專利名稱：細(xì)胞遷移測(cè)定的制作方法
細(xì)月包遷移測(cè)定相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2005年9月16日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?0〃18,057的美國 臨時(shí)專利申請(qǐng)，以及2006年5月17日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?0/747,430的 美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，上述申請(qǐng)披露的內(nèi)容全部通過援引加入 本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及血球滲出測(cè)定方法。更具體地講，本發(fā)明涉及用 于跨內(nèi)皮遷移測(cè)定的組合物，以及制備和使用這些組合物的方法。發(fā)明背景細(xì)胞通過血管內(nèi)皮的遷移是像炎癥、動(dòng)脈硬化和腫瘤轉(zhuǎn)移這些狀 況的病理生理學(xué)上的重要事件。這些年已經(jīng)發(fā)展出了體外測(cè)量細(xì)胞遷 移的方法。最常用的方法是使用人工屏障(膜)，通常需要對(duì)遷移的 細(xì)月包進(jìn)行人工計(jì)數(shù)。市場(chǎng)上已有的細(xì)胞遷移測(cè)定裝置有經(jīng)典Boyden 小室(Boyden chamber )、纟田胞培養(yǎng)插入(cell culture insert)(改良版 Boyden小室)、FluoroBlockTM (BD Biosciences)和Cell Motility HitKitTM(Cellomics)。這些裝置的主要局限性有通量低，細(xì)胞人工計(jì)數(shù)， 使用為了細(xì)胞穿越的生物非相關(guān)材料，以及分析得到的結(jié)果存在困難。最近，致力于模仿遷移細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境的多層構(gòu)建物已經(jīng)提出(參 見公布號(hào)為WO 2003/027256和WO 2004/046337的國際申請(qǐng))。然而， 該系統(tǒng)制備復(fù)雜，并且不適合高通量篩選。仍需要改良的、使用簡單的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移(Transendothehal Cell Migration, TEM )測(cè)定系統(tǒng)，尤其是用于藥物4罙尋業(yè)的高通量篩選。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供用于跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移測(cè)定的組合物和方法。 這些組合物和方法特別適于高通量TEM測(cè)定，以及抑制或刺激TEM 進(jìn)程的介質(zhì)的分析。本發(fā)明的 一方面提供用于檢測(cè)細(xì)胞遷移的組合物，該組合物含有 含有膠原凝膠的固體層；接觸所述固體層并含有第 一 細(xì)胞類型的第一 細(xì)胞層；以及接種到所述第一細(xì)胞層上的第二細(xì)胞類型。固體膠原凝 膠層任選地含有明膠。這方面的一個(gè)具體實(shí)施方式
提供了在96孔板形 式中的組合物，具有人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的匯合第 一細(xì)胞層， 中性粒細(xì)胞或者外周血單核細(xì)胞(PBMC)作為第二細(xì)胞類型。該實(shí)施方 式的變化被提供在下面的詳細(xì)說明和權(quán)利要求中。本發(fā)明的另 一方面提供了 一種制備用于檢測(cè)細(xì)胞遷移的物質(zhì)組合 物(composition of matter )的方法，該方法包才舌以下步艱茌在容器內(nèi)；咒 積和固化膠原凝膠以形成含有膠原凝膠的固體層；置第一類型細(xì)胞于 所述固體層上并孵育所述第 一細(xì)胞類型以形成同所述固體層接觸的匯 合細(xì)胞層；以及將第二細(xì)胞類型的細(xì)胞接種到所述第一細(xì)胞層上。提 供了能夠制備所述物質(zhì)組合物的詳細(xì)實(shí)施方式，包括在96孔板形式(96 well plate format)內(nèi)的所述復(fù)合物，其對(duì)于包括TEM在內(nèi)的細(xì)胞遷移 的高通量分析是理想的。在形成固體層前任選地將明膠溶液混入膠原 凝膠中。本發(fā)明的另 一方面提供了 一種檢測(cè)包括TEM在內(nèi)的細(xì)胞遷移的方 法，包括以下步驟孵育所述物質(zhì)組合物；以及在所述組合物的所述 固體層的第一位置檢測(cè)遷移細(xì)胞。提供了該方法的一些實(shí)施方式，其 采用96孔板形式中的組合物，適于利用自動(dòng)化細(xì)胞分析儀進(jìn)行自動(dòng)化、 高通量的細(xì)胞遷移分析。本發(fā)明的又一方面提供了一種鑒別細(xì)胞遷移的介質(zhì)(mediator)的 方法，該方法包括將細(xì)胞遷移的候選介質(zhì)加入到所述的物質(zhì)組合物 中；孵育所述組合物；以及測(cè)定存在所述候選介質(zhì)的情況下的細(xì)胞遷 移，其中相對(duì)于缺少所述候選介質(zhì)的組合物在應(yīng)答上的差異鑒別了細(xì) 胞遷移的介質(zhì)。該方法的高通量實(shí)施為大量的細(xì)l包遷移/TEM介質(zhì)的快 速測(cè)定提供了一個(gè)平臺(tái)，是制藥業(yè)的重要技術(shù)(enabler)。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的詳細(xì)說明中體現(xiàn)出來。附圖簡要說明

圖1表示依照本發(fā)明實(shí)施方式的三維的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移(TEM) 測(cè)定的構(gòu)建。在左側(cè)是該系統(tǒng)側(cè)一見的示意說明。在右邊表示了俯^見的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)單層的圖。圖2是表示膠原凝膠質(zhì)量對(duì)中性粒細(xì)胞TEM的影響的圖示。 圖3是表示膠原凝膠質(zhì)量對(duì)外周血單核細(xì)胞(PBMC)TEM的影響的 圖示。圖4表示膠原凝膠體積對(duì)中性粒細(xì)胞TEM的影響。圖5表示膠原凝膠體積對(duì)PBMC TEM的影響。圖6表示起始細(xì)胞密度對(duì)中性粒細(xì)胞TEM的影響。圖7表示中性粒細(xì)胞TEM的時(shí)間過程。定量測(cè)量了板底以上Z: 120pm在0.5、 1、 1.5和2小時(shí)的時(shí)點(diǎn)上的遷移細(xì)胞。圖8表示PBMCTEM的時(shí)間過程。定量測(cè)量了板底以上Z: 120 pm在2、 4、 6和8小時(shí)的時(shí)點(diǎn)上的遷移細(xì)胞。圖9表示用IL-8預(yù)浸凝膠層時(shí)提高了中性粒細(xì)胞TEM。圖10表示1，10-phenathronoline ( 一種MMP隱9抑制劑)抑制中性粒細(xì)l包TEM。圖11是貫通凝膠層的一疊21-Z切片的三維圖像重建。 圖12是利用陽性對(duì)照(IL-ip刺激)和陰性對(duì)照(未用IL-ip刺激)進(jìn)行 的中性粒細(xì)胞TEM的大規(guī)才莫研究。
具體實(shí)施方式
我們提供了用于細(xì)胞遷移測(cè)定的組合物和方法，包括跨內(nèi)皮細(xì)胞 遷移(TEM)和血J求滲出測(cè)定。為了更4妻近地表示體內(nèi)環(huán)境，已i殳計(jì) 出了三維測(cè)定系統(tǒng)。該測(cè)定系統(tǒng)已經(jīng)提供于能夠自動(dòng)化高通量篩選的 96孔板形式中，因此滿足了制藥業(yè)中對(duì)基于細(xì)胞的功能分析的需要。 我們的結(jié)果表明所述測(cè)定方法適用于例如炎癥、動(dòng)脈硬化和肺瘤轉(zhuǎn)移 這些病理生理狀況的研究。它們完全適于高通量篩選測(cè)定。這些組合 物和方法還提供了改良的4全測(cè)生物學(xué)和細(xì)胞分析儀(例如IN Cell Analyzer 3000 )的自動(dòng)化特征之間在定量分析上的協(xié)同性。它們提供 了用于研究抑制或剌激該進(jìn)程的介質(zhì)(例如細(xì)胞因子或藥物)的獨(dú)特 方法。文中所用的術(shù)語"跨內(nèi)皮遷移"(TEM)是指遷移細(xì)胞從內(nèi)皮細(xì)胞 的上表面到基膜的運(yùn)動(dòng)，超出了對(duì)趨化因子(當(dāng)這些因子在內(nèi)皮細(xì)胞 的基膜的濃度高于上表面時(shí))應(yīng)答的范疇。細(xì)胞因子在單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞之間形成的接合部位之間遷移。通常，TEM發(fā)生在內(nèi)皮細(xì)胞被激活時(shí)， 例如被TNF、 IL-1或者其它前炎性介質(zhì)激活時(shí)。TEM也會(huì)內(nèi)源性地 發(fā)生，甚至在內(nèi)皮細(xì)胞沒有直接激活的情況下，由于白細(xì)胞黏附，TEM 將會(huì)沿內(nèi)皮細(xì)胞以較低的、強(qiáng)度更小的水平發(fā)生。因此，在體內(nèi)，TEM 發(fā)生在炎癥位點(diǎn)；在體外，會(huì)穿過培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，更優(yōu)選地在內(nèi)皮 細(xì)胞激活后以及/或者創(chuàng)建了趨化梯度(chemotactic gradient)后發(fā)生。 文中所用的術(shù)語"血球滲出(Diapedesis)，，是指白細(xì)胞透過血管 內(nèi)皮層進(jìn)入間質(zhì)液(IF)的運(yùn)動(dòng)。該進(jìn)程受到趨化因子的驅(qū)動(dòng)。血球滲 出經(jīng)常發(fā)生在一個(gè)區(qū)域受傷或被損壞且需要炎癥反應(yīng)時(shí)。組合物圖1提供了依照本發(fā)明的實(shí)施方式的三維的跨內(nèi)皮遷移(TEM) 測(cè)定模型。左側(cè)是該系統(tǒng)的示意說明。上部的綠點(diǎn)代表熒光標(biāo)記的白 細(xì)胞。褐色帶代表匯合的內(nèi)皮細(xì)胞。無底色區(qū)域代表厚約200[Lim的凝 固的膠原凝膠。EC層下分散的綠點(diǎn)代表遷移的細(xì)胞。注意，明膠任選 地包含在凝固的膠原凝膠中。注意，膠原凝膠層的厚度根據(jù)成像顯微 鏡的對(duì)焦面而定。多數(shù)情況下，約50 - 500 |Lim的膠原層為TEM測(cè)定 提供合適的厚度。右側(cè)為內(nèi)皮細(xì)胞(EC)單層的照片。在該照片中， 細(xì)胞核受到Hoechst染色(藍(lán)色)。F-肌動(dòng)蛋白由Alexa FluorTM 488結(jié) 合的鬼筆環(huán)肽(phalloidin)染色(綠色)。染紅色的表明是一種蛋白， VE釣黏蛋白(VE-Cadherin),其在細(xì)胞邊界當(dāng)有緊密的接合形成時(shí)進(jìn) 行表達(dá)。我們的系統(tǒng)相對(duì)于已有技術(shù)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于它簡單而高效。它是 可誘導(dǎo)的，并利用人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人類白細(xì)胞模擬了體內(nèi)血球 滲出。我們確定了中性粒細(xì)胞TEM在2小時(shí)內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)并表現(xiàn)出 受到MMP-9抑制劑的特異抑制。我們也斷定該系統(tǒng)可用于在膠原凝膠 中加入化學(xué)引誘劑分子的趨化性研究。要注意圖1中的3-D TEM模型圖表示在單容器(vessel)中的構(gòu)建 (setup)。我們?cè)趯?shí)施例部分詳細(xì)描述96孔板形式的開發(fā)。我們確定 了膠原質(zhì)量對(duì)中性粒細(xì)胞TEM的影響(圖2)和對(duì)PBMC TEM(圖3) 的影響。我們證實(shí)在正常凝膠負(fù)荷條件(loading conditions )下并進(jìn)行 快速旋轉(zhuǎn)，我們能夠可靠地制出質(zhì)量足夠好的膠原凝膠層。我們也確定了對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)9 6孔板形式中每個(gè)孔的膠原凝膠的工作體積(圖4和5 )。 我們也測(cè)驗(yàn)了最佳的遷移細(xì)胞密度，得出的結(jié)論為300,000 - 500,000 細(xì)胞/孔之間能夠得到滿意的測(cè)定結(jié)果(圖6)。我們注意到膠原凝膠 層中明膠的增加不影響系統(tǒng)的性能。明膠的使用能夠延長凝固的膠原 凝月交在室溫下的貯藏時(shí)間。96孔板形式中的TEM才莫型有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。其一，它是可以在96孑L 板的單個(gè)孔中完成測(cè)定的更緊湊的系統(tǒng)。使用自動(dòng)化細(xì)胞分析儀并用 上合適的圖像分析軟件能夠進(jìn)行高通量的藥物篩選測(cè)定。它也允許在 空間上和時(shí)間上和以三維形式(共聚焦顯微鏡的Z-堆疊特征(Z-stacking feature ))進(jìn)4亍細(xì)月包運(yùn)動(dòng)的定量測(cè)量。測(cè)定系統(tǒng)的三層i殳置也 避免了如塑膠多孔膜這類生物不相關(guān)材料的使用。組合物的制備我們提供用于制備實(shí)施例部分中的測(cè)定系統(tǒng)的詳細(xì)材料和方法。 簡要的講，膠原沉積在容器內(nèi)并凝固形成固體層?；蛘咦鳛檫x擇，可 以使用支持3D內(nèi)皮生長和細(xì)胞遷移的合成基質(zhì)凝膠。任選地，在膠原 層凝固前，將明膠溶液加入到膠原凝膠中。然后將第一細(xì)胞類型(內(nèi) 皮細(xì)胞)置于固體層上并進(jìn)行培養(yǎng)以形成與固體層接觸的匯合細(xì)胞層。 然后制備遷移細(xì)胞并將其接種到第一細(xì)胞類型的匯合層頂部。典型地， 第一細(xì)胞類型為內(nèi)皮細(xì)l包，例如為HUVEC。也可以-使用其它的原^戈內(nèi) 皮細(xì)胞，例如HCAEC (冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞)、HMVEC (肺微血管內(nèi)皮細(xì) 胞)或者內(nèi)皮細(xì)胞系例如SK-HEP-1 (ATCC HTB-52)。盡管任何遷移細(xì) 胞類型都能在該系統(tǒng)中使用或進(jìn)行試驗(yàn)，例如中性粒細(xì)胞系HL-60 (ATCC CCL-240)、淋巴細(xì)胞、月中瘤細(xì)胞系例如HT-1080 (ATCC CCL-121) 以及精子，但我們用原代中性粒細(xì)胞和PBMC作為遷移細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。為了檢測(cè)方便，在對(duì)遷移細(xì)月包進(jìn)^^妾種和分析前可以進(jìn)4亍標(biāo)i己。 通常用于標(biāo)記細(xì)胞的很廣范的染料也能用于該模型，所用染料例如為 Hoechst、鉤黃綠素(Calcein)、 熒光右旋糖酐 (fluorescein dextran) 和德州紅右旋糖酐(Texas Red dextran )。作為一個(gè)例子，我們?cè)谖覀?的研究中用CellTracker Green (Invitrogen)標(biāo)記細(xì)胞。做為選擇，在固體膠原凝膠層的制備過程中，可以在膠原凝膠中 混入熒光化合物。當(dāng)細(xì)胞遷移到凝膠中時(shí)，它們暴露于熒光材料。細(xì)胞和熒光材料之間的相互作用產(chǎn)生熒光信號(hào)，所述相互作用例如為蛋白酶的消化、內(nèi)在化(internalization)或者其它生化反應(yīng)。所述信號(hào)然 后被熒光顯微鏡捕獲，并且進(jìn)行定量測(cè)量。這里遷移細(xì)胞在測(cè)定前不 需要標(biāo)記。這會(huì)使測(cè)定更易于操作，更有效，并且更適于高通量應(yīng)用。 因?yàn)檫w移細(xì)l包在^爭(zhēng)內(nèi)皮遷移前不帶標(biāo)記，因此^又遷移通過內(nèi)皮細(xì)J包層 的細(xì)胞含有焚光信號(hào)。從未遷移的細(xì)胞完全不會(huì)顯示信號(hào)。這消除了 來自未遷移的、預(yù)先標(biāo)記的細(xì)胞的背景，因此提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性和 靈敏性。使用所述組合物的方法我們開發(fā)的細(xì)胞遷移測(cè)定系統(tǒng)能夠用于細(xì)胞遷移研究，也能夠篩 選促進(jìn)或抑制細(xì)胞遷移的介質(zhì)或藥物。當(dāng)用于篩選細(xì)胞遷移的介質(zhì)時(shí)， 該方法包括以下步驟(a)將細(xì)胞遷移的候選介質(zhì)加入所述組合物中， 或者用所述候選介質(zhì)對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理；(b)孵育所述組合物，包 括接種后的遷移細(xì)胞；(c)測(cè)定存在所述候選介質(zhì)情況下的細(xì)胞遷移； 和(d)與缺少所述候選介質(zhì)的同 一類型的細(xì)胞就測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較，測(cè) 量的遷移結(jié)果的差異鑒別了細(xì)胞遷移的介質(zhì)。我們成功地檢驗(yàn)了該系統(tǒng)對(duì)于刺激或抑制細(xì)胞遷移的分子進(jìn)行篩 選的能力。白介素-l-(3 (IL-ip)是中性粒細(xì)胞和PBMC的內(nèi)生的細(xì)胞遷 移介質(zhì)。IL-ip明顯地刺激內(nèi)皮細(xì)胞以表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)上述兩種細(xì)胞類 型IE爭(zhēng)內(nèi)皮遷移的黏附分子。存在IL-ip時(shí)，中性粒細(xì)胞TEM發(fā)生得相 對(duì)較快，并在約0.5-2小時(shí)內(nèi)達(dá)到明顯的信噪比(S/N) (IL-1(3刺激對(duì) 比未刺激，圖7)。我們也注意到經(jīng)過過4支孵育，中性粒細(xì)胞TEMS/N (有/無IL-lp刺激)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。PBMCTEM發(fā)生的相對(duì)較慢，通 常需要6-8小時(shí)的孵育時(shí)間(圖8)。將IL-ip加入用于HUVEC培養(yǎng)的培養(yǎng)基中并過夜培養(yǎng)時(shí)，我們也 檢驗(yàn)了另一種方法，即引入化學(xué)引誘物。白介素-8(IL-8)是公知的中性 粒細(xì)胞強(qiáng)力吸引劑。為了證實(shí)IL-8對(duì)中性粒細(xì)月包TEM的作用，在接種 HUVEC層前，我們用含有IL-8的培養(yǎng)基預(yù)浸月交原凝膠4小時(shí)。我們 的結(jié)果表明IL-8的浸漬產(chǎn)生了 TEM作用，類似于HUVEC的IL-ip活 化所起到的作用(圖9)。我們也檢驗(yàn)了抑制劑并顯示出該系統(tǒng)也能鑒別TEM抑制劑。公知1,10-phenathronolme抑制MMP-9 (基質(zhì)金屬蛋白酶-9)。用 1,10-phenathronoline對(duì)中性粒細(xì)胞預(yù)處理。整個(gè)TEM測(cè)定中該抑制劑 持續(xù)存在。圖9和10中(對(duì)于圖9，對(duì)比IN-和IN+)，我們證明了中 性粒細(xì)胞TEM的抑制。另 一個(gè)MMP-9抑制劑，強(qiáng)力霉素(doxycyclm), 也進(jìn)行了測(cè)驗(yàn)并表明抑制TEM。公知遷移細(xì)胞釋放的蛋白酶，例如 MMP-9,會(huì)促進(jìn)細(xì)胞遷移通過組織。蛋白酶的抑制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞遷移的 下調(diào)。高通量、三維的細(xì)力色遷移測(cè)定系統(tǒng)上面描述的組合物已經(jīng)成功地在96孔板平臺(tái)中得到實(shí)施。具有透 明底部的96孔一反用于該測(cè)定， 一個(gè)這樣的實(shí)例是PerkinElmer的 ViewPlateTM。用自動(dòng)化的細(xì)胞分析儀，例如In Cell Analyzer (GE Healthcare),進(jìn)行細(xì)胞遷移的分析。例如，在某一 Z-plate上產(chǎn)生預(yù)定 觀察區(qū)域的共聚焦圖像。然后這些圖像通過自動(dòng)分析和定量軟件進(jìn)行 處理。結(jié)合自動(dòng)成像和數(shù)據(jù)分析，該測(cè)定系統(tǒng)在96孔形式中的實(shí)施提 供了高通量的細(xì)胞遷移系統(tǒng)。該系統(tǒng)能夠用于大規(guī)模的探尋和評(píng)測(cè)用 于包括TEM在內(nèi)的細(xì)胞遷移的介質(zhì)。除了單個(gè)的Z plane圖像采集，該系統(tǒng)也能提供細(xì)胞遷移的3-D細(xì) 胞圖像。因?yàn)檫M(jìn)行圖像采集不干擾該測(cè)定系統(tǒng)，它也能夠提供時(shí)間數(shù) 據(jù)系列。圖11提供了 96孔板的孔的視域(field view )的白細(xì)胞TEM 的3-D圖像。該圖像是從通過膠原凝膠層的一疊21個(gè)Z-plate圖像切 片(每部分lOjim)重新構(gòu)建而成。該3-D圖像表明凝膠層中白細(xì)胞 TEM向下遷移到了凝膠中積聚了較高梯度化學(xué)引謗物的地方。該系統(tǒng)的可靠性通過中性粒細(xì)胞TEM的分散圖得到了檢驗(yàn)，所述 分散圖呈現(xiàn)了 Z:120 處有或無HUVEC激活情況下遷移細(xì)胞的數(shù)量 (圖12)。我們看到了緊密-分散分布。這表明處理中的變化很小，并 且兩個(gè)處理間的差異是顯著的并可辨別，這就符合了該測(cè)定的高通量 目的。需要時(shí)，同才羊的測(cè)定形式應(yīng)當(dāng)也可以用于384孔形式。實(shí)施例提供這些實(shí)施例只是出于說明性目的，不應(yīng)解釋為對(duì)權(quán)利要求界 定的本發(fā)明的范圍的限定。本說明書下文或其它地方給出的參考文獻(xiàn)都通過援引包含于此。 材泮+和方法表1包含了以下測(cè)定中用到的基本材料，以及關(guān)于生產(chǎn)商和相應(yīng) 的目錄編號(hào)的信息。另外的材料在隨后的方法中進(jìn)行說明。表1:試驗(yàn)部分用到的材料材料供應(yīng)商目錄弁HUVECCAMBREXCC2915EGM-2CAMBREXCC3162纖維粘連蛋白(Fibronectin )BD Bioscknc6S354008VITROGEN-100,I型膠原COHESIONFXP-019CdlTmcker GreenInvitrogenC2925結(jié)合鬼筆環(huán)肽的Alexa Fluor 488InvitrogenA-22284抗人PECAM單克隆(Anti-human PECAM monoclonal)PicrcsMA 3100人血清白蛋白SigmaA 1653RPMI培養(yǎng)基Invitrogen72400-047Cadherin-5,小鼠抗人單克隆抗體BD Biosciences555661小鼠IgGSigmaM 9144ViewPlateTM 96-孔沐反PerkinElmer6005182明膠SigmaG9391黑色膠粘封板劑(Black adhesive plate seal)Perkin Elmer6005189下面的副標(biāo)題描述了用于制備和實(shí)施該測(cè)定系統(tǒng)的操作步驟 膠原凝膠層的制備膠原I按照生產(chǎn)商的建議制備。簡要地講，將8ml的膠原與1 ml 的10xPBS和1 ml NaOH (0.1 N)相混合，使用的是保存在4 °C預(yù)冷的 吸液管和反應(yīng)物。可選4奪地，通過加入0.12N HC1將所述混合物的pH調(diào)到7.5.將96-孔板(ViewPlateTM, PerkmElmer Life and Analytical Sciences) 放到冰上，用分步重復(fù)移液器(stepper repeat pipette )( 500或者1000 的移液頭)將40 fil的凝膠(2.5 mg/ml)分配入每個(gè)孔。將該板在4 。C 以1,500 rpm旋轉(zhuǎn)2分鐘。該凝膠在無C〇2的培養(yǎng)箱中在37 °C固化， 以在96孔板的孔上構(gòu)建厚的膠原凝膠層(200 pm)。利用這種方法制 備的月交原凝力交進(jìn)4亍下面的TEM測(cè)定。備選地，在向96孔板中分配前加入明膠溶液至膠原凝膠混合物中。 通過向組織級(jí)水(tissue grade water )中加入5克粉末并加熱到完全溶解 來制備5%明月交溶液。用10 N NaOH將pH調(diào)到7.2,該溶液121。C高壓滅 菌30分鐘。分裝為1 ml量4。C貯存。每l ml的膠原混合物中加入125 pl的 5%明膠溶液。膠原/明膠混合物以類似于膠原凝膠混合物的方式進(jìn)行分 裝和固化。具有固化凝膠的板可以立刻用于下述TEM測(cè)定。備選地， 該板可用封板劑密封并在潮濕的環(huán)境下以室溫保存，留作后用。培養(yǎng)HU VEC在凝膠上形成匯合單層各孔中的膠原凝膠層被涂敷上200 pl的含有l(wèi) pg/ml的人纖維粘 連蛋白(BD Biosciences)的無血清EGM-2培養(yǎng)基，置于室溫下l小時(shí)。移 除含有纖維粘連蛋白的培養(yǎng)基后，將HUVEC細(xì)胞(CAMBREX)接種到 凝膠上并在EGM-2培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)3天，細(xì)胞濃度為40,000細(xì)胞/孔。 從早期傳代(第3到第4代)挑選細(xì)胞，70-80y。匯合的HUVEC細(xì)胞培養(yǎng) 物。測(cè)定的前一天，HUVEC培養(yǎng)基替換為新鮮的單獨(dú)的EGM-2培養(yǎng)基 或者含有IO ng/ml IL-1 p (或者TNF-cx或者其它化學(xué)引誘物)的新鮮 EGM-2培養(yǎng)基。該混合物過夜孵育用以刺激TEM。備選地，為了證實(shí)IL-8是中性粒細(xì)胞TEM的主要化學(xué)引誘物，在 接種遷移細(xì)胞前，萬交原凝膠可以用含有200 ng/ml的IL-8的培養(yǎng)基預(yù)浸 4小時(shí)。從血樣中分離和標(biāo)記白細(xì)胞中性粒細(xì)胞或者外周血單核細(xì)胞(PBMC)從血沉椋黃層(blood Buffycoat)中新鮮分離。簡單地講，利用右旋糖酐沉降法除去RBC。 然后用Ficoll-Hypaque離心法分離PBMC。在Ficoll-Hypaque離心的團(tuán)粒中，通過殘留的RBC的低滲溶解純化中性粒細(xì)胞。這些細(xì)月包用 CellTracker Green標(biāo)記，37。C下在含0.5到1pm染料的RPMI中孵 育45分鐘。移除含有染料的RPMI,用無血清RPMI培養(yǎng)基清洗細(xì)胞 一次。在含有0.2% HAS (測(cè)定用培養(yǎng)基)的RPMI中以2.5xl()6細(xì)胞 /毫升重懸所述細(xì)胞。執(zhí)4亍并測(cè)量TEM測(cè)定在測(cè)定日，除去用于HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，HUVEC單層用 PBS清洗2次并用測(cè)定培養(yǎng)基(含有0.2 %HAS的RPMI)清洗一次。 將CellTracker Green標(biāo)記的500,000 (200 pl)中性粒細(xì)胞或PBMC置 于各孔中的HUVEC單層之上。該測(cè)定在37°C進(jìn)一步孵育。孵育時(shí)間 的長度根據(jù)主要的細(xì)胞類型而定。對(duì)于中性粒細(xì)胞，孵育時(shí)間在2小 時(shí)內(nèi)，對(duì)于PBMC,可能需要6到10小時(shí)。所需的孵育時(shí)間過后，獲取已經(jīng)遷移到HUVEC層之下的中性粒細(xì) 胞/PBMC細(xì)胞的圖像。通常，在單個(gè)Z位置就足以獲取圖像并確定在 目標(biāo)Z位置在凝膠中的遷移細(xì)胞的數(shù)目。例如，利用IN Cell Analyzer 3000 (GE Healthcare)的Z-切片特征(Z隱slicing feature )對(duì)120 , Z平 面的圖像進(jìn)行量化。利用目標(biāo)強(qiáng)度(Object Intensity)分析;f莫型分析圖 像。在多個(gè)時(shí)間重復(fù)進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，這樣，圖中的各數(shù)據(jù)點(diǎn)代表6個(gè)重 復(fù)的孔的正/負(fù)標(biāo)準(zhǔn)差， 一個(gè)圖像Z平面/孔。結(jié)果膠原凝膠的制備合適的凝膠制劑是高質(zhì)量TEM測(cè)定所必須的。圖2和3表明凝膠 質(zhì)量顯著影響TEM結(jié)果。壞膠(broken gel)是通過插入移液器槍頭穿道的移液l將不同體積的對(duì)照凝膠分裝入各孔中。氣泡好像是使得中 性粒細(xì)胞和PBMC的TEM測(cè)定存在差異的主要因素。相對(duì)于正常的對(duì) 照膠，壞膠確實(shí)影響測(cè)定結(jié)果，但是不太顯著。注意，用多管道的移 液器注射凝膠時(shí)，小氣泡易于通過外力而帶入凝膠中。我們發(fā)現(xiàn)在4。C 以1,500 rpm轉(zhuǎn)動(dòng)該板2分鐘會(huì)除去大部分氣泡。也要注意，小心地進(jìn)行清洗操作能夠防止壞膠發(fā)生。由于分析設(shè)備的限制，膠的體積對(duì)測(cè)定的設(shè)置(setup)也很重要。 IN Cell Analyzer僅能聚焦板底凝膠中限定的200 的Z距。我們的分 析表明40 pi的凝膠體積提供了用于在孔的中心形成膠層的良好凝膠深 度，并且滿足了測(cè)定和設(shè)備的要求。圖4和5分別顯示了膠的體積對(duì) 中性粒細(xì)胞和PBMC TEM的影響。HUVEC培養(yǎng)依照以上的材料和方法部分在EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自 CAMBREX的HUVEC。合適的HUVEC培養(yǎng)物匯合單層在膠原凝膠上 生長。這通過鈣粘蛋白-5免疫染色而證實(shí)。圖l右側(cè)的彩色圖像表示 有緊密連接的匯合的內(nèi)皮細(xì)胞單層。細(xì)胞核受到Hoechst染色(藍(lán)色)。 F-肌動(dòng)蛋白由Alexa Fluor 488結(jié)合的鬼筆環(huán)肽(phalloidin )染色(綠 色)。染紅色表明是一種蛋白，即VE4丐黏蛋白(VE-Cadherin),其在 細(xì)胞邊界當(dāng)有緊密的接合形成時(shí)進(jìn)行表達(dá)。中性粒細(xì)^4口 PBMC的接種密度用滴定法測(cè)量中性粒細(xì)^^和PBMC的接種密度以鑒定出測(cè)定所需 的最佳細(xì)胞數(shù)目。中性粒細(xì)胞的起始細(xì)胞密度的分析結(jié)果表示在圖6 中。其表明為獲得合理的信噪(S/N)比，需要300，000-500,000細(xì)胞/ 孔的密度。對(duì)于PBMC,確定了類似的范圍。中性粒細(xì)胞和PBMC TEM的時(shí)間過程中性粒細(xì)胞TEM發(fā)生得相對(duì)比較快，在約0.5-2小時(shí)內(nèi)達(dá)到明顯 的S/N (IL-1(3刺激對(duì)比未刺激)。圖7顯示了中性粒細(xì)胞TEM時(shí)間過 程測(cè)定的結(jié)果。分別在0.5、 1、 1.5和2小時(shí)的時(shí)點(diǎn)上定量測(cè)量了板 底以上Z: 120 (im的遷移細(xì)胞。我們也注意到經(jīng)過過夜孵育，中性粒細(xì) 胞TEM S/N (有/無IL-1(3刺激)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。PBMC TEM發(fā)生的相 對(duì)4交'隄，通常需要6-8小時(shí)的孵育時(shí)間。圖8顯示了 PBMCTEM時(shí)間 過程測(cè)定的結(jié)果。分別在2、 4、 6和8小時(shí)的時(shí)點(diǎn)上定量測(cè)量了板底 以上Z: 120 的遷移細(xì)胞。IL-8浸漬增加中性粒細(xì)月包TEMIL-8是公知的中性粒細(xì)胞強(qiáng)力吸引劑。為了證實(shí)IL-8對(duì)中性粒細(xì) 胞TEM的作用，在開始該測(cè)定前，具有一層匯合的HUVEC單層的月交 原凝膠用含有200 ng/ml的IL-8的培養(yǎng)基預(yù)浸4小時(shí)。圖9顯示了該研 究的結(jié)果。該結(jié)果表明IL-8的浸漬產(chǎn)生了 TEM作用，類似于HUVEC 的IL-ip活化所起到的作用。IN+/IN-:存在/缺失MMP-9抑制劑(參見 下文)。通過MMP-9抑制劑抑制中性粒細(xì)胞TEM該TEM測(cè)定前，用1，10-phenathronoline, —種MMP-9抑制劑(12 -1000 ^M)，對(duì)中性粒細(xì)胞預(yù)處理0.5小時(shí)。整個(gè)TEM測(cè)定中持續(xù)存 在該抑制劑。圖9和10中，證明了中性粒細(xì)l包TEM受到抑制。圖10 中的各數(shù)據(jù)點(diǎn)代表6個(gè)重復(fù)孔的正/負(fù)SD,每個(gè)孔在Z: 60um處一個(gè)圖 像。另一個(gè)MMP-9抑制劑，強(qiáng)力霉素(doxycyclin),也進(jìn)行了測(cè)驗(yàn)并 表明抑制TEM (數(shù)據(jù)未顯示)。重建的三維TEM圖像96孔板的孔中的白細(xì)胞可視3-D細(xì)胞圖像表示在圖11中。利用IN Cell Analyzer 3000產(chǎn)生了 Z系列共聚焦圖像部分(sections )。采集了 從0-200 (im,通過凝膠層，每部分為lO(im的總共21個(gè)切片的圖像。 利用圖Y象分^斤程序AutoDeblur&AutoVisulize 9.3 (AutoQuant Imaging) 構(gòu)建3-D圖像。注意，圖ll僅表示了孔的一'J、部分，約0.75mm2的視 域(afield view )。該3-D圖像表明凝膠層中的白細(xì)胞TEM,向下遷移 到了含有化學(xué)引誘物的膠層中。中性粒細(xì)胞TEM的大規(guī)模研究圖12中表示了中性粒細(xì)胞TEM的分散圖，所述分散圖呈現(xiàn)了 Z:120 處在有或無HUVEC激活情況下遷移細(xì)胞的數(shù)量。緊密-分散 分布表明處理中的變化很小，并且兩個(gè)處理間的差異給出了顯著的信 號(hào)窗口，這使得該測(cè)定能夠用于高通量應(yīng)用。如同每一個(gè)都被單獨(dú)并特別地通過援引并入本文一樣，文中提及的所有的專利、專利公布和提及的其它公布的參考文獻(xiàn)都全部通過援引并入本文。盡管描述了本發(fā)明的優(yōu)選的說明性實(shí)施方式，所述領(lǐng)域 的技術(shù)人員會(huì)知道本發(fā)明能夠通過上述實(shí)施方式外的其它方式來實(shí) 施，上述實(shí)施方式僅是出于說明性目的而提供的，并不起限制作用。 本發(fā)明只由后面的權(quán)利要求來限定。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)細(xì)胞遷移的物質(zhì)組合物，該物質(zhì)組合物含有(a)含有膠原凝膠或合成基質(zhì)凝膠的固體層；(b)接觸所述固體層并含有第一細(xì)胞類型的第一細(xì)胞層；以及(c)接種到所述第一細(xì)胞層上的第二遷移細(xì)胞類型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述細(xì)胞遷移為跨內(nèi) 皮遷移(TEM)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述固體層還含有熒 光化合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述固體層還含有化 學(xué)引諸物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)組合物，其中所述化學(xué)引誘物在添 加所述第一細(xì)胞層之前加入到所述膠原凝膠中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)組合物，其中所述化學(xué)引誘物由所 述第 一細(xì)胞層的所述第 一細(xì)胞類型在細(xì)胞因子刺激后釋放出來。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第一細(xì)胞層是匯 合的。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第一細(xì)胞類型是 人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第一細(xì)胞類型由 細(xì)胞因子刺激。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第二細(xì)胞類型選 自由單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)月包、肺瘤細(xì)l包或 者精子組成的組。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第二細(xì)胞類型是 中性粒細(xì)胞或者外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第二細(xì)胞類型進(jìn) 4亍了染料標(biāo)記。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其位于96孔板形式中。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的物質(zhì)組合物，其中所述第一細(xì)胞類型 是HUVEC的匯合層，且其中所述第二細(xì)胞類型為中性粒細(xì)胞或 PBMC。
15. 才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其位于384孔板形式中。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的物質(zhì)組合物，其還含有用于圖像采集 的自動(dòng)熒光顯微鏡。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的物質(zhì)組合物，其中所述自動(dòng)熒光顯微 鏡包括共聚焦顯微鏡和用于自動(dòng)圖像采集和同時(shí)在線分析的軟件。
18. —種制備用于4全測(cè)細(xì)胞遷移的物質(zhì)組合物的方法，該方法包括 以下步驟(a) 在容器內(nèi)沉積和固化膠原凝膠以形成含有膠原凝膠的固體層；(b) 置第 一 細(xì)胞類型的細(xì)胞于所述固體層上并孵育所述第 一 細(xì)胞 類型以形成同所述固體層接觸的匯合細(xì)胞層；以及(c) 將第二細(xì)胞類型的細(xì)胞接種到所述第 一 細(xì)胞層上。
19. 一種檢測(cè)細(xì)胞遷移的方法，包括以下步驟(a) 孵育4又利要求1所述的組合物；以及(b) 在所述組合物的所述固體層的第 一位置;^全測(cè)遷移細(xì)胞。
20. —種鑒別細(xì)力包遷移的介質(zhì)的方法，包括(a) 將細(xì)胞遷移的候選介質(zhì)加入到權(quán)利要求1所述的組合物中；(b) 孵育所述組合物；以及(c) 測(cè)定存在所述候選介質(zhì)的情況下的細(xì)胞遷移，其中相對(duì)于缺少 所述候選介質(zhì)的組合物，在應(yīng)答上的差異鑒別了細(xì)胞遷移的介質(zhì)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述固體層還含有明膠。
22. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述沉積步驟還包括將明 膠溶液與所述膠原凝膠混合。
23. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，還含有用于采集圖像的自動(dòng) 焚光顯微鏡。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述自動(dòng)熒光顯微鏡包 括共聚焦顯微鏡和用于自動(dòng)圖像采集和同時(shí)在線分析的軟件。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于制備三維跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移(TEM)測(cè)定的組合物和方法。這些組合物和方法特別適于高通量TEM測(cè)定，以及抑制或刺激TEM進(jìn)程的介質(zhì)的分析和鑒定。用于檢測(cè)細(xì)胞遷移的組合物含有含有膠原凝膠的固體層；接觸所述固體層并含有第一細(xì)胞類型的第一細(xì)胞層；以及接種到所述第一細(xì)胞層上面的第二細(xì)胞類型。任選地，膠原凝膠中含有明膠。披露了一種96孔板形式，與高通量的細(xì)胞篩選儀結(jié)合能夠進(jìn)行高通量的TEM測(cè)定。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101263223SQ200680033862
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2006年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日
發(fā)明者A·貝萊茨基, P·錢納瓦哈拉, 於利敏, 趙立紅 申請(qǐng)人:通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科學(xué)公司