一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片的制作方法
【專利摘要】一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片，包括第一PDMS薄膜層、第二PDMS薄膜層和玻璃底層，第一PDMS薄膜層、第二PDMS薄膜層和玻璃底層依次不可逆鍵合成一整體結(jié)構(gòu)，第一PDMS薄膜層上設(shè)有第一微閥和第二微閥；第二PDMS薄膜層上開設(shè)有第一細(xì)胞培養(yǎng)通道、第二細(xì)胞培養(yǎng)通道和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道；第一微閥位于第一細(xì)胞培養(yǎng)通道與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道連接處上部，第二微閥位于第二細(xì)胞培養(yǎng)通道與第三細(xì)胞培養(yǎng)通道連接處上部。本發(fā)明具有操作靈活簡單、運(yùn)行可靠、制作成本低、實(shí)驗(yàn)成功率高及多功能等優(yōu)點(diǎn)。具有較高的生物學(xué)研究和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有望為以后開發(fā)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲藥物提供一個(gè)新的研究平臺(tái)。
【專利說明】一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療設(shè)備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤的轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵是腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，腫瘤轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響到患者的生存幾率，臨床治療對(duì)如何抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移一直都作為研究的重點(diǎn)?，F(xiàn)在體外有幾種常用的研究細(xì)胞遷移和侵襲的模型，例如劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室的跨膜檢測等被廣泛的用來研究細(xì)胞遷移和侵襲。細(xì)胞劃痕法是研究細(xì)胞遷移的常規(guī)方法，是當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)介質(zhì)上匯合形成一單層時(shí)，用移液槍頭等在細(xì)胞上劃出一道傷痕，然后觀察細(xì)胞遷移情況。但是這種方法會(huì)造成細(xì)胞機(jī)械性的損傷而且精度不夠。Transwell小室的跨膜檢測方法用來研究細(xì)胞侵襲的常規(guī)方法，是將基質(zhì)膠等涂與上層小室，然后將細(xì)胞加入小室中然后計(jì)算侵襲的細(xì)胞數(shù)。這種方法在去除細(xì)胞的過程容易造成誤差，且Transwell小室價(jià)格普遍較高。
[0003]用于研究細(xì)胞遷移和侵襲的微流控芯片取得了一定的進(jìn)展，但也存在很多不足，它們中往往集成有與細(xì)胞尺度相當(dāng)?shù)奈谓Y(jié)構(gòu)，利用微壩材料表面張力形成液膜隔離芯片中剛注入的細(xì)胞懸液或未固化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，防止?jié)B入到相鄰?fù)ǖ纼?nèi)。但實(shí)驗(yàn)操作過程中溫差的驟然變化，例如芯片從室溫轉(zhuǎn)到37°C培養(yǎng)過程中，細(xì)胞懸液或未固化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)與微壩表面張力發(fā)生顯著變化，極易造成細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)外泄影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)對(duì)芯片進(jìn)行移液器或注射器手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)容易使芯片通道中產(chǎn)生壓力波動(dòng)造成細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)外泄而實(shí)驗(yàn)失敗，這對(duì)操作者的技術(shù)熟練程度提出了很大的挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

·[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片，此芯片可以通過控制微閥的開關(guān)來研究細(xì)胞的遷移和侵襲，本發(fā)明具有操作靈活簡單、運(yùn)行可靠、制作成本低、實(shí)驗(yàn)成功率高及多功能等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]采用的技術(shù)方案是:
一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片，包括第一 PDMS薄膜層、第二 PDMS薄膜層和玻璃底層，第一 PDMS薄膜層、第二 PDMS薄膜層和玻璃底層依次不可逆鍵合成一整體結(jié)構(gòu)，其特征在于:
第一 PDMS薄膜層上設(shè)有第一微閥和第二微閥；
第二 PDMS薄膜層上開設(shè)有第一細(xì)胞培養(yǎng)通道、第二細(xì)胞培養(yǎng)通道和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道；第二細(xì)胞培養(yǎng)通道高于第一細(xì)胞培養(yǎng)通道和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道；第一微閥位于第一細(xì)胞培養(yǎng)通道與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道連接處上部，第一微閥與第一細(xì)胞培養(yǎng)通道和第二細(xì)胞培養(yǎng)通道由第二 PDMS薄膜層相隔，控制第一細(xì)胞培養(yǎng)通道與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道之間的連通或關(guān)閉；第二微閥位于第二細(xì)胞培養(yǎng)通道與第三細(xì)胞培養(yǎng)通道連接處上部，第二微閥與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道由第二 PDMS薄膜層相隔，控制第二細(xì)胞培養(yǎng)通道與第三細(xì)胞培養(yǎng)通道之間的連通或關(guān)閉。
[0006]第一細(xì)胞培養(yǎng)通道和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道的截面為方形，高度相同，高度為80-200 μm。
[0007]第二細(xì)胞培養(yǎng)通道的截面為方形，高度為200-500 μ m。
[0008]第一微閥由多個(gè)第一支柱支撐，多個(gè)第一支柱分兩排設(shè)置，兩排間距為100-300 μ m,每二個(gè)第一支柱之間距離為50-300 μ m,每個(gè)支柱的截面為方形。
[0009]第二微閥由多個(gè)第二支柱支撐，多個(gè)第二支柱分兩排設(shè)置，兩排間距為100-300 μ m, 二個(gè)第二支柱之間距離為50-300 μ m,每個(gè)第二支柱的截面為方形。
[0010]第一支柱和第二支柱與第一細(xì)胞培養(yǎng)通道高度相同。
[0011]所述第一微閥和第二微閥可獨(dú)立控制或通過管路連接，實(shí)現(xiàn)連動(dòng)控制。閥系統(tǒng)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)可以保持很好的關(guān)閉狀態(tài)，無漏液現(xiàn)象，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞無損隔離等操作，而且上述微流控芯片既能用于細(xì)胞的二維培養(yǎng)又能用于細(xì)胞的三維培養(yǎng)。
[0012]本發(fā)明具有操作靈活簡單、運(yùn)行可靠、制作成本低、實(shí)驗(yàn)成功率高及多功能等優(yōu)點(diǎn)。具有較高的生物學(xué)研究和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有望為以后開發(fā)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲藥物提供一個(gè)新的研究平臺(tái)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1本發(fā)明微流控芯片整體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0014]圖2是圖1的分解示意圖。
[0015]圖3為第一閥和第二閥關(guān)閉狀態(tài)下肝腫瘤細(xì)胞HepG2在微流控芯片中的遷移實(shí)驗(yàn)圖。
[0016]圖4為第一閥和第二閥開啟狀態(tài)下肝腫瘤細(xì)胞HepG2在微流控芯片中的遷移實(shí)驗(yàn)圖。
[0017]圖5是肝腫瘤細(xì)胞HepG2在侵襲實(shí)驗(yàn)中的生長狀態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片，包括第一 PDMS薄膜層1、第二 PDMS薄膜層2和玻璃底層3，第一 PDMS薄膜層1、第二 PDMS薄膜層2和玻璃底層3依次不可逆鍵合成一整體結(jié)構(gòu)，其特征在于:
第一 PDMS薄膜層I上設(shè)有第一微閥4和第二微閥5 ；
第二 PDMS薄膜層2上開設(shè)有第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6、第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8 ;第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7高于第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8 ;第一微閥位于第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7連接處上部，第一微閥4與第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6和第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7由第二 PDMS薄膜層2相隔，控制第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7之間的連通或關(guān)閉；第二微閥5位于第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7與第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8連接處上部，第二微閥5與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8由第二 PDMS薄膜層2相隔，控制第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7與第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8之間的連通或關(guān)閉。
[0019]第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8的截面為方形，高度相同，高度為80-200 μm。
[0020]第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7的截面為方形，高度為200-500 μ m。
[0021]第一微閥4由多個(gè)第一支柱9支撐，多個(gè)第一支柱9分兩排設(shè)置,兩排間距為100-300 μ m,每二個(gè)第一支柱9之間距離為50-300 μ m,每個(gè)支柱9的截面為方形。
[0022]第二微閥5由多個(gè)第二支柱10支撐，多個(gè)第二支柱10分兩排設(shè)置，兩排間距為100-300 μ m,每二個(gè)第二支柱10之間距離為50-300 μ m,每個(gè)第二支柱10的截面為方形。
[0023]第一支柱9和第二支柱10與第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6高度相同。
[0024]所述第一微閥4和第二微閥5可獨(dú)立控制或通過管路連接，實(shí)現(xiàn)連動(dòng)控制。閥系統(tǒng)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)可以保持很好的關(guān)閉狀態(tài)，無漏液現(xiàn)象，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞無損隔離等操作，而且上述微流控芯片既能用于細(xì)胞的二維培養(yǎng)又能用于細(xì)胞的三維培養(yǎng)。
[0025]實(shí)驗(yàn)實(shí)施例 實(shí)施例1 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):所用微流控芯片為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)和制備。芯片由上中下三層不可逆鍵合而成，上層為帶有微閥結(jié)構(gòu)的聚二甲基硅氧烷聚合物材料(PDMS)，中層為帶有流體通道結(jié)構(gòu)厚度為80-500 μ m聚二甲基硅氧烷聚合物薄膜，下層材料為普通玻璃、石英玻璃或光學(xué)玻璃。用移液槍將濃度為lmg/ml的鼠尾膠原I通入到第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6、第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7、第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8，放置在超凈臺(tái)中過夜晾干，使膠原蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域。第2天將芯片第一微閥4、第二微閥5關(guān)閉，然后以一定密度的肝腫瘤細(xì)胞H印G2懸液灌流入第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8，第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7不加細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，用注射泵以0.1μ Ι/min的流速將完全培養(yǎng)基通入到第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8，待細(xì)胞匯合成單層時(shí)，用含1%的胎牛血清培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞饑餓24h，其細(xì)胞狀態(tài)如圖3所示。然后打開芯片第一微閥4、第二微閥5，每4小時(shí)觀察一次細(xì)胞遷移狀態(tài)。開閥8小時(shí)后細(xì)胞遷移狀態(tài)如圖4所示。
[0026]實(shí)施例2
細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將HepG2細(xì)胞進(jìn)行消化并離心富集至所需要的濃度，然后置于冰浴中備用，將在冰浴中的鼠尾膠原I配置成濃度為4mg/ml，然后按1:1 (V:V)的比例與細(xì)胞懸液進(jìn)行混合最好制備成濃度為2mg/ml的細(xì)胞-膠原溶液,并且混合均勻。將芯片第一微閥4、第二微閥5關(guān)閉，然后將此溶液通入第二細(xì)胞培養(yǎng)通道7中，放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中，20min后待膠凝固,然后打開第一微閥4、第二微閥5,在第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8以0.1 μ 1/min的流速通入完全細(xì)胞培養(yǎng)液，4天后將第一細(xì)胞培養(yǎng)通道6通入含有藥物的無血清培養(yǎng)液，第三細(xì)胞培養(yǎng)通道8仍通入完全細(xì)胞培養(yǎng)液，原位觀測細(xì)胞侵襲狀態(tài)的同時(shí)收集細(xì)胞上清液，檢測細(xì)胞侵襲時(shí)分泌因子的改變。其在膠原中侵襲過程時(shí)的生長狀態(tài)如圖5所示。
【權(quán)利要求】
1.一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片，包括第一 PDMS薄膜層(I)、第二 PDMS薄膜層(2)和玻璃底層(3)，第一 PDMS薄膜層(I)、第二 PDMS薄膜層(2)和玻璃底層(3)依次不可逆鍵合成一整體結(jié)構(gòu)，其特征在于: 第一 PDMS薄膜層(I)上設(shè)有第一微閥(4)和第二微閥(5)； 第二 PDMS薄膜層(2)上開設(shè)有第一細(xì)胞培養(yǎng)通道(6)、第二細(xì)胞培養(yǎng)通道(7)和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道(8);第二細(xì)胞培養(yǎng)通道(7)高于第一細(xì)胞培養(yǎng)通道(6)和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道(8);第一微閥位于第一細(xì)胞培養(yǎng)通道(6)與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道(7)連接處上部，第一微閥(4)與第一細(xì)胞培養(yǎng)通道(6)和第二細(xì)胞培養(yǎng)通道(7)由第二 PDMS薄膜層(2)相隔，控制第一細(xì)胞培養(yǎng)通道(6)與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道(7)之間的連通或關(guān)閉；第二微閥(5)位于第二細(xì)胞培養(yǎng)通道(7 )與第三細(xì)胞培養(yǎng)通道(8 )連接處上部，第二微閥(5 )與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道(7)和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道(8)由第二 PDMS薄膜層(2)相隔，控制第二細(xì)胞培養(yǎng)通道(7)與第三細(xì)胞培養(yǎng)通道(8 )之間的連通或關(guān)閉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片，其特征在于: 第一細(xì)胞培養(yǎng)通道(6)和第三細(xì)胞培養(yǎng)通道(8)的截面為方形，高度相同，高度為80-200 μm ； 第二細(xì)胞培養(yǎng)通道(7)的 截面為方形，高度為200-500 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片，其特征在于: 第一微閥(4)由多個(gè)第一支柱(9)支撐,多個(gè)第一支柱(9)分兩排設(shè)置,兩排間距為100-300 μ m，每二個(gè)第一支柱(9)之間距離為50-300 μ m，每個(gè)支柱(9)的截面為方形； 第二微閥(5)由多個(gè)第二支柱(10)支撐，多個(gè)第二支柱(10)分兩排設(shè)置，兩排間距為100-300 μ m，每二個(gè)第二支柱(10)之間距離為50-300 μ m，每個(gè)第二支柱(10)的截面為方形。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片，其特征在于: 第一支柱(9)和第二支柱(10)與第一細(xì)胞培養(yǎng)通道(6)高度相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的多功能微流控芯片，其特征在于: 所述第一微閥(4)和第二微閥(5)為獨(dú)立控制或通過管路連接實(shí)現(xiàn)連動(dòng)控制。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK103627635SQ201310571126
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】孟憲生, 馬立東, 王乙同, 包永睿, 王帥 申請(qǐng)人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)