可 才全測(cè)標(biāo)簽以及使釋放的標(biāo)簽與偶聯(lián)至電極的標(biāo)簽互補(bǔ)物結(jié)合以形成固定 化的標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物。通常通過設(shè)置成用于檢測(cè)與標(biāo)簽標(biāo)簽互 補(bǔ)物絡(luò)合物的存在相關(guān)聯(lián)的電化學(xué)信號(hào)的儀器來檢測(cè)和/或定量標(biāo)簽標(biāo)簽 互補(bǔ)物絡(luò)合物；并且被;險(xiǎn)測(cè)/定量的信號(hào)與所述樣品中的靶多核普酸序列的 存在/量有關(guān)聯(lián)。適于靶核酸聚合物的擴(kuò)增和隨后的檢測(cè)的典型微流體設(shè)備示于圖8。 圖示描述了微流體設(shè)備162,為了簡(jiǎn)單，其不包括可存在于所述微流體系 統(tǒng)的所有微通道和微孔。微流體設(shè)備162包括電極組件164以及控制器166,控制器166設(shè)置成以控制應(yīng)用于電極組件164的電位。所述控制器 通常用作電源和實(shí)施電流測(cè)量的儀器。電極組件164的上游是設(shè)置以制備感興趣的樣品溶液的微流體設(shè)備的 樣品制備區(qū)168。樣品制備區(qū)168包括設(shè)置以供應(yīng)可用于樣品制備過程的 試劑的試劑庫170。微流體設(shè)備的各室經(jīng)適于通過該設(shè)備運(yùn)輸試劑、樣品 溶液以及反應(yīng)產(chǎn)物的微流體通道系統(tǒng)172互聯(lián)，并且特別將這些物質(zhì)運(yùn)輸 至電極組件164或自電極組件164運(yùn)輸這些物質(zhì)。樣品(通常生物樣品)可經(jīng)入口 174引入^f效流體i殳備。樣品可通過注 射、毛細(xì)管作用或任何其他合適的引入方法引入。所述微流體設(shè)備任選包 括預(yù)處理孔或室176。如果需要，預(yù)處理室176允許生物樣品與用于樣品 消化、液化或稀釋的試劑混合。所述預(yù)處理可用于提供流動(dòng)性足以提高下 游過程的有效性的生物樣品。在該預(yù)處理之后，通常可通過電滲透泵經(jīng)過過濾器178將樣品運(yùn)輸至 反應(yīng)室180。過濾器178可用于去除可干擾下游反應(yīng)的大顆粒。所述過濾 器可為可與所研究的生物樣品相容的任何合適的過濾劑。例如，過濾器178可包括具有較大孔徑例如約100(im的膜過濾器，或多孔玻璃過濾器。反應(yīng)室180可用于樣品的裂解和變性。如圖8所示，用于裂解和/或變 性過程的試劑可經(jīng)閥184^Mv試劑庫182添加。裂解和/或變性過程可通過經(jīng) 加熱單元86加熱來加速。加熱單元86可包括一個(gè)或多個(gè)力。溫?zé)?、加熱?管、流體熱交換器或任何其他合適的加熱裝置以及風(fēng)扇、吹風(fēng)器、熱交換 器或其他用于冷卻反應(yīng)室180的合適的冷卻裝置。在裂解和/或變性之后，將樣品途經(jīng)過濾器190運(yùn)輸至PCR室188。與 較粗的過濾器178不同，選擇約5-10 )im孔徑大小的過濾器190,意于去 除裂解/變性過程的不想要的副產(chǎn)物。 一旦樣品到達(dá)PCR室188,經(jīng)閥194 從PCR試劑庫192將可用于PCR過程的試劑添加至PCR室188。在本發(fā) 明的一方面，添加至反應(yīng)室的試劑包括如上所述的本發(fā)明的探針，其含有 與靶多核苷酸互補(bǔ)的片段和可切割的可檢測(cè)標(biāo)簽?？赏ㄟ^加熱單元196加 熱PCR室188。與加熱單元186相似，加熱單元196可為便于PCR過程 的任何合適的加熱裝置，并且通常包括冷卻裝置，使得可于PCR室188 中實(shí)現(xiàn)加熱循環(huán)。所選擇的合適的熱循環(huán)裝置描述于授予Wittwer等的美國(guó)專利No. 5,455,175(1995)，由此該專利通過引用并入本申請(qǐng)。應(yīng)理解PCR 室可用于等溫模式，用于不需要熱循環(huán)的應(yīng)用。在完成PCR之后，將樣品通過另一個(gè)具有約5-10 pm孔徑的過濾器 198運(yùn)輸至電解室197。電解室197包括由控制器控制的電極200。盡管圖 8中描述為電連接于控制器166,但電極200的控制器可與電極164的控 制器相同或不同。合適的試劑可經(jīng)閥204從試劑庫202添加至電解室197。 然后，在PCR過程中由核酸酶活性從探針切割的標(biāo)簽可與偶聯(lián)至電極164 的標(biāo)簽互補(bǔ)物結(jié)合，其中任選經(jīng)一種或多種電化學(xué)介質(zhì)的存在^^測(cè)與標(biāo) 簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物的存在相關(guān)聯(lián)的電化學(xué)信號(hào)。在完成擴(kuò)增之后，可將電位施加于電解微孔197的電極200和電解微 孔208的電極206之間。通常，將電極200保持在陰極電位，電極206保 持在陽極電位，使得結(jié)合薄層交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠208經(jīng)凝膠210發(fā)生電 泳。當(dāng)發(fā)生電泳時(shí)，電極164通常為電中性。聚丙烯酰胺凝膠通常使用低度交聯(lián)制備。在這些電泳條件下，除了已 絡(luò)合和雜交的DNA外的所有核酸片段均遷移至電解室210。較大的核酸絡(luò) 合物由于其大尺寸和相對(duì)不能穿透薄層交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠而落后。盡管已經(jīng)描述了電泳分離，但任何合適的分離方法均可用于分離切割 的標(biāo)簽，包括例如機(jī)械分離、尺寸排阻色譜法、使用衍生的珠或基質(zhì)(例 如包括磁珠或鏈霉親和素修飾的基質(zhì))分離。如上文和下面的實(shí)施例所述， 一旦標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物與電極表 面結(jié)合，可檢測(cè)和/或定量存在于絡(luò)合物中的可檢測(cè)標(biāo)簽。試劑盒根據(jù)本發(fā)明的方法，本文公開的探針可以以用于檢測(cè)耙多核苦S交序列 的試劑盒的形式提供。這些試劑盒任選包括含有與所選的耙多核苦酸序列 互補(bǔ)的片段和可檢測(cè)標(biāo)簽的一種或多種探針。所述試劑盒可包括對(duì)許多獨(dú) 立且不同的耙多核苷酸序列具有選擇性的探針。所述試劑盒可包括各自具 有不同的且可單獨(dú)檢測(cè)的標(biāo)簽的探針。所述試劑盒任選包括當(dāng)從所述探針 切割標(biāo)簽時(shí)形成標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物的一種或多種標(biāo)簽互補(bǔ)物。所述品，例如用于校準(zhǔn)目的。所述試劑盒任選包括一種或多種適于制備探針溶 液和/或靶多核香酸序列溶液的緩沖液或緩沖劑。所述試劑盒任選摻入其他試劑，包括但不限于電化學(xué)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品、酶、 酶底物、核酸染色劑、標(biāo)記抗體和/或其他另外的檢測(cè)試劑。本發(fā)明的探針 任選可作為低壓凍干的固體或作為濃縮的母液或準(zhǔn)備用于適當(dāng)測(cè)定的預(yù) 稀釋的溶液存在。通常，所述試劑盒被設(shè)計(jì)成適用于自動(dòng)和/或高通量測(cè)定， 并且因此被設(shè)計(jì)成完全適于樣t流體方法和/或其他自動(dòng)高通量方法。電化學(xué)組合物本發(fā)明還提供了例如本文所述的電化學(xué)化合物。所述化合物可用于多 種電化學(xué)用途，包括但不限于檢測(cè)本文所述的靶多核苷酸序列的方法。例如，本發(fā)明公開內(nèi)容提供了下文方案5所述形式的雙鋨(bis-osmium ) 化合物。本發(fā)明還公開了方案10所示化合物21形式的化合物和方案10所述 的可使用可選的芳香烷基胺反應(yīng)物產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物。本發(fā)明還公開了方案6 (例如化合物10和11 )、方案7 (例如化合物 14和15)、方案15 (例如化合物2)、方案16 (例如化合物4)、方案17 (例如化合物6 )以及方案18至20所述形式的聚鋨(poly-osmium)化合 物，及其類似物和書于生物。實(shí)施例實(shí)施例1: DNA擴(kuò)增探針的制備制備對(duì)食物病原體產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特氏菌(丄^fen'a ) 的李斯特氏菌細(xì)胞溶解素(Hly)基因的擴(kuò)增具有選擇性的探針。互補(bǔ)探針 (或引物)在序列的5'端被生物素化?；パa(bǔ)探針還含有位于最后的dT殘 基處的生物素，以及防止PCR過程中探針延長(zhǎng)的3'端氨基。互補(bǔ)序列被下 列粗體字顯示的19個(gè)堿基的標(biāo)簽序列修飾。5'-CACGAATCAAAGCTCTCAACGCCTGCAAGTCC*AAGACGCC A畫3窗2其中"標(biāo)記生物素化的堿基。生物素化允許使用鏈霉親和素修飾的珠去除互補(bǔ)序列。標(biāo)簽序列的存在不影響靶序列的PCR擴(kuò)增，如通過與對(duì)照反應(yīng)比較的 擴(kuò)增子的電泳分析所證實(shí)的。PCR過程中使用的正向和反向？ 1物如下5'畫CATGGCACCACCAGCATCT和5'-ATCCGCGTGTTTCTTTTCGA，其中各引物的5'端還^皮生物素化， 用于使用鏈霉親和素珠去除。在95。C進(jìn)行PCR反應(yīng)10分鐘，然后在含有6 mM MgCl2的PCR緩沖 液A(Applied Biosystems， Ca # N808-0228)中進(jìn)行(95 °C 15秒鐘，63 °C 1分 鐘)x40個(gè)循環(huán)。引物和探針濃度分別為200nM和400nM。使用7%ACN (乙腈)+ 93% TEAA (0.1 M醋酸三乙醇胺，pH 6.8)平衡來自Waters公司的 HPLC柱XTerroMSC18 (2.5mm x 50mm)。分三步進(jìn)行梯度洗脫(0.3ml/分 鐘，60C):步驟1: 7% ACN + 93% TEAA, 7分鐘；步驟2: 10% ACN +卯％ TEAA， 10分鐘；步驟3: 35% ACN + 65% TEAA, 10分鐘。(ACN-乙 腈，TEAA-0.1M - pH6.8的醋酸三乙醇胺)。在95。C進(jìn)行PCR 10分鐘， 然后分別在200 nM引物和400 nM探針濃度進(jìn)行(95。C 15秒鐘，63°C1分 鐘)x 40個(gè)循環(huán)。在完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之后，通過添加NaCl溶液將反應(yīng)混 合物調(diào)整至1M鹽。然后將反應(yīng)混合物與鏈酶親和素包被的磁珠一起溫育 15分鐘。生物素化的互補(bǔ)探針，包括仍舊含有未切割的標(biāo)簽序列的互補(bǔ)探 針，吸附于》茲珠并從反應(yīng)混合物去除。生物素化的擴(kuò)增子相似地從混合物 去除，溶液中保留切割的標(biāo)簽序列。使用在5'端使用熒光標(biāo)記(萸光素)標(biāo)記的標(biāo)簽序列進(jìn)行擴(kuò)增和切割， 然后通過HPLC進(jìn)行鑒定，顯示產(chǎn)生20個(gè)堿基長(zhǎng)度的切割產(chǎn)物，并且使 用鏈霉親和素包被的珠消耗反應(yīng)混合物去除了未切割的探針。如圖9所示， 以3000拷貝的李斯特氏菌DNA的起始材料切割約50%探針，而無模板對(duì) 照不含有切割的寡核苷酸，然而，在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生3拷貝模板之后， 該方法足夠靈每t地產(chǎn)生可檢測(cè)的切割產(chǎn)物。標(biāo)簽序列還可電化學(xué)檢測(cè)。在于鏈霉親和素包被的珠上消耗之后，含 耙的樣品和無模板對(duì)照溶液均暴露于分開的金電極，所述金電極被與切割 的序列互補(bǔ)的固定化的捕獲探針官能化。直接從珠分離步驟使得該溶液在45°C雜交1小時(shí)，然后，使用10 mM Tris, 100 mM NaCl (pH = 8)漂洗。然 后在電化學(xué)電池中將電極暴露于使用于lOmMTris, 100 mM NaCl(pH = 8) 中的電催化鋨2,2-雙(二吡啶)(參見方案1的結(jié)構(gòu))標(biāo)記的100 jig/mL 螺紋型插入劑(threading intercalator)溶液。在使用PBS緩沖液(20mM磷 酸鹽和100 mM氯化鈉，pH 7)洗滌和于10%乙醇中的NaCl飽和的磷酸鹽 緩沖液洗滌之后，于200 [iL PBS中在0.2 V vs Ag/AgCl獲得基線電流。當(dāng) 添加800 jxL 6.25 mM抗壞血酸基質(zhì)時(shí)，電流以與插入劑的量成比例并由此 與雜交的靶的量成比例地增加(見圖10)。輩巴電極和電化學(xué)裝置。使用具有100埃Cr層、然后是2000埃金層 (Lance Goddard Associates, Foster City, CA)的趁式濺射涂覆4"石圭片(silicon wafer)來制備工作電極。然后手工切割硅片形成約1 cmx 1.5 cm的片段。 使用UV-Ozone清潔劑(Model 42, Jelight Company, Inc, Irvine, CA)清洗電 極20分鐘，然后將其暴露于無水乙醇20分鐘。然后將電極暴露于于1M 磷酸鉀緩沖液(pH=7 )中的巰基化的DNA捕獲探針的0.5 )iM溶液10分 鐘，然后5秒鐘水漂洗。捕獲探針序列緊接著示于如下G3'其中DTPA是方案20所述的含有二硫鍵的磷S吏根連接鍵類型，其由 二巰基亞磷酰胺制備(Glen Research, Sterling, VA)。然后將電極過夜暴露于 巰基己醇的1 mM水溶液，然后是30秒鐘水漂洗。然后在氮?dú)庀虑г镫姌O?？稍陔娀瘜W(xué)電池中使用CHI型660B恒電位器(CH Instruments, Austin, TX)以1/8"ID O型圏限定工作電極區(qū)和Ag/AgCl對(duì)照電極(Cypress Systems: Lawrence, KS)以及鉑線圈對(duì)應(yīng)電極來進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。實(shí)施例2:使用二茂絡(luò)鐵(Fc)標(biāo)記的探針進(jìn)行PCR進(jìn)程的電化學(xué)監(jiān)測(cè)在該實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)混合物的成分和擴(kuò)增方案與實(shí)施例1中的相同，除了所述探針在其5'端被二茂絡(luò)鐵部分取代("Synthegene"， Houston, TX)并且 100,000拷貝的李斯特氏菌DNA用作模板。將六個(gè)含有50 pl等份的相同 PCR反應(yīng)混合物的試管》文入9700熱循環(huán)4義(Applied Biosystems, Foster City, CA)。在擴(kuò)增的20、 26、 29、 32以及38個(gè)循環(huán)之后從熱循環(huán)儀順序取出 試管。在38個(gè)循環(huán)之后取出對(duì)應(yīng)于無模板對(duì)照(NTC)的試管。如實(shí)施例1 所述，使用鏈霉親和素磁珠從未切割的探針純化切割的含二茂絡(luò)鐵的 20-mer片段(可檢測(cè)標(biāo)簽)。將30 |al等份的純化的Fe20-mer(于1M NaCl 中)放置于金電極表面1小時(shí)使得與互補(bǔ)捕獲寡核苷酸雜交。在使用PBS 緩沖液快速漂洗電極之后，將各電極放入實(shí)施例1所述的室中。使用約100 ulPBS緩沖液填充室，并如圖11中所述進(jìn)行電化學(xué)4企測(cè)。電化學(xué)信號(hào)幅度取決于所實(shí)施的PCR循環(huán)的數(shù)量。圖IIA顯示了擴(kuò) 增子的凝膠電泳分析和密度計(jì)定量。圖11B是擴(kuò)增子數(shù)量與PCR循環(huán)數(shù) 量的曲線圖。圖IIC顯示了電化學(xué)檢測(cè)結(jié)果。圖IID顯示了電化學(xué)信號(hào)值 (峰區(qū))與PCR循環(huán)數(shù)量的曲線圖。圖11B和IID顯示的曲線對(duì)應(yīng)表明 該方法允許定量監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)。實(shí)施例3:電催化核酸插入劑的制備檢測(cè)試劑任選為作為核酸鏈插入劑的電化學(xué)部分。示例的插入劑具有 下列方案1所示的式<formula>formula see original document page 25</formula>方案1并且通過類似于Tansil等(Anal Chem. 2005, 77(1), 126-134)的方法制 備。將于3.0 mL無水THF中的6.0 mL(24.92 mmol)l(3-氨丙基)咪唑溶液裝 入50mL雙頸圓底燒瓶，所述燒瓶裝有水冷凝結(jié)器、均衡壓力添加漏斗以 及1/4"磁性攪拌棒。反應(yīng)方案于方案2中提供。<formula>formula see original document page 25</formula>方案215分鐘時(shí)段內(nèi)，持續(xù)攪拌下向該溶液添加于3.0 mL無水THF中的 0.6058 g (2.26 mmol)l，4,5，8-萘四羧基二酐。于逆流加熱該反應(yīng)混合物24小 時(shí)。反應(yīng)混合物的顏色在30分鐘內(nèi)從亮淡黃橘色變?yōu)榉浅０档淖厣Ｔ?反應(yīng)時(shí)間結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并在快速攪拌下添加20mL丙 酮/水混合物(3:l v:v)。使得該混合物在室溫靜置5分鐘。倒出上清液層。 向殘留物中添加lOmL曱醇，攪拌所產(chǎn)生的漿體。通過抽濾收集黃色結(jié)晶。 使用甲醇快速洗滌過濾塊并使用抽吸進(jìn)行空氣干燥。由20 mL氯仿/乙醇混 合物(l:l v:v)重結(jié)晶沉淀，然后在4(TC過夜真空千燥，產(chǎn)生0.236 g (22%產(chǎn) 率，先前報(bào)道的產(chǎn)率85%)的產(chǎn)物。產(chǎn)物的^-NMR光語與文獻(xiàn)中所報(bào)道 的完全一致。方案3中提供了該反應(yīng)的方案?！穯酛S^°^+ a';丄-D^i3^嗎J方案3在IO分鐘時(shí)段內(nèi)持續(xù)攪拌下，向于16.0 mL乙二醇中的0.642 g(0.52 mmol) Os(bpy)2Cl2溶液中添加0.236 g (0.25 mmol)PIND (參見方案3左側(cè) 的結(jié)構(gòu))。在180。C的油浴溫度加熱最終的混合物30-40分鐘。通過在60°C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙二醇，產(chǎn)生粘稠的油性殘留物。強(qiáng)力攪拌下向該粘稠的殘 留物中添加150mLTNF，形成最終的沉淀。通過抽濾收集沉淀，使用無水 TNF漂洗，并經(jīng)過濾器千燥，產(chǎn)生129.3 mg(50。/。產(chǎn)率，先前報(bào)道的產(chǎn)率 78%)極易溶于水和乙醇的暗紫色粉末產(chǎn)物。相比之下，起始材料 (Os(bpy)2Cl2是不易溶于水并幾乎不溶于乙醇的暗紫色粉末。該產(chǎn)物的UV 可見光語與文獻(xiàn)中所報(bào)道的一致。實(shí)施例4:聚陽離子電化學(xué)部分在本發(fā)明公開的方法的選擇方面，標(biāo)簽序列在檢測(cè)前固定于遠(yuǎn)距離的 電極。例如，在標(biāo)簽序列包括一個(gè)或多個(gè)含硫官能團(tuán)(如巰基或二硫鍵) 和所迷電極包括金金屬表面的情況中。在這些方面，可通過添加與所吸附 的標(biāo)簽序列靜電相互作用的電化學(xué)部分便于標(biāo)簽序列的檢測(cè)。所述靜電相 互作用不依賴或需要表面多核苷酸探針與所述標(biāo)簽序列的雜交。聚陽離子與巰基化的結(jié)合的標(biāo)簽序列的結(jié)合示于下列方案4中的簡(jiǎn)電極方案4其中，聚陽離子包括多個(gè)可逆性氧化還原中心。靜電結(jié)合的氣化還原 中心可介導(dǎo)在電極表面的檢測(cè)，如圖12所示。注意圖12的"基質(zhì)"可指可 便于可檢測(cè)標(biāo)簽的檢測(cè)的任何氧化還原活性化合物或材料(這里結(jié)合的標(biāo) 簽是為聚陽離子并與含有氧化還原活性部分的聚陽離子部分絡(luò)合的 ssDNA側(cè)翼(例如鋨絡(luò)合物)，其中所述氧化還原活性部分的存在可通過 圖22所示的氧化還原循環(huán)檢測(cè))。實(shí)施例3A. 氣化還原可逆性聚陽離子可包括a,(o-二咪唑鏈烷的鋨絡(luò) 合物，如下列方案5所示。<formula>formula see original document page 27</formula>其中n為1至10的整數(shù)，5和6是可商購(gòu)獲得的方案 5實(shí)施例3B. 可選地，聚陽離子電化學(xué)部分可包括其他鋨絡(luò)合物， 如下文所述。二鋨絡(luò)合物或四鋨絡(luò)合物通過分別使合適的二酸或四酸與亞 硫酰氯反應(yīng)而合成。除了其他方法外，所產(chǎn)生的?；然衔锟赏ㄟ^真空蒸餾純化。在某些方面，酰基氯化合物可轉(zhuǎn)化為其N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 酯相似物。NHS酯可在二異丙基乙胺(DIPEA)的存在下通過使用二琥珀酰 亞胺碳酸酯(DSC)處理酸而制備。反應(yīng)策略示于方案6。<formula>formula see original document page 28</formula>方案6實(shí)施例3C. 可選地，二鋨絡(luò)合物或四鋨絡(luò)合物可根據(jù)下文所述的 方案進(jìn)行制備。于含水乙醇中的2-(2-氨乙基)吡啶和Os(bpy)2Cl2反應(yīng)，沉 淀和純化產(chǎn)物，產(chǎn)生所需的鋨絡(luò)合物。二?；群退孽；然衔?包括 它們的NHS酯類似物)可根據(jù)上述方案制備。合成策略示于方案7。<formula>formula see original document page 29</formula>其中。、n和t報(bào)立地為、2、 J或O， J- (2-A乙基吡喊)U.為商購(gòu)可獲得的，方案7實(shí)施例3D. 在又一個(gè)實(shí)施例中，氧化還原可逆性聚陽離子可為包 括多個(gè)電活性中心的聚合物，例如鋨絡(luò)合物。所述聚合的聚陽離子可通過 根據(jù)類似于美國(guó)專利No. 5,262,035 (由此通過引用并入)所"J艮道的方案處理 聚(4-乙烯吡夂)和Os(bpy)2Cl2而制備。為了防止在高pH的a-消除，可使 用曱基基團(tuán)取代與吡啶環(huán)體系連接的2-氨基或2-羥乙基。合成策略示于方 案8。見B * Gwg9和A He11w壤速M(fèi)類似W務(wù)步flU其中IUCH;CM:ON A CH^C^m^ 方案8實(shí)施例3E. 在所選擇的可選實(shí)施方案中，聚陽離子電化學(xué)部分可 如下文所述由聚(l-乙烯基咪唑)制備。聚合物骨架可通過在TEMED的存在下使用過硫酸銨作為引發(fā)劑進(jìn)行1-乙烯基咪唑的溶液聚合而制備。1-乙烯基咪唑的自由基聚合也可通過水溶性偶氮化合物引發(fā)，例如2,2'-偶氮 雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二氫氯化物。所產(chǎn)生的聚合物1為氷溶性并可 通過例如透析進(jìn)行純化。使用例如于含水乙醇中的Os(bpy)2Cl2處理聚咪唑 化合物導(dǎo)致多個(gè)氣化還原活性中心添加至聚合物上。在其中很少的咪喳環(huán) 仍未^1取代的高度轉(zhuǎn)化的情況中，所產(chǎn)生的聚陽離子化合物可通過由THF 沉淀分離和純化。在某些方面，所需單體例如N,N-二甲基丙烯酰胺可使用 乙烯咪唑化合物共聚，以使得所產(chǎn)生的聚合物的特定物理和化學(xué)特性根據(jù) 需要而不同。合成策略示于方案9。12 M JS方案9實(shí)施例3R 在所選的實(shí)施方案中，聚陽離子電化學(xué)部分可包括具有 沿聚合物骨架的鞋基氮雜環(huán)丁烷(hydroxylazetidinium)基團(tuán)的水溶性聚合 物，所迷水溶性聚合物由N,N-二烯丙基-3-羥基氮雜環(huán)丁烷鹽的聚合或共聚 而制備?？蛇x地，POLYCUP聚合物可通過使用已二酸聚酰胺和N,N-二(2-氨乙基)胺處理表氯醇而制備。聚合物^_為高陽離子并且極易溶于水。氮 雜環(huán)丁烷氯化物對(duì)于氨基和羧基具有高反應(yīng)性。氣化還原可逆性咪唑基 -Os(bpy)2Cl可如所述摻入而產(chǎn)生21，所述2L可通過由甲醇或TNF沉淀而 分離并可通過透析純化。o<formula>formula see original document page 31</formula>其中！^HOlA-N^J和HW《Ha N^3$ 可分別被<formula>formula see original document page 31</formula>取代，方案10實(shí)施例3C. 可選地，有電活性的二茂絡(luò)鐵絡(luò)合物(而不是鋨絡(luò)合 物)可通過2L與2-氨乙基二茂絡(luò)鐵或醋酸二茂絡(luò)鐵反應(yīng)而摻入。實(shí)施例3D. 在特定實(shí)施例中，將12%的POLYCUP聚合物20_溶液 的等份加入等量的多官能胺聚(乙烯亞胺)21的10%水溶液中。在50°C 水浴中加熱的15分鐘內(nèi)該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化為固體凝膠，表明23_中的氮雜 環(huán)丁烷環(huán)對(duì)于胺官能團(tuán)的高反應(yīng)性。當(dāng)多官能胺2!^被單官能胺3-氨基丙 基咪唑25_取代與2L反應(yīng)時(shí)，沒有形成凝膠。參見方案ll。CH2CHjNH2{CH2CH2-NH-CH2CH2"^CH2CH2-N-CH2CH2f 方案11實(shí)施例5: 1,1'-(1，6-己烷二基)雙(咪唑)的制備在攪拌下向250 mL三頸圓底燒瓶裝入3.0 mL水和5.82 g(103.7 mmol) 氫氧化鉀，所迷燒瓶裝有磁性攪拌棒、添加漏斗以及Dean-Stark凝結(jié)器。H2ISKCH2)3-N^j 趙當(dāng)KOH分解時(shí)，添加100mL甲苯，然后添加6.81 g(lOO.O mmol咪唑。當(dāng) 咪唑分解時(shí)，添加40.0 mL的DMSO。子133。C油浴中加熱并攪拌該混合物，直到?jīng)]有氷再共餾出，或約4 小時(shí)。產(chǎn)生約8mL水。在反應(yīng)混合物的溫度降至低于9(TC時(shí)，持續(xù)攪拌下滴加12.07 g(49.5 mmol)的1,6-二溴己烷。在添加過程中形成白色沉淀。在85-90。C攪拌該混合物17小時(shí)。通過過濾去除溴化鉀。通過減壓蒸餾(49°C， 0.5 mm Hg)去除過濾液 中的曱苯和DMSO產(chǎn)生粘稠的油狀物。真空蒸餾小量白色結(jié)晶固體(90。C， 0.02mmHg)，并通過^-NMR光 譜法鑒定為咪唑。使用1:1 v:v的二氯曱烷和甲醇混合物使殘留的油狀物經(jīng) 受色謙純化，產(chǎn)生8.0g(74。/。產(chǎn)率)產(chǎn)物。該產(chǎn)物的iH-NMR光譜與預(yù)期結(jié) 構(gòu)一致。合成方案示于方案12。方案12實(shí)施例6:鋨取代的1,1'-(1,6-己烷二基)雙(咪唑)的制備向裝有磁性攪拌棒和凝結(jié)器的500 mL圓底燒瓶中添加2.0 g (3.5 mmol) 二吡"^二氯化鋨、0.38 g(1.76 mmol)的1,6-雙(咪唑)己烷、100.0 mL 乙醇以及100.0 mL去離子水。于油浴中加熱該反應(yīng)混合物至溫和逆流16 小時(shí)，產(chǎn)生暗紫色溶液。然后，將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，在減壓下去 除溶劑。于60 mL的THF中研磨殘留物15分鐘。通過抽濾收集沉淀物，使用 THF漂洗去除l,6-雙(咪唑)己烷，并抽吸空氣千燥，產(chǎn)生暗紫色結(jié)晶粉 末。于55。C過夜真空干燥該產(chǎn)物，產(chǎn)生2.26 g(94.5 %產(chǎn)率)產(chǎn)物。該產(chǎn)物 的iH-NMR光譜與預(yù)期的結(jié)構(gòu)一致。合成方案示于方案13。方案13實(shí)施例7:化合物7于DNA修飾的電極的反應(yīng)通過具有10 nm鉻層、然后是500 nm金層的毯式濺射涂覆氧化硅片 來制備工作電極。然后使用商業(yè)UV-Ozone清潔劑清潔該硅片的劃線片段 30分鐘，然后于無水乙醇中浸泡20分鐘。然后在氮?dú)庀赂稍镫姌O。使用 PDMS墊圏限定暴露區(qū)，將不同濃度的DTPA修飾的25個(gè)堿基的DNA鏈 置于電極表面20分鐘(其中DTPA為方案20所示類型的含二硫鍵的磷酸 酯連接子)，然后暴露于水中的1 mM巰基己醇10分鐘。在使用水漂洗之 后，然后將電極暴露于于Millipore水中的2 (參見方案14 )的100 pg/mL 溶液1分鐘，并于水中漂洗20分鐘。<formula>formula see original document page 33</formula>然后將電極裝入具有3 mm直徑O形圈的電化學(xué)電池以限定電極區(qū)。 使用電極在100 mV/秒鐘于10 mM Tris緩沖液(pH8)使用鉑對(duì)應(yīng)電極和 Ag/AgCl參考電極進(jìn)行循環(huán)伏安圖鐠，如圖13所示。然后將檢測(cè)的整合電荷相對(duì)于化合物]_和2_的DNA濃度進(jìn)行繪圖。 所產(chǎn)生的曲線圖示于圖14。實(shí)施例8:樹枝狀電化學(xué)部分氧化還原可逆性介質(zhì)可經(jīng)四臂聚(氧化乙烯)琥珀酰亞胺終止的季戊四醇(通過Polymer Source (Quebec, Canada)商購(gòu)獲得)制備。如下文所述， 赤藻糖醇中間物的反應(yīng)產(chǎn)生一種然后與Os(bpy)2)Cl2反應(yīng)產(chǎn)生四臂氧化還 原部分的化合物。所產(chǎn)生的化合物具有親水性，并對(duì)于化學(xué)吸附較不敏感。 對(duì)于本文所述的各聚陽離子，平衡離子可經(jīng)任何合適的離子交換方法例如 離子交換樹脂或在大于7的pH下透析而凈皮取代。 制備四臂電化學(xué)部分的合成策略示于方案15。<formula>formula see original document page 34</formula>可葡購(gòu)獲得<formula>formula see original document page 34</formula>其中B^n可舉U為L(zhǎng) 2、 并且HT樣代替*方案15氧化還原可逆性介質(zhì)還制備成具有其他數(shù)量的臂。例如，六臂部分可 相似地使用六臂聚(氧化乙烯)琥珀酰亞胺-終止的二季戊四醇(也可商購(gòu)獲得(Polymer Source, Quebec, Canada))來制備。如方案16所示，琥珀酰 亞胺酯化合物與過渡金屬的含胺絡(luò)合物的反應(yīng)產(chǎn)生六臂樹枝狀介質(zhì)。<formula>formula see original document page 35</formula>其中—nT攀敏地為！、 2、 5我4，并且<formula>formula see original document page 35</formula>方案16六臂樹枝狀電化學(xué)部分的可選實(shí)例可如下列方案17所列進(jìn)行制備，其中六臂聚(氣化乙烯)琥珀酰亞胺終止的三羥曱基丙烷用于制備包括基 于鋨的氧化還原中心的六臂樹枝狀介質(zhì)。<formula>formula see original document page 36</formula> 方案17實(shí)施例8:包括鋨氧化還原中心的檢測(cè)標(biāo)簽的制備可根據(jù)方案18的合成策略制備包括鋨電活性部分的檢測(cè)標(biāo)簽(<formula>formula see original document page 37</formula>其中,2、 3、 4jfth bpy鍾2,2曙二1fc喊，WPB"二異丙基乙接、方案18作為基于咪唑的檢測(cè)標(biāo)簽的替代物，還可制備包括摻入吡啶環(huán)的鋨中 心的檢測(cè)標(biāo)簽，如方案19中的合成策略所示。<formula>formula see original document page 37</formula>其中DCC"二環(huán)已基欲二亞胺；DIPEA"二異丙基二胺；DMF^二甲基二酰胺方案19摻入鋨氧化還原中心和二硫鍵部分的檢測(cè)標(biāo)簽如方案20的合成策略 所示制備。<formula>formula see original document page 38</formula>其中n-l、 2、3或4，,p~J—J5,壤lt歸,Diped-ji并內(nèi)基乙接,HMP-H-甲基吡咯烷酮方案20如上所述，二石克鍵標(biāo)記的寡核苷酸起始材料自身可用作檢測(cè)標(biāo)簽，這 是由于二硫鍵部分便于吸附至金金屬表面，而聚陰離子磷酸根基團(tuán)便于與 聚陽離子電化學(xué)部分相互作用。然而，末端氨基的存在允許檢測(cè)標(biāo)簽被進(jìn) 一步修飾成包括鋨電化學(xué)部分。實(shí)施例10:帶電荷的標(biāo)簽于未修飾的金電極上的捕獲PCR條件與實(shí)施例中所述相同，除了具有下列序列的報(bào)告探針，其中 DTPA是方案20所述的類型的含有二硫鍵的磷酸酯連接子，并且探針中的 3個(gè)DTPA促進(jìn)化學(xué)吸附至電極表面而無雜交事件 (DTPA)(DTPAXDTPA) CAC GAA TCA AAG CTC TCA ACG CCT GCA AGT CCT AAG ACG CCA(生物素)在PCR之后，然后使用上述用于鏈霉親和素包被的Dynal磁珠的方案 去除未切割的探針和擴(kuò)增子。如先前所述制備和清潔電極。在使用鏈霉親和素包被的Dynal珠分離未切割的探針和擴(kuò)增子之后，將溶液暴露于新清潔的金電極20分鐘，然 后是5秒鐘水漂洗和暴露于巰基己醇的1 mM水溶液10分鐘。然后將電極 暴露于指定的陽離子氧化還原報(bào)告分子的水溶液10分鐘，并然后在水中 漂洗20秒鐘。記錄800 nM探針和化合物21 (方案10所示)的溶液相對(duì) 于Ag/AgCl參考電極和鉑對(duì)應(yīng)電極的循環(huán)伏安圖鐠，如圖15所示。記錄 800 nM探針和化合物7溶液相對(duì)于Ag/AgCl參考電極和鉑對(duì)應(yīng)電極的循 環(huán)伏安圖鐠，如圖15所示。實(shí)施例ll:在未切割的探針的存在下檢測(cè)切割的標(biāo)簽該實(shí)施例描述了下述實(shí)施方案即其中標(biāo)簽互補(bǔ)物通過表現(xiàn)對(duì)結(jié)合金 表面(如金電極)具有特異性的巰基部分(此處由DTPA部分提供)固定 于電極，且可切割探針含有(i)連接至靶互補(bǔ)片段5'端的多核苷酸序列和 (ii)可檢測(cè)標(biāo)簽，其包括切割的標(biāo)簽被固定化的標(biāo)簽互補(bǔ)物捕獲之后用 于電化學(xué)檢測(cè)的含鋨的絡(luò)合物。可在未切割的探針的存在下通過選擇合適的捕獲探針(標(biāo)簽互補(bǔ)物) 來檢測(cè)和/或測(cè)定切割的探針，其中捕獲探針通過選擇性結(jié)合接近電極表面 的未切割探針的標(biāo)簽使未切割的(完整的)探針的捕獲不穩(wěn)定。因此，較結(jié)合探:針的未切割標(biāo)簽部分，捕獲探針較穩(wěn)定地與切割標(biāo)簽雜交。制備50 ^反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物含有IX PCR緩沖液A (Applied Biosystems, P/N N808國(guó)0228), 6 mM MgCl2, 200 mM各dNTP， 200 nM正向和反向引物(見實(shí)施例1), 400 nM 5'-0s標(biāo)記的探針(見下列方案 21用于偶聯(lián)至各探針5'氨基的鋨絡(luò)合物標(biāo)記劑)，0.05單位的Gold AmpliTaqTM聚合酶和3,000拷貝的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特氏菌DNA。檢測(cè)了可切割探針和固定標(biāo)簽互補(bǔ)物的三種不同組合，如下文組合中 所述，其中上面的序列(加下劃線)表示待檢測(cè)的鋨標(biāo)記的切割的探針，標(biāo)簽互補(bǔ)物的捕獲探針； 、 、' " ^ 組合#1標(biāo)簽1: 5'-CACGAATCAAAGCTCTCAAX-3' 帽l:3'GTGCTTAGTTTCGAGAGTTGTGTGAACTTAACGACCCCAAAAAAA5' 組合#2標(biāo)簽1: 5'-CACGAATCAAAGCTCTCAAX-3'帽2 : 3'AAAAAAGTGCTTAGTTTCGAGAGTT (C18 )5'組合#3標(biāo)簽2: 5'-ATCAAAGCTCTCAAX-3'帽2: 3'AAAAAAGTGCTTAGTTTCGAGAGTT( C18 )5'其中X = CGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA-3'(靶特異性片段)且C18 =(OCH2CH2)6(DTPA)3在95。C進(jìn)行熱循環(huán)10分鐘，然后(92°C15秒鐘，66°C1分鐘)x 40 個(gè)循環(huán)。然后，將PCR混合物裝入電化學(xué)電池用于電化學(xué)檢測(cè)，如實(shí)施例 l和2所述。使用來自實(shí)施例2的雜交緩沖液在3rC (約低于上述組合#3 的15-mer切割的標(biāo)簽序列的熔解溫度10。C，如使用IDT網(wǎng)站www.idt.com 上的Tm計(jì)算器程序計(jì)算)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果示于圖16。方案21盡管已參考前述操作原理和優(yōu)選實(shí)施方案展示和描述了本發(fā)明，但對(duì) 于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況 下可進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的各種改變。本發(fā)明意在涵蓋所有這樣的替換、修 改和變化。
權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)靶多核苷酸序列的方法，其包括使探針與包含至少一種靶多核苷酸序列的樣品在有效使所述探針形成探針-靶絡(luò)合物的條件下相接觸，其中所述探針包含靶互補(bǔ)片段和可檢測(cè)標(biāo)簽；從所述探針切割所述可檢測(cè)標(biāo)簽；使被釋放的標(biāo)簽與偶聯(lián)至電極的標(biāo)簽互補(bǔ)物結(jié)合，以在電極上形成固定化的標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物；檢測(cè)與所述標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物的存在相關(guān)聯(lián)的電化學(xué)信號(hào)；以及使所檢測(cè)的信號(hào)與所述樣品中所述靶多核苷酸序列的存在相關(guān)聯(lián)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其還包括使所檢測(cè)的信號(hào)與所述樣品中所述靶 多核香酸序列的量相關(guān)聯(lián)。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述切割所述可檢測(cè)標(biāo)簽包括酶作用切割 所述可^r測(cè)標(biāo)簽。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述切割包括使用核酸酶切割雜交的探針。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中在引物延伸過程中切割所述探針，所迷方 法還包括通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增所述靶序列。
6. 權(quán)利要求3至5任一項(xiàng)的方法，其中所述切割由DNA聚合酶的5' 核酸酶活性介導(dǎo)。
7. 權(quán)利要求3至5任一項(xiàng)的方法，其中所述探針包括RNA片段，且 所述切割包括使所述探針-靶絡(luò)合物與具有RNA酶H活性的酶結(jié)合。
8. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其還包括 使第二探針與所述靶多核苷酸雜交；以及從雜交的探針切割第二可檢測(cè)標(biāo)簽。
9. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所釋放的可檢測(cè)標(biāo)簽包含非靶互 補(bǔ)多核苷s吏序列，且所述標(biāo)簽互補(bǔ)物包含與所述非靶互補(bǔ)多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
10. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所釋放的可檢測(cè)標(biāo)簽包含 L-DNA多核苷酸序列，且所述標(biāo)簽互補(bǔ)物包含與所釋放的可檢測(cè)標(biāo)簽中的 所述L-DNA多核苷酸序列互補(bǔ)的L-DNA多核苷酸序列。
11. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述電化學(xué)信號(hào)是使用與所述 標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物中雙鏈區(qū)結(jié)合的電化學(xué)介質(zhì)來產(chǎn)生的。
12. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所釋放的可檢測(cè)標(biāo)簽包含能夠 與所述標(biāo)簽互補(bǔ)物形成絡(luò)合物的多核苷酸部分。
13. 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所釋放的可檢測(cè)標(biāo)簽包含能夠 與所述標(biāo)簽互補(bǔ)物形成絡(luò)合物的非多核苷酸部分。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述非多核苷酸部分帶有負(fù)電荷，并且 所述標(biāo)簽互補(bǔ)物帶有正電荷。
15. 權(quán)利要求13的方法，其中所述標(biāo)簽互補(bǔ)物包含聚陽離子部分。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述聚陽離子部分包含多個(gè)帶有正電荷 的含氮雜環(huán)部分。
17. 權(quán)利要求13的方法，其中所述非多核苷酸部分包含一個(gè)或多個(gè)巰 基，并且所述標(biāo)簽互補(bǔ)物包含金。
18. 權(quán)利要求13的方法，其中所述非多核苷酸部分包含聚陰離子部 分，并且所述電化學(xué)信號(hào)是使用靜電結(jié)合至所述聚陰離子部分的聚陽離子 電化學(xué)介質(zhì)產(chǎn)生的。
19. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述切割在無所述標(biāo)簽互補(bǔ)物 的情況下進(jìn)行。
20. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸包括使所述樣品與多 種各自互補(bǔ)于不同靶多核苷酸序列的探針接觸，并且所述檢測(cè)包括檢測(cè)至 少兩種不同的輩巴序列。
21. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述探針的濃度等于或小于800nM。
22. —種用于檢測(cè)權(quán)利要求l-21任一項(xiàng)所述的靶多核苷酸序列的微流體設(shè)備，其包括基質(zhì)，其具有形成于其中的多個(gè)微流體室和通道； 覆蓋物，其附著于所述基質(zhì)表面；入口 ，其設(shè)置成接收含有至少一種靶多核苷酸序列的樣品； 一個(gè)或多個(gè)室，其設(shè)置用于使探針與所述樣品接觸，其中所述探針含有耙互補(bǔ)片段和可檢測(cè)標(biāo)簽；一個(gè)或多個(gè)室，其設(shè)置用于使所述樣品經(jīng)受溫度控制、從所述探針切割所述可檢測(cè)標(biāo)簽以及使所釋放的標(biāo)簽與偶聯(lián)至電極的標(biāo)簽互補(bǔ)物結(jié)合以形成固定化的標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物；以及儀器，其設(shè)置成用于檢測(cè)與標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物的存在相關(guān)聯(lián)的 電化學(xué)信號(hào)以及使所檢測(cè)的信號(hào)與所述樣品中所述靶多核苷酸序列的存 在相關(guān)聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用具有靶互補(bǔ)片段和可檢測(cè)標(biāo)簽的探針檢測(cè)靶多核苷酸序列的方法。通過切割可檢測(cè)標(biāo)簽并將所述標(biāo)簽和偶聯(lián)至電極的標(biāo)簽互補(bǔ)物結(jié)合，可檢測(cè)與標(biāo)簽標(biāo)簽互補(bǔ)物絡(luò)合物的存在有關(guān)的電化學(xué)信號(hào)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101268199SQ200680032574
公開日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2006年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月15日
發(fā)明者克里斯蒂安·M·斯卡布, 奧瑞克·N·K·勞, 康拉德·佛爾斯蒂奇, 約翰·R·范·坎普, 維薩里昂·艾瓦澤茨維利, 羅伯特·G·伊森, 蒂莫西·Z·劉 申請(qǐng)人:阿普爾拉股份有限公司