專利名稱：液體加工裝置和方法
液體加工裝置和方法
相關(guān)申請的交叉引用本發(fā)明涉及加工液體的裝置、系統(tǒng)和方法。更具體地，本發(fā) 明涉及操作、加工或改變液體樣品的裝置。
概要根據(jù)不同實(shí)施方案，提供了下述液體加工裝置，其中樣品中 含有的多種不同核酸序列可被預(yù)擴(kuò)增，以產(chǎn)生多種不同的經(jīng)預(yù)擴(kuò)增序 列，然后可以采用單一裝置，對所述多種不同的經(jīng)預(yù)擴(kuò)增序列中的一種 或多種耙核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增。該液體加工裝置可包括微流裝置。根據(jù)多種不同的實(shí)施方案，提供了下述液體加工裝置，其可 包括可包括第一表面、相反的第二表面和厚度(thickness)的基底； 和一個或多個至少部分地由該基底所限定的液體加工通路；所述一個或 多個液體加工通路的每一個可包括第一區(qū)域和兩個或多個第二區(qū)域，其 中第一區(qū)域可包括被置于其中的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)組分，其可適合于預(yù)擴(kuò)增存 在于樣品中的多種不同核酸序列，以產(chǎn)生多種經(jīng)預(yù)擴(kuò)增序列，第二區(qū)域 的每一個都與第一區(qū)域液體相通，并且可包括;故置于的擴(kuò)增反應(yīng)組分， 其可適合于對多種經(jīng)預(yù)擴(kuò)增序列中的一種或多種耙序列進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn) 生一種或多種經(jīng)擴(kuò)增靶序列。根據(jù)多種不同的實(shí)施方案，提供了下述液體加工裝置，其可 包括具有第一表面和相反的第二表面的基底；和一個或多個可至少部 分地由基底所限定的液體加工通路，所述一個或多個液體加工通路的每 一個可包括至少一個熱介導(dǎo)的、壓力啟動的閥，當(dāng)坤黃3爭該閥施加至少兩 個大氣壓的壓力以及該閥一皮加熱至約100。C至約150°C (如約110。C至 約130。C)的溫度時，所述閥可適于爆裂。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了下述液體加工裝置，其可包括具有第一表面和相反的第二表面的基底；和一個或多個至少部分地由基 底所限定的液體加工通^各，所述一個或多個液體加工通^各的每一個可包 括第一區(qū)域和一個或多個置于第一區(qū)域下游并與其液體相通的密封區(qū) 域，所述一個或多個密封區(qū)域的每一個包括可包含氨氣。在一些實(shí)施方 案中，所述一個或多個液體加工通路還可包括置于第一區(qū)域和所述一個 或多個密封區(qū)域之間并與它們液體相通的閥。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了下述液體加工系統(tǒng)，其可包括液 體加工裝置和與所述液體加工裝置的每一個液體加工通路的兩個或多 個第二區(qū)域光學(xué)和/或電化學(xué)相通的檢測器，該檢測器可適合于檢測所述 兩個或多個第二區(qū)域中的一種或多種經(jīng)擴(kuò)增把序列，其中該靶序列的每 一種^皮各自的可片企測標(biāo)記所標(biāo)記。該液體加工系統(tǒng)可包4舌熱循環(huán)裝置。 如果包括的話，該熱循環(huán)裝置可包括例如半導(dǎo)體制冷裝置(peltier device) 或其它已知的加熱裝置?？墒褂玫氖纠园雽?dǎo)體制冷裝置包括于2004 年8月26日提交的美國專利申請10/926,915中所描述的那些，在此通 過引用將其整體并入本文。該熱循環(huán)裝置可提供兩個或多個不同的溫度 區(qū)，例如，以-使將液體加工裝置的兩個部分加熱至兩種不同溫度，和/ 或提供熱區(qū)和冷區(qū)。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了下述液體加工方法，其包括提 供液體加工裝置，其可包括一個或多個液體加工通路，每一個液體加工 通路包括與兩個或多個第二區(qū)域液體相通的第一區(qū)域；向該液體加工裝 置的第一區(qū)域引入可包含多種不同核酸序列的液體樣品；在第一區(qū)域中 預(yù)擴(kuò)增多種不同核酸序列，以產(chǎn)生包含多種經(jīng)預(yù)擴(kuò)增核酸序列的經(jīng)預(yù)擴(kuò) 增液體樣品；將經(jīng)預(yù)擴(kuò)增液體樣品從第一區(qū)域移至所述兩個或多個第二 區(qū)域；以及，在所述兩個或多個第二區(qū)域的每一個中對所述多種經(jīng)預(yù)擴(kuò) 增核酸序列的至少 一種各自的靶核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，以在所述兩個或多 個第二區(qū)域的每一個中產(chǎn)生至少 一種各自的經(jīng)擴(kuò)增耙核酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了下述液體加工方法，其可包括 提供液體加工裝置，其可包括一個或多個液體加工通^各，該液體加工通 路的每一個包括第一區(qū)域和至少一個被置于所述第一區(qū)域下游并與其
液體相通的密封區(qū)域，其中所述至少一個密封區(qū)域可包含氨氣；在第一 區(qū)域中保留液體樣品；以及使液體樣品與氨氣接觸，使得隨著氨氣溶解 進(jìn)液體樣品從第一區(qū)域吸出液體樣品。這種通過溶解作用進(jìn)4亍的液體吸
出可發(fā)生多次，例如，以將液體和/或其反應(yīng)產(chǎn)物順序吸入兩個或多個不 同區(qū)域。根據(jù)多種不同的實(shí)施方案，對一種或多種靶核酸序列進(jìn)行的 預(yù)擴(kuò)增和擴(kuò)增可在單個液體加工裝置(如單個微流加工裝置)中完成。 在一些實(shí)施方案中，預(yù)擴(kuò)增和擴(kuò)增連同樣品制備、測序反應(yīng)和檢測反應(yīng) 中的 一種或多種都可在單個液體加工裝置中完成。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了下述液體加工裝置和方法，它們
可加工多至50種不同液體樣品，每一種都是針對一組病原體(如20種 病原體)多重化的(multiplexed)。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了下述液 體加工裝置和方法，它們可鑒定病原體、抗生素抗性、物種起源、突變、 癌癥或其它基因組病癥。該液體加工裝置和方法可對單種分子壽丈感，并 且可以是菌林特異性的。根據(jù)不同實(shí)施方案，提供了這樣的方法，其可包括多重擴(kuò)增 過程，例如多重PCR過程。該過程可包括在液體加工裝置的液體加工 通路的第一或預(yù)擴(kuò)增區(qū)域中，采用靶區(qū)域外側(cè)引物，預(yù)擴(kuò)增包含核酸分 子的一個以上片段的大區(qū)域，接著可以是在與該裝置的第一或預(yù)擴(kuò)增 區(qū)域液體相通的第二或擴(kuò)增區(qū)域中，采用特異于每一位點(diǎn)的引物擴(kuò)增每 一靶區(qū)域。這種方法使得能同時檢測特定基因或幾個基因中 一個以上的 多態(tài)區(qū)。以下說明書中示出了本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)中的部分，還 有部分會由于這種說明而顯而易見，或可由本發(fā)明的實(shí)施而了解到。通 過在下文說明中特別指出的元件和組合，可意識到并實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的 和其它優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)理解，前面的 一般性說明和以下的詳細(xì)說明僅是示例性 的和解釋性的，它們旨在為本發(fā)明提供進(jìn)一步的解釋。
附圖在附圖中舉例說明了本發(fā)明的多種不同實(shí)施方案。本發(fā)明不 限于繪制在附圖中的實(shí)施方案，其包括在以下說明中示出的以及本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員結(jié)合本發(fā)明能夠知道的類似結(jié)構(gòu)和方法。附圖中

圖1顯示了根據(jù)多種不同實(shí)施方案的液體加工裝置的平面
圖；圖2顯示了根據(jù)一些實(shí)施方案的液體加工裝置的平面圖；
圖3顯示了圖2中顯示的液體加工裝置的4黃截面圖；
圖4顯示了根據(jù)多種不同實(shí)施方案的液體加工裝置的平面
圖；圖5-10顯示了根據(jù)本發(fā)明的多種不同實(shí)施方案的系統(tǒng)，其包 括預(yù)擴(kuò)增陣列、混合陣列和微流卡；以及圖11顯示根據(jù)本發(fā)明其它多種不同實(shí)施方案的系統(tǒng)。
應(yīng)當(dāng)理解，以下的說明僅為示例性和解釋性的。附圖^皮并入 本申請并構(gòu)成其一部分，它們與說明書一起說明了若干示例性實(shí)施方 案?，F(xiàn)在將參考多種不同的實(shí)施方案，它們的實(shí)例在附圖中有圖解。只 要可能，在附圖和說明書中都用同樣的附圖標(biāo)記來表示相同或相似的部 件。
說明書
I.概述整份本申請中，對各個實(shí)施方案的說明采用"包括"性用語； 但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在一些特定情況下，備選地，實(shí)施方案可 采用"基本上由...組成"或"由...組成"的用語來描述。為更好地理解本發(fā)明而非限制本發(fā)明范圍的目的，本領(lǐng)域技 術(shù)人員應(yīng)清楚，除非另有明確說明，單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。因此，術(shù)語 "一個/一種"("a" 、"an")和"至少一個，，在本申請中可互換使 用。除非另有指明，用在說明書和權(quán)利要求書中的所有表述數(shù)量、 百分比或比例的所有數(shù)字以及其它數(shù)值應(yīng)被理解為在所有情況下都被 詞語"約，，所修飾。因此，除非有相反說明，在以下說明書和所附權(quán)利 要求書中列出的數(shù)字參數(shù)為近似值，其可以根據(jù)所想獲得的期望性質(zhì)而 變化。在一些情況下，"約，，可一皮理解為給定值士5%。因此，例如約100 nl,可指95-105 nl。至少，每個數(shù)字參數(shù)應(yīng)至少根據(jù)所報道的有效數(shù)字 值并通過應(yīng)用通常的舍入技術(shù)來理解。用于本文中時，用語"數(shù)個"可^f皮理解為"兩個或多個"。 這時，用語"兩個或多個"與用語"數(shù)個"同義使用。
入。此外，當(dāng)數(shù)量、濃度或其它值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選范圍或一系列較 高優(yōu)選值和一系列較低優(yōu)選值給出時，這應(yīng)當(dāng)被理解為明確公開了由任 何上限范圍值或優(yōu)選值和任何下限范圍值或優(yōu)選值的任何配對所形成 的所有范圍，無論這些范圍是否被獨(dú)立公開。當(dāng)在本文中提到數(shù)值范圍 時，除非另有說明，該范圍旨在包括其端點(diǎn)和該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分 數(shù)。這并不意味著本發(fā)明的范圍被限制到在定義范圍時提到的特定值。本文中，術(shù)語核酸序列指核苷酸堿基的任何序列，例如，通
過糖-磷酸酯骨架結(jié)合在一起的序列。用在本文時，術(shù)語"核苷酸堿基" 指被取代的或未被取代的芳族環(huán)或芳族多環(huán)。在某些實(shí)施方案中，芳族 環(huán)或芳族多環(huán)含有至少一個氮原子。在某些實(shí)施方案中，核苷酸堿基能
夠與適當(dāng)互補(bǔ)的核苦酸堿基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氫鍵。示 例性核苷酸堿基及其類似物包括但不限于，天然產(chǎn)生的核苷酸堿基腺嘌 呤、鳥噪呤、胞嘧啶、6甲基-胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，以及天然產(chǎn) 生的核苷酸堿基類似物，例如，7-脫氮腺噪呤、7-脫氮烏嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤、N6-A2-異戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-A2-異戊烯基-2-甲硫基腺嘌呤(2ms6iA)、 N2-二甲基鳥嘌呤(dmG)、 7-曱基鳥 嘌呤(7mG)、次黃嘌呤核苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、 2,6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤、 -假尿嘧啶核苷、Wi胞嘧啶、^i異胞嘧啶、
5- 丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、2-硫代嘧啶、
6- 石危代鳥噤呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫脲嘧啶、06-曱基鳥嘌呤、N6-甲 基腺嘌呤、04-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氫胸腺嘧啶、5,6-二氫尿嘧啶、吡 唑并[3,4-D]嘧咬(參見，例如美國專利6,143,877和6,127,121以及PCT 公布的申請WO 01/38584)、亞乙烯基腺。票呤、吲咮類如硝基吲咮和4-甲基巧l咮、以及吡咯類如硝基吡咯。某些示例性核普酸堿基可例如在 Fasman, 1989, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, pp. 385-394, CRC Press, Boca Raton, Fla.以及其中引用的文獻(xiàn)中找到。用于本文中時，術(shù)語"核苷酸"指這樣的化合物，其包含連
接至糖(諸如核糖、阿拉伯糖、木糖、吡喃糖)及其糖類似物的c-r石友 上的核苷酸堿基。術(shù)語核苷酸也包括核苷酸類似物。糖可以是被取代的 或未被取代的。被取代的核糖包括但不限于其中 一 個或多個碳原子如2'-
碳原子被一個或多個相同或不同Cl、 F、 -R、 -OR、 ^112或鹵素基團(tuán)取 代的那些核糖，其中每個R獨(dú)立地為H、 Cl-C6烷基或C5-C14芳基。
示例性核糖包括但不限于2'-(Cl-C6)烷氧基核糖、2'，3'-二脫氳核糖、2'-脫氧-3'-卣代核糖、2'-脫氧-3'-氟核糖、2'-脫氧-3'-氯核糖、2'-脫氧-3'-氨基 核糖、2'-脫氧-3'-(Cl-C6)烷基核糖、2'-脫氧-3'-(Cl-C6)烷氧基核糖和2'-脫氧-3'-(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2'-脫氧核糖、2',3'-二脫氧核糖、2'-卣代核糖、2'-氟代核糖、2'-氯代核糖、以及2'-烷基核糖，例如2'-0-曱 基，4'-異頭核苷酸、l'-異頭核苷酸、2'-4'-和3'-4'-連接的以及其它"鎖定 的，，或"LNA",雙環(huán)糖修飾物(參見，例如PCT公開的申請WO 98/22489， WO 98/39352;和WO 99/14226)。示例性的多核香酸中LNA糖類似物包 括但不限于以下結(jié)構(gòu)
<formula>formula see original document page 10</formula>
其中B為任何核苦酸堿基。在核糖2'-或3'-位進(jìn)行的修飾包括但不限于氬、羥基、曱氧基、 乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、曱氧基乙基、烷氧 基、苯氧基、疊氮基、氨基、烷基氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括但不 限于天然D光學(xué)異構(gòu)體以及L光學(xué)異構(gòu)形式(參見，例如Garbesi (1993) Nucl. Acids Res. 21:4159-65; Fujimori (1990) J. Amer. Chem. Soc. 112:7435; Umta, (1993) Nucleic Acids Symposium Ser. No. 29:69-70)。當(dāng) 核苷酸堿基為噤呤即A或G時，核糖連接到核苷酸堿基的N9位。當(dāng)核 普酸堿基為嘧啶即C、 T或U時，除了假尿嘧啶核苷以外，戊糖連接到 核苷酸堿基的Nl位，在假尿嘧咬核苷中，戊糖連接到尿嘧咬核普酸堿 基的C5位(參見，例如Romberg and Baker, (1992) DNA Replication, 2nd Ed., Freeman, San Francisco, CA)。核苦酸的一個或多個戊糖石灰可以 一皮具有下式的》岸酸酯取代<formula>formula see original document page 11</formula>其中a是0至4的整數(shù)。在一些實(shí)施方案中，a是2并且該^疇酸酯連接到戊糖的3'或 5'碳。在一些實(shí)施方案中，核苷酸是其中核苷酸堿基是嘌呤、7-脫氮嘌 呤、嘧咬或其類似物的那些核普酸。"核苦酸5'-三磷酸"指在5'位具有 三磷酸酯基團(tuán)的核苷酸，其有時被表示為"NTP"或"dNTP"和"ddNTP", 以特別指出該核糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。三磷酸酯基團(tuán)可以包括對多種不同的氧 進(jìn)行的石危取代，例如-硫代-核苦酸5'-三磷酸。關(guān)于核苷酸化學(xué)的綜述， 參見Shabarova, Z. and Bogdanov， A. Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, VCH, New York, 1994。用于本文中時，術(shù)語"核苦酸類似物"指下述實(shí)施方案，其 中核苷酸的戊糖和/或核苷酸堿基和/或一個或多個磷酸酯可以被其各自 的類似物所替換。在某些實(shí)施方案中，示例性的戊糖類似物為上文描述 的那些。在某些實(shí)施方案中，核苷酸類似物具有上文描述的核苷酸堿基 類似物。在某些實(shí)施方案中，示例性磷酸酯類似物包括但不限于烷基 磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidates)、磷酸三酯、硫代磷 酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、 phosphoroanilothioates 、 phosphoroanilidates 、 石壽 酰 胺 酉旨 (phosphoroamidates)、石朋石舞酸酉旨(boronophosphates)等，并且可以包4舌結(jié) 合的平衡離子。包括在核苦酸"類似物"定義內(nèi)的還有核苷酸類似物單體， 其可被聚合成多核苷酸類似物，在該多核苷酸類似物中DNA/RNA磷酸 酯/或糖磷酸酯骨架被不同類型的核苷酸間鍵合所替換。示例性的多核苷 酸類似物包括但不限于肽核酸，其中多核苷酸的糖磷酸酯骨架被肽骨架 替換。還包括嵌入(intercalating)核酸(INAs, Christensen and Pedersen, 2002中所描述的)和AEGIS堿(Eragen,美國專利5,432,272)。用于本文中時，術(shù)語"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸" 可互換使用，它們指核苷酸單體的單鏈和雙鏈聚合物，包括通過核苷酸 間^壽酸二酯腱或核苷酸間類似物連接的2'-脫氧核糖核苷酸(DNA)和核 糖核苦酸以及結(jié)合的平tf離子，例如H+、 NH4+、三烷基4妄、Mg2+、 Na+,等等。核酸可以完全由脫氧核糖核苷酸組成、完全由核糖核苷酸 組成或由其嵌合混合物組成。核苷酸單體單元可以包括本文描述的任何 核苷酸，其包括但不限于天然產(chǎn)生的核苷酸和核苷酸類似物。核酸的典 型大小范圍從數(shù)個單體單位(例如，當(dāng)它們在現(xiàn)有技術(shù)中常常被稱為寡核 苷酸時，5-40個)到數(shù)千個單體核苷酸單元。除非另有說明，每當(dāng)表述 核苷酸時，應(yīng)理解核苷酸從左到右為5'至3'順序，以及除非另有說明，
"A"指脫氧腺苷或其類似物、"C"指脫氧胞苷或其類似物、"G"指 脫氧烏苷或其類似物、以及"T"指胸腺嘧啶脫氧核苷或其類似物。核酸包括但不限于基因組DNA、 cDNA、 hnRNA、 mRNA、 rRNA、 tRNA、片斷化核酸、從諸如線粒體或葉綠體的亞細(xì)胞器獲得的 核酸以及/人可能存在于生物樣品上或樣品中的樣￡生物或DNA或RNA病 毒獲得的核酸。核酸可以由單一類型的糖部分構(gòu)成(例如，在RNA和DNA 的情況下)，或者由不同糖部分的混合物構(gòu)成(例如，在RNA/DNA嵌 合體的情況下)。在某些實(shí)施方案中，核酸為以下結(jié)構(gòu)式的核糖多核苷 酸和2'-脫氧核糖核苷酸其中每個B獨(dú)立地為核苷酸或類似物核苷酸的堿基部分，例如噤
呤、7-脫氮嘌呤、嘧啶；每個m定義各核酸的長度，范圍從0至數(shù)千、 數(shù)萬或更大；每個R獨(dú)立地選自氫、卣素、—R"、 —OR"、和—NR"R"， 其中每個R"獨(dú)立地為(C1-C6)烷基或(C5-C14)芳基，或者兩個鄰近的R 合起來形成鍵以使得核糖為2',3'-二脫氧核糖；以及每個R'獨(dú)立地為羥基 或
<formula>formula see original document page 13</formula>其中a為0、 1或2。在以上圖解說明的核糖多核苷酸和2'-脫氧核糖多核苷酸的某 些實(shí)施方案中，核苷酸石咸基B共價連接到糖部分的Cl'碳，如之前所描 述的。術(shù)語"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"還可包括核酸
類似物、多核苷酸類似物和寡核苦酸類似物。術(shù)語"核酸類似物"、"多 核苷酸類似物"和"寡核苷酸類似物"在本文中可互換使用，它們指含 有至少一個核苷酸類似物和/或至少一個磷酸酯類似物和/或至少一個戊 糖類似物的核酸。包括在核酸類似物定義中的還有磷酸酯和/或糖磷酸酯
鍵被其它類型鍵替換的核酸，所述其它類型鍵例如為N-(2-氨基乙基)-甘氨酸酰胺和其它酰胺(參見,例如Nielsen et al., 1991, Science 254: 1497-1500; WO 92/20702; U.S. Pat. No. 5,719,262; U.S. Pat No. 5,698,685);嗎啉4戈(參見，例如U.S. Pat. No. 5,698,685; U.S. Pat. No. 5,378,841; U.S. Pat. No. 5,185,144);氨基曱酸脂類(參見，例如Stirchak & Summerton, 1987, J. Org. Chem. 52: 4202);亞曱基(甲基亞氨基)(參見， 例如Vasseur et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 4006); 3'-碌u甲縮醛 (thioformacetals)(參見,例如Jones et al., 1993, J. Org. Chem. 58: 2983); 氨基磺酸脂類(參見，例如U.S. Pat. No. 5,470,967); 2-氨基乙基甘氨酸， 常常稱為PNA (參見，例如Buchardt, WO 92/20702; Nielsen (1991) Science 254:1497-1500);以及其它鍵(參見，例如U.S. Pat. No. 5,817,781; Frier & Altaian, 1997, Nucl. Acids Res. 25:4429以及其中引用的參考文 獻(xiàn))。磷酸酯類似物包括但不限于(i) C1C4烷基磷酸酯，例如甲基磷酸酯； (ii)磷酰胺酯；(iii) C1C6烷基-磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯；以及(v)二硫 代磷酸酯。根據(jù)多種不同的實(shí)施方案，耙核酸序列可包括任何目的核酸 序列，例如核酸、SNP、含有全長或部分目的基因多態(tài)區(qū)的核酸，等等。根據(jù)多種不同的實(shí)施方案，提供了與樣品制備和分析中涉及 的過程或行為有關(guān)的方法。應(yīng)當(dāng)理解，在多種不同的實(shí)施方案中，方法 可以以所指出過程的順序來進(jìn)行，但是在相關(guān)實(shí)施方案中，為了實(shí)現(xiàn)希 望的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)為適當(dāng)而改變該順序。根據(jù)多種不同的實(shí)施方案，液體樣品可包括含水或非水樣品。 含水或非水樣品可包括任何含有核酸的材料，例如生物材料。含有核酸
的材料可包括例如以下材料中的一種或多種血液；細(xì)胞樣品；亞細(xì)胞 的細(xì)胞器，例如線粒體或葉綠體；細(xì)胞裂解液；組織樣品，例如皮月夫； 細(xì)胞培養(yǎng)基；體液，例如唾液、尿或滲出液；活檢培養(yǎng)液等。這類含有 核酸的材料可包括任何來源，例如，人類來源、動物來源、植物來源、
細(xì)菌來源、病毒來源，等等。含有核酸的樣品可在預(yù)擴(kuò)增之前或在預(yù)擴(kuò) 增的同時被處理以獲得核酸?？稍陬A(yù)擴(kuò)增之前采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的方法獲得核苷酸和核酸。才艮據(jù)多種不同的實(shí)施方案，加工或反應(yīng)組分可包括在一個或
多個過程中使用所需或所希望的一種或多種組分，例如以任何方式影響 所期望反應(yīng)的進(jìn)展的組分。加工組分可包括反應(yīng)性組分。但是，該組分 不是必須要參與反應(yīng)。加工組分可包括非反應(yīng)性組分。加工組分可包括 可回收組分，其可包4舌例如溶劑和/或催4匕劑。加工組分可包括啟動劑、 促進(jìn)劑或延緩劑，它們不是反應(yīng)所必需的，但是會影響到反應(yīng)，例如影 響反應(yīng)速率。術(shù)語"反應(yīng)組分"與術(shù)語"加工組分"同義使用，如本文 所述。合適的過程可包括一個或多個樣品制備過程、樣品純化過程、樣 品擴(kuò)增過程、預(yù)擴(kuò)增過程、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物純化過程、擴(kuò)增過程、擴(kuò)增產(chǎn)物 純化過程、分離過程、測序過程、測序產(chǎn)物純化過程、標(biāo)記過程、；險測 過程，等等。加工組分可包括樣品制備組分、純化組分、預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)組 分、擴(kuò)增反應(yīng)組分、測序反應(yīng)組分，等等。無需過度實(shí)驗，技術(shù)人員可 容易地選擇和采用適于所期望的反應(yīng)或過程的組分。根據(jù)一些實(shí)施方案，可采用現(xiàn)有技術(shù)中任何已知的方法將加 工組分或反應(yīng)組分配置在一個或多種區(qū)域或通道中。例如，組件可,皮噴 霧和干燥，采用稀釋劑遞送，采用毛細(xì)管、移液器和/或自動移液器注入， 或以其它方式#1配置在所述區(qū)域或通道中。根據(jù)一些實(shí)施方案，所提供的液體加工裝置可包括一個或多 個液體加工通路，它們每一個可包括一個或多個元件，例如一個或多個 區(qū)域、通道、分支通道、閥、分流器、排氣口、孑L、入口區(qū)、通路、小 珠、含有反應(yīng)物的小珠、覆蓋層、反應(yīng)組件、混流器(flow combiner)、 集流器(flow merger)、交叉流通路、它們的任意組合等等。任何元件可 與另一元件液體相通，其中"液體相通"可-皮理解為直接的液體相通，
為可適合于液體相通，例如當(dāng)兩個區(qū)域通過包括有置于其中的密閉閥的
立液體相通)，其中這兩個區(qū)域為可適合于液體相通。用在本文時，術(shù)語 "液體相通"指直接液體相通和/或可適合于直接液體相通，除非另有明 確說明。本文也使用術(shù)語"有閥的液體相通"，指有閥置于其間的元件，
4吏得在打開或開動閥時，可在該元件間建立液體相通。根據(jù)多種不同的實(shí)施方案，可按照本文所述來使用的閥可例
如包括可分解閥、可溶脹岡和/或復(fù)合閥，例如2005年10月18日提交 的美國專利申請11/252,821、 2005年10月18日提交的美國專利申請 11/252,912、2005年10月18日提交的美國專利申請11/252, 915以及2005 年10月18日提交的美國專利申請11/252,914中所描述的，在此通過引 用將它們整體并入本文。根據(jù)不同實(shí)施方案，閥可包括油封通道，例如 美國專利申請11/380,327中所描述的，在此通過引用將其整體并入本文。涉及核酸的反應(yīng)可包括酶促反應(yīng)，其中核酸^皮擴(kuò)增以增加覃巴 核酸的量用于分析。其它的反應(yīng)可例如包括引物延伸反應(yīng)、測序反應(yīng)、 斷裂反應(yīng)(例如采用特異的內(nèi)切核酸酶)、核酸錯配異型雙鏈的切割反應(yīng)、 寡核苦酸連接反應(yīng)和單鏈構(gòu)象反應(yīng)。根據(jù)多種不同的實(shí)施方案，相對于 靶序列擴(kuò)增反應(yīng)，第二或下游擴(kuò)增反應(yīng)可以是產(chǎn)物擴(kuò)增反應(yīng)。就此而言， 靶序列并不被擴(kuò)增，而是其一種或多種反應(yīng)產(chǎn)物以成倍方式產(chǎn)生，最終 形成成倍的可檢測產(chǎn)物。這種類型的示例性檢測法為可從Third Wave Technologies of Madison, Wisconsin獲4尋的Invader 4全測法。示例十生才企測 法在Brow等人的美國專利6,706,471和2004年1月22日公布的美國專 利申請US 2004/0014067中有描述，在此通過引用將它們整體并入本文。核酸擴(kuò)增反應(yīng)可包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其可根據(jù)現(xiàn)有技 術(shù)中已知的任何方法進(jìn)行。例如，在一種PCR方案中，使細(xì)胞基因組 DNA與兩種引物接觸，并進(jìn)行多輪擴(kuò)增以足以產(chǎn)生所需量的經(jīng)擴(kuò)增的 DNA。兩引物位置可例如間隔約50至350、約50至500、多至約IOOO 或更多石咸基對、多至約10,000石咸基對，或多至100,000或更多石咸基對。如果要進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，開始將包括核酸分子 一個以上片 段的大區(qū)域用該區(qū)域外側(cè)引物擴(kuò)增，然后采用各位點(diǎn)特異引物擴(kuò)增每一 亞區(qū)域或片段，例如嵌套PCR。多重PCR的一些缺點(diǎn)包括PCR引物間 的部分結(jié)合或PCR引物和其它引物或基因組DNA不同于靶位點(diǎn)的其它 區(qū)域之間的部分結(jié)合，由此導(dǎo)致產(chǎn)生副產(chǎn)物，并且期望PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量 降低。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉多重PCR的設(shè)計和限制?？膳c本發(fā)明聯(lián)合使用的示例性多重方法和裝置包括例如在 2004年9月9日公布的美國專利申請US2004/0175733中描述的那些， 在此通過引用將其整體并入本文。擴(kuò)增核酸的其它方法可包4舌^旦不限于孩iPCR (mim-PCR)、 連接酶鏈反應(yīng)(LCR) [Wiedmann et al. (1994) PCR Methods Appl. Vol. 3, Pp. 57-64;Barnay(1991)Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189-93]、鏈置換擴(kuò) 增(SDA) [Walker et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2670-77]、 RT-PCR [Higuchi etal. (1993) Bio/Technology 11 :1026-1030]、滾環(huán)擴(kuò)增、重組酶 聚合酶擴(kuò)增(Armes et al., WO03072805; Piepenburg et al., US2005112631)、 EXPAR (van Ness et al., WO2004067726)、產(chǎn)生空間定 位產(chǎn)物(spatially localized product)的等溫核酸擴(kuò)增(Saba, http:〃wbabin.net/saba/sabal7.htm)、諸如采用QJ復(fù)制酶的自身催化方法、 TAS、 3SR和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它適合的方法。其它擴(kuò)增方法可包括自主序列復(fù)制(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874-1878)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173-1177)、Q卩復(fù)制酶(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197)或任何其它核酸擴(kuò)增方法，之后采用本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的和本文公開的技術(shù)檢測經(jīng)擴(kuò)增的分子。如果核酸分子以極小 的數(shù)量存在時，這些^r測方案尤其可用于對這些分子加以;險測核酸分 子?；蛘?，可以采用等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)，其依賴于選擇性PCR 擴(kuò)增。用作特異性擴(kuò)增引物的寡核苷酸可以在分子中部帶有目的等位變 體(使得擴(kuò)增依賴于差異雜交)，或者在一個引物的3'末端帶有目的等位 變體，其中在合適的條件下，4昔配可防止或減少聚合酶延伸(Prossner (1993) Tibtech 11:238; Newton et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:2503)。此 外，有可能希望在突變區(qū)域中引入限制性位點(diǎn)，以產(chǎn)生基于切割的檢測 (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1)。引物延伸反應(yīng)引物延伸反應(yīng)包括聚合酶介導(dǎo)的核酸鏈延伸 的特異終止，這通過向延伸反應(yīng)引入鏈終止劑(如二脫氧核苷酸)來實(shí) 現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)中已知若干種基于引物延伸的方法，它們已被用于測定核 酸序列中特定核苷酸的身份。通常，制備的引物在特定核酸分子中鄰近 目的位點(diǎn)如多態(tài)位點(diǎn)處特異雜交。然后，在一種或多種二脫氧核苷酸存 在下延伸，其中通常有至少一種二脫氧核普酸是該多態(tài)位點(diǎn)核苷酸的互 補(bǔ)物。片斷化反應(yīng)在包括PCR產(chǎn)物或其它擴(kuò)增產(chǎn)物在內(nèi)的特異核 酸內(nèi)是否存在一種或多種突變?nèi)缍鄳B(tài)性，可從這些核酸的片斷來確定。
可通過不同的化學(xué)和/或酶學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生這些片斷。對于這些片斷化反應(yīng)的 任一種，可通過例如電泳、毛細(xì)管電泳、質(zhì)i普等確定反應(yīng)后獲得的核酸 片段的分子量。可通過其表征全序列的整體片斷化模式來表征靶核酸，或通 過片斷化^t式的所選部分來表征。核酸的某些片斷可^f皮選擇性分離和純 化，例如通過在基底上的雜交或者通過其它特異性相互作用(如一條或多 條片斷的生物素/鏈霉親和素親和力)來捕獲。用于分離和純化所產(chǎn)生的 全部或大部分片斷的方法例如包括通過在一種以及多種基底上的雜交 來特異和非特異(例如，通過使用聚肌苷)捕獲，所述基底通過離子鍵、 氫鍵或疏水相互作用、螯合配體、親和相互作用或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的其它手段與片斷結(jié)合。產(chǎn)生核酸片斷(優(yōu)選從擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生片斷)的一種方法是使 用一種或多種限制酶。對該反應(yīng)的產(chǎn)物的數(shù)量、大小和/或組成的分析將 提供關(guān)于該核酸和其在一個或多個位點(diǎn)變體的信息。例如，測序反應(yīng)內(nèi) 的特異核苷酸多態(tài)性多種核酸測序反應(yīng)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，并可 用于鑒定特定核酸。示例性測序反應(yīng)包括基于Maxam和Gilbert [(1977) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 74:560]或Sanger [Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463]開發(fā)的技術(shù)的那些反應(yīng)。對于一些實(shí)施方 案，在測序反應(yīng)中僅需確定一個、兩個或三個核苷酸堿基的存在，這對 本領(lǐng)域技術(shù)人員來i兌顯而易見。例如，可進(jìn)4亍A追蹤(A-track)測序或類 似測序，其中僅片企測一種核苷酸。其它的測序方法是已知的(參見，例如 標(biāo)題為 "Method of DNA sequencing employing a mixed DNA- polymer chain probe " 的美國專利 5,580,732和標(biāo)題為 "Method for mismatch-directed in vitro DNA sequencing" 的美國專利5,571,676)。
多重反應(yīng)可在第一和第二區(qū)域中的一個或多個中進(jìn)行。在示例性實(shí) 施方案中，100重(100-plex)反應(yīng)可在第一區(qū)域中進(jìn)行，例如由此使得100 種不同的靶核酸序列^f皮擴(kuò)增。然后，所述100重產(chǎn)物可被輸送至數(shù)個第 二區(qū)域，例如輸送至25個反應(yīng)區(qū)域。所述輸送可包括形成/人第一區(qū)域 到每個第二區(qū)域的流體連通，例如使用數(shù)個通道和第一分流器和/或打開 閥。在該25個第二區(qū)域中，可進(jìn)行其它的多重反應(yīng)。例如在該25個第 二區(qū)域每一個中進(jìn)行不同的4重反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，可在第一區(qū) 域中進(jìn)行20重反應(yīng)，然后在五個獨(dú)立的第二區(qū)域中進(jìn)4亍五個不同的4
重反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，最初的cDNA樣品被分進(jìn)24個不同的第 一區(qū)域。在該24區(qū)i或的每一個中，可進(jìn)4亍不同的獨(dú)立1280重反應(yīng)。然 后，每個第 一 區(qū)域中的擴(kuò)增產(chǎn)物可被轉(zhuǎn)移進(jìn)256個獨(dú)立的第二反應(yīng)區(qū)域 中，其中可發(fā)生不同的獨(dú)立5重擴(kuò)增和/或檢測。根據(jù)一些實(shí)施方案，可進(jìn)行多重反應(yīng)，用于檢測單核苷酸多 態(tài)性(SNP's)。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)產(chǎn)物可被連接到分子比例 (molecular rate )修飾劑，然后在毛細(xì)管電泳分析儀上解析或4企測。根 據(jù)一些實(shí)施方案，單核苷酸多態(tài)性可在第二區(qū)域中被檢測。在一些實(shí)施 方案中，SNP-plex反應(yīng)可在第一和/或第二區(qū)域中進(jìn)行。寡核苷酸連接反應(yīng)在纟皮稱為核苷酸連接的另 一核酸反應(yīng)方 案中，將兩種設(shè)計來能夠與靶核酸的單鏈的鄰近序列雜交的寡核苷酸與 樣品核酸混合。如果在樣品核酸中存在精確的互補(bǔ)序列，則該寡核苷酸 將雜交，使得它們的末端鄰接并產(chǎn)生連接底物。于是，樣品中的核酸可 采用寡核苷酸連接測定法(OLA)才企測，如Landegren et al., Science 241:1077-1080 (1988)中所描述的。Nickerson等人描述了一種核酸4全測 法，其合并了 PCR和OLA的特點(diǎn)[Nickerson et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8923-89271。在該方法中，PCR被用于實(shí)現(xiàn)靶DNA的指 數(shù)擴(kuò)增，然后采用OLA對其進(jìn)行檢測。在另一實(shí)施方案中，可先使用 OLA,然后是PCR,例如高度多重PCR。通過引用將上述參考文獻(xiàn)都并 入本文?；谠揙LA方法的若干種技術(shù)已被開發(fā)出來，其可用于檢測 基因多態(tài)區(qū)的特異等位基因變體。例如，美國專利5,593,826公開了一 種OLA,其采用具有3'-氨基基團(tuán)的寡核苷酸和5'-磷酸寡核苷酸形成具 有石壽酰胺酯鍵的偶聯(lián)物?？墒褂玫钠渌?支術(shù)包括OLA-PCR纟支術(shù)和 PCR-OLA技術(shù)。在其它方案中，基于連接酶鏈反應(yīng)(LCR)， 4吏耙核酸與一套連 接引物(hgation educts)和熱穩(wěn)定DNA連接酶雜交，使得連接酶引物成為 彼此共價連接，形成連接產(chǎn)物?？捎糜诤怂岱磻?yīng)中的試劑由涉及核酸 的反應(yīng)的類型顯而易見的是，多重試劑可用在這類反應(yīng)中。反應(yīng)物包括 酶(例如，聚合酶、內(nèi)切酶、外切酶、核酸酶S1、連接酶)、引物、寡核 普酸、脫氧核苷三A壽酸(dNTPs)和二脫氧核苷三磷酸(ddNTPs)。在其它實(shí)施方案中，核酸序列可一皮連接至蛋白、抗體和抗原。
這些方法在文獻(xiàn)中一皮稱為免疫PCR (Sano et al, Science 258, 120-122 (1992)， Sims et al., Anal. Biochem 281, 230-232 (2000))和鄰近連接測定 法(Fredriksson et al., Nature Biotechnology 20, 473-477 (2002))。它們比常 規(guī)用于蛋白測定的ELISA方法更靈敏。與本文描述的裝置和方法聯(lián)合使 用這些方法擴(kuò)展了蛋白檢測的有效性并有助于多重蛋白檢測。引物引物指能夠在鄰近目的區(qū)域(如多態(tài)區(qū))位置處與核酸序 列(經(jīng)常稱為^t板)特異雜交的核酸。引物可通過酶(如聚合酶)的作用在一 過程中被延伸，其中互補(bǔ)于鄰近引物的模板的核苷酸或其類似物被添加 至生長的核苷酸鏈。例如，如果使用RNA模板，則可通過逆轉(zhuǎn)錄酶的 作用延伸寡聚脫氧核苷酸引物，以生成互補(bǔ)于RNA模板的cDNA。如果 使用DNA沖莫板，則可通過DNA聚合酶的作用延伸。引物可單獨(dú)使用，例如在設(shè)計為提供關(guān)于草巴核酸的鑒定和/或 存在方面信息的引物延伸反應(yīng)中，或者引物可與至少一種其它引物或探 針一起使用，例如在擴(kuò)增反應(yīng)中。為了擴(kuò)增至少一部分核酸，優(yōu)選使用 正向引物(即，5'引物)和反向引物(即，3'引物)。正向和反向引物雜交至 雙鏈核酸的互補(bǔ)鏈，使得在從每一引物延伸時，擴(kuò)增雙鏈核酸。在不改變其作用本質(zhì)情況下，可以通過末端添加核苷酸來4多 飾本文描述的引物(RNA、 DNA(單鏈或雙鏈)、PNA及其類似物)，所述 核苷酸被設(shè)計用來例如并入限制性位點(diǎn)或其它有用序列?？刹鹏迵?jù)現(xiàn)有技術(shù)中熟知的以及例如在Sambrook, J. and Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y中描述的方 法來制備引物。例如，可使用限制酶制備和克隆DNA的不連續(xù)片斷。 或者，可采用具有合適序列的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備引物，或者 引物可一皮合成。引物，尤其是在檢測等位基因變體方法中進(jìn)行的反應(yīng)所使用 的引物，具有足夠的長度，以與等位基因多態(tài)位點(diǎn)部分特異雜交。通常， 這種長度取決于源生物體基因組的復(fù)雜性。對于人類而言，這種長度至 少為14-16核苦酸，通?？梢詾?0, 30, 50, 100個或更多核苷酸。核普/核普酸很多涉及核酸的反應(yīng)包括作為建筑塊(building blocks)的脫氧核普三磷酸(dNTPS)和二脫氧三磷酸(ddNTPs),它們可例
如^L用在延伸、擴(kuò)增和測序反應(yīng)中來延伸引物。在某些實(shí)施方案中，可
能希望使用經(jīng)修飾的dNTPS來促進(jìn)反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定和/或檢測，或者區(qū)
分不同反應(yīng)的產(chǎn)物。例如，不同反應(yīng)的核酸產(chǎn)物之間分子量差異可通過 其自身核酸序列(組成或長度)或通過向產(chǎn)物引入質(zhì)量修飾官能團(tuán)而實(shí) 現(xiàn)。例如，可在核酸擴(kuò)增過程其間引入質(zhì)量修飾。寡核苷酸類型寡核苷酸的序列、長度和組成將隨待捕獲的 核酸的性質(zhì)而變化。寡核苷酸可特異于每一測定產(chǎn)物或者可互補(bǔ)于兩個 或多個多態(tài)位點(diǎn)等位基因變體的共同區(qū)域。例如，在引物延伸反應(yīng)測定 中，表面固定的互補(bǔ)寡核苷酸可與源自兩多態(tài)位點(diǎn)等位基因的延伸產(chǎn)物 雜交。這是因為不與多態(tài)區(qū)形成雜交。寡核苷酸與多態(tài)區(qū)的5'延伸產(chǎn)物 雜交。但是每個寡核苷酸只與單個多態(tài)區(qū)的等位基因雜交。根據(jù)多種不同的實(shí)施方案，可將通用寡核苷酸("zip code" 寡核苷酸)固定在基底上。zip code寡核苷酸可為任何長度，典型地為6 至25核苷酸長度。所捕獲的測定產(chǎn)物具有zip code互補(bǔ)序列，使得其能 與表面結(jié)合的寡核普酸雜交。根據(jù)不同實(shí)施方案，zip code可用在非固定化技術(shù)中。例如 zip code可用作用于第二擴(kuò)增反應(yīng)的引物。根據(jù)不同實(shí)施方案，可進(jìn)行 的采用通用PCR和/或zip code的各種方法可包括例如Andersen等人的 美國專利申請11/090,830和Lao等人的美國專利申請11/090,468(都于 2005年3月24日提交)、Marmaro等人的美國專利6,6O5,451以及 Andersen等人的
發(fā)明者., K·福爾斯蒂赫, M·奧爾當(dāng) 申請人:阿普爾拉公司