專利名稱：：用于穿越血腦屏障并進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)劑及其使用方法用于穿越血腦屏障并進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)劑及其使用方法相關(guān)的申請本申請根據(jù)35U.S.C.SS119和120要求2006年7月6日提交的名為"用于穿越血腦屏障并進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)試劑及其使用方法"的美國臨時(shí)專利申請NO.60/818,510、2005年7月19日提交的美國臨時(shí)專利申請No.60/700,297、2005年10月6日提交的美國專利申請No.11/244,105的優(yōu)先權(quán)。這些申請的完整內(nèi)容通過引用完全合并在此。政府利益的聲明本申請的主題得到來自國家衛(wèi)生研究所(NIH)，Bethesda，Maryland,U.S.A.的支持(撥款編號ES04050-18)。在本發(fā)明中政府可擁有某些權(quán)力。背景用于腦部的新藥的開發(fā)比用于身體其他部分的藥物進(jìn)展要慢得多。這種緩慢的進(jìn)展大部分是由于大多數(shù)藥物不能穿越形成血腦屏障(BBB)的腦毛細(xì)血管壁進(jìn)入腦部。大約100%的大分子藥物和大于98%的小分子藥物不能穿越BBB。僅僅一小類藥物、具有高度脂溶解性以及分子量小于400-500道爾頓的小分子實(shí)際地穿越BBB。在穿越BBB的小分子中，僅有很小的百分比以藥學(xué)上有意義的量穿越BBB。(Pardridge,MolecularInnovations3:90-103(2003))僅有少數(shù)腦部的疾病響應(yīng)可以穿越BBB的小分子藥物，例如抑郁癥、情感障礙、慢性疼痛和癲癇癥。遠(yuǎn)遠(yuǎn)更多的腦部疾病不響應(yīng)常規(guī)的脂可溶小分子量藥物，例如阿爾茨海默病、中風(fēng)/神經(jīng)保護(hù)、腦和脊髓損傷、腦癌、腦部的HIV感染、各種產(chǎn)生共濟(jì)失調(diào)的失調(diào)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、亨廷頓病、影響腦部的兒童先天遺傳性錯(cuò)誤、帕金森氏病和多發(fā)性硬化。即使可獲得有效的小分子藥物的少數(shù)腦部疾病也需要進(jìn)一步的研究和新的、改進(jìn)的藥物的開發(fā)。同上。特別難以治療的是腦部的癌癥。腦中癌癥的常見形式是多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)和間變性星形細(xì)胞瘤(AA)?；加蠫BM的患者的平均存活是大約10到12個(gè)月，而患有AA的患者的平均存活是3到4年。對于患有GBM的患者，手術(shù)將延長他們的生命僅數(shù)月。(Kufe"fl/.,OmcerMeAc/"e,§§23and83，(6thed.BCDecker,2003))通過手術(shù)和局部放射治療GBM的大多數(shù)情況產(chǎn)生原始腫瘤邊緣的2到4cm內(nèi)的復(fù)發(fā)。同上。施用不能穿越BBB的藥物進(jìn)入腦部的當(dāng)前方法包括通過顱骨切開術(shù)、在頭部鉆孔的方法以及通過側(cè)腦室內(nèi)(ICV)或腦內(nèi)(IC)注射的藥物施用。對于IC施用，藥物存留在針的尖端處沉積的位置上。對于ICV施用，藥物分布僅僅遠(yuǎn)至同側(cè)腦室的室管膜表面，不能顯著地穿透進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)。因此，IVC和IC施用方法到達(dá)低于l。/。的腦體積，僅有少數(shù)的腦部疾病可以通過這種有限的穿透來治療。同上。相比之下，藥物遞送的穿血管途徑可以治療實(shí)際上100%的腦部神經(jīng)元。因?yàn)槊總€(gè)神經(jīng)元通過它自己的血管灌注，穿血管施用的藥物可以在跨越BBB后到達(dá)每個(gè)神經(jīng)元。然而，由于沒有容許藥物穿越BBB的藥物靶向系統(tǒng)，穿血管施用途徑對于絕大多數(shù)藥物候選物是不可用的。盡管大多數(shù)藥物和其他分子不能穿越BBB，已知某些細(xì)菌和真菌/病毒病原體穿越BBB引起感染。(Nassif,W"/.，TrendsMicrobiol.10:227-232(2002))這些細(xì)菌性病原體可以是細(xì)胞外的，例如腦膜炎奈瑟氏球菌(■/Ve&sen'ar、月巿炎鏈球菌(5^e//ococcwspweMmom'ae)禾口大腸桿菌(^^/^n'c/n'aco//)K-l，或細(xì)胞內(nèi)的，例如單核細(xì)胞增多性李氏桿菌(wo"oc,ge"es)或結(jié)核分枝桿菌(聊c。6a"eWww^"c"/ow》)。細(xì)胞內(nèi)病原體主要通過隱藏在感染的白細(xì)胞內(nèi)部侵入腦脊膜，細(xì)胞外病原體通過首先散布在血流中然后直接與腦內(nèi)皮的腔側(cè)相互作用、從而破壞腦部微血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接來進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。(NassifWa/"同上；Drevets&Leenen,MicrobesInfect.2:1609-1618(2000);Kim，Subcell.Biochem.33:47-59(2000))這種相互作用容許病原體侵入腦脊膜引起腦膜炎。利用體外的穿越BBB的單層和雙層模型以及分離不能通過這種模型單層或雙層的細(xì)菌突變體，多種細(xì)菌蛋白已經(jīng)總體上與BBB的侵入和穿越相關(guān)聯(lián)。(Huang&Jong,Cell.Microbiol.3:277-287(2001))例如，Eco//K-l基因例如/6"、仏eS、as/丄力'尸和om/W，或編碼蛋白如IV型菌毛、Ope、Opa的腦膜炎奈瑟氏球菌基因等等，以及病毒蛋白例如HIV表面蛋白gp120，都已經(jīng)被認(rèn)為容許對BBB的有效侵入和穿越以引起感染。對于細(xì)胞外的細(xì)菌性病原體來說，這些蛋白被認(rèn)為容許粘附和隨后的BBB突破用以侵入腦脊膜。(Nassif&a/.,同上；Huang&Jong，同上。)沒有單個(gè)的細(xì)菌表面蛋白被證明促進(jìn)緊密連接的破壞以容許穿越BBB。天青蛋白(azurin)樣基因存在于許多淋球菌和腦膜炎球菌中，例如淋球菌(A^z'^en'ago"o/rteeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌。(Gotschlich&Seiff，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.43:253-255(1987);Kawula,efa/.，Mol.Microbiol.1:179-185(1987))天青蛋白由許多病原菌產(chǎn)生，在這些基因之間存在顯著的序列同源性。(Yamada，efa/.，Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005))稱為"H.S"的蛋白表位在病原性奈瑟氏球菌之中是保守的，通過稱為H.8的單克隆抗體的結(jié)合來檢測。兩種不同的淋球菌基因，/oz和/z;p，編碼與H.8單克隆抗體交叉反應(yīng)的蛋白質(zhì)。(Hayashi&Wu,J.Bioenerg.Biomembr.22:451-471(1990))許多病原體具有天青蛋白樣蛋白，但奈瑟氏球菌屬是獨(dú)特的，具有附著其上的H,8區(qū)域。Laz和Lip是淋球菌外表面蛋白，其含有信號肽脂蛋白共有序列，所述共有序列由細(xì)菌酶信號肽酶II識別，其加工該序列以產(chǎn)生半胱氨酸殘基與脂肪酸和甘油的N-末端?；饔?。(Hayashi&Wu,同8上；Yamada，da/.，Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005)).Lip脂蛋白，約6.3kDa，幾乎完全由基序Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(AAEAP(SEQIDNO:25))的五肽重復(fù)構(gòu)成，而Laz脂蛋白，約17kDa，在N-末端包含一39個(gè)氨基酸的區(qū)域，其含有不完全的AAEAP(SEQIDNO:25)重復(fù)。(Gotschlich&Seiff,同上；Kawula,"a/"同上；Woods"<a/"Mol.Microbiiol.3:43-48(1989)).在Laz中在這39個(gè)氨基酸N-末端區(qū)域之外是與銅綠假單胞菌(尸.fl^"g/"o^)天青蛋白高度同源的127個(gè)氨基酸的區(qū)域。(Cannon,Clin.Microbiol.Rev.2:S1-S4(1989))Laz參與對抗氧化性逆境和銅毒性的防御，并提高體外原代人類宮頸上皮分析中的存活率。(Wu，Infect.Immun.73:8444-8448(2005))第三種淋球菌外膜蛋白Panl也具有AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)基序。(HoehnandClark,InfectionandImmunity,60:4704-4708(1992))Lip的大小在不同的奈瑟氏球菌屬菌株中不同。在菌株FA1090中，Lip長度是71個(gè)氨基酸，具有AAEAP(SEQIDNO:25)的13個(gè)重復(fù)和不是重復(fù)的一部分的六個(gè)氨基酸。在菌株R10中，Lip長度是76個(gè)氨基酸，具有14個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)重復(fù)。(Cannon,同上)純化的Lip肽是強(qiáng)力的炎性調(diào)節(jié)劑，能夠誘導(dǎo)永生的人類子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞釋放趨化因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)和細(xì)胞因子IL-6，和用toll樣受體2轉(zhuǎn)染的人類胚腎293細(xì)胞產(chǎn)生IL-8和活化轉(zhuǎn)錄因子NF-KB。(Fisette，"a/.，J.Biol.Chem.278:46252-46260(2003))鑒于全世界大量的患有嚴(yán)重腦部和脊髓病癥的患者，需要的是可以攜帶親水性分子和大分子穿越BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。優(yōu)選地，這種遞送系統(tǒng)將具有高度的特異性以容許藥物靶向腦部而不產(chǎn)生一般性滲漏的BBB。進(jìn)一步地，成功的遞送系統(tǒng)將一般是良性的，并且容許在患者中重復(fù)使用該系統(tǒng)而沒有不希望的副作用。在某些情況下，成功的遞送系統(tǒng)將同樣地將藥物遞送到腦部的所有區(qū)域。在其它情況下，遞送系統(tǒng)將特異性地將藥物遞送到腦部癌細(xì)胞。9發(fā)明概述本發(fā)明提供了來自奈瑟氏球菌屬外膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其可以促進(jìn)附著的或相連的貨物化合物(cargocompound)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腦部癌細(xì)胞和/或穿越血腦屏障。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)運(yùn)肽和它的貨物化合物的復(fù)合物，以及使用所述復(fù)合物和所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽來診斷和治療腦部癌癥以及診斷和治療其他與腦部相關(guān)的疾病的方法。最后，本發(fā)明提供了包含所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽和/或復(fù)合物、和/或編碼它們的核酸的試劑盒。本發(fā)明的一個(gè)方面是分離的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其是來自奈瑟氏球菌屬的Laz、Lip或Panl的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物，并且其促進(jìn)連接的分子進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞或穿越血腦屏障。Laz的H.8區(qū)域(SEQIDNO:24)可以與這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽具有至少90%的氨基酸同一性。在某些實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽是SEQIDNO:24。在其他實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以被修飾以延長或優(yōu)化所述肽在血流中的半衰期。本發(fā)明的另一個(gè)方面是轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其包含由Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQIDNO:25)的至少4個(gè)不完全或完全重復(fù)組成的區(qū)域，該區(qū)域的每個(gè)總長度具有至少約50。/。的AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)。在某些實(shí)施方式中，所述不完全或完全重復(fù)的區(qū)域至少約90%地相同于包含相同數(shù)量的Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQIDNO:25)重復(fù)的肽。在某些實(shí)施方式中，這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽是合成的。在其他實(shí)施方式中，這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以被修飾以延長或優(yōu)化這些肽在血流中的半衰期。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含連接到轉(zhuǎn)運(yùn)肽的至少一個(gè)貨物化合物的復(fù)合物，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽包含由Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQIDNO:25)的至少4個(gè)不完全或完全重復(fù)組成的區(qū)域，其中這個(gè)區(qū)域不包含低于約50%的所述肽。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含與來自奈瑟氏球菌屬的Laz、Lip或Pan1的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物連接的至少一種貨物化合物的復(fù)合物，所述變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物促進(jìn)連接的分子進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞或穿越血腦屏障。在某些實(shí)施方式中，所述貨物化合物是銅氧還蛋白(cupredoxin)，例如天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素(plastocyanin)、鐵硫菌藍(lán)蛋白(rusticyanin)、4叚天青蛋白(pseudoazurin)、橙纟錄屈撓素(auracyanin)和天青蛋白樣蛋白，特別是來自銅綠假單胞菌的天青蛋白。在其他實(shí)施方式中，所述復(fù)合物被修飾以延長或優(yōu)化所述肽在血流中的半衰期。這種復(fù)合物可以另外包含銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。這種復(fù)合物的貨物化合物可以是蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、核酸、染料、微粒、納粒、毒素和藥物。在某些實(shí)施方式中，所述貨物化合物是蛋白質(zhì)，所述復(fù)合物是融合蛋白。在其他實(shí)施方式中，所述貨物化合物是毒素。所述貨物化合物可以是用于抑郁癥、情感障礙、慢性疼痛、癲癇癥、阿爾茨海默病、中風(fēng)/神經(jīng)保護(hù)、腦和脊髓損傷、腦部癌癥、腦的HIV感染、各種產(chǎn)生共濟(jì)失調(diào)的失調(diào)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、亨廷頓病、影響腦部的兒童先天遺傳性錯(cuò)誤、帕金森氏病和/或多發(fā)性硬化的治療的治療劑。所述貨物化合物可以是可檢測物質(zhì)，例如通過熒光測定、顯微鏡檢査、X射線CT、MRI和/或超聲可檢測的物質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述復(fù)合物處在藥學(xué)上適合的載體中。所述藥學(xué)上適合的載體可以是用于靜脈內(nèi)施用的。在其他實(shí)施方式中，所述藥學(xué)上可接受的載體適合于側(cè)腦室內(nèi)或腦內(nèi)的注射。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種方法，包括使一或多個(gè)細(xì)胞與復(fù)合物接觸，所述復(fù)合物包含與來自奈瑟氏球菌屬的Laz、Lip或Panl的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物連接的至少一種貨物化合物，所述變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物促進(jìn)連接的分子進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞或穿越血腦屏障。所述細(xì)胞可以來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，特別是星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、脊髓腫瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤或髓母細(xì)胞瘤。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療患有癌癥的患者的方法，其中本發(fā)明的復(fù)合物以治療有效量施用給患者。在某些實(shí)施方式中，所述復(fù)合物靜脈內(nèi)地、體表地、皮下地、肌內(nèi)地施用或施用到細(xì)胞或腫瘤中。在其他實(shí)ii施方式中，所述復(fù)合物與另一種癌癥治療共同施用。本發(fā)明的另一個(gè)方面是在患者中使癌癥成像的方法，包括向患者施用具有可檢測的貨物化合物的復(fù)合物，以及檢測在所述患者內(nèi)所述貨物化合物的位置。在某些情況下，所述貨物化合物是x射線造影劑，其通過X射線CT檢測。在其它情況下，所述貨物化合物是磁共振成像造影劑，其通過MRI檢測。在其它情況下，所述貨物化合物是超聲造影劑，其通過超聲成像檢測。本發(fā)明的另一個(gè)方面是診斷癌癥的方法，包括使細(xì)胞與具有可檢測的貨物化合物的本發(fā)明的復(fù)合物接觸并檢測所述貨物化合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種試劑盒，包含試劑與分離的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽是來自奈瑟氏球菌屬的Laz、Lip或Panl的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物，并且其促進(jìn)連接的分子進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞或穿越血腦屏障。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包含試劑，所述試劑包含藥學(xué)上可接受的載體。在其他實(shí)施方式中，所述試劑盒包含用于所述試劑的施用的工具。本發(fā)明的另一個(gè)方面是核酸分子。在某些實(shí)施方式中，所述核酸編碼分離的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其是來自奈瑟氏球菌屬的Laz、Lip或Panl的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物，并且其促進(jìn)連接的分子進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞或穿越血腦屏障。在其他實(shí)施方式中，所述核酸編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽包含由Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQIDNO:25)的至少4個(gè)不完全或完全重復(fù)組成的區(qū)域，其中這個(gè)區(qū)域不包含低于約50%的所述肽。在其他實(shí)施方式中，所述核酸編碼包含融合蛋白的復(fù)合物，所述融合蛋白包含與轉(zhuǎn)運(yùn)肽連接的至少一種蛋白質(zhì)貨物化合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療或診斷患有與腦部相關(guān)的疾病的患者的方法，包括向所述患者共同施用本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和至少一種貨物化合物。在其他實(shí)施方式中，銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽與所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽和/或貨物化合物共同施用。12序列的簡要說明SEQIDNO:l是淋球菌/az基因的基因組DNA編碼序列，Genbank登錄號Y00530。SEQIDNO:2是銅綠假單胞菌天青蛋白基因的基因組DNA編碼序列。SEQIDNO:3是淋球菌toz基因的H.8區(qū)域的基因組DNA編碼序列。SEQIDNO:4是PCR擴(kuò)增淋球菌的Laz編碼基因(/oz)的正向引物。SEQIDNO:5是PCR擴(kuò)增淋球菌的Laz編碼基因(/az)的反向引物。SEQIDNO:6是？01擴(kuò)增？1;(:18-/^的3.1kb片段的正向引物。SEQIDNO:7是？01擴(kuò)增？1;(:18-^的3.1kb片段的反向引物。SEQIDNO:8是PCR擴(kuò)增pUC19-;az的0.4kb片段的正向引物。SEQIDNO:9是PCR擴(kuò)增pUC19oz的0.4kb片段的反向引物。SEQIDNO:10是PCR擴(kuò)增pUC19-;az的3.3kb片段的正向引物。SEQIDNO:11是PCR擴(kuò)增pUC19-poz的3.3kb片段的反向引物。SEQIDNO:12是？《1擴(kuò)增？11(:18-/07的0.131^片段的正向引物。SEQIDNO:13是PCR擴(kuò)增pUC18-te的0.13kb片段的反向引物。SEQIDNO:14是PCR擴(kuò)增來自pGEX-5X-3的GST編碼基因的正向引物。SEQIDNO:15是PCR擴(kuò)增來自pGEX-5X-3的GST編碼基因的反向引物。SEQIDNO:16是？01擴(kuò)增來自？11(:18-^的信號肽和11.8編碼區(qū)的正向引物。SEQIDNO:17是？011擴(kuò)增來自？1;(:18-/02的信號肽和11.8編碼區(qū)的反向引物。SEQIDNO:18是PCR擴(kuò)增來自pUC18-^的H,8編碼區(qū)的正向引物。SEQIDNO:19是？01擴(kuò)增來自？11<:18-/02的11.8編碼區(qū)的反向引物。SEQIDNO:20是？01擴(kuò)增來自？0￡乂-5又-3-118的08丁-118融合區(qū)域200680033370.9說明書第9/57頁的正向引物。SEQIDNO:21是PCR擴(kuò)增來自pGEX-5X-3-H.8的GST-H.8融合區(qū)域的反向引物。SEQIDNO:22是淋球菌菌株F62Laz蛋白的氨基酸序列，Genbank登錄號Y00530。SEQIDNO:23是銅綠假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:24是來自淋球菌F62Laz蛋白的H.8區(qū)域的氨基酸序列。SEQIDNO:25是五肽基序的氨基酸序列。附圖的簡要說明圖l.圖l描繪了來自淋球菌的te(A)和來自銅綠假單胞菌的p"z(B)的示意圖。用于在￡.""中克隆和超表達(dá)的銅綠假單胞菌天青蛋白基因由天青蛋白基因本身(paz)和確定它的周質(zhì)位置的信號肽(psp)序列組成(B)。/^的H.8區(qū)域框內(nèi)克隆到包括奈瑟氏球菌屬信號序列rap的;7az基因的5'-末端(C)(pUC18-H.8-/oz)或;az基因的3'-末端(D)(pUC19-p"z-H.8)。制備構(gòu)建體的詳細(xì)步驟在實(shí)施例l中給出。"a;在te基因中存在的淋球菌的天青蛋白樣序列；"w，奈瑟氏球菌屬信號肽序列。兩種情況中的信號肽序列都被切割以產(chǎn)生成熟的Paz(周質(zhì))蛋白和Laz(表面暴露的)蛋白。(E)，Laz、Paz和融合蛋白的SDS-PAGE。H.8融合蛋白例如Laz、H,8-Paz或Paz-H.8(都大約17kDa)的不規(guī)則遷移先前己經(jīng)在脂質(zhì)化(lapidated)的含H.8蛋白中注意到了(Cannon,Clin.Microbiol.Rev.2:S1國S4(1989);Fisette,"a/"J.Biol.Chem.278:46252-46260(2003))。圖2.圖2描繪了說明H.8-Paz融合蛋白對各種癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性程度的圖表。(A)合成的H.S肽、Paz、Laz和在Paz的羧基末端的H,8融合物(Paz-H.8)和Paz的氨基末端的H,8融合物(H.8-Paz)對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-229細(xì)胞的細(xì)胞毒性。以3種不同濃度(10、20和40pM)的所述蛋白處理細(xì)胞6、12和24h。進(jìn)行MTT分析來測量活細(xì)胞的程度以計(jì)算細(xì)胞毒性(細(xì)胞死亡百分比)。為了計(jì)算細(xì)胞毒性百分比，采用未處理的活細(xì)胞的值作為100%，在Paz、Laz和R8融合蛋白處理的樣品中測量活細(xì)胞的數(shù)量。然后根據(jù)死細(xì)胞的數(shù)量確定細(xì)胞毒性的程度(％)。(B)H.S肽、Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz對人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。所有處理?xiàng)l件與上述的(A)類似。圖3.圖3描繪了各種熒光標(biāo)記的天青蛋白相關(guān)蛋白對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-229和乳腺癌MCF-7細(xì)胞的進(jìn)入。(A)與Alexafluor⑧568結(jié)合的H.8肽、Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz(各20^M)在蓋玻片上與LN-229細(xì)胞在37匸溫育30分鐘，之后采集圖像。(B)由共焦顯微鏡檢查顯現(xiàn)的、如(A)所描述的、與Alexafluoi^568結(jié)合的各種蛋白進(jìn)入MCF-7細(xì)胞的內(nèi)在化。(C)由共焦顯微鏡檢查顯現(xiàn)Laz的內(nèi)在化。不同濃度(2、4、8和18pM)的熒光標(biāo)記的Laz在37。C與LN-229細(xì)胞溫育30分鐘。核用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)標(biāo)記成藍(lán)色。(D)與Alexafluor②568結(jié)合的Laz(10pM)與LN-229細(xì)胞在37'C溫育各種時(shí)間(5、10、20和30分鐘)。通過共焦顯微鏡檢査顯現(xiàn)內(nèi)在化。(E)與Alexafluor⑧568結(jié)合的Paz(10HM)在蓋玻片上在37r與LN-229細(xì)胞溫育各種時(shí)間，之后采集圖像。在(E)中檢測到非常少的可測量熒光。圖4.圖4描繪了柱形圖，其標(biāo)明了圖3A-D中共焦顯微鏡圖像中發(fā)現(xiàn)的熒光的定量。(A)在圖3A中圖像中的熒光定量。使用Adob^Photoshop^進(jìn)行天青蛋白中的熒光的定量。誤差柱代表單個(gè)樣本中三種不同細(xì)胞中熒光的標(biāo)準(zhǔn)偏差。(B)附圖3B中圖像中的熒光定量。如附圖4A中進(jìn)行定量。(C)在圖3C中圖像中的熒光數(shù)量。如圖4A中進(jìn)行定量。(D)在附圖3D中圖像中的熒光定量。如附圖4A中進(jìn)行定量。圖5.使用H,8-GST融合蛋白的組合處理促進(jìn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-229細(xì)胞中Alexafluor⑧568標(biāo)記的Paz的攝取。未標(biāo)記的20pM(A)H.8、(B)GST、(C)GST-H.8、(D)H.8-GST、(E)PBS緩沖液和20pM與Alexafluor568結(jié)合的Paz在37"C與LN-229細(xì)胞溫育30分鐘。通過共焦顯微鏡檢查顯現(xiàn)內(nèi)在化。(F)有或者沒有Paz的合成的H.S肽、GST以及GST-H.8/R8-GST融合衍生物的細(xì)胞毒性。大約5xl(^個(gè)LN-229細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)皿中，用有20nMPaz.(+Paz)或沒有20nMPaz(-Paz)的各20pMH.8肽、GST、GST-H.8、H.8-GST或相同體積的PBS緩沖液處理。圖6.圖6描繪了用與IRdye⑧800CW(LI-CORBiotechnology,Lincoln,Nebraska)結(jié)合的Paz、H.8-Paz和Laz注射的小鼠的腦部圖像。(A)來自活小鼠的腦部圖像。將500^的與11^乂6@800CW結(jié)合的Paz、H,8-Paz和Laz腹膜內(nèi)注射到活的裸鼠中。24h后，處死小鼠，取出腦，檢測熒光并使用LI-COROdyssey②紅外成像系統(tǒng)測量。(B)如(A)中處理的裸鼠腦的中腦外側(cè)(rostralmesencephalon)區(qū)域圖像。水平地切割小鼠腦，采集圖像。圖7.圖8描繪了￡."/沖118-08{融合蛋白的808-八0￡、Westem印跡和定位的共焦顯微鏡圖像。具有克隆的g仏H.8-^或gW-H.8基因的五.co/z'BL21(DE3)細(xì)胞在37。C用0.1mMIPTG培養(yǎng)。細(xì)胞團(tuán)用PBS洗滌兩次，全細(xì)胞裂解液在SDS-PAGE上電泳。Coomassie藍(lán)染色被用于蛋白質(zhì)的檢測。(B).重復(fù)上述操作，但這次單獨(dú)地分離全細(xì)胞裂解液和周質(zhì)間隙的內(nèi)容物，在SDS-PAGE上電泳(20嗎蛋白質(zhì))，通過使用單克隆的抗GST抗體的Western印跡檢測GST或GST-R8融合蛋白來測定蛋白質(zhì)的總濃度和周質(zhì)濃度。(C).攜帶克隆的gW、H.8-gW或gW-H.8基因(表5)的￡.<%>//菌株8121(DE)細(xì)胞在37T:用0.4mMIPTG培養(yǎng)。一毫升每種這些細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行離心，收集產(chǎn)生的細(xì)菌團(tuán)。在用PBS洗滌兩次之后，施加含有抗GST抗體(1:2000)的lmL的P/。FBS-PBS。溫育細(xì)胞懸液lh，然后用PBS洗滌兩次。細(xì)菌細(xì)胞與FITC結(jié)合的抗兔IgG在P/。FBS-PBS中溫育30分鐘。為了除去未結(jié)合的抗體，再次洗滌細(xì)胞，在冰上用乙醇固定。在共焦顯微鏡(xl00物鏡)下觀察用DAPI(給予藍(lán)色著色)處理的Ec^16樣品，對單個(gè)細(xì)胞拍照。(D).攜帶pUC19-;^z(銅綠假單胞菌天青蛋白)、pUC19-/w(奈瑟氏球菌屬)、卩11(:18-118-;^或卩1;(:18-/^-118的五.co/Z細(xì)胞在37。C在存在0.1mMIPTG的情況下培養(yǎng)過夜。離心0.5ml的這種培養(yǎng)物，產(chǎn)生的細(xì)菌團(tuán)用冷卻的PBS洗漆兩次。施力[UmLlc/。FBS-PBS中的抗天青蛋白抗體(1:500)并在冰上孵育lh。用PBS洗滌兩次之后，施加結(jié)合FITC的抗兔抗體，在冰上孵育30分鐘，用PBS洗滌兩次，用冷乙醇固定。通過共焦顯微鏡(xl00物鏡)觀察細(xì)菌樣品。實(shí)施方式的詳細(xì)描述定義如在此使用的，術(shù)語"細(xì)胞"包括該術(shù)語的單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非特別地描述為"單個(gè)細(xì)胞"。如在此使用的，術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"可互換地使用來指代氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于這樣的氨基酸聚合物，在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物。該術(shù)語還適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"還包括修飾，所述修飾包括但不限于糖基化、脂連接(lipidattachment)、硫酸化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥基化和ADP核糖基化。要理解的是，多肽不總是完全是直鏈的。例如，作為泛素化作用的結(jié)果多肽可以是支鏈的；一般作為翻譯后事件的結(jié)果(包括天然的加工事件和由非天然發(fā)生的人類操作導(dǎo)致的事件)，它們可以是環(huán)狀的(有或沒有分支)。環(huán)狀的、支鏈的和分支環(huán)狀的多肽可以通過非翻譯的天然過程、也可以通過完全的合成方法來合成。合成肽是沒有細(xì)胞成分的幫助制成的肽。產(chǎn)生肽的合成方法是本領(lǐng)域公知的，并且是商業(yè)上可獲得的。進(jìn)一步地，本發(fā)明預(yù)期本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基端含甲硫氨酸變體和氨基端甲硫氨酸減少變體的用途。如在此使用的，使用"疾病"包括相對于正常的解剖學(xué)和生理學(xué)的偏17離，其構(gòu)成活體動(dòng)物或其一個(gè)部分的正常狀態(tài)的損傷，其阻斷或改變了身體功能的性能。如在此使用的，術(shù)語"抑制細(xì)胞生長"是指減慢或停止細(xì)胞分裂和/或細(xì)胞增殖。該術(shù)語還包括細(xì)胞發(fā)育的抑制或細(xì)胞死亡的提高。如在此使用的，術(shù)語"患有"包括當(dāng)前展現(xiàn)疾病的癥狀、即使沒有可見癥狀具有病理狀況、處于從疾病的恢復(fù)中、和已從疾病恢復(fù)。如在此使用的，術(shù)語"治療"包括防止、降低、停止或逆轉(zhuǎn)與疾病或要治療的疾病相關(guān)的癥狀的進(jìn)展或嚴(yán)重性。因而，術(shù)語"治療"包括視情況的藥物、治療和/或預(yù)防施用。"治療有效量"是有效防止、降低、停止或逆轉(zhuǎn)受試者要治療的特定疾病的現(xiàn)有癥狀的發(fā)展、或部分或全部減輕所述癥狀的量。治療有效量的確定處在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。如在此使用的，術(shù)語"基本上純的"，當(dāng)用于修飾本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其他細(xì)胞產(chǎn)物時(shí)，是指，例如，從生長培養(yǎng)基或細(xì)胞內(nèi)容物分離的蛋白質(zhì)，處于基本上沒有或不攙雜其他蛋白質(zhì)和/或活性抑制化合物的形式。術(shù)語"基本上純的"是指量為分離的部分干重的至少約75%的因素，或至少"基本上75%純的"。更特別地，術(shù)語"基本上純的"是指活性化合物干重的至少約85%的化合物，或至少"基本上85%純的"。最特別地，術(shù)語"基本上純的"是指活性化合物干重的至少約95%的化合物，或至少"基本上95%純的"。術(shù)語"基本上純的"還可以用于修飾合成地產(chǎn)生的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或化合物，其中，例如，合成的蛋白質(zhì)從合成反應(yīng)的試劑和副產(chǎn)品中分離。如在此使用的，術(shù)語"藥物級"，當(dāng)指本發(fā)明的肽或化合物時(shí)，是一種肽或化合物，其基本上或?qū)嵸|(zhì)上從在它的天然狀態(tài)發(fā)現(xiàn)時(shí)通常伴隨該材料的成分(包括合成試劑和副產(chǎn)品)中分離，以及基本上或?qū)嵸|(zhì)上從將損害它作為藥物的用途的成分中分離。例如，"藥物級"肽可以從任何致癌物中分離。在某些情況下，"藥物級"可以用預(yù)期的施用方法來修飾(例如，"靜脈內(nèi)藥物級")，以指明一種肽或化合物，其基本上或?qū)嵸|(zhì)上從將使該組合物不適合向患者靜脈內(nèi)施用的任何物質(zhì)分離。例如，"靜脈內(nèi)藥物級"肽可以從洗滌劑(例如SDS)和抗菌劑(例如疊氮化物)分離。用語"分離的"、"純化的"或"生物學(xué)純的"是指物質(zhì)基本上或?qū)嵸|(zhì)上沒有通常與天然狀態(tài)下存在的所述物質(zhì)相伴的成分。因而，根據(jù)本發(fā)明的分離的肽優(yōu)選地不含有在所述肽的原位環(huán)境中與所述肽通常相關(guān)的材料。"分離的"區(qū)域是指不包括多肽的完整序列的區(qū)域，所述區(qū)域來自所述多肽。"分離的"核酸、蛋白或其相應(yīng)片段已經(jīng)基本上從它的體內(nèi)環(huán)境移出，從而它可以由技術(shù)人員操作，例如但不限于核酸片段的核苷酸測序、限制性消化、定點(diǎn)誘變、以及亞克隆到表達(dá)載體中，以及以基本上純的量獲得所述蛋白質(zhì)或蛋白片段。在此對于肽使用的術(shù)語"變體"，是指氨基酸序列變體，與野生型多肽相比其具有替換、缺失或插入的氨基酸。變體可以是野生型肽的截短體。"添加"是從野生型蛋白質(zhì)內(nèi)去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而"截短，，是從野生型蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)末端去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因而，變體肽可以通過操作編碼所述多肽的基因來產(chǎn)生。通過改變所述多肽的基本組成或特征，而不是至少某些其基本活性，可以產(chǎn)生變體。例如，奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的"變體"可以是保持了其穿越BBB和/或進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的能力的突變的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽。在某些情況下，變體肽用非天然氨基酸(例如s-(3，5-二硝基苯甲酰基)-賴氨酸殘基)合成。(Ghadiri&Fernholz，J.Am.Chem.Soc，112:9633-9635(19卯))在某些實(shí)施方式中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過20、19、18、17或16個(gè)替換、缺失或插入的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過15、14、13、12或11個(gè)替換、缺失或插入的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過IO、9、8或7個(gè)替換、缺失或插入的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，與野生型肽相比，所述變體具有不19超過6個(gè)替換、缺失或插入的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過5或4個(gè)替換、缺失或插入的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過3、2或1個(gè)替換、缺失或插入的氨基酸。在此使用的術(shù)語"氨基酸"意為包含任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸殘基的氨基酸部分，即，包含通過一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多碳原子、一般一個(gè)(a)碳原子直接連接的至少一個(gè)羧基和至少一個(gè)氨基的任何部分。在此對于肽使用的術(shù)語"衍生物"是指來源于目標(biāo)肽的肽。衍生包括肽的化學(xué)修飾，從而所述肽將仍然保持某些它的一些基本活性。例如，奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的"衍生物"可以是保持了其穿越BBB和域進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的能力的化學(xué)上修飾的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽。感興趣的化學(xué)修飾包括，但不限于，肽的酰胺化、乙?；⒘蛩峄?、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化或糖基化。此外，衍生的肽可以是多肽或其片段與化合物的融合物，所述化合物例如但不限于，另一種肽、藥物分子或其他治療劑或藥劑或可檢測的探針。術(shù)語"氨基酸序列同一性百分比(％)"被定義為當(dāng)比對兩個(gè)序列時(shí)在多肽中與候選序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為了確定氨基酸同一性％，比對序列，如果有必要，引入缺口來實(shí)現(xiàn)最大的序列同一性％;保守性替換不被認(rèn)為是序列同一性的部分。確定同一性百分比的氨基酸序列比對方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件被用于比對肽序列。在特定的實(shí)施方式中，使用長復(fù)雜性過濾器、預(yù)期IO、字大小3、存在性ll和延伸l的缺省參數(shù)來使用Blastp(可從國家生物技術(shù)信息中心，BethesdaMD獲得)。當(dāng)比對氨基酸序列時(shí)，給定氨基酸序列A與、和、或相對給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性M(或者其可以稱為給定氨基酸序列A具有或包含與、和、或相對給定氨基酸序列B的一定氨基酸序列同一性M)可以計(jì)算為氨基酸序列同一性％=X/Y*100其中X是通過序列比對程序或算法對A和B的比對，作為同一的匹配評分的氨基酸殘基的數(shù)量，Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。如果氨基酸序列A的長度不同于氨基酸序列B的長度，A對B的氨基酸序列同一性。/。不會(huì)等于B對A的氨基酸序列同一性。/。。當(dāng)將較長的序列與較短的序列比較時(shí)，較短的序列將是"B"序列。例如，當(dāng)將截短的肽與相應(yīng)的野生型多肽比較時(shí)，截短的肽將是"B"序列。概述本發(fā)明涉及用于遞送貨物化合物穿越血腦屏障(BBB)和/或進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的方法和物質(zhì)，以及用于治療哺乳動(dòng)物腦部癌癥以及腦部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他疾病的物質(zhì)和方法。如在此公開的，現(xiàn)在已知的是由基序AAEAP(SEQIDNO:25)的重復(fù)組成的肽區(qū)域?qū)⑷菰S相連的或融合的肽和其他貨物化合物被轉(zhuǎn)運(yùn)穿越血腦屏障和/或進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞。更具體地，淋球菌蛋白Laz的H.S區(qū)域可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)相連的或融合的蛋白質(zhì)和其他貨物化合物穿越BBB和域進(jìn)入腦部癌細(xì)胞。此外，預(yù)期的是在AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)的使用中類似于H.8區(qū)域的肽可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)和其他貨物化合物穿越BBB和域進(jìn)入腦部癌細(xì)胞，所述肽例如Lip蛋白的部分或全部以及Panl蛋白的部分或全部，兩種都來自淋球菌。由本發(fā)明遞送的貨物化合物包括但不限于，蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、核酸(包括反義核酸)、染料、熒光標(biāo)簽和放射性標(biāo)簽、微粒或納粒、毒素、無機(jī)和有機(jī)分子、小分子、和藥物。在某些實(shí)施方式中，所述藥物和/或毒素殺死腫瘤細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，所述貨物化合物治療腦部的各種疾病。已知的是許多銅氧還蛋白蛋白，例如銅綠假單胞菌天青蛋白，具有特異性地進(jìn)入并殺死許多類型的哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞的能力。(YamadaWCell.Biol.7:1418隱1431(2005);Himoka"a/,PNAS101:6427-6432(2004);Hiraoka"a/.，Biochem.Biophys.Res.Comm.338:1284-1290(2005))還已知的是銅綠假單胞菌天青蛋白對于腦部癌細(xì)胞例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。參見實(shí)施例2。令人震驚地，現(xiàn)在已知的是，來自淋球菌和其他奈瑟氏球菌的Laz蛋白、天青蛋白樣蛋白能夠特異性地進(jìn)入并殺死腦部癌細(xì)胞例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞以及其他腫瘤。參見實(shí)施例2和7。此外，現(xiàn)在已知的是Laz蛋白的H.8結(jié)構(gòu)域當(dāng)融合到銅綠假單胞菌天青蛋白的N-末端或C-末端時(shí)可以賦予它進(jìn)入和殺死成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的能力。參見實(shí)施例2和3。還令人震驚地，現(xiàn)在已知的是，！^.8區(qū)域不必要物理上附著于共同施用的蛋白質(zhì)(例如天青蛋白)來賦予該蛋白進(jìn)入成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的能力。參見實(shí)施例5。與單獨(dú)的天青蛋白相比，H.S和融合到GST的N-末端的11.8都提高了物理上不附著的天青蛋白進(jìn)入成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的能力，然而融合到08丁的0末端的11.8是無效的。進(jìn)一步地，H,8和融合到GST的N-末端的H.8當(dāng)與天青蛋白共同施用時(shí)都增強(qiáng)了天青蛋白對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。參見實(shí)施例5。令人震驚地，現(xiàn)在已知Laz的R8結(jié)構(gòu)域賦予了它融合的蛋白質(zhì)穿越活小鼠的血腦屏障并定位到腦部的能力。參見實(shí)施例6。最后，現(xiàn)在己知H.8區(qū)域負(fù)責(zé)E②/沖融合蛋白的表面呈現(xiàn)。參見實(shí)施例7。雖然GST和具有融合到C-末端的H.8的GST都在表達(dá)它們的E.o^的周質(zhì)間隙中積累，具有融合到1^末端的1"1.8的08丁被轉(zhuǎn)運(yùn)到￡.^//細(xì)胞的表面。雖然不意圖將本發(fā)明限制于任何作用機(jī)制，H,8區(qū)域引起融合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞表面的能力可能與H,8區(qū)域容許融合蛋白穿越BBB的能力相關(guān)。由于腦膜炎球菌(例如腦膜炎奈瑟氏球菌)穿越BBB侵入腦膜22(Nassif，efa/，同上；Huang&Jong，同上.)，可能的是這種細(xì)菌使用表面暴露的細(xì)胞成分來破壞BBB。腦膜炎奈瑟氏球菌的IV型菌毛與腦微絨毛樣膜凸起的形成相關(guān)，己知這種菌毛的回縮在奈瑟氏球菌屬和人類細(xì)胞之間的相互作用中起到核心作用。(PujolWa/.,PNAS96:4017-4022(1999);Merz"a/.,Nature407:98-102(2002))然而，已知IV型菌毛在與其他細(xì)胞的菌毛介導(dǎo)的接觸形成時(shí)回縮，認(rèn)為腦膜炎奈瑟氏球菌的其他未知的表面成分負(fù)責(zé)穿越BBB。(Nassif^fl/.,同上)因而可能的是表面呈現(xiàn)的H.8區(qū)域直接涉及容許奈瑟氏球菌屬穿越BBB并且與人類腦部癌細(xì)胞相互作用。LazR8區(qū)域是Laz的N-末端的39個(gè)氨基酸區(qū)域，其含有不完全的AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)。預(yù)期的是該AAEAP(SEQIDNO:25)重復(fù)單元可以用于設(shè)計(jì)將轉(zhuǎn)運(yùn)貨物穿越BBB和/或進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的肽。進(jìn)一步地，預(yù)期的是來自淋球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌的具有AAEAP(SEQIDNO:25)重復(fù)的其他外膜蛋白的氨基酸序列可以用于設(shè)計(jì)將轉(zhuǎn)運(yùn)貨物穿越BBB和域進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的肽。其他感興趣的奈瑟氏球菌屬外膜蛋白包括但不限于Lip和Pan1。(TreesWa/.,J.Clin.Microbiol.38:2914-2916(2000);HoehnandClark，InfectionandImmunity60:4704-4708(1992))本發(fā)明涉及用于遞送貨物化合物穿越血腦屏障進(jìn)入腦部和/或進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的方法和材料。根據(jù)本發(fā)明的貨物化合物的遞送伴隨著使用適合的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述貨物化合物與本發(fā)明的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽連接。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述貨物化合物與本發(fā)明的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽共同施用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述貨物化合物與銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和本發(fā)明的奈瑟氏球菌屬或AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，貨物化合物被遞送以抑制癌細(xì)胞(例如腦部癌細(xì)胞)中的細(xì)胞生長。這種癌細(xì)胞可以來自，例如，星形細(xì)胞瘤、成膠23質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、脊髓腫瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤。例如，所述貨物化合物可以是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，例如p53;細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物，例如pl6、p21或p27;自殺蛋白，例如胸苷激酶或硝基還原酶；細(xì)胞因子或其他免疫調(diào)節(jié)蛋白，例如白介素l、白介素2或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);或毒素，例如銅綠假單胞菌外毒素A，等等。在某些實(shí)施方式中，上述化合物種類之一的生物學(xué)活性片段被遞送。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述貨物化合物被遞送以產(chǎn)生目標(biāo)組織的圖像。例如，所述目標(biāo)組織可以是癌，所述貨物化合物可以是一種通常用于產(chǎn)生通過X射線計(jì)算機(jī)斷層(CT)、磁共振成像(MRI)和超聲檢測的圖像的化合物。在這些實(shí)施方式中，所述貨物化合物可以是Y射線或正電子發(fā)射放射性同位素、磁共振成像造影劑、X射線造影劑和/或超聲造影劑。在其他實(shí)施方式中，所述貨物化合物可以被遞送以治療與腦相關(guān)的疾病。奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽和AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其容許將連接的或聯(lián)合的貨物轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞中而不是非癌細(xì)胞中、和/或轉(zhuǎn)運(yùn)所述貨物穿越BBB。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是，奈瑟氏球菌屬外膜蛋白，例如Laz，包含蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域H.8結(jié)構(gòu)域，其促進(jìn)連接的貨物進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞和/或穿越BBB的進(jìn)入。本發(fā)明提供了來自奈瑟氏球菌屬外膜蛋白的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)的天然或合成的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，其可以用于將連接的或聯(lián)合的貨物轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞中和/或穿越BBB。術(shù)語"奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽"是指奈瑟氏球菌屬外膜蛋白的全部或片段，其包括貨物進(jìn)入腦部癌細(xì)胞和/或穿越BBB所需的氨基序列。適合的奈瑟氏球菌屬外膜蛋白包括但不限于來自淋球菌的Laz、Lip或Pan1。特別感興趣的是來自腦膜炎奈瑟氏球菌和淋球菌的Laz。確定包含貨物進(jìn)入腦部癌細(xì)胞和/或穿越BBB所需的氨基序列的外膜蛋白可以通過鑒定進(jìn)入腦部癌細(xì)胞或穿越BBB所需的那些肽的任何方法進(jìn)行。在一種這樣的方法中，奈瑟氏球菌屬外膜蛋白的全部或片段被連接到標(biāo)記物質(zhì)，進(jìn)行測試來確定奈瑟氏球菌屬外膜蛋白的全部或片段是否進(jìn)入腦部癌細(xì)胞和/或穿越BBB?？梢杂糜阼b定適合的奈瑟氏球菌屬外膜蛋白或其片段的方法在實(shí)施例4和7中找到?？梢杂糜诒景l(fā)明的適合的奈瑟氏球菌屬外膜蛋白包括奈瑟氏球菌的外膜蛋白，其被H.8抗體識別，和/或由AAEAP(SEQIDNO:25)基序的幾個(gè)完全或不完全重復(fù)組成。在某些實(shí)施方式中，奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽被1"1.8抗體識別。用于確定蛋白質(zhì)或肽是否被11.8抗體識別的方法和參數(shù)在Cannon"a/.,InfectionandImmunity43:994-999(1984)中描述。本發(fā)明還提供AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其是由AAEAP(SEQIDNO:25)基序的多個(gè)完全或不完全重復(fù)組成的肽，其可以轉(zhuǎn)運(yùn)連接的或聯(lián)合的貨物化合物進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞和域穿越BBB。如在此使用的"不完全"重復(fù)被定義為一種AAEAP(SEQIDNO:25)五肽的重復(fù)，其中所述五個(gè)氨基酸中的至少一個(gè)不是AAEAP(SEQIDNO:25)基序的部分。在其他實(shí)施方式中，所述不完全重復(fù)可以具有不超過l、2、3或4個(gè)不是AAEAP(SEQIDNO:25)五肽的部分的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，所述奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽是Laz蛋白的l-39位氨基酸(SEQIDNO:24)。在某些實(shí)施方式中，所述奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽是長度至少約20個(gè)氨基酸、長度至少約40個(gè)氨基酸、長度至少約60個(gè)氨基酸、或長度至少約80個(gè)氨基酸。在其他實(shí)施方式中，所述奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽長度不超過約40個(gè)氨基酸、長度不超過約100個(gè)氨基酸、長度不超過約200個(gè)氨基酸、或長度不超過約400個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方式中，所述奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽與奈瑟氏球菌屬外膜蛋白(例如SEQIDNO:22)具有至少約90%的氨基酸序列同一性、至少約95%的氨基酸序列同一性或至少約99%的氨基酸序25列同一性。術(shù)語"AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽"是指包含完全和/或不完全AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)的區(qū)域的肽。AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法合成，或可以通過基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)來增殖。在某些實(shí)施方式中，所述AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽由至少2個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、至少4個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、至少6個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、至少8個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、至少10個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、至少15個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)或至少20個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)組成。在某些實(shí)施方式中，所述AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽由不超過10個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、不超過20個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、不超過30個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、或不超過40個(gè)AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)組成。在某些實(shí)施方式中，所述AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽僅由完全AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、僅由不完全AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、或由完全和不完全AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)的混合物組成。在某些實(shí)施方式中，所述AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽僅由AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)組成。在其他實(shí)施方式中，所述AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽由每個(gè)總長度至少約95。/o的AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、每個(gè)總長度至少約90。/。的AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、每個(gè)總長度至少約80。/。的AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)、每個(gè)總長度至少約50。/。的AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)組成。在某些實(shí)施方式中，重復(fù)的區(qū)域與包含相同數(shù)量的Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQIDNO:25)重復(fù)的肽具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、或至少約95%的同一性。在某些實(shí)施方式中，所述奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽和/或AAEAP(SEQID26NO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以用于促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)連接的貨物選擇性地進(jìn)入腦部癌細(xì)胞和/或穿越BBB。在其他實(shí)施方式中，所述奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽和/或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)共同施用的貨物進(jìn)入腦部癌細(xì)胞和^^穿越BBB。奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域或AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的修飾在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽被化學(xué)地修飾或遺傳地改變來產(chǎn)生保持了轉(zhuǎn)運(yùn)貨物化合物進(jìn)入腦部癌細(xì)胞或穿越BBB的能力的變體和衍生物。奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的變體可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。衍生物是直接地或通過修飾或部分替換從天然氨基酸形成的氨基酸序列。變體可以是類似物，其是具有與天然化合物類似但不相同的結(jié)構(gòu)、某些組分或側(cè)鏈與天然化合物不同的氨基酸序列。類似物可以合成或來自不同的進(jìn)化來源。如果衍生物或類似物含有修飾的氨基酸，變體可以是全長的或不是全長的。本發(fā)明提供了奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的氨基酸序列變體，與野生型多肽相比，其具有替換、缺失或插入的氨基酸。本發(fā)明的變體可以是奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的截短體。如在此使用的，多肽的"截短體"是從多肽序列的至少一個(gè)末端除去至少一個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生的肽。在某些實(shí)施方式中，截短的肽產(chǎn)自從多肽序列的一端或兩端除去至少一個(gè)氨基酸殘基、至少五個(gè)氨基酸殘基、至少10個(gè)氨基酸殘基、至少50個(gè)氨基酸殘基、至少IOO個(gè)氨基酸殘基、至少120個(gè)氨基酸殘基或至少150個(gè)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，所述組合物包含肽，所述肽由奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的區(qū)域組成，所述區(qū)域少于全長奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽。在某些實(shí)施方式中，所述組合物包含肽，所述肽由截短的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的超過約10個(gè)殘基、超過約15個(gè)殘基或超過約20個(gè)殘基組成。在某些實(shí)施方式中，所述組合物包含肽，所述肽由截短的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的不超過約1OO個(gè)殘基、不超過約70個(gè)殘基、不超過約50個(gè)殘基，不超過約40個(gè)殘基或不超過約30個(gè)殘基組成。奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的變體包括但不限于，包含區(qū)域的分子，所述區(qū)域在相同大小的氨基酸序列上或當(dāng)與比對的序列比較時(shí)，以至少約65%、70%、75%、85%、卯％、95%、98%或99%的同一性基本上與奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQIDNO:24)或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽同源，其中所述比對通過同源性算法來進(jìn)行。術(shù)語在奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽與候選序列之間的"氨基酸序列同一性百分比(％)"被定義為當(dāng)比對兩個(gè)序列時(shí)在奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽中與候選序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。所述變體還包括用非天然存在的合成氨基酸制成的肽。例如，非天然存在的氨基酸可以整合到變體肽中來延長或優(yōu)化組合物在血流中的半衰期。這種變體包括但不限于，D，L-肽(非對映異構(gòu)體)(Futaki&a/.,J.Biol.Chem.276(8):5836-40(2001);Papo"a/.,CancerRes.64(16):5779-86(2004);MillerWa/.，Biochem.Pharmacol.36(1):169-76,(1987));含有稀有氨基酸的肽(Lee"a/"J.Pept.Res.63(2):69-84(2004));以及接有烴類環(huán)鉤(hydrocarbonstapling)的含烯烴的非天然氨基酸(Schafmeisterefa/.，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenski自/"Science305:1466-1470(2004))，以及包含s-(3,5畫二硝基苯甲酰萄-賴氨酸殘基的肽。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽是奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的衍生物。所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽的衍生物是所述肽的化學(xué)修飾體，從而所述肽仍然保持某些其基本活性。例如，轉(zhuǎn)運(yùn)肽的"衍生物"可以是保持了其穿越BBB和/或進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的能力的化學(xué)上修飾的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。產(chǎn)生改變的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽活性的衍生作為本發(fā)明的部分是預(yù)期的，只要這樣的活性喪失不是明顯的。如在此28使用的，"明顯的喪失"是與未改變的肽相比超過約50%的活性。感興趣的化學(xué)修飾包括，但不限于，肽的酰胺化、乙?；?、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化和糖基化。此外，衍生的肽可以是轉(zhuǎn)運(yùn)肽、或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物與化合物的融合物，所述化合物例如但不限于，另一種肽、藥物分子或其他治療劑或藥劑或可檢測的探針。感興趣的衍生物包括化學(xué)修飾體，由此本發(fā)明的肽和組合物在血流中的半衰期可以例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾種方法被延長或優(yōu)化，所述化學(xué)修飾體包括但不限于，環(huán)化的肽(Monk"a/.,BioDrugs19(4):261-78，(2005);DeFreestWa/.,J.Pept.Res.63(5):409-19(2004))、N-和C陽末端修飾體(Labrie"a/.,Clin.Invest.Med.13(5):275-8，(1990)).、以及接有烴類環(huán)鉤的含烯烴的非天然氨基酸(SchafineisterWJ.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);WalenskiWa/"Science305:1466-1470(2004))、以及包含s-(3，5-二硝基苯甲?；?-賴氨酸殘基的肽。預(yù)期的是本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的變體、衍生物和/或結(jié)構(gòu)等效物。例如，所述肽可以是已經(jīng)被PEG化的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的截短體，因而使得它同時(shí)是變體和衍生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用接有通過釕催化的烯烴置換的全烴類"環(huán)鉤(staple)"的含攜帶烯烴的鏈(tether)的a,a-二取代的非天然氨基酸來合成本發(fā)明的肽。(ScharmeisterWa/.，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenskye^/.，Science305:1466-1470(2004)).此外，作為奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的結(jié)構(gòu)等效物的肽可以與其他肽融合，因而產(chǎn)生既是結(jié)構(gòu)等效物又是衍生物的肽。這些實(shí)例僅僅是說明性的而不是限制本發(fā)明。改變可以被引入奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽中，其引起奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的氨基酸序列中的改變，其不使奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽喪失轉(zhuǎn)運(yùn)貨物化合物進(jìn)入腦部癌細(xì)胞和/或穿越BBB的能力。"非必需"氨基酸殘基是可以在奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列中改變而不使它喪失轉(zhuǎn)運(yùn)貨物化合物進(jìn)入細(xì)胞和/或穿越BBB的能力，而"必需"氨基酸殘基是這種活性所需的?？梢赃M(jìn)行的"保守性"替換的氨基酸是本領(lǐng)域公知的。有用的保守性替換在表l，"優(yōu)選的替換"中示出。其中一種類型的氨基酸被相同類型的另一個(gè)氨基酸替代的保守性替換落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要所述替換不使所述奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽的活性喪失。產(chǎn)生改變的奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽活性的這種改變作為本發(fā)明的部分是預(yù)期的，只要活性的喪失不是明顯的。如在此使用的，"明顯的喪失"是與未改變的肽相比超過約50%的活性。表l優(yōu)選的替換<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>Phe(F)Leu、Val、He、Ala、TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr、PheTyrTyr(Y)Trp、Phe、Thr、SerPheVal(V)Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸Leu影響(1)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如P-片層或a-螺旋構(gòu)象、(2)電荷、(3)疏水性、或(4)目標(biāo)位點(diǎn)的側(cè)鏈的主體(bulk)的"非保守性"替換可以改變奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽功能。如表2所示，基于常見的側(cè)鏈性質(zhì)將殘基分組。非保守性替換需要將這些類別中的一類的成員換為另一類。其中一種類型的氨基酸被不同類型的另一個(gè)氨基酸替代的非保守性替換落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要所述替換不使所述奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的活性喪失。產(chǎn)生改變的奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽活性的這種改變作為本發(fā)明的部分是預(yù)期的，只要活性的喪失不是明顯的。表2.氨基酸類別類別氨基酸疏水的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie中性親水的Cys、Ser、Thr酸性的Asp、Glu堿性的Asn、Gln、His、Lys、Arg斷裂鏈(disruptchain)構(gòu)象Gly、Pro芳香的Trp、Tyr、Phe31在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)期奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的結(jié)構(gòu)等效物，其具有與淋球菌Laz的l-39位氨基酸殘基(SEQIDNO:24)的顯著結(jié)構(gòu)相似性。特別地，奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的結(jié)構(gòu)等效物和淋球菌Laz的l-39位氨基酸殘基(SEQIDNO:24)之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性通過使用VAST算法來確定(Gibrat""/.,CurrOpinStructBiol6:377-385(1996);MadejWa/"Proteins23:356-3690(1995))。在特定的實(shí)施方式中，來自奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的結(jié)構(gòu)等效物與淋球菌Laz的l-39位氨基酸殘基(SEQIDNO:24)的結(jié)構(gòu)比較的VASTp值是低于約l(T3、低于約l(T5、或低于約10—7。在其他實(shí)施方式中，奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽的結(jié)構(gòu)等效物和淋球菌Laz的l-39位氨基酸殘基(SEQIDNO:24)之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性可以通過使用DALI算法確定(Holm&Sander,J.Mol.Biol.233:123-138(1993))。在特定的實(shí)施方式中，配對結(jié)構(gòu)比較的DALIZ分值是至少約3.5、至少約7.0、或至少約10.0。對奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的修飾可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變?？梢詫寺〉腄NA進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Carter,BiochemJ,237:l-7(1986);ZollerandSmith,MethodsEnzymol.154:329-50(1987))、盒式誘變、限制選擇誘變(Wellsa/"Gene34:315-23(1985))或其他已知的技術(shù)來產(chǎn)生編碼奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽變體的核酸。此外，編碼奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽變體或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽變體的核苷酸可以通過本領(lǐng)域公知的方法合成。奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽-貨物化合物復(fù)合物在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供的是轉(zhuǎn)運(yùn)肽-貨物復(fù)合物，其中奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽與至少一種貨物化合物復(fù)合。這些復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽、AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)32肽或兩者之一的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物。由本發(fā)明遞送的貨物化合物包括但不限于，蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、核酸(包括反義核酸)、染料、微粒或納粒、毒素、無機(jī)和有機(jī)分子、小分子、和藥物。這種轉(zhuǎn)運(yùn)肽-貨物復(fù)合物可以用于為了治療目的遞送藥物進(jìn)入腦和/或腦部癌細(xì)胞、以及一般的癌細(xì)胞，用于為了診斷目的遞送成像化合物到腦部癌細(xì)胞和一般的癌細(xì)胞，以及用于需要遞送特定的化合物進(jìn)入腦部和/或進(jìn)入腦部癌細(xì)胞的任何其他目的。貨物化合物可以附于所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽的C-末端或N-末端。在某些實(shí)施方式中，所述奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)肽或AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽與銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽復(fù)合。在2005年10月6日提交的美國專利申請NO.ll/244，105中提供了銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，通過引用將其明確地合并在此。在某些實(shí)施方式中，所述銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽是包含銅綠假單胞菌天青蛋白的50-77位氨基酸區(qū)域的其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物。如在此使用的，術(shù)語"復(fù)合的"、"復(fù)合物"或"連接的"是指在要復(fù)合的成分之間的物理聯(lián)合。在某些情況下，所述物理聯(lián)合可以不是直接的，但可以通過連接基團(tuán)或另一種成分來介導(dǎo)。成分可以是蛋白質(zhì)、其他有機(jī)分子或無機(jī)分子，等等。在成分之間的物理聯(lián)合可以通過共價(jià)鍵、疏水性鍵和/或范德華力、或保持所述成分處于物理聯(lián)合的任何其他方式。在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，所述貨物化合物可以包含對癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性的銅氧還蛋白，例如來自銅綠假單胞菌的天青蛋白(SEQIDNO:24)("wt-天青蛋白")；來自藍(lán)細(xì)菌藍(lán)藻(戶/2WvmV^w/a附/"owm)的質(zhì)體藍(lán)素；來自鐵氧化硫桿菌(7T2/o6ac/〃wj/wraojczV/a"s)的鐵硫菌藍(lán)蛋白；來自裂環(huán)無色桿菌"c/^owo6fl"wcj;c/oc/ayfes)的假天青蛋白；來自丁香假單胞菌(尸"i^omo"w^yW"ga)、腦膜炎奈瑟氏球菌、副溶血弧菌(F/6n'o/ara/^ewo/"/cws)、支氣管炎博《惠牛寺氏菌(5orafefe//aZvw7c/nk;^/ca)的天青蛋白；來自橙色綠屈撓菌(C7z/o^/feci^awra油'ac^s)33或淋球菌的橙綠屈撓素A和B;和其他天青蛋白和天青蛋白樣蛋白。在其他實(shí)施方式中，所述貨物化合物可以是細(xì)胞色素C，例如來自淋球菌的細(xì)胞色素(:551。在其他實(shí)施方式中，所述貨物化合物可以是保持了其在癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的任何上述化合物的變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述貨物化合物可以是可檢測的物質(zhì)，例如熒光物質(zhì)，如綠色熒光蛋白；發(fā)光物質(zhì)；酶，例如卩-半乳糖苷酶；或放射性標(biāo)記的或生物素化的蛋白，被遞送以賦予細(xì)胞可檢測的表型。類似地，用可檢測物質(zhì)(例如熒光物質(zhì))標(biāo)記的微?；蚣{粒可以被遞送。適合的納粒的一個(gè)實(shí)例在2002年5月7日授權(quán)的美國專利NO.6，383，500中找到，通過引用將其明確地合并在此。許多這種可檢測物質(zhì)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。在某些實(shí)施方式中，所述貨物化合物可以是適合于X射線計(jì)算機(jī)斷層、磁共振成像、超聲波成像或放射性核素閃爍照相的可檢測物質(zhì)。在這些實(shí)施方式中，為了診斷目的將貨物化合物施用給患者。作為貨物化合物施用造影劑來增強(qiáng)通過X射線CT、MRI和超聲獲得的圖像。在各種實(shí)施方式中，所述貨物化合物是Y射線或正電子發(fā)射放射性同位素、磁共振成像造影劑、X射線造影劑和/或超聲造影劑。經(jīng)由奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽靶向腦腫瘤組織的、有或者沒有銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的放射性核素貨物化合物的施用，可以用于放射性核素閃爍照相。在某些實(shí)施方式中，奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以含有有或者沒有貨物化合物的放射性核苷酸。美國專利公開NO.2006/0039861提供了肽耙向的、多聚的造影劑，用作放射性核素造影劑。適合于X射線成像的商業(yè)上可獲得的貨物化合物包括但不限于Visipaque(碘克沙醇)、Omnipaque(碘海醇)禾口Imagopaque⑧，可從GEHealthcare(ChalfontSt.Giles,UnitedKingdom)獲得。經(jīng)由奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽耙向腦腫瘤組34織的、有或者沒有銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的超聲造影劑貨物化合物的施用，可以用于超聲成像。適合用作貨物化合物的超聲造影劑包括但不限于，生物相容性氣體的微泡、液體載體和表面活性劑微球體，進(jìn)一步包括在靶向部分和微泡之間的任選的連接部分Ln。感興趣的微泡包括但不限于表3中提供的那些。在本文中，術(shù)語液體載體是指水溶液，術(shù)語表面活性劑是指任何兩親性物質(zhì)，其導(dǎo)致溶液中界面張力降低。用于形成表面活性劑微球體的適合的表面活性劑的列表在EP0727225A2中公開，通過引用明確地合并在此。術(shù)語表面活性劑微球體包括納球、脂質(zhì)體、泡囊等等。在某些實(shí)施方式中，超聲造影劑是脂質(zhì)體或葡聚糖。所述生物相容性氣體可以是空氣或碳氟化合物(例如C3-Cs全氟烷)，其提供了產(chǎn)生回聲的差異并因而提供了超聲波成像中的對比。所述氣體可以被封入或包含在微球體中，所述微球體上任選地經(jīng)由連接基團(tuán)連接了奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽。所述連接可以是共價(jià)的、離子的或通過范德華力。表3.用作超聲造影劑的微泡和它們的組成。_微泡氣體穩(wěn)定殼第一代，不穿肺部血管游離微泡空氣無Echovist(SHU454)空氣無第二代，穿肺部血管，短半衰期(<5分鐘)Albunex空氣白蛋白Levovist(SHU508A)空氣棕櫚酸第三代，穿肺部血管，更長的半衰期(>5分鐘)Aerosomes(Definity，MRX115,DMP115)全氟丙烷磷脂Echogen(QW3600)十二氟戊烷表面活性劑Optison(FS069)八氟丙垸白蛋白PESDA全氟丁垸白蛋白Quantison空氣白蛋白QW7437全氟化碳表面活性劑Imavist(Imagent,AF0150)全氟己垸表面活性劑Sonovue(BR1)六氟化硫磷脂以器官特異性方式(肝、脾)穿肺部的BR14全氟丁烷磷脂Levovist(SHU508A)空氣棕櫚酸Sonavist(SHU563A)空氣氰基丙烯酸酯Sonazoid(NC100100)全氟化碳表面活性劑經(jīng)由奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽靶向腦腫瘤組織的、有或者沒有銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的X射線造影劑貨物化合物的施用，可以用于X射線計(jì)算機(jī)斷層和X射線成像的其他形式。適合用作貨物化合物的當(dāng)前的商業(yè)性X射線造影劑可以分成兩類1)離子造影劑，具有離子的羧基，和2)非離子造影劑，其不含有任何離子基團(tuán)。商業(yè)上可獲得的離子造影劑的實(shí)例包括Hypaqu^(泛影酸)fBHexabrix(碘克沙酸鹽)，而非離子劑包括01111^&91^@(碘海醇)、Isovue(碘帕醇)、Optimy(碘佛醇)和Visipaqu^(碘克沙醇)。適合用作貨物化合物的其他X射線造影劑包括但不限于，一種或多種X射線吸收性的或原子序數(shù)20或更大的"重，，原子，進(jìn)一步包含奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽和X射線吸收原子之間的任選的連接部分Ln。在X射線造影劑中經(jīng)常使用的重原子是碘。已經(jīng)公開了由金屬螯合物組成的X射線造影劑(例如，美國專利NO.5，417，959)和由多種金屬離子組成的多螯合物組成的X射線造影劑(例如，美國專利NO.5,679,810)。多核的聚簇復(fù)合物已經(jīng)作為X射線造影劑公開(例如，美國專利NO.5,804,161、PCTWO91/14460和PCTWO92/17215)。其他X射線造影劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以與本發(fā)明中的貨物化合物同樣好地使用。經(jīng)由奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽靶向腦腫瘤組織的、有或者沒有銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的MRI造影劑貨物化合物的施用，可以用于MRI成像。適合用作貨物化合物的MRI造影劑包括但不限于，一種或多種順磁性金屬離子，進(jìn)一步包括在奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽和所述順磁性金屬離子之間的任選的連接部分Ln。金屬螯合物的金屬離子可以是順磁性離子。適合的金屬離子包括具有22-29(包括)、42、44和58-70(包括)的原子序數(shù)并且具有+2或+3的氧化態(tài)的那些金屬離子。這種金屬離子的實(shí)例是鉻(III)、錳(II)、鐵(II)、鐵(III)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、鐠(III)、釹(III)、釤(III)、釓(III)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)、鉺(III)和鐿(III)。適合用作貨物化合物的商業(yè)上可獲得的MRI造影劑包括但不限于來自GEHealthcare(ChalfontSt.Giles,UnitedKingdom)的Omniscan⑧(釓雙胺)禾口Teslascan⑧。在另一個(gè)實(shí)施方式中，貨物化合物被遞送以殺死或抑制癌細(xì)胞(例如腦部癌細(xì)胞或其他癌細(xì)胞)的生長。例如，貨物化合物可以是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，例如p53;細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物，例如pl6、p21或p27;自殺蛋白，例如胸苷激酶或硝基還原酶；細(xì)胞因子或其他免疫調(diào)節(jié)蛋白，例如白介素l、白介素2或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);或毒素，例如銅綠假單胞菌外毒素A，等等。在其他實(shí)施方式中，上述化合物種類之一的生物學(xué)活性片段可以被遞送。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述貨物化合物是用于治療癌癥的藥物。這種藥物包括，例如，5-氟尿嘧啶；干擾素(X;氨甲蝶呤；他莫昔芬和硫酸長春新堿(Vincrinstine)。適合于治療癌癥的其他貨物化合物包括但不37限于烷化劑，例如氮芥、垸基磺酸鹽、亞硝基脲、氮丙啶和三氮烯；抗代謝物，例如葉酸拮抗劑、嘌呤類似物和嘧啶類似物；抗生素，例如蒽環(huán)類、博來霉素、絲裂霉素、放線菌素D和普卡霉素；酶例如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制物；5a-還原酶抑制物；17P-羥甾醇脫氫酶3型的抑制物；激素劑，例如糖皮質(zhì)激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕酮和黃體生成素釋放激素拮抗劑、醋酸奧曲肽；微管破壞劑，例如海鞘素或它們的類似物和衍生物；微管穩(wěn)定劑，如紫杉烷類，例如紫杉酚(Taxol)、多西紫杉酚(Taxotere)和它們的類似物，和埃博霉素，例如埃博霉素A-F和它們的類似物；植物衍生產(chǎn)物，例如長春花生物堿、表鬼臼毒素、紫杉垸類；和拓?fù)洚悩?gòu)酶(topiosomemse)抑制物；異戊二烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制物；以及雜劑(miscellaneousagent)例如羥基脲、丙卡巴肼、米托坦、六甲三聚氰胺、鉑配位絡(luò)合物(例如順式鉑氨和卡鉑)；和其他用作抗癌和細(xì)胞毒劑的藥劑，例如生物反應(yīng)修飾物、生長因子；免疫調(diào)節(jié)物和單克隆抗體。這些抗癌劑和細(xì)胞毒劑種類的代表性的實(shí)例包括但不限于氮芥氫氯化物、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、異環(huán)磷酰胺、白消安、卡莫司汀(carmustin)、環(huán)己亞硝脲、甲基環(huán)己亞硝脲、鏈脲菌素、硫替派、氮烯唑胺、氨甲蝶呤、硫鳥嘌呤、巰基嘌呤、氟達(dá)拉賓、pentastatin、克拉屈賓(dadribin)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、鹽酸阿霉素、柔紅霉素、伊達(dá)比星、硫酸博來霉素、絲裂霉素C、放線菌素D、safracin、沙弗拉霉素(saframycin)、quinocarcin、discodermolide、長春新減、長春堿、酒石酸長春瑞濱、依托泊甙、磷酸依托泊甙、替尼泊甙、紫杉醇、他莫昔芬、雌氮芥、雌氮芥磷酸鈉、氟他胺、布舍瑞林、亮丙瑞林、蝶啶、diynese、左旋四咪唑、aflacon、干擾素、白細(xì)胞介素、阿地白介素、非格司亭、沙莫司亭、利妥昔單抗、BCG、維甲酸、鹽酸伊立替康、betamethosone、鹽酸吉西他濱、六甲蜜胺(altretamine)和鹽酸托泊替康(topoteca)以及其任何類似物或衍生物。38可用作貨物化合物的抗癌劑和其他細(xì)胞毒劑的實(shí)例包括以下的德國專利No.4138042.8、WO97/19086、WO98/22461、WO98/25929、WO98/38192、WO99/01124、WO99/02224、WO99/02514、WO99/03848、WO99/07692、WO99/27890、WO99/28324、WO99/43653、WO99/54330、WO99/54318、WO99/54319、WO99/65913、WO99/67252、WO99/67253和WO00/00485中找到的埃博霉素衍生物；WO99/24416(還參見美國專利NO.6，040，321)中找到的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物；和WO97/30992以及WO98/54966中發(fā)現(xiàn)的異戊二烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制物；以及例如在美國專利NO.6，011，029中分類地和具體地描述的那些藥劑，其化合物可以與任何NHR調(diào)節(jié)物(例如AR調(diào)節(jié)物、ER調(diào)節(jié)物)一起采用、與LHRH調(diào)節(jié)物一起采用，特別是在癌癥的治療中。貨物化合物的其他實(shí)例包括可以有益地遞送到腦部的那些化合物。這些貨物化合物包括用于治療與腦部相關(guān)的疾病的藥物和其他治療劑。這些與腦部相關(guān)的疾病包括但不限于，憂郁癥、情感障礙、慢性疼痛、癲癇癥、阿爾茨海默病、中風(fēng)/神經(jīng)保護(hù)、腦和脊髓損傷、腦部癌癥、腦的HIV感染、各種產(chǎn)生共濟(jì)失調(diào)的失調(diào)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、亨廷頓病、影響腦部的兒童先天遺傳性錯(cuò)誤、帕金森氏病和多發(fā)性硬化?？梢杂米髫浳锘衔飦碇委煈n郁癥和情感障礙的抗抑郁藥物包括但不限于三環(huán)抗憂郁藥，例如去甲替林、文拉法辛(Effexor⑧)和萘發(fā)扎酮(nefazadone)(Serzone);選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI)，例如費(fèi)洛克汀(Prozac)、舍曲林(Zoloft)、氟伏沙明(Luvox)、帕羅西汀(Paxil)和西酞普蘭(Celexa)、鎮(zhèn)靜米氮平(Remeron)以及更有活性的安非他酮(bupropion)(Wellbutrin)。還感興趣的是頭痛和偏頭痛藥物，包括但不限于麥角胺、二氫麥角胺、酮洛芬、普萘洛爾(propranolol)、噻嗎洛爾、阿替洛爾、美多心安和萘羥心安?？梢杂米髫浳锘衔飦碇委熉蕴弁吹乃幬锇ǖ幌抻诔Ｒ姷逆?zhèn)痛藥，例如醋氨酚(Tylenol);抗炎藥物例如阿斯匹林；非甾族抗炎性藥物(NSAID)例如布洛芬(Advil,Motrin)和萘普生(Aleve);阿片類鎮(zhèn)痛藥例如嗎啡樣阿片樣物質(zhì)；抗抑郁藥和抗發(fā)作藥物?？梢杂米髫浳飦碇委煱d癇癥的藥物包括但不限于苯巴比妥、地侖丁、三甲雙酮(Tridione)、地西泮(Valium)、酰胺咪嗪(Tegretol)、丙戊酸(Depakene)、Emeside(乙琥胺)、Zarontin(乙琥胺)、確樂多(trileptal)、酰胺咪嗪、Keppra(左乙拉西坦)、拉莫三嗪、乙酰唑胺、triagabine、丙戊酸鈉、普瑞巴林、氯硝西泮、酰胺咪嗪、托吡酯、丙戊酸、拉莫三嗪、乙琥胺、氯巴占、氨己烯酸、左乙拉西坦、加巴噴丁、唑尼沙胺、麥蘇林、苯妥英和奧卡西平?？梢杂米髫浳锘衔飦碇委煱柎暮Ｄ〉乃幬锇ǖ幌抻谀憠A酯酶抑制劑，例如Razadyne⑧(以前被稱為Reminy產(chǎn))(加蘭他敏)、Exelor^(利斯的明)、Aricept(多奈哌齊)、Cognex(塔克林)和N-甲基D-天冬氨酸(畫DA)拮抗劑、Namenda(美金剛胺)?？梢杂米髫浳锘衔飦碇委熤酗L(fēng)或用于神經(jīng)保護(hù)的藥物包括但不限于Gavestine嚴(yán)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、促血小板生成素、TNF-a、雌激素、褪黑素和大麻素?？梢杂米髫浳锘衔飦碇委熌X部HIV感染的藥物包括但不限于非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)例如delavardine、施多寧(efavirenz)和奈韋拉平；核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)例如阿巴卡韋、阿巴卡韋、拉米夫定、阿巴卡韋、拉米夫定、齊多夫定、去羥肌苷、恩曲他濱、恩曲他濱、替諾福韋DF、拉米夫定、拉米夫定、齊多夫定、司他夫定、替諾福韋DF、扎昔他賓和齊多夫定；蛋白酶抑制物(PI)例如氨普那韋、阿扎那韋、呋山那韋、茚地那韋、洛匹那韋、利托那韋、奈芬那韋、利托那韋、沙奎那韋和替拉那韋；以及融合抑制劑例如恩夫韋肽。可以用作貨物化合物來治療肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)的藥物包括但不限于肌酸、Myotrophin、Celebrex、Neotrogin、NAALAD酶、neurodex、Rilutek、氧甲氫龍、輔酶Q10、托吡酯(Topamax)、扎利羅登、茚地40那韋、米諾環(huán)素以及丁螺環(huán)酮?？梢杂米髫浳锘衔飦碇委熀嗤㈩D病的藥物包括但不限于抗精神病藥，例如氟哌啶醇，或其他藥物，例如氯硝西泮、抗抑郁藥，例如費(fèi)西汀、舍曲林和去甲替林；鎮(zhèn)靜劑以及鋰；米諾環(huán)素、西酞普蘭和Ethyl-EPA(Miraxion)?？梢杂米髫浳锘衔飦碇委熍两鹕喜〉乃幬锇ǖ幌抻诳鼓憠A能藥或金剛垸胺、左旋多巴(L-d叩a)、溴麥角環(huán)肽、培高利特、普拉克索、羅匹尼羅、司來吉蘭和金剛垸胺?？梢杂米髫浳锘衔飦碇委煻喟l(fā)性硬化的藥物包括但不限于促腎上腺皮質(zhì)激素(更了解的為ACTH)、脫氫可的松、氫化潑尼松、甲基強(qiáng)的松龍、倍他米松、地塞米松、卩干擾素(Avonex②、Betaseror^和Rebi產(chǎn))、a干擾素、Novantrone(米托蒽醌)、環(huán)孢霉素(Sandimmune)、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、氨甲蝶呤、咪唑硫嘌呤(Imuran)和克拉屈濱(Leustatin)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述貨物化合物是編碼上述化合物種類之一的核酸。提供上述實(shí)例僅用于說明，許多其他這樣的化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。編碼奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域或AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域、或與貨物化合物連接的上述任一結(jié)構(gòu)域的核酸在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽和其變體、或融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含與貨物化合物連接的奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中所述貨物化合物是蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以通過本領(lǐng)域已知技術(shù)的組合來制備。在這些核酸中使用的編碼序列可以是在編碼特定肽的天然基因組DNA中存在的那些，或可以從已知的密碼子設(shè)計(jì)。這些編碼序列也可以考慮要表達(dá)所述肽的有機(jī)體的可選的密碼子利用和優(yōu)選的的密碼子利用來設(shè)計(jì)。奈瑟氏球菌屬/AAEAV(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽和轉(zhuǎn)運(yùn)肽-貨物復(fù)合物的核酸序列可以通過化學(xué)合成或克隆分別制備。然后可以使用連接酶將核酸序列連接在一起以得到目標(biāo)核酸分子。使用奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域或AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域遞送貨物化合物的方法本發(fā)明的組合物可以用于，例如，細(xì)胞類型的檢測或成像，用于癌癥的治療、特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)或腦部癌癥的治療，或用于與腦部相關(guān)的疾病的治療。所述組合物可以以治療有效量施用。一般地，宿主生物體是哺乳動(dòng)物，例如人類或動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，所述貨物化合物與奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽復(fù)合地遞送，而在其他實(shí)施方式中，所述貨物化合物與奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽共同施用但不與之復(fù)合。超過一種貨物化合物可以與奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽共同施用。貨物化合物的共同施用可以與所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽的施用同時(shí)發(fā)生，在同一藥物制品中，或在施用所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽約一小時(shí)之內(nèi)施用的另一藥物制品中。此外，奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽與貨物化合物的共同施用可以包括奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的施用，其自所述貨物化合物的施用開始超過約一小時(shí)但少于約兩小時(shí)、四小時(shí)、六小時(shí)、十二小時(shí)或二十四小時(shí)發(fā)生。在某些實(shí)施方式中，奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽、貨物化合物和銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以共同施用。在其他實(shí)施方式中，奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以和與貨物化合物復(fù)合的銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽共同施用。.在本發(fā)明的其他各種實(shí)施方式中，奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽體外、先體外后體內(nèi)或體內(nèi)遞送貨物化合物進(jìn)入細(xì)胞。例如，通過向細(xì)胞培養(yǎng)物(例如活檢物)添加奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQ42IDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽和貨物化合物的復(fù)合物，可以實(shí)現(xiàn)體外遞送?；蛘?，通過向從患者移出的樣品(例如血液、組織或骨髓)添加所述復(fù)合物，并將所述處理的樣品返回到患者中，可以實(shí)現(xiàn)先體外后體內(nèi)遞送。通過直接向患者施用所述復(fù)合物，也可以實(shí)現(xiàn)遞送。本發(fā)明的方法可以用于治療的、預(yù)防的、診斷的或研究的目的。含有奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的組合物，包括包含奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的復(fù)合物可以通過任何適合的途徑施用，例如，通過口服、口腔的、吸入、舌下的、直腸的、陰道的、經(jīng)尿道的、鼻的、體表的、經(jīng)皮膚的(即經(jīng)皮的)、或胃腸外的(包括靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、和冠狀動(dòng)脈內(nèi)施用)，或通過側(cè)腦室內(nèi)的或者腦內(nèi)的注射。本發(fā)明的組合物和其藥物制劑可以以任何有效量施用來實(shí)現(xiàn)它預(yù)期的目的。當(dāng)為了治療癌癥或任何其它需要治療的疾病來施用時(shí)，所述組合物以治療有效量施用。各種貨物化合物的劑量和施用安排的指導(dǎo)可以采集自許多參考文獻(xiàn)，其描述這些化合物在治療或診斷中的使用，例如Physicians'DeskReference(PDR)，或由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員另外確定。本發(fā)明的組合物可以通過常規(guī)的公知滅菌技術(shù)來滅菌，或可以無菌過濾。產(chǎn)生的水溶液可以被封裝來照原樣使用，或被凍干，凍干的制品在施用之前與無菌溶液組合。當(dāng)以靜脈內(nèi)的方式施用根據(jù)本發(fā)明的奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽、貨物化合物和/或轉(zhuǎn)運(yùn)肽-貨物化合物復(fù)合物時(shí)，施用可以通過靜脈滴注或間歇性的輸注。參與護(hù)理的提供者或臨床醫(yī)師根據(jù)患者的狀況確定確切的劑型、給藥途徑和劑量。劑量和間隔可以依個(gè)體調(diào)整以提供足以維持治療效果的本發(fā)明的組合物的血漿水平。一般地，期望的組合物在與根據(jù)預(yù)定施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐所選擇的藥物載體的混合物中施用。適合的劑量可以取決于例如所采用的含奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的化合物、貨物化合物、宿主、施用模式和要治療或43診斷的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性而變化。然而，在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，在人類中獲得滿意的治療結(jié)果需要約0.001到約20mg/kg體重的含奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的化合物或奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于人類中的治療的標(biāo)明的每日劑量在約0.7mg到約1400mg含奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的化合物或奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽復(fù)合物的范圍內(nèi)，例如以每日劑量、每周劑量、每月劑量和/或連續(xù)劑量給藥方便地施用。每日劑量可以是每天1到12次或更多的不連續(xù)的劑量。或者，劑量可以每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周和類似地天數(shù)增加直到31天或更久地施用。定量給藥可以是持續(xù)的、間歇性的或單劑量，使用任何可應(yīng)用的給藥形式，包括片劑、貼片、靜脈內(nèi)施用，等等。更具體地，所述組合物以治療有效量施用。在特定的實(shí)施方式中，所述治療有效量是約0.01-20mg/kg體重。在特定的實(shí)施方式中，所述劑量水平是約10mg/kg/天、約15mg/kg/天、約20mg/kg/天、約25mg/kg/天、約30mg/kg/天、約35mg/kg/天、約40mg/kg/天、約45mg/kg/天或約50mg/kg/天。在某些實(shí)施方式中，向患者導(dǎo)入含奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的組合物或奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽復(fù)合物的方法是，與其他已知用于治療癌癥的藥物共同施用。這種方法是本領(lǐng)域公知的。在特定的實(shí)施方式中，含奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的組合物或奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽復(fù)合物是混合物(cocktail)的一部分，或者含有或與其他治療癌癥的藥物的共同給藥的一部分。這種藥物包括在此列出的用于癌癥治療的任何貨物化合物。包含本發(fā)明的組合物的藥物組合物可以根據(jù)本發(fā)明使用，可以按照常規(guī)的方式使用一種或多種生理學(xué)可接受的載體配制成可以治療地使用的制劑，所述生理學(xué)可接受的載體包含便于所述組合物的加工的賦形劑和助劑、用于抑制或剌激所述組合物的分泌的活性劑、或其混合物。編碼奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽或組合了轉(zhuǎn)運(yùn)肽和貨物化合物之一和/或銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的融合蛋白的核酸分子可以插入載體中并用作基因治療載體。基因治療載體可以通過例如靜脈內(nèi)注射、局部施用(美國專利No.5,328,470)或通過立體定向注射來遞送給受試者。(Chene^/"ProcNatlAcadSciUSA,91:3054-57(1994))基因治療載體的藥物制劑可以包含可接受的稀釋劑，或可以包含緩釋基質(zhì)，其中包埋了基因遞送工具?；蛘?，當(dāng)可以從重組細(xì)胞完整地產(chǎn)生完整基因遞送載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)時(shí)，藥物制劑可以包含產(chǎn)生該基因遞送系統(tǒng)的一種或多種細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述組合物作為DNA來遞送，從而在原位產(chǎn)生所述復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述DNA是"裸露的"，如例如Ulmer"a/.，Sc/e"ce259:1745-49(1993)所描述和Cohen，5We"ce259:1691-92(1993)所綜述的。通過將裸DNA包被在載體(例如生物可降解的珠)上可以增加裸DNA的攝取，所述載體然后被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。在這種方法中，DNA可以存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何各種遞送系統(tǒng)中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)和病毒表達(dá)系統(tǒng)。將DNA摻入到這些表達(dá)系統(tǒng)中的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。參見，例如，WO卯/11092、WO93/24640、WO93/17706和美國專利No.5，736，524。用于在生物體之間往返遺傳物質(zhì)的載體可以被分為兩種一般類型克隆載體是復(fù)制型質(zhì)粒或噬菌體，具有在適合的宿主細(xì)胞中增殖非必需的區(qū)域，其中可以插入外源DNA;所述外源DNA被復(fù)制和增殖，如同它是載體的成分一樣。表達(dá)載體(例如，質(zhì)粒、酵母或動(dòng)物病毒基因組)用于將外源遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞或組織以轉(zhuǎn)錄并翻譯外源DNA，如所述組合物的DNA。在表達(dá)載體中，導(dǎo)入的DNA被可操作地連接到元件(例如啟動(dòng)子)，其給宿主細(xì)胞信號以轉(zhuǎn)錄插入的DNA。某些啟動(dòng)子是特別有用的，例如可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其響應(yīng)于特殊因子來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。將組合物多核苷酸可操作地連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以調(diào)控奈瑟氏球菌屬45/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽組合物多肽或片段的表達(dá)。典型的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括對a-千擾素、熱激、重金屬離子和類固醇例如糖皮質(zhì)激素(Km/mw,MeAoA^2jwo/./S5:"7-5//OP卯J)和四環(huán)素起反應(yīng)的那些啟動(dòng)子。其他理想的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括對于導(dǎo)入了構(gòu)建體的細(xì)胞不是內(nèi)源的那些啟動(dòng)子，然而，當(dāng)外源地提供誘導(dǎo)劑時(shí)，在那些細(xì)胞中是應(yīng)答性的。一般地，有用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒。然而，其他形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒)是預(yù)期的。載體選擇由使用的生物體或細(xì)胞和期望的載體結(jié)局所指示。一般地，載體包含信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。含有奈瑟氏球菌屬轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的藥物組合物含有奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的本發(fā)明的藥物組合物或與貨物化合物連接的奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的復(fù)合物可以以任何常規(guī)的方式制造，例如，通過常規(guī)的混合、溶解、?；?、滾糖衣、乳化、封入、包埋或凍干步驟。奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽復(fù)合物可以容易地與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體組合。這種載體允許制劑被配制為片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、淤漿、懸浮液，等等。適合的賦形劑還可以包括，例如，填充物和纖維素制劑。其他賦形劑可以包括，例如，調(diào)味劑、著色劑、防粘劑、增稠劑，和其他可接受的添加劑、佐劑或粘合劑。在各種實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含載體和賦形劑(包括但不限于緩沖液、碳水化物、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸，例如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑)、水、油、鹽水溶液、含水葡萄糖和甘油溶液，達(dá)到近似生理?xiàng)l件所需的其他藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如緩沖劑、張度調(diào)節(jié)劑、潤濕劑等等。應(yīng)認(rèn)識46到，雖然可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何適合的載體來施用本發(fā)明的組合物，載體的類型將取決于施用的模式而變化。化合物也可以使用公知的技術(shù)封入脂質(zhì)體內(nèi)。也可以采用生物可降解的微球體作為本發(fā)明的組合物的載體。例如，在美國專利No.4，897，268、5，075，109、5，928，647、5,811,128、5,820,883、5，853，763、5,814,344和5,942,252中顯示了適合的生物可降解的微球體。如在此使用的"化合物"包括本發(fā)明的肽、氨基酸序列、貨物化合物和復(fù)合物以及核酸。用于制備藥物組合物以施用所述奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽、貨物和轉(zhuǎn)運(yùn)肽-貨物復(fù)合物和核酸的靜脈內(nèi)液體可以由類晶體或膠體組成。如在此使用的類晶體是無機(jī)鹽或其他水溶性分子的水溶液。如在此使用的膠體含有較大的不溶性分子，例如明膠。靜脈內(nèi)液體可以是無菌的?？梢杂糜陟o脈內(nèi)施用的晶樣液體包括但不限于，生理鹽水(0.9%濃度的氯化鈉溶液)、林格氏乳酸鹽或林格氏溶液，以及5%的葡萄糖水溶液(有吋稱為D5W)，如表4中所描述的。表4:常見的晶體溶液的組成溶液別名[Na+][cr][葡萄糖]D5W5%葡萄糖002522/3&1/33.3%葡萄糖5151168/0.3%鹽水半生理鹽水0.45%NaCl77770生理鹽水0.9%NaCl1541540林格氏乳酸鹽林格氏溶液1301090*林格氏乳酸鹽還含有28mmol/L乳酸鹽、4mmol/LK+和3mmol/L本發(fā)明的組合物在血流中的半衰期可以被延長或優(yōu)化，例如，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾種方法，包括但不限于，環(huán)化的肽(MonkeM/.,BioDrugs19(4):261-78,(2005);DeFreestetal.,J.Pept.Res.63(5):409-19(2004))、D,L-肽(非對映異構(gòu)體)(Futakie^/"J.Biol.Chem.Feb23;276(8):5836-40(2001);Papoefa/"CancerRes.64(16):5779-86(2004);Millere^/.，Biochem.Pharmacol.36(1):169-76,(1987))、含有非天然氨基酸的月太(LeeJ.Pept.Res,63(2):69-84(2004))、以及N誦末端修飾和C-末端修飾(Labriea/.，Clin.Invest.Med.13(5):275-8，(1990))。特別感興趣的是d-異構(gòu)化(替換)和肽穩(wěn)定性的修飾，經(jīng)由D-替換或L-氨基酸替換。當(dāng)通過注射施用時(shí)，組合物可以配制在水性溶液中，優(yōu)選的在生理學(xué)地相容的緩沖液(例如Hanks溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液)中。該溶液可包含配制劑(formulatoryagent)例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，所述組合物可以是粉末形式用于在使用前與適合的載體(vehicle)(例如，無菌的無熱原水)構(gòu)制。當(dāng)通過吸入施用時(shí)，所述組合物可以以氣溶膠噴射的形式從加壓包或噴霧器、借助適合的推進(jìn)劑(例如二氯二氟甲垸、三氯氟甲烷、二氧化碳或其他適合的氣體)來遞送。對于加壓的氣霧劑來說，劑量單位可以通過提供閥門來遞送計(jì)量的量來確定。例如，在吸入器或吹入器中使用的明膠的藥囊和藥筒可以配制為含有蛋白和適當(dāng)?shù)姆勰┗|(zhì)(base)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。當(dāng)通過體表施用來施用時(shí)，所述組合物可以被配制為溶液、凝膠劑、軟膏劑、乳膏劑、懸浮液等等，如本領(lǐng)域公知的。在某些實(shí)施方式中，施用是通過經(jīng)皮貼片的方式。當(dāng)通過栓劑施用時(shí)(例如，直腸或陰道)，組合物還可被配制在含有常規(guī)栓劑基質(zhì)的組合物中。當(dāng)口服施用時(shí)，所述組合物可以與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體組合容易地配制。可以采用固體載體，例如甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂等等；這種載體允許趨化因子被配制為片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿、淤漿、懸浮液等等，用于由要治療的受試者口服攝入。對于口服腔固體劑型，例如粉末、膠囊和片劑，適合的賦形劑包括填充物(例如糖類)、纖維素制劑、成粒劑和粘合劑。本領(lǐng)域公知的其他方便的載體還包括多價(jià)載體，例如細(xì)菌莢膜多糖、葡聚糖或遺傳工程化的載體。此外，包含所述組合物的緩釋制劑允許釋放所述組合物持續(xù)延長的時(shí)間，從而沒有所述緩釋制劑時(shí)，組合物將在引發(fā)或增強(qiáng)治療效果之前從受試者的系統(tǒng)清除，和/或被例如蛋白酶和簡單的水解作用降解。包含奈瑟氏球菌屬/AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的試劑盒在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在包裝或容器中含有一種或多種以下物質(zhì)的試劑盒(1)包含與貨物化合物連接的奈瑟氏球菌屬或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的復(fù)合物的試劑；(2)含有藥學(xué)上可接受的佐劑或賦形劑的試劑；(3)用于施用的工具，例如注射器；(4)施用的說明。其中在相同的容器中存在部分(1)-(4)的兩個(gè)或多個(gè)的實(shí)施方式也是預(yù)期的。在其他實(shí)施方式中，所述試劑盒部分可以包括包含奈瑟氏球菌屬或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的試劑，以及包含所述貨物化合物的獨(dú)立的試劑。在其他實(shí)施方式中，所述試劑盒包括包含奈瑟氏球菌屬或AAEAP(SEQIDNO:25)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的試劑，而不包括包含所述貨物化合物的試劑。在其他實(shí)施方式中，所述試劑被配制用于靜脈內(nèi)施用，和/或施用的工具適合于靜脈內(nèi)施用。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒可以包含銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，特別是銅綠假單胞菌天青蛋白。在其他實(shí)施方式中，所述試劑盒可以包含用于將貨物化合物連接到奈瑟氏球菌屬/AAEAP轉(zhuǎn)運(yùn)肽或銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的試劑。當(dāng)提供試劑盒時(shí)，組合物的不同成分可以包裝在分開的容器中，在使用前即時(shí)混合。這種成分的分開包裝可以允許長期保存而不喪失活性49成分的功能。試劑盒中包括的試劑可以在任何類型的容器中提供，從而保持了不同成分的壽命，并且所述試劑不被容器的材料吸附或改變。例如，密封的玻璃安瓿可以含有凍干的多肽或多核苷酸、或緩沖液，其在中性的、非反應(yīng)性氣體(例如氮?dú)?中包裝。安瓿可以由任何適合的材料構(gòu)成，例如玻璃、有機(jī)聚合物(例如聚碳酸酯、聚苯乙烯等等)、陶瓷、金屬或保持類似試劑一般采用的任何其他材料。適合的容器的其他實(shí)例包括簡單的瓶子，其可以由與安瓿類似的材料制造，以及包膜，其可以包含箔排列的內(nèi)部，例如鋁或合金。其他容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器，等等。容器也可以有無菌的進(jìn)人孔，例如具有塞子的瓶子，所述塞子可以被皮下注射針剌穿。其他容器可以具有由容易移動(dòng)的膜分隔的兩個(gè)區(qū)室，在移除膜時(shí)允許兩個(gè)部分混合?？梢瞥哪た梢允遣ＡА⑺芰?、橡膠，等等。試劑盒還可以提供說明材料。說明書可以打印在紙或其他基質(zhì)上，和/或可以作為電子可讀介質(zhì)例如軟磁盤、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盤、錄像磁帶、錄音磁帶、閃存設(shè)備等等來提供。詳細(xì)的說明書可以與試劑盒不是物理上關(guān)聯(lián)的；而是，可以指引用戶到試劑盒的廠家或分銷商指定的因特網(wǎng)網(wǎng)站，或作為電子郵件提供。本發(fā)明的更完整的理解可以通過參考以下具體實(shí)施例來獲得。僅為了例示的目的而不是限制本發(fā)明的范圍，描述了實(shí)施例。當(dāng)條件可以表明適宜或變得適宜時(shí)，形式上的改變和等效物的替換是預(yù)期的。雖然在此已經(jīng)采用了特定的術(shù)語，這種術(shù)語意圖是描述性的意義，而不是為了限制的目的。可以產(chǎn)生以上闡述的本發(fā)明的修飾和變化，而不背離其精神和范圍，因而，如通過附隨的實(shí)施方式所指明的，僅加以這樣的限制。實(shí)施例實(shí)施例l.Laz和H.8-天青蛋白融合基因的克隆和表達(dá)50淋球菌的te基因根據(jù)它的已知序列(SEQIDNO:1)來克隆(圖1A)。稱為pm的銅綠假單胞菌天青蛋白基因(SEQIDNO:2)(圖1B)和來自淋球菌的/"2的11.8表位的序列(SEQIDNO:3)被用于在;^z的5'末端框內(nèi)克隆以產(chǎn)生H.8卞oz(圖1C)或在戸z的3'末端框內(nèi)克隆以產(chǎn)生p^-H.8(圖1D)，如下所述。細(xì)胞系和試劑。人類癌細(xì)胞、細(xì)菌菌株和質(zhì)粒在表5中列出。人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞和腦腫瘤LN-229細(xì)胞來自芝加哥伊利諾斯大學(xué)(UIC)的外科腫瘤學(xué)系的儲用培養(yǎng)物中心。細(xì)胞培養(yǎng)在具有Eagle's鹽、含有2mML一谷氨酰胺、0.1mMMEM必需氨基酸并添加有10。/。熱滅活胎牛血清、100單位/ml青霉素和100lag/ml鏈霉素的MEM中。所有細(xì)胞在37'C在5。/。C02中進(jìn)行培養(yǎng)。(Yamada,WProc.Natl.Acad.Sci.USA99:14098-14103(2002);Punj,e《a/"Oncogene23:2367-2378(2004)).表5.癌細(xì)胞、細(xì)菌菌株和遺傳構(gòu)建體細(xì)胞/菌株/質(zhì)粒相關(guān)的特征*參考文獻(xiàn)LN-229人類腦部成膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ishii，ea/"BrainPathol.9:469-479(1999)MCF-7人類乳腺癌Soule，"a/"J.Natl.Cancer.Inst.51:1409-1416(1973);Punj,"a/"Oncogene23:2367-2378(2004)銅綠假單胞菌原養(yǎng)生物，F(xiàn)P-(性因子缺陷)Holloway,"a/"Microbiol.Rev.PAOl43:73-102(1979)￡.co//JM109克隆和天青蛋白表達(dá)菌株Yanisch-Perron，Wa/"Gene33:103-119(1985)五.co/z'BL21GST表達(dá)菌株N0v3gcn(DE3)51淋球菌F62pUC18pUC19pUC18-tepUC19評pUC18-H.8評pGEX陽5X陽3pET29apET29a誦gWpET29a-H.8-gWpGEX-5X-3-H.8pET29a夢H.8用于DNA分離的原養(yǎng)生物一般克隆載體，A-一般克隆載體，A,克隆到pUC18中來自淋球菌F62的基因組DNA的lkbPCR片段克隆到///"^//和尸^/消化的pUC19中來自銅綠假單胞菌PAOl的0.55kbPCR片段，Apf編碼來自淋球菌的H.8和來自銅綠假單胞菌PAOl的天青蛋白的融合質(zhì)粒，ApfGST基因融合載體，Apf五.co/i'表達(dá)載體，Km'含有g(shù)^基因的pET29a衍生物，Kmr含有H.8-gW基因的pET29a衍生物，Kmr含有H.8編碼區(qū)的pGEX-5X-3衍生物，Apr含有g(shù)st-H.8基因的pET29a衍生物，Kmr美國典型培養(yǎng)物保藏中心Yanisch-Perron，a/.，同上Yanisch-Perron,"a/.,同上本文中Yamada，"a,.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:14098-14103(2002);Yamada，"a/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:4770-4775(2004)本文中AmershamNovagen本文中本文中本文中本文中*Ap，氨芐青霉素；Km,卡那霉素；GST，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶,;^z和/m基因的克隆和表達(dá)已經(jīng)描述了天青蛋白基因的克隆和超表達(dá)。(Yamada,Wa/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:14098-14103(2002);Punj，Wa/.,Oncogene23:2367-2378(2004))通過PCR使用淋球菌菌株F62的基因組DNA作為模板DNA來擴(kuò)增淋球菌的Laz編碼基因(/^)。使用的正向和反向引物是5'-CCGGAATTCCGGCAGGGATGTTGTAAATATCCG-3'(SEQIDNO:4)和5'-GGGGTACCGCCGTGGCAGGCATACAGCATTTCAATCGG-3'(SEQIDNO:5)，其中另外引入的五coi/和7^"/限制性位點(diǎn)分別以下劃線標(biāo)出。l.Okb擴(kuò)增的DNA片段，用&0//和&"/消化，插入到pUC18載體(Yanisch-Perron，e/a/.，Gene33:103-119(1985))的相應(yīng)位點(diǎn)中，使得/oz基因位于lac啟動(dòng)子的下游，來產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pUC18-/oz(表5,圖l)。用卩1^:19-;7^和？1;(:18-/^作為模板通過？0^構(gòu)建表達(dá)淋球菌1^2的H.8和銅綠假單胞菌的天青蛋白(Paz)融合物的質(zhì)粒。對于R8-Paz融合物，使用pUC18-;^作為模板和以下引物擴(kuò)增3.1kb片段，5'-(磷酸化的)GGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3*(SEQIDNO:6)和5'-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3'(SEOIDNO:7)，其中5W/位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出。PCR擴(kuò)增的0.4kb片段從作為模板的pUC19-戸z和以下引物獲得，5'陽(磷酸化的)GCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGG-3'(SEQIDNO:8)禾卩5'-TACTCGAGTCACTTCAGGGTCAGGGTG-3'(SEQIDNO:9)，其中J^o/位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出。將來自pUC18-te的5W/消化的PCR片段和來自pUC19少oz的屈o/消化的PCR片段克隆以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pUC18-H.8-/az(表5，圖l)。對于Paz-R8融合物，用pUC19-戸z作為模板和以下引物擴(kuò)增3.3kb片段，5'-CTTCAGGGTCAGGGTGCCCTTCATC-3'(SEQIDNO:10)和5'-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3'(SEQIDNO:ll)，其中&附///位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出。使用？11(:18-/^作為模板和以下引物擴(kuò)增0.13kb片段，5'-(磷酸化的)TGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCCTGC-3'(SEQIDNO:12)和5'-TAGGATCC7X4GGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3'(SEQIDNO:13)，其中5flm77/位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出，另外引入的TTA、相應(yīng)于細(xì)菌基因終止密碼子是斜體的。將兩個(gè)萬"m/7/消化的PCR53片段克隆以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pUC19-pflz-H.8(表5)。五.co/HM109被用作宿主菌株，用于天青蛋白和其衍生物基因的表達(dá)。重組￡."http://菌株培養(yǎng)在含有100嗎/ml氨芐青霉素、0.1mMIPTG和0.5mMCUS04的2xYT培養(yǎng)基中、在37。C培養(yǎng)16h來產(chǎn)生天青蛋白。融合GST蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)編碼基因使用pGEX-5X-3(GEHealthcareBio畫SciencesCorp,，Piscataway，NJ)作為模板DNA通過PCR擴(kuò)增。使用的正向和反向引物是5'-CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3'(SEQIDNO:14)和5'-CCCAAGCTT70GGGGATCCCACGACCTTCGATCAGATCC-3'(SEQIDNO:15)，其中分別地，另外引入的限制性位點(diǎn)5"ac/和歷m////以下劃線標(biāo)出，另外引入的TCA，相應(yīng)的細(xì)菌基因終止密碼子是斜體的。用5^/和歷"^///消化的1.0kb的擴(kuò)增DNA片段被插入到pET29a載體的相應(yīng)位點(diǎn)來產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pET29a-g^(表5)。對于H.8-GST融合，/"z的信號肽和H.8編碼區(qū)使用pUC18-te作為模板DNA通過PCR擴(kuò)增。使用的正向和反向引物是5'-GGAATTCATATGAAAGCTTATCTGGC-3'(SEQIDNO:16)和5'-CCGGAATTCGGCAGCAGGGGCTTCGGC-3'(SEQIDNO:17)，其中另外引入的A^飾&oi/位點(diǎn)的限制性位點(diǎn)分別以下劃線標(biāo)出。用A^e/和五coi/消化的0.14kb的擴(kuò)增DNA片段被插入到pET29a-^慮體的相應(yīng)位點(diǎn)來產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pET29a-R8-g^(表5)。對于GST-H.8融合，H.8編碼區(qū)使用pUC18-Zaz作為模板DNA通過PCR擴(kuò)增。使用的正向和反向引物是5'-CGGGATCCCCTGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCC-3'(SEQIDNO:18)和5'國CGGAATTC77MGGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGCAGG-3'(SEQIDNO:19)，其中另外引入的限制性位點(diǎn)^mi^和&o^以下劃線標(biāo)出，引入的細(xì)菌基因終止密碼子TTA是斜體的。用5<3附///和&0^/消化的0.14kb的擴(kuò)增DNA片段被插入pGEX-5X-3載體的相應(yīng)位點(diǎn)來產(chǎn)生pGEX-5X-3-H.8。GST-H.8融合區(qū)域然后用pGEX-5X-3-H.8作為模板DNA通過PCR擴(kuò)增。使用的正向和反向引物是5'-CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3'(SEQIDNO:20)和5'-CCGCTCGAG7QGGCAGCAGGGGCTTCGGCAG-3'(SEQIDNO:21)，其中另外引入的限制性位點(diǎn)&c/和Wo/位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出，引入的細(xì)菌基因終止密碼子TCA是斜體的。用5^/和Wo/消化的l.lkb的擴(kuò)增DNA片段被插入到pET29a載體的相應(yīng)位點(diǎn)來產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pET29a-g^-H.8(表5)。BL21(DE3)被用作宿主菌株，用于g^和其融合衍生物的表達(dá)。當(dāng)攜帶這些質(zhì)粒的Ea^菌株在存在IPTG的情況下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，如對天青蛋白所描述的裂解細(xì)胞和純化蛋白(Yamada,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:14098-14103(2002);Punj,Wa/"Oncogene23:2367-2378(2004);Yamada,"a/"Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005)),各種天青蛋白衍生物在SDS-PAGE作為單個(gè)成分遷移(圖1E)，而含H.8的蛋白質(zhì)(約17kDa)顯示了不規(guī)則的遷移，如之前注意到的(Cannon"a/.,同上；Fisetteefa/"同上)。實(shí)施例2.118增強(qiáng)銅綠假單胞菌天青蛋白對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞而不是乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性已經(jīng)報(bào)道了Paz對癌細(xì)胞的優(yōu)先進(jìn)入(Yamada,Wa/.,Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005))和它在體外和體內(nèi)對人類黑素瘤(Yamada,Wa/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:14098-14103(2002))和乳腺癌(Punj,"a/"Oncogene23:2367-2378(2004))的細(xì)胞毒性。然而，已知Paz或Laz對腦腫瘤如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤沒有影響。在此研究了Paz、Laz、H.8-Paz(H.8表位在Paz的N-末端)禾tlPaz-R8(H.8表位在Paz的C-末端)對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(LN-229細(xì)胞系)和乳腺癌(MCF-7細(xì)胞系)細(xì)胞的影響。蛋白質(zhì)的制備。銅綠假單胞菌的天青蛋白(Paz)、淋球菌的Laz、55&2-11.8和11.8-&2如先前描述的進(jìn)行純化。(Yamada，efa/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:14098-14103(2002);Punj，Wa/.,Oncogene23:2367-2378(2004);Yamada，"a/.，Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005))所有的重組GST融合物衍生物如以前描述的進(jìn)行純化。(Yamada,WCell.Microbiol.7:1418-1431(2005))購買化學(xué)合成的39個(gè)氨基酸的H.8肽。細(xì)胞毒性分析。進(jìn)行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基)四唑溴化物(MTT)分析來確定對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在37'C、5%(:02將細(xì)胞(每孔5xl(^個(gè))接種到100:1培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)皿中。過夜溫育之后，除去上清液，將含有指定的各種濃度的蛋白質(zhì)的新鮮培養(yǎng)基添加到附著的細(xì)胞中。這些細(xì)胞被溫育指定的各種時(shí)間，之后向培養(yǎng)物添加10pl5mg/mlMTT(Sigma-Aldrich，St.LouisMO)溶液并在37。C溫育2小時(shí)通過MTT分析來測定活細(xì)胞的數(shù)量。通過添加100pl異丙醇中的40mMHC1來終止MTT反應(yīng)。根據(jù)Mosmann描述的方法分光光度地測量形成的MTT甲月替(J.Immunol.Methods65:55-63(1983))。合成的R8肽對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-229(圖2A)或者乳腺癌MCF-7(圖2B)細(xì)胞有非常少的細(xì)胞毒性。在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(圖2A)中而不是在乳腺癌(圖2B)細(xì)胞中，天青蛋白(Paz)的影響是劑量依賴性的，雖然很低，隨著天青蛋白濃度從10pM提高到40nM細(xì)胞毒性提高。提高的細(xì)胞毒性僅僅或多或少地超過6h溫育期。最顯著的是Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌細(xì)胞中細(xì)胞毒性方面的差異。雖然在MCF-7細(xì)胞中對于不同的溫育時(shí)間Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz在所有劑量具有基本上相同的細(xì)胞毒性(圖2B)，對于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞Paz具有比Paz-H.8、H,8-Paz或Laz低得多的細(xì)胞毒性，特別是在較短的溫育期(6h)。因而H,8部分雖然本身缺乏細(xì)胞毒性，看起來增強(qiáng)了Paz的細(xì)胞毒性，但僅僅針對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤而不針對乳腺癌細(xì)胞。56實(shí)施例3.Paz或Laz中存在的R8表位促進(jìn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中天青蛋白的攝取與Paz相比Paz-H.8、H.8-Paz和Laz對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的增強(qiáng)的細(xì)胞毒性提出了問題，玨8部分是否以某種方式促進(jìn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中天青蛋白的攝取。Alexafluor568標(biāo)記的紅色熒光蛋白(Invitrogen-MolecularProbesCorp.,CarlsbadCA)被用于測定成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌細(xì)胞內(nèi)部這些蛋白的內(nèi)在化。這種技術(shù)先前被用于展現(xiàn)MCF-7細(xì)胞中天青蛋白的內(nèi)在化(Punj，do/.,Oncogene23:2367-2378(2004);Yamada，efa/"Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005))。共焦顯微鏡檢查。為了制備顯微樣品，在37'C在5。/。C02下將細(xì)胞在蓋玻片上培養(yǎng)過夜。預(yù)溫的37'C新鮮培養(yǎng)基與紅色熒光標(biāo)記的(Alexafluor568)天青蛋白或GST融合衍生物混合，與細(xì)胞溫育指定的時(shí)間。用PBS洗滌細(xì)胞，在-2(TC用甲醇固定5分鐘。在用PBS洗滌三次并加入含有1.5mg/ml用于核染色的4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(VECTASHIELD,VectorLaboratories,BurlingameCA)之后，通過使用CarlZeissLSM510激光掃描共焦顯微鏡采集圖像。(Yamada，a/.，Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005))與Paz-H.8、H.8-Paz禾口Laz相比，天青蛋白(Paz)以降低的效力被內(nèi)在化，表明了Paz進(jìn)入成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-229細(xì)胞的屏障(圖3A和4A)。相比之下，如先前報(bào)道的在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Paz被有效地內(nèi)在化，與Paz-H.8、H,8-Paz或Laz相比具有同等或略高的效力(圖3B和4B)。(Punj,Wa/"Oncogene23:2367-2378(2004);Yamada，"a/.，Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005))在LN-229細(xì)胞中Laz進(jìn)入的劑量依賴性展現(xiàn)了在37'C在30分鐘溫育期期間約16pM的最佳濃度(圖3C和4C)，高于該濃度將沒有進(jìn)一步的增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未顯示)。在10pM濃度下，雖然在約10到20分鐘內(nèi)大部分Laz在LN-229細(xì)胞中被內(nèi)在化(圖3D和4D)，在這種條件下Paz的內(nèi)在化是最小的(附圖3E)，表明Paz內(nèi)在化在LN-229細(xì)胞中是天生低效的。在LN-229細(xì)胞中與Laz類似但與Paz形成對比的Paz-H.8和H,8-Paz的顯著內(nèi)在化(圖3A和4A)看來表明了R8部分的相對位置，在Paz的N-末端還是C-末端，不影響它促進(jìn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中Paz部分內(nèi)在化的能力。實(shí)施例4.11.8部分促進(jìn)在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤而不是在乳腺癌細(xì)胞中的？&2進(jìn)入為了確定H.8表位是否如Laz中的需要成為Paz的部分，或它能否單獨(dú)起作用來促進(jìn)Paz進(jìn)入成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，除了單獨(dú)的R8之外使用了各種H.8融合蛋白。由于小肽(如39個(gè)氨基酸的合成R8部分)在溶液中具有低穩(wěn)定性，我們構(gòu)建了與H,8部分的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合物，類似于Paz-H.8或H.8-Paz，使得H.8被整合到GST的N-末端(H.8-GST)或GST的C-末端(GST-H.8)。在實(shí)施例1中描述了GST融合肽的構(gòu)建。發(fā)紅色熒光的結(jié)合Alexafluor568的Paz與未標(biāo)記的合成H.8肽、GST、08丁-11.8和118-08丁融合蛋白單獨(dú)地進(jìn)行溫育，以及與磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溫育作為對照，在37'C溫育30分鐘后在LN-229細(xì)胞中測定20Paz混合物的內(nèi)在化。與PBS(圖5E)、GST(圖5B)或GST-H.8(圖5C)相比，當(dāng)單獨(dú)地與Paz導(dǎo)入時(shí)，合成的H,8肽確實(shí)增強(qiáng)了Paz內(nèi)在化(圖5A)。熒光的定量顯示R8肽促進(jìn)Paz進(jìn)入達(dá)2.1倍。然而，H.8-GST的存在顯著地增強(qiáng)(超過3倍)Paz的內(nèi)在化(圖5D)。另一方面，GST-H.8僅顯示了輕微的促進(jìn)(圖5C)。Paz本身僅緩慢地(圖5E)進(jìn)入成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，表明在腦腫瘤細(xì)胞中的進(jìn)入由H.S介導(dǎo)。單獨(dú)的H.S不進(jìn)入成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(圖3A)，但它促進(jìn)Paz的內(nèi)在化的能力(圖5A)反映了它促進(jìn)蛋白質(zhì)進(jìn)入腦腫瘤細(xì)胞的能力。實(shí)施例5.在存在R8-GST的情況下Paz在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中增強(qiáng)的內(nèi)在化引起了這種細(xì)胞中更高的細(xì)胞毒性。我們在存在或不存在20Paz的情況下與LN-229細(xì)胞溫育合成的58H,8肽、GST、08丁-118和11.8-08丁蛋白(各20pM)24h，然后在24h后通過MTT分析測量活的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞來測量細(xì)胞毒性的程度。在缺乏Paz的情況下，H,8肽、GST或GST融合蛋白都沒有展現(xiàn)任何顯著的細(xì)胞毒性(圖5F，-Paz)。在存在20pMPaz的情況下，其本身在存在H.8肽或PBS的情況下展現(xiàn)了低細(xì)胞毒性(圖5F，+Paz)，僅在存在R8-GST的情況下觀察到相當(dāng)大的細(xì)胞毒性增強(qiáng)(圖5F，+Paz)，而GST本身或GST-H.8確實(shí)顯示了一定的細(xì)胞毒性增強(qiáng)(圖5F，+Paz)。結(jié)合起來，這些數(shù)據(jù)表明當(dāng)作為蛋白質(zhì)的部分或在存在蛋白質(zhì)(如Paz)時(shí)，H.8部分促進(jìn)Paz在這些細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)，產(chǎn)生增強(qiáng)的細(xì)胞毒性。實(shí)施例6.H.8介導(dǎo)BBB的穿越以容許進(jìn)入腦部H.8表位容許成膠質(zhì)細(xì)胞瘤LN-229細(xì)胞中融合蛋白或單獨(dú)的蛋白質(zhì)的增強(qiáng)的內(nèi)在化的能力(圖3A、4A和5D)提出了問題作為R8-Paz的N-末端或Laz的部分的R8是否促進(jìn)BBB的穿越并容許將這些蛋白從外周循環(huán)轉(zhuǎn)移到腦部微靜脈。Odyssey⑧分析在廠家建議的條件下使用IRDye⑧800CW(LI-CORBiosciences,Lincoln,Nebraska)標(biāo)記所有蛋白。將與IRdye⑧800CW結(jié)合的500嗎的Paz、R8-Paz和Laz腹膜內(nèi)注射到裸鼠中。24h后，處死小鼠，取出腦，并使用0-(:0110(17886丫@紅外成像系統(tǒng)(84pm分辨率，1mm偏移量)檢測腦成像。然后水平地切割小鼠腦部，采集中腦外側(cè)區(qū)域圖像用于標(biāo)記的蛋白存在的檢測。天青蛋白的熒光的定量熒光的定量通過使用AdobePhotoshop^如下測量通過Photoshop的LassoTool選擇一個(gè)細(xì)胞，從圖像菜單的紅色直方圖獲取平均值。對一個(gè)樣品測量至少三個(gè)不同的細(xì)胞，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。將用紅外染料IRdye⑧800CW(LI-CORBioscience)標(biāo)記的500嗎Paz、H,8-Paz和Laz蛋白腹膜內(nèi)注射到活的裸鼠中。24h后，處死小鼠，分離腦，并使用LI-COROdySSey紅外成像系統(tǒng)采集圖像。雖然發(fā)現(xiàn)Paz少59量地進(jìn)入腦部微靜脈，多得多的Laz和特別是H.8-Paz(超過4倍)在這種條件下在腦內(nèi)檢測到(圖6)，表明凡8表位容許融合蛋白進(jìn)入腦部的清楚的作用。實(shí)施例7.當(dāng)存在于N-末端時(shí)，118表位容許外周蛋白的細(xì)菌表面呈現(xiàn)。為了研究H.8表位在Laz中的N-末端定位是否促成它的表面呈現(xiàn)，如實(shí)施例l中描述的在GST的N-末端和C-末端(圖5)禾BPaz(圖2和圖3A/B和4A/B)構(gòu)建了H,8融合衍生物。五.co/沖表面暴露的蛋白質(zhì)的定位攜帶pET29a-g^、pET29a-H.8-g^或pET29a畫,H.8的co//菌株BL21(DE3)和攜帶pUC19-戸、pUC19az-H.8、卩11(:18-;.8-/^或？1;(:18-/02的￡.co/Z菌株JM109在37。C用0.4mM異丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)培養(yǎng)。離心一毫升每種這些細(xì)菌培養(yǎng)物，收集產(chǎn)生的細(xì)菌團(tuán)。在用PBS洗滌兩次之后，添加含有針對GST衍生物的抗GST抗體(1:2000)或針對天青蛋白衍生物的抗天青蛋白抗體(1:500)的lmL1%FBS-PBS。細(xì)胞懸液在冰上孵育lh，然后用PBS洗滌兩次。施加針對GST衍生物的結(jié)合FITC的抗兔IgG或針對天青蛋白衍生物的結(jié)合FITC的抗兔抗體，并在冰上孵育30分鐘。為了除去未結(jié)合的抗體，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，在冰上用乙醇固定。然后在共焦顯微鏡下觀察用DAPI處理的五.co"樣品。純化H,8融合蛋白(圖1E和圖7A)。在圖7B中顯示了GST以及N國末端和C-末端的兩種R8融合物(R8-GST和GST-H.8)的細(xì)胞定位。當(dāng)使用抗GST抗體通過Westem印跡檢測時(shí)，所有三種蛋白在Eco/f中超量表達(dá)，并存在于五.②"的全細(xì)胞裂解液中(圖7B)。當(dāng)從五.co"分離周質(zhì)部分時(shí)并檢査三種蛋白質(zhì)的存在時(shí)，GST和GST-H，8蛋白以顯著的量被檢測到(圖7B，周質(zhì)部分下的泳道1和3)，但僅少量的H,8-GST(圖7B，周質(zhì)部分下的泳道2)可以在這種周質(zhì)部分中檢測到。為了檢査其余的迕8-08丁融合蛋白是否可能被轉(zhuǎn)運(yùn)到￡.>//細(xì)胞的表面，培養(yǎng)并收獲超表達(dá)三種蛋白質(zhì)的細(xì)胞，洗滌，用抗GST抗體處理來結(jié)合任何表面暴露的GST，再次洗滌并用結(jié)合FITC的二級抗體處理。如果GST是表面暴露的，抗GST抗體將與它們結(jié)合，其然后可以通過結(jié)合FITC的二級抗體檢測。實(shí)際上，僅攜帶H.8-GST的五.co/湖胞顯示了FITC產(chǎn)生的綠色熒光(圖7C，H.8-GST)，表面R8表位在GST的N-末端的存在促進(jìn)了它轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。在GST的C-末端的R8部分的存在(GST-H.8)以及GST本身主要仍為周質(zhì)性的和胞內(nèi)的，沒有任何表面呈現(xiàn)(圖7C，GST和GST-R8)。使用如上所述的相同技術(shù)，我們確定了Paz和Paz-H，8仍為胞內(nèi)的(圖7D，Paz和Paz-H.8)，而H.8-Paz和Laz都顯示了表面呈現(xiàn)，確定了H.8在N-末端的存在，可能需要游離的半胱氨酸用于脂質(zhì)化，對于融合蛋白通過外膜轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)表面是重要的。實(shí)施例8.患有癌癥的患者的治療在患有癌癥的患者中進(jìn)行了H.S-Paz融合物(研究藥物)的I/II期臨床試驗(yàn)。特別地，來自淋球菌的Laz編碼基因(/oz)的H.S結(jié)構(gòu)域以及貨物化合物是來自銅綠假單胞菌的天青蛋白(pflz)，產(chǎn)生了融合蛋白"H.8-poz"。這種融合蛋白將如實(shí)施例1中描述的來構(gòu)建?；加薪M織學(xué)上證實(shí)的腦部癌癥、在通過當(dāng)前可用的FDA批準(zhǔn)的化學(xué)治療藥物和療法的充分治療后展現(xiàn)了臨床的和放射照成像進(jìn)展或復(fù)發(fā)的四十九位成年患者，將被編入施用所述研究藥物的開放性遠(yuǎn)景研究。為了有資格編入研究，所有患者在批準(zhǔn)的化學(xué)療法療程完成后展現(xiàn)了提高的可測量腫瘤體積。持久的轉(zhuǎn)移性沉積和/或大小或體積的繼續(xù)增加的證據(jù)必需被組織學(xué)地確定。這種組織學(xué)證據(jù)可以通過細(xì)針抽吸(FNA)活檢來獲得。在從所有患者根據(jù)芝加哥伊利諾斯大學(xué)的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)和FDA的知情同意之后將開始治療程序?；颊邲]有并發(fā)的疾病，例如其他惡性腫61瘤、先前的惡性腫瘤史、血質(zhì)不調(diào)、胰島素依賴型糖尿病或其他嚴(yán)重的心血管疾病，其可能干擾推薦治療的效果的合適評估。包括肝功能研究(LFT)的基線血液工作(全血球計(jì)數(shù)[CBC]和血清化學(xué))將在治療開始之前進(jìn)行。所有有資格的患者在試驗(yàn)期間必需不同時(shí)接受任何癌癥化學(xué)療法。通過每天靜脈內(nèi)注射藥學(xué)上可接受的研究藥物的制品來施用研究藥物12周，觀察受試者的任何劑量限制毒性。以10mg/kg^^開始的7個(gè)劑量水平，增加5mg/kg/天直到50mg/kg/天的最大劑量。每個(gè)劑量水平的效力將在患有晚期(advanced)可測量癌癥的7位患者中記錄。通過在2維上(a和b)測量可測量腫瘤來估計(jì)反應(yīng)。1)目標(biāo)腫瘤的全部消失將被認(rèn)為是完全反應(yīng)(CR);2)75%降低將被認(rèn)為是極好的部分反應(yīng)(PR);以及3)良好反應(yīng)(PR)將是處理后大小減少達(dá)50%。4)大小上25%的降低被認(rèn)為是穩(wěn)定的疾病(SD)，以及5)<25%將被認(rèn)為是無反應(yīng)(NR)。展現(xiàn)了疾病進(jìn)展的患者將停止他們的治療，但將跟蹤額外的12周。目標(biāo)腫瘤的全部消失和大小上的任何減少將表明11.8-天青蛋白治療對于治療癌癥是有效的。凡8-天青蛋白治療有效的其他指標(biāo)是新的腦腫瘤出現(xiàn)的減少率，和與腫瘤相關(guān)的血管生成疾病的減少。本發(fā)明的描述的實(shí)例和系統(tǒng)的各種修改和改變對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。雖然已經(jīng)結(jié)合具體實(shí)施方式描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是請求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過度局限于這些特定實(shí)施方式。實(shí)際上，對于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯的、用于進(jìn)行本發(fā)明的描述的模式的各種修改，意于在以下權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種分離的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其是來自奈瑟氏球菌屬的Laz、Lip或Pan1的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等效物，并且其促進(jìn)連接的分子進(jìn)入哺乳動(dòng)物腦部癌細(xì)胞或穿越血腦屏障。2.權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其與Laz的H.8區(qū)域(SEQIDNO:24)具有至少90%的氨基酸同一性。3.權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中所述肽是SEQIDNO:24。4.權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽被修飾以延長或優(yōu)化所述肽在血流中的半衰期。5.—種包含區(qū)域的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，所述區(qū)域由Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQIDNO:25)的至少4個(gè)不完全或完全重復(fù)組成，并且所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽每個(gè)總長度具有至少約50。/。的AAEAP(SEQIDNO:25)五肽重復(fù)。6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中所述重復(fù)區(qū)域與包含相同數(shù)量的Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQIDNO:25)重復(fù)的肽具有至少約90%的同一性。7.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其是合成的。8.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽被修飾以延長或優(yōu)化所述肽在血流中的半衰期。9.一種復(fù)合物，其包含至少一種貨物化合物和一種轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽是權(quán)利要求5的肽，并且所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽與所述貨物化合物連接。10.—種復(fù)合物，其包含至少一種貨物化合物和一種轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽是權(quán)利要求l的肽，并且所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽與所述貨物化合物連接。11.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其中所述貨物化合物是銅氧還蛋白，所述銅氧還蛋白選自天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、假天青蛋白、橙綠屈撓素和天青蛋白樣蛋白。12.權(quán)利要求ll的復(fù)合物，其中所述貨物化合物是來自銅綠假單胞菌(i^W(io附o"osaerwg/"。sa)的天青蛋白。13.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物被修飾以延長或優(yōu)化所述肽在血流中的半衰期。14.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其另外包含銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。15.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其中所述貨物化合物選自蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、核酸、染料、微粒、納粒、毒素和藥物。16.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其中所述貨物化合物是蛋白質(zhì)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽與所述貨物化合物連接以形成融合蛋白。17.權(quán)利要求15的復(fù)合物，其中所述貨物化合物是毒素。18.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其中所述貨物化合物是用于疾病的治療的治療劑，所述疾病選自抑郁癥、情感障礙、慢性疼痛、癲癇癥、阿爾茨海默病、中風(fēng)/神經(jīng)保護(hù)、腦和脊髓損傷、腦部癌癥、腦的fflV感染、各種產(chǎn)生共濟(jì)失調(diào)的失調(diào)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、亨廷頓病、影響腦部的兒童先天遺傳性錯(cuò)誤、帕金森氏病和/或多發(fā)性硬化。19.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其中所述貨物化合物是可檢測的物質(zhì)。20.權(quán)利要求19的復(fù)合物，其中所述可檢測的物質(zhì)是可通過選自熒光測定、顯微鏡檢査、X射線CT、MRI和超聲的方法檢測的。21.—種藥物組合物，其包含藥學(xué)上適合的載體中的權(quán)利要求10的復(fù)合物。22.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體適合于靜脈內(nèi)施用。23.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體適合于側(cè)腦室內(nèi)或腦內(nèi)注射。24.—種方法，包括用權(quán)利要求10的復(fù)合物接觸細(xì)胞。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤。26.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞，所述癌選自星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、脊髓腫瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤。27.—種治療患有癌癥的患者的方法，包括給所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求10的復(fù)合物。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述復(fù)合物以選自靜脈內(nèi)、體表、皮下、肌內(nèi)和進(jìn)入腫瘤的方式施用。29.權(quán)利要求27的方法，進(jìn)一步包括共同施用另一種癌癥治療。30.—種用于成像患者癌癥的方法，包括向所述患者施用權(quán)利要求19的復(fù)合物，并檢測所述貨物化合物在所述患者中的位置。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述貨物化合物是X射線造影劑，所述貨物化合物的位置通過X射線CT檢測。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述貨物化合物是磁共振成像造影劑，所述貨物化合物的位置通過MRI檢測。33.權(quán)利要求30的方法，其中所述貨物化合物是超聲造影劑，所述貨物化合物的位置通過超聲成像檢測。34.—種診斷癌癥的方法，包括用權(quán)利要求19的復(fù)合物接觸細(xì)胞，并檢測所述貨物分子的細(xì)胞位置。35.—種試劑盒，包含試劑，所述試劑包含權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。36.權(quán)利要求35的試劑盒，進(jìn)一步包含試劑，所述試劑包含藥學(xué)上可接受的載體。37.權(quán)利要求35的試劑盒，進(jìn)一步包含用于施用所述試劑的工具。38.—種核酸分子，其編碼權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。39.—種核酸分子，其編碼權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。40.—種核酸分子，其編碼權(quán)利要求10的復(fù)合物。41.一種治療或診斷患有腦部相關(guān)疾病的患者的方法，包括給所述患者共同施用權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和至少一種貨物化合物。42.權(quán)利要求41的方法，其中另外共同施用銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。43.—種治療或診斷患有腦部相關(guān)疾病的患者的方法，包括給所述患者共同施用權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和至少一種貨物化合物。44.權(quán)利要求43的方法，其中另外共同施用銅氧還蛋白衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。全文摘要本發(fā)明公開了用于將貨物化合物遞送到腦部癌細(xì)胞中和/或穿越血腦屏障的方法和物質(zhì)。所述貨物化合物的遞送是通過使用源于奈瑟氏球菌屬外膜蛋白例如Laz的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還提供了由五肽AAEAP組成的合成轉(zhuǎn)運(yùn)肽。本發(fā)明進(jìn)一步公開了治療癌癥、特別是腦部癌癥以及其他腦部相關(guān)疾病的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了成像和診斷癌癥、特別是腦部癌癥的方法。文檔編號C12P21/04GK101490270SQ200680033370公開日2009年7月22日申請日期2006年7月19日優(yōu)先權(quán)日2005年7月19日發(fā)明者A·查克拉博蒂,A·菲亞略,T·達(dá)斯古普塔,山田亨,昌洪申請人:伊利諾斯大學(xué)理事會(huì)