專利名稱：用于影響腫瘤細(xì)胞生長、遷移和侵襲的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，其涉及癌癥相關(guān)技術(shù)。本發(fā)明的某些方面包括與miR221和miR222相關(guān)的診斷、治療和預(yù)后的應(yīng)用。特別地在本文中論述了肝癌和肺癌的診斷、治療和預(yù)后。 本發(fā)明部分基于如下發(fā)現(xiàn) 肝細(xì)胞生長因子對(duì)肝細(xì)胞生長因子受體(MET)的結(jié)合上調(diào) 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶(ERK1/2)和Jun N-末端激酶(JNK)的磷酸化，這繼而上調(diào) Jun的轉(zhuǎn)錄激活，這繼而上調(diào) 非編碼microRNA(miR-221和miR-222)的表達(dá)，這繼而調(diào)節(jié) 磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)以及金屬蛋白酶3的組織抑制劑(TMP3)的表達(dá)，這繼而 賦予對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性，并增強(qiáng)肺癌和肝癌細(xì)胞的致腫瘤性。本發(fā)明提供了使用從本發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的知識(shí)的研究工具、診斷方法以及治療方法和組合物。本發(fā)明在產(chǎn)業(yè)上適用于使腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物誘導(dǎo)的誘導(dǎo)致敏以及還有抑制腫瘤細(xì)胞存活、增殖和侵襲能力的目的。
背景技術(shù)：
盡管在早期檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)治療上取得進(jìn)展，但非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和肝細(xì)胞癌(HCC)通常在晚期才得以診斷并且具有不良預(yù)后。促進(jìn)細(xì)胞凋亡是藥物開發(fā)的可能目標(biāo)。TNF相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)目前正在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試；然而許多腫瘤包括NSCLC和HCC對(duì)TRAIL的抗性代表了對(duì)其臨床應(yīng)用的障礙。miRNA是可阻斷mRNA翻譯和/或負(fù)面調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性的19 - 25nt的小非編碼RNA。目前，已在人細(xì)胞中鑒定了 500多種不同的miRNA，并且證據(jù)表明miRNA水平的調(diào)節(jié)與許多細(xì)胞類型和組織的生長和分化相關(guān)。失調(diào)的miRNA表達(dá)與實(shí)體和造血系統(tǒng)惡性腫瘤(hematopoietic malignancy)相關(guān)，并且有證據(jù)表明一些miRNA可用作癌基因或腫瘤抑制基因。miR-221和miR-222是其中脫調(diào)控程度最高的牽涉癌癥的miRNA。它們的表達(dá)在多種實(shí)體瘤中被高度上調(diào)，包括甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌和黑色素瘤細(xì)胞。升高的miR-221和miR-222的表達(dá)與幾種癌細(xì)胞系的增殖、細(xì)胞凋亡和遷移具有因果聯(lián)系。然而，在一般的癌細(xì)胞，特別是在NSCLC和HCC中介導(dǎo)miR-221和miR-222的功能的分子機(jī)制在本發(fā)明之前在很大程度上是未知的。PTEN是人癌癥的腫瘤阻抑子和細(xì)胞生長及細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑。在功能上，PTEN將細(xì)胞質(zhì)中的磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇_4，5-二磷酸(PIP2)，從而直接拮抗PI3激酶(PI3K)的活性。PTEN失活導(dǎo)致PI3K/AKT途徑的組成型激活，以及隨后蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移和存活的增加。此外，許多研究已證明PTEN的蛋白磷酸酶活性通過幾個(gè)途徑抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活。PTEN與多個(gè)藥物抗性包括針對(duì)TRAIL的抗性的發(fā)生相關(guān)。AKT的組成型激活促成不同類型腫瘤包括肺和肝癌中細(xì)胞的遷移和侵襲。TMP3是一組稱為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的蛋白質(zhì)的成員。MMP是參與正常生理過程例如胚胎發(fā)育、組織和骨重塑、傷口愈合以及血管生成中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的分解的鋅蛋白酶的家族。在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)，金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)(其中存在4個(gè)家族成員OlMPl至4))通過以1:1的化學(xué)計(jì)量與活性位點(diǎn)結(jié)合而抑制MMP的活性。TMP3在血管平滑肌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞系中的過表達(dá)抑制侵襲和促進(jìn)凋亡細(xì)胞死亡。已報(bào)導(dǎo)TMP3誘導(dǎo)引發(fā)者(initiator)胱天蛋白酶_8和-9的激活。TMP3與血管生成和腫瘤形成相關(guān)。 MET，也稱為c-Met，是肝細(xì)胞生長因子(HGF)/散射因子(scatter factor) (SF)的膜受體。MET通常由上皮來源的細(xì)胞表達(dá)，然而HGF的表達(dá)限制于間質(zhì)來源的細(xì)胞。當(dāng)HGF刺激時(shí)，MET刺激癌細(xì)胞的侵襲性生長并且增強(qiáng)它們的轉(zhuǎn)移潛能，主要通過ERK1/2和JNK的增加的磷酸化。磷酸化的JNK激活癌蛋白質(zhì)C-Jun，已知其與其伴侶c_Fos以同二聚體或異二聚體的形式形成激活物蛋白-I(AP-I)轉(zhuǎn)錄因子。HGF/SF及其受體MET的異常表達(dá)通常與多種人惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。由于其對(duì)于惡性腫瘤細(xì)胞的特異性毒性的原因，TRAIL的重組形式是基于細(xì)胞凋亡的抗腫瘤劑。然而，許多人癌細(xì)胞仍然抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但這種抗性的機(jī)制還不清楚。發(fā)明概述本發(fā)明提供了改變細(xì)胞的TRAIL表達(dá)模式的方法，包括抑制能夠表達(dá)c_Jun、miR-221 和 miR-222、PTEN 和 TIMP3 的細(xì)胞的 c-Jun、miR-221 和 miR-222、PTEN 或 TIMP3,和觀察TRAIL表達(dá)模式的改變。還提供了改變細(xì)胞的TRAIL表達(dá)模式的方法，包括過表達(dá)能夠表達(dá)c_Jun、miR-221 和 miR-222、PTEN 和 TIMP3 的細(xì)胞的 c-Jun、miR-221 和 miR-222、PTEN 或 TIMP3,以及觀察TRAIL表達(dá)模式的改變。還提供了鑒定細(xì)胞樣品的TRAIL表達(dá)模式的方法，包括鑒定細(xì)胞樣品的至少兩種核酸的表達(dá)水平，其中所述至少兩種核酸選自miR-221和miR-222以及c-Jun ；miR-221和 miR-222 以及 PTEN ;miR_221、miR-222 和 TIMP3 ；miR-221 和 miR-222、c-Jun 和 PTEN ；miR-221 和 miR-222、PTEN 和 TIMP3 ；以及 miR-221 和 miR-222、c-Jun 和 TIMP30還提供了改變TRAIL抗性細(xì)胞的基因表達(dá)的方法，包括抑制還表達(dá)至少一種選自c-Jun、PTEN和TMP3的核酸的細(xì)胞中的miR-221和miR-222。還提供了改變TRAIL抗性細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法，包括在還表達(dá)至少一種選自c-Jun、PTEN和TMP3的核酸的細(xì)胞中過表達(dá)miR-221和miR-222。還提供了鑒定具有核酸表達(dá)抑制的測(cè)試細(xì)胞的方法，包括將至少一種測(cè)試細(xì)胞與反義miR-221和miR-222接觸，和觀察選自PTEN和TIMP3的核酸的表達(dá)的增加。還提供了預(yù)測(cè)經(jīng)診斷患有癌癥的患者的臨床結(jié)果的方法，包括檢測(cè)獲自患者的癌細(xì)胞樣品的miR-221和miR-222的表達(dá)水平和選自c-Jun、PTEN和HMP3的至少一種核酸的表達(dá)水平，其中相對(duì)于對(duì)照而言，腫瘤樣品中miR-221和miR-222的水平升高至I. 5倍或更高與PTEN或TIMP3表達(dá)的水平降低至2/3或更低的組合預(yù)測(cè)了存活的減少，或其中相對(duì)于對(duì)照而言，腫瘤樣品中miR-221和miR-222的水平升高至I. 5倍或更高與c-Jun表達(dá)水平升高至I. 5倍或更高的組合預(yù)測(cè)了存活的減少。此外，本發(fā)明還提供了抑制表達(dá)miR-221和miR-222以及PTEN的腫瘤細(xì)胞中的PTEN表達(dá)的下調(diào)的方法，包括抑制表達(dá)miR-221和miR-222以及PTEN的腫瘤細(xì)胞中的miR-221和miR-222活性，和觀察PTEN下調(diào)的抑制。優(yōu)選的是如下所述的方法，其中通過反義miR-221和miR-222抑制所述miR-221和miR-222的活性，雖然其中通過TRAIL敏感性觀察PTEN表達(dá)下調(diào)的抑制的方法也是優(yōu)選的，其中通過PTEN轉(zhuǎn)錄分析觀察PTEN表達(dá)下調(diào)的抑制的方法同樣是優(yōu)選的。 在其它實(shí)施方案中，提供了鑒定用于治療TRAIL抗性癌癥的治療劑的方法，包括體外篩選候選試劑以選擇減少TRAIL抗性癌細(xì)胞中的miR-221和miR-222的表達(dá)和增加PTEN的表達(dá)的試劑，從而鑒定用于治療TRAIL抗性癌癥的試劑。還提供了治療具有TRAIL抗性腫瘤的細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用能夠抑制PTEN表達(dá)的下調(diào)的治療劑，所述哺乳動(dòng)物具有TRAIL抗性腫瘤細(xì)胞，如通過miR-221和miR-222的水平升高至I. 5倍或更高與PTEN表達(dá)水平降低至2/3或更低的組合所鑒定的。還提供了用于鑒定測(cè)試細(xì)胞中PTEN的miR-221和miR-222上調(diào)的試劑盒，包括miR-221和miR-222的至少一種分子鑒定物和PTEN的至少一種分子鑒定物，其中所述分子鑒定物選自探針、引物、抗體或小分子。在本文中的任何方法中，優(yōu)選方法利用選自癌細(xì)胞、ITRAIL抗性癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和HCC的細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了改變能夠表達(dá)TMP3以及miR-221和miR-222的細(xì)胞中的TMP3表達(dá)的調(diào)節(jié)的方法，包括改變表達(dá)TMP3和表達(dá)miR-221和miR-222的細(xì)胞中的miR-221和miR-222活性，和觀察TIMP3表達(dá)的改變。還提供了抑制能夠表達(dá)TMP3的細(xì)胞中的TMP3表達(dá)的方法，包括在也表達(dá)TMP3的細(xì)胞中過表達(dá)miR-221和miR-222，和觀察TMP3表達(dá)的抑制。還提供了鑒定具有TMP3表達(dá)抑制的細(xì)胞的方法，包括將測(cè)試細(xì)胞與反義miR-221及miR-222接觸，和觀察TMP3表達(dá)的增加。還提供了鑒定TRAIL抗性細(xì)胞的方法，包括鑒定測(cè)試細(xì)胞樣品是否包含miR-221和miR-222核酸和TMP3核酸。還提供了鑒定用于治療TRAIL抗性癌癥的治療劑的方法，包括體外篩選候選試劑以選擇減少TRAIL抗性癌細(xì)胞中的miR-221和miR-222的表達(dá)并且增加TMP3的表達(dá)的試齊U，從而鑒定用于治療TRAIL抗性癌癥的試劑。還提供了預(yù)測(cè)經(jīng)診斷患有癌癥的患有的臨床結(jié)果的方法，包括檢測(cè)獲自患者的癌細(xì)胞樣品的miR-221、miR-222和TIMP3表達(dá)的水平，其中相對(duì)于對(duì)照而言，腫瘤樣品中miR-221和miR-222的水平升高至I. 5倍或更高與TIMP3表達(dá)的水平降低至2/3或更低的組合預(yù)測(cè)存活的降低。還提供了治療具有TRAIL抗性腫瘤細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的方法,包括給哺乳動(dòng)物施用能夠抑制TMP3表達(dá)的下調(diào)的治療劑，所述哺乳動(dòng)物具有TRAIL抗性腫瘤細(xì)胞，如通過miR-221和miR-222的水平升高至I. 5倍或更高與TIMP3的表達(dá)水平降低至2/3或更低的組合所鑒定。還提供了用于鑒定測(cè)試細(xì)胞中TMP3的miR-221及miR-222上調(diào)的試劑盒，包括miR-221和miR-222的至少一種分子鑒定物和TIMP3的至少一種分子鑒定物，其中所述分子鑒定物選自探針、引物、抗體或小分子。還提供了優(yōu)選方法，其中所述細(xì)胞選自癌細(xì)胞、TRAIL抗性細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞癌細(xì)胞。 還提供了抑制表達(dá)miR-221、miR-222和TMP3的腫瘤細(xì)胞中的TMP3的下調(diào)的方法，包括抑制表達(dá)miR-221、miR-222和TIMP3的腫瘤細(xì)胞中的miR-221和miR-222活性，和觀察TIMP3下調(diào)的抑制。優(yōu)選的是這樣的方法其中所述miR-221和miR-222的活性通過反義miR-221和miR-222抑制，或其中通過TRAIL敏感性觀察TMP3表達(dá)下調(diào)的抑制，或其中通過TMP3翻譯分析來觀察TMP3表達(dá)下調(diào)的抑制。根據(jù)下列參考附圖進(jìn)行的幾個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本公開內(nèi)容的上述和其它性質(zhì)及有利方面將變得更顯然。


專利或申請(qǐng)文件可包括一張或多張彩色附圖和/ 一張或多張照片。具有彩色附圖和/或照片的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開案的拷貝在提出請(qǐng)求和支付必要費(fèi)用后可由專利局提供。圖 1A-1H. PTEN 和 TMP3 為 miR-221 和 miR-222 的靶；圖1A. PTEN和TMP33’ UTR包含一個(gè)預(yù)測(cè)的miR-221和miR-222結(jié)合位點(diǎn)。在圖IA中顯示了 miR-221及222與PTEN和TMP33’ UTR的種子區(qū)域(seed region)的比對(duì)。靶向誘變的位點(diǎn)以紅色標(biāo)示。(圖IA按照出現(xiàn)的順序分別公開了 SEQ ID NO 26-29和26、30,28 和 31)。圖1B.在增強(qiáng)miR-221和miR-222的表達(dá)后MEGOl細(xì)胞的qRT-PCR。圖1C. PTEN和TMP33’ UTR為miR-221和miR-222的靶。將包含野生型(直方圖的左側(cè))或突變的(直方圖的右側(cè))PTEN和TMP33’UTR的pGL3_PTEN和pGL3-TMP3熒光素酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入MEGOl細(xì)胞。針對(duì)轉(zhuǎn)染對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化螢火蟲熒光素酶表達(dá)的相對(duì)抑制。進(jìn)行3次報(bào)道分子測(cè)定，結(jié)果基本上一致。圖1D.增強(qiáng)miR-221和miR-222的表達(dá)后的H460細(xì)胞的qRT-PCR。圖IE. miR-221和miR-222增強(qiáng)的表達(dá)降低H460 NSCLC的PTEN和TMP3蛋白的內(nèi)源水平。用無規(guī)miR或miR-221或miR-222轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞，進(jìn)行72小時(shí)。利用western印跡法測(cè)定PTEN和TMP3的表達(dá)。通過使用抗-P -肌動(dòng)蛋白抗體獲得上樣對(duì)照。圖1F.顯示抗IiR轉(zhuǎn)染后Calu-I細(xì)胞中的miR-221及222下調(diào)的qRT-PCR。圖1G.顯示通過使用抗-miR-221和miR-222下調(diào)miR-221和miR-222后PTEN和TIMP3的表達(dá)的Western印跡?？?miR-221和-222能夠增加Calu-I細(xì)胞系的PTEN和TIMP3表達(dá)。圖1H.在H460細(xì)胞中的miR-221和miR-222增強(qiáng)的表達(dá)后PTEN和TMP3mRNA的qRT-PCR。PTEN 但非 HMP3mRNA 被 miR-221 和 miR-222 下調(diào)。數(shù)據(jù)表示為 SD。圖2A-2B. NSCLC 和 HCC 中 PTEN 和 TMP3 的表達(dá)與 miR-221 和 miR-222 的表達(dá)呈
反相關(guān)。圖2k.使用 15 ii g NSCLC 的總 RNA 和 10 y g HCC 細(xì)胞中的總 RNA 通過 northern印跡分析miR-221和-222的表達(dá)水平。使用從不同的NSCLC和HCC的分離的總蛋白質(zhì)提取物(50 u g)進(jìn)行抗-PTEN和TMP3的Western印跡分析。圖2B.通過如“補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)方法”部分所述從不同NSCLC和HCC提取RNA進(jìn)行miR-221和222和PTEN mRNA的qRT-PCR。miR-221和miR-222與所有不同NSCLC和HCC細(xì)胞中的 PTEN mRNA表達(dá)呈反相關(guān)。數(shù)據(jù)表示為SD。圖3A-3L. PTEN和TMP3在體外和體內(nèi)為HCC的miR-221和miR-222的直接靶。圖3A.顯示miR-221和miR-222過表達(dá)或下調(diào)后Sk-H印I和Snu_387細(xì)胞中的PTEN和TMP3的表達(dá)的Western印跡。miR-221和miR-222能夠下調(diào)Sk-H印I的PTEN和TIMP3表達(dá)；相反地，抗-miR-221和miR-222能夠增加Snu-387細(xì)胞中的PTEN和HMP3表達(dá)。圖3B.關(guān)于22個(gè)肺癌患者和10個(gè)正常肺組織的qRT-PCR。通過使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(r)和各自的P-值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上計(jì)算正常組的10個(gè)受試者和腫瘤組的22個(gè)受試者的miR-221/222與PTEN mRNA之間的相關(guān)性，在p0. 05下全都是顯著的。皮爾遜相關(guān)性顯示正常和腫瘤樣品的miR-221、-222與PTEN mRNA之間的反相關(guān)性。圖3C.關(guān)于肝細(xì)胞癌和正常肝組織樣品的IHC和ISH。肝癌和相鄰正常/硬化肝組織中的miR-221/222 (藍(lán)色)與PTEN/TMP3 (紅色)表達(dá)呈反相關(guān)。通過原位雜交，然后進(jìn)行PTEN和TIMP3的免疫組織化學(xué)來分析這些組織的miR-221和miR-222表達(dá)。肝癌細(xì)胞大量表達(dá)miR-221/222并且極少表達(dá)PTEN或TMP3 (圖3G、3H、3K、3L)，而相鄰非惡性腫瘤肝大量表達(dá)PTEN或TMP3并且極少具有可檢測(cè)的miR-221/222 (圖3A、3B、3E、3F)。在其miR-221/222和TMP3的表達(dá)都顯著的肝細(xì)胞癌的情況下，表達(dá)miR-221 (大箭頭，圖3K ；TIMP3由圖3L中的箭頭描述)的癌細(xì)胞與表達(dá)TMP3的細(xì)胞(圖3K，小箭頭)不同。圖3C-3I、3H及3E ；3D-3J ;在肝中不表達(dá)的miR-302用作陰性對(duì)照。分析了 80個(gè)人的HCC。比例尺寸表示25m。圖4A-4E. miR-221 和 miR-222 通過靶向 PTEN 和 TMP3 誘導(dǎo) NSCLC 和 HCC 的 TRAIL抗性。圖4A.關(guān)于5種不同HCC的增殖測(cè)定。將細(xì)胞與Super-KiIler-TRAIL (400ng/ml)一起溫育24小時(shí)，如補(bǔ)充方法中所述，評(píng)估存活率。具有低miR-221和-222表達(dá)的Huh7、HepG2和Sk-H印I與高度表達(dá)miR-221/222的PLC/PLF-5和Snu-387相比較，對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更敏感。以一式三份重復(fù)4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均SD。圖4B. miR-221/222增強(qiáng)的表達(dá)和PTEN或TMP3下調(diào)后Sk-H印I細(xì)胞的細(xì)胞死亡效應(yīng)。用對(duì)照miR或用pre-miR-221-222轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用Super-KillerTRAIL處理細(xì)胞24小時(shí)。利用Annexin-FITC或(圖4C)利用胱天蛋白酶-Glo 3/7試劑盒估計(jì)細(xì)胞凋亡。在miR-221/222過表達(dá)或PTEN和TMP3下調(diào)后TRAIL抗性增強(qiáng)。圖4D. miR-221/222對(duì)細(xì)胞死亡的作用。用對(duì)照siRNA或?qū)φ誱iR或用IOOnmol的PTEN和TMP3siRNA轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞。從感染48小時(shí)后，用Super-Killer TRAIL處理細(xì)胞24小時(shí)。通過胱天蛋白酶3/7活性(圖4E)或Annexin-V評(píng)估細(xì)胞凋亡。PTEN和TMP3下調(diào)后凋亡細(xì)胞的百分比下降。誤差棒表示SD。通過t檢驗(yàn)，*p〈0. 05, * * p〈0. 001。圖5A-5G.抗-miR-221 和 miR-222 通過抑制 AKT 途徑使 NSCLC 和 HCC 的 TRAIL 抗性無效。(圖5A-5C)miR-221/222 增強(qiáng)的表達(dá)后 H460 細(xì)胞的 Western 印跡。miR-221 和miR-222增強(qiáng)的表達(dá)誘導(dǎo)AKT/ERK途徑和金屬肽酶的激活。圖5B. miR-221 和 miR-222 被抗-miR-221/222 敲低后 Snu-387 細(xì)胞的 Western 印跡。AKT途徑的抑制顯示為miR-221和miR-222下調(diào)的結(jié)果。
圖OT-5E. PTEN或TMP3敲低后的Western印跡。Erk磷酸化和PAKl激活都是PTEN和TMP3依賴性的。AKT途徑的激活是PTEN依賴性的，而TMP3沉默誘導(dǎo)金屬肽酶的表達(dá)。圖5F-5G.抗-miR和API2/曲西立濱對(duì)AKT途徑的抑制對(duì)細(xì)胞死亡的作用。用抗-miR221/222轉(zhuǎn)染Calu-I和Snu-387細(xì)胞72h小時(shí)，或用API2/曲西立濱處理細(xì)胞48小時(shí)。miR-221和miR-222的下調(diào)和/或Akt途徑的抑制誘導(dǎo)Calu-I和Snu-387細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡百分比的增加，如通過胱天蛋白酶3/7活性所評(píng)估。誤差棒表示SD。通過t檢驗(yàn)，* * p〈0. 001。圖6A-6D. miR-221和miR-222的異位表達(dá)影響H460的細(xì)胞周期分布和遷移/侵
襲能力。圖 6A.利用無規(guī) pre-miR、miR-221 和 miR-222、無規(guī) siRNA、siRNA PTEN 轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞的流式細(xì)胞分布(Flow cytometric distributions)。轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞顯示作為PTEN下調(diào)的結(jié)果，Gl的減少和S和G2-M期的相應(yīng)增加。圖6B-6C. miR-221和miR-222調(diào)節(jié)H460細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力。如“實(shí)驗(yàn)方法”中所述進(jìn)行遷移測(cè)定。圖6D. miR-221和miR-222影響H460和Sk-H印I細(xì)胞的侵襲能力。直方圖報(bào)告了在用陰性對(duì)照miRNA、miR-221、miR-222、siPTEN和siTMP3轉(zhuǎn)染后，侵襲通過Matrigel涂覆的膜的細(xì)胞的百分比。進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)以測(cè)試侵襲值的平均值之間的差異。將薛費(fèi)氏多重比較法(Scheffe’ multiple-comparison method)用于測(cè)試每一對(duì)平均值之間的差異。在無規(guī)miR對(duì)miR-221和miR_222、PTEN和HMP3轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞之間發(fā)現(xiàn)顯著差異(p-值0. 001)。使用Bonferroni和Sidak法獲得了相同的結(jié)果。誤差棒表示SD0通過t檢驗(yàn)，*p〈0. 001。比例尺表示25m。放大倍數(shù)對(duì)于所有圖框都是相同的。圖7A-7M. MET癌基因調(diào)節(jié)miR-221和miR-222的激活。(圖7A-7B-7C).在用 miR 對(duì)照和 siRNA MET 轉(zhuǎn)染后，Calu-l、Snu_387 和 GTL16 中miR-221和miR-222的相對(duì)表達(dá)水平。MET敲低后，miR-221和miR-222的表達(dá)減少。圖7D-7E-7F. siRNA MET 轉(zhuǎn)染后 Calu-1、Snu-387 和 GTL16 細(xì)胞的 Western 印跡分析。MET的敲低降低miR-221和miR-222的表達(dá)水平，在所有不同細(xì)胞系中產(chǎn)生PTEN和TIMP3的上調(diào)。用4 ii M的MET抑制劑SUl 1274再處理GTL16細(xì)胞24小時(shí)。MET抑制增加miR-221和miR-222的靶的表達(dá)水平。圖7G-7H-7I.通過使用2種不同的跨越miR-221/222轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的擴(kuò)增子鑒定c-Jun (AP-I)相互作用區(qū)域。利用來自H460c-Jun陰性細(xì)胞、Calu-I和Snu_387c-Jun陽性細(xì)胞的染色質(zhì)進(jìn)行ChIP分析。BS=結(jié)合位點(diǎn)。圖7J.利用茴香霉素(IOM)處理30分鐘后，Huh7細(xì)胞中的miR-221和miR-222的qRT-PCR。茴香霉素誘導(dǎo)miR-221和miR-222的上調(diào)。圖7K.茴香霉素在Huh7細(xì)胞中誘導(dǎo)c-Jun的激活以及PTEN和TMP3的下調(diào)。使用抗-PTEN和抗-HMP3抗體通過western印跡分析總裂解物。誤差棒表示SD。圖8. MET通過AP-I (c-Jun)轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)miR-221和miR-222的激活。已報(bào)導(dǎo)了這樣的模型，在所述模型中，生長因子決定c-Met的激活，這繼而通過AP-I并從而通過miR-221和miR-222的上調(diào)，產(chǎn)生PTEN和TMP3的下調(diào)和隨后細(xì)胞凋亡抗性、細(xì)胞遷移和侵 襲。圖9A-9H.肺癌和相鄰良性組織的miR-221/222和PTEN/HMP3的IHC和ISH。miR-221/222 (藍(lán)色)與PTEN/TMP3 (紅色)表達(dá)在肺癌和相鄰正常肺組織中呈反相關(guān)。如“補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)方法”中所述，通過原位雜交分析這些組織中的miR-221和miR-222的表達(dá)，然后通過免疫組織化學(xué)分析PTEN和TIMP3的表達(dá)。大部分癌細(xì)胞對(duì)于miR-221和miR-222呈陽性并且對(duì)于PTEN(圖9F-9G)和TMP3(圖91-9J)呈陰性。相反地，正常細(xì)胞對(duì)于miR-221/222 (圖9A-9B-9D-9E)呈陰性并且對(duì)于PTEN和TMP3呈陽性。注意，在幾種癌癥中(圖91和9J)，miR-221/222的表達(dá)通過TMP3的表達(dá)來證明；然而miRNA的表達(dá)在癌細(xì)胞中是明顯的并且TMP3的表達(dá)在促結(jié)締組織增生型組織的周圍細(xì)胞中是明顯的。圖9C-9H. H&E-小箭頭miR_221-222，大箭頭HMP3。分析了 92個(gè)人肺癌。圖9K-9L.肺的miRNA_221/222表達(dá)和組織學(xué)的相關(guān)性。miR-221和-222在肺的鱗狀細(xì)胞癌中顯示等同的分布模式。圖9K顯示正在浸潤相鄰纖維變性肺組織的腫瘤細(xì)胞巢(nests of tumor cell)中的強(qiáng)信號(hào)(大箭頭)。注意，信號(hào)顯示癌細(xì)胞中基于細(xì)胞質(zhì)和核膜的定位(圖9L，更高的放大倍數(shù))。相比之下，只有極少良性細(xì)胞在相鄰纖維變性組織(小箭頭)中表達(dá)miR-222，所述相鄰纖維變性組織被癌細(xì)胞侵入。比例尺表示25m。圖10A-10B. miR-221 和 miR-222 上調(diào)或 PTEN/TMP3 敲低后 H印G2 和 Huh7 細(xì)胞中的胱天蛋白酶3/7活性。為了進(jìn)行胱天蛋白酶3/7活性檢測(cè)，將細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，用IOOnM miR-221和miR-222轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞72小時(shí)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用400ng/ml的TRAIL處理細(xì)胞24小時(shí)，按照制造商的說明書使用胱天蛋白酶-Glo 3/7測(cè)定試劑盒進(jìn)行分析。在miR-221和miR-222增強(qiáng)的表達(dá)或PTEN/HMP3下調(diào)后，IfepG2和Huh7細(xì)胞變得抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。數(shù)據(jù)表示為土SD。圖11A-11C. TIMP3的過表達(dá)誘導(dǎo)Calu-ITRAIL抗性細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。圖11A. PTEN、TIMP3和PTEN/TMP3上調(diào)后Calu-I細(xì)胞的胱天蛋白酶3/7活性。將細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，用PTEN、TIMP3或兩者轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞72小時(shí)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用400ng/ml的TRAIL處理細(xì)胞24小時(shí)，按照制造商的說明書使用胱天蛋白酶-Glo 3/7測(cè)定試劑盒進(jìn)行分析。在PTEN、TMP3或PTEN/TMP3過表達(dá)后，Calu-I細(xì)胞變得對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。圖I IB. PTEN和TMP3對(duì)細(xì)胞死亡的作用。用PTEN和TMP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Calu-I細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用400ng/ml的Super-Killer TRAIL處理細(xì)胞24小時(shí)。通過Annexin-V評(píng)估細(xì)胞凋亡。凋亡細(xì)胞的百分比在PTEN和TMP3上調(diào)后增加。圖11C. TIMP3過表達(dá)后Calu-I細(xì)胞的Western印跡。將50微克的總提取物加載至SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上，用指明的抗體對(duì)膜進(jìn)行印跡。TMP3的過表達(dá)激活外部和內(nèi)部細(xì)胞凋亡途徑。誤差棒表示SD。通過t檢驗(yàn)，* p〈0. 001。圖12A12G. PTEN和TMP3沉默在體內(nèi)對(duì)H460細(xì)胞的致瘤性的作用。圖12A-12B.顯示shPTEN和shTMP3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后H460異種移植物的PTEN和TMP3表達(dá)的Western印跡。注射后35天,處死小鼠,通過western印跡分析腫瘤。圖12C-12D.在裸小鼠注射后35天，在利用媒介物(PBS)或TRAIL處理后，sh對(duì)照、shPTEN和shTMP3的H460細(xì)胞中的腫瘤移植物尺寸的比較。PTEN和TMP3的敲低在體內(nèi)增加TRAIL抗性。圖像顯示來自每一個(gè)類別的5個(gè)腫瘤的平均大小的腫瘤。
圖12E-12F-12G.利用以sh對(duì)照、sh PTEN和shTMP3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞注射的裸小鼠的植入的腫瘤的生長曲線。數(shù)據(jù)表示為SD。0.001。圖13A-13B. miR-221和miR-222的異位表達(dá)影響Sk-H印I細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和遷移/侵襲能力。圖13A.用空載體、miR-221和miR-222、siRNA PTEN轉(zhuǎn)染的Sk-H印I細(xì)胞的流式細(xì)胞分布。報(bào)告3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖13B. miR-221和miR-222調(diào)節(jié)Sk-H印I細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力。將具有8- y m多孔膜的Transwell插入小室用于測(cè)定。轉(zhuǎn)染后，用PBS洗滌細(xì)胞，將150，000個(gè)細(xì)胞添加至頂部小室中的無血清培養(yǎng)基中。底部小室充滿含有10%FBS的培養(yǎng)基。為了定量遷移的細(xì)胞，使用棉簽(cotton-tipped swab)除去頂部小室上的細(xì)胞,將遷移的細(xì)胞固定在PBS, 25%戍二醛中，然后使用結(jié)晶紫染色。對(duì)4個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。比例尺表示25m。放大倍數(shù)對(duì)于所有圖框都是相同的。圖14A-14B. 2’-0_me-抗-mR_221&222 減弱 Calu-I 和 Snu-387 細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲能力。圖14A.將具有8 iim多孔膜的Transwell插入小室用于測(cè)定。轉(zhuǎn)染后，用PBS洗滌細(xì)胞，將50，000個(gè)細(xì)胞添加至頂部小室中的無血清培養(yǎng)基中。底部小室充滿含有10%FBS的培養(yǎng)基。為了定量遷移的細(xì)胞，使用棉簽除去頂部小室上的細(xì)胞，將遷移的細(xì)胞固定在PBS, 25%戊二醛中，然后使用結(jié)晶紫染色。對(duì)5個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。miR-2221及222敲低減少Calu-I和Snu-387細(xì)胞的遷移。圖14B. miR-221和miR-222影響Calu-I和Snu-387細(xì)胞的侵襲能力。直方圖報(bào)告用陰性對(duì)照miRNA、抗-miR-221或抗-miR-222轉(zhuǎn)染后，侵襲通過Matrigel涂覆的膜的細(xì)胞的百分比。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)獨(dú)立測(cè)定的土SD。比例尺表示25m。圖15A-15F. c-Jun結(jié)合決定其激活的miR-221/222啟動(dòng)子。圖15A.在通過使用MET抑制劑SU11274進(jìn)行MET抑制后，GTL-16細(xì)胞的qRT-PCR。與未處理的細(xì)胞相比較，miR-221&222被下調(diào)約40%。圖15B. 4個(gè)不同細(xì)胞系的c-Jun和c Fos的表達(dá)水平。將50 y g的總裂解物加載至12%聚丙烯酰胺凝膠上。Calu-I和Snu-387顯示高c-Jun表達(dá)，Huh7顯示低表達(dá)水平，在H460中，c-Jun表達(dá)不存在。c-Fos表達(dá)水平在Calu-I細(xì)胞中非常高，在所有其它細(xì)胞系中較低。圖15C. MET、c-Jun 和 c-Fos 下調(diào)后，Calu-I 細(xì)胞的 qRT-PCR 在 10 ii I PCR 中使用總共5ng的RNA。使用來自合成lin-4miRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線將TaqMan A CT值轉(zhuǎn)變成絕對(duì)拷貝數(shù)。數(shù)據(jù)表示為與U44和U48rRNA相比較的不同miR的相對(duì)表達(dá)。miR-221和miR-222在MET和c-Jun但非c-Fos被siRNA敲低后下調(diào)，這表明c-Jun是負(fù)責(zé)miR-221和miR-222激活的轉(zhuǎn)錄因子。圖15D-15E.在用具有miR-221 和 miR-222 啟動(dòng)子的不同位點(diǎn)(_150、-600、-1000)的報(bào)告質(zhì)粒和siRNA MET、siRNA c-Jun、siRNA c_Fos共轉(zhuǎn)染后Calu-I細(xì)胞的熒光素酶測(cè)定。MET和c-Jun siRNA但非c_Fos siRNA能夠降低miR-221和miR-222熒光素酶活性。圖15F. c-Met和c-Jun沉默后的Western印跡。MET敲低減少JNK1/2的磷酸化。c-Jun沉默產(chǎn)生增加的PTEN和TMP3的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為土SD。圖16A-16H. PTEN、TIMP3和MET共標(biāo)記。對(duì)72個(gè)肺腫瘤樣品進(jìn)行IHC和ISH。圖16A.單獨(dú)的c-Met的IHC (棕色)。圖16B.單獨(dú)的TMP3 (紅色)。圖16C.肺癌中的c_Met/HMP3共標(biāo)記。圖16D.通過蘇木素復(fù)染(Hematoxylin Counterstain)顯示的細(xì)胞核。c_Met僅在癌細(xì)胞(大箭頭)中表達(dá)，而TIMP3在周圍的良性細(xì)胞(小箭頭)中表達(dá)。注意，當(dāng)c-MET存在時(shí)，TIMP3不存在，并且反之亦然。
圖16E. c-Met (紅色)和TMP3(棕色)在肝細(xì)胞癌(分析了 60個(gè)腫瘤樣品)中的共定位。注意,腫瘤細(xì)胞表達(dá)c-Met并且HMP3表達(dá)不明顯。圖框還顯示癌癥的蘇木素染色特征，特征在于促結(jié)締組織增生型間質(zhì)中的多個(gè)侵入巢(invasive nest)。圖16F.利用配色系統(tǒng)(Nuance system)分析相同視野,突光紅代表c_Met,突光黃代表TMP3，熒光綠代表被c-Met和TMP3共標(biāo)記的細(xì)胞。很明顯，沒有癌細(xì)胞被c-Met和TIMP3共標(biāo)記。圖16G. c-Met和PTEN在肺癌中的共定位。c_Met染色(紅色)顯示c_Met在癌細(xì)胞中的常見細(xì)胞膜模式(大箭頭)。與其相鄰的是間質(zhì)，良性成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)PTEN (棕色-小箭頭)但不表達(dá)cMET。圖16H. H&E-比例尺表示25m。放大倍數(shù)對(duì)于所有圖框都是相同的。圖17A-17E. MET沉默減少Calu-I和Snu-387細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲并且在體內(nèi)增強(qiáng)TRAIL敏感性。圖17A.將具有8-iim多孔膜的Transwell插入小室用于遷移測(cè)定。在用PBS洗滌轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，將50000個(gè)細(xì)胞添加至頂部小室中的無血清培養(yǎng)基中。底部小室充滿包含10%FBS的培養(yǎng)基。為了定量遷移的細(xì)胞，通過使用棉簽除去頂部小室上的細(xì)胞，將遷移的細(xì)胞固定在PBS，25%戊二醛中，然后使用結(jié)晶紫染色。對(duì)5個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖17B. MET影響Calu-I和Snu-387細(xì)胞的侵襲能力。直方圖報(bào)告用siRNA陰性對(duì)照或siRNA MET轉(zhuǎn)染后侵入通過Matrigel涂覆的膜的細(xì)胞的百分比。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)獨(dú)立測(cè)定的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖17C.顯示shMET穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Calu-I異種移植物的MET表達(dá)的Western印跡。注射后35天,處死小鼠,通過western印跡分析腫瘤。
圖17D-17E.利用以sh對(duì)照和shMET穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Calu-I細(xì)胞注射的裸小鼠的植入的腫瘤的生長曲線。數(shù)據(jù)表示為SD。0.01。比例尺表示25m。放大倍數(shù)對(duì)于所有圖框都相同。序列表本申請(qǐng)包含已通過EFS-web提交并且通過弓I用整體并入本文的序列表。2010年11月 22 日創(chuàng)建的 ASCII 拷貝稱為 604_51413_SEQLIST_0SU-10076. txt，大小為 7，374 字節(jié)。使用如37C. F. R. I. 822中定義的核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸的3字母代碼顯示所述序列表中所列的核酸和氨基酸序列。只顯示每一個(gè)核酸序列的一條鏈，但通過對(duì)顯示的鏈的任何制成，互補(bǔ)鏈理解為包括在其中。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了 miR-221和miR-222的激活至少部分受MET癌基因和c-Jun轉(zhuǎn)錄因 子調(diào)節(jié)，并且這繼而下調(diào)PTEN和TMP3。MET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活是在肝癌和肺癌發(fā)展中觀察到的常見遺傳事件。AP-I是二聚堿性區(qū)域-亮氨酸拉鏈蛋白的復(fù)合物，屬于Jun(c-Jun、JunB> JunD)、Fos(c_Fos、FosB、Fra-I和Fra-2)、Maf和ATF亞家族。c-Jun是其組中效力最高的轉(zhuǎn)錄激活子，其轉(zhuǎn)錄活性被JunB減弱以及有時(shí)被其拮抗。不能同源二聚化的Fos蛋白與Jun蛋白形成穩(wěn)定的異二聚體，從而增強(qiáng)它們的DNA結(jié)合活性。本發(fā)明人著眼于這兩個(gè)AP-I亞家族，特別地著眼于c-Jun和c-Fos，雖然他們通過生物信息學(xué)研究(TESS數(shù)據(jù)庫)發(fā)現(xiàn)ATF-I和JunD也可以是參與miR-221和miR-222激活的潛在轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明顯示c-Jun而非c-Fos參與miR-221和miR-222激活以及c-Jun在miR-221/222啟動(dòng)子區(qū)域具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。AP-I的誘導(dǎo)主要由JNK級(jí)聯(lián)介導(dǎo)。通過使用茴香霉素，激活JNK級(jí)聯(lián)的抗生素，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)作為c-Jun磷酸化的結(jié)果，Huh7肝癌細(xì)胞的miR-221/222表達(dá)增加。有趣地，當(dāng)本發(fā)明人在無血清培養(yǎng)基中生長Huh7細(xì)胞時(shí)，他們未觀察到miR-221和miR-222或PTEN和TMP3的表達(dá)水平的任何變化，從而顯示MET激活對(duì)于miR-221和miR-222轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和隨后的細(xì)胞遷移具有重要意義。為了解決該問題，本發(fā)明人研究了 MET沉默后Calu-I和Snu-387細(xì)胞的遷移和侵襲。兩種細(xì)胞系的遷移和侵襲能力在MET癌基因沉默后下降(圖17A-17B)。此外，其中通過使用shMET質(zhì)粒(圖17C)使c_Met沉默的Calu-I細(xì)胞的異種移植物模型顯示，用Calu-I shMET細(xì)胞注射的小鼠與用sh對(duì)照注射的小鼠相比較，對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更敏感(圖17D-17E)。因此，與對(duì)照腫瘤相比較，MET在體內(nèi)不僅賦予超過對(duì)照腫瘤的腫瘤生長有利方面而且還賦予超過對(duì)照腫瘤的對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抗性。因此，MET癌基因調(diào)節(jié)miR-221和miR-222的水平，從而通過c-Jun轉(zhuǎn)錄因子和JNK激活調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲和遷移(圖8)。綜合起來，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了 miR-221和miR-222籍以促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，其中涉及MET。因此靶向MET受體和/或miR-221和miR-222以使NSCLC和HCC對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡致敏而且防止和抑制肺癌和肝細(xì)胞癌的方法包括在本發(fā)明中。在本發(fā)明中，存在在一大組NSCLC和HCC衍生的細(xì)胞系中介導(dǎo)miR-221和miR-222的調(diào)節(jié)的已鑒定的主要mRNA靶和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示NSCLC和HCC中miR-221和miR-222的升高的水平與PTEN和TIMP3下調(diào)相關(guān)，從而表明這兩種microRNA是這些類型的癌癥的PTEN和TIMP3的下調(diào)的誘因。本發(fā)明人檢查了 miR-221和miR-222及其靶對(duì)細(xì)胞存活和TRIL抗性的作用。有趣地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在miR-221/222增強(qiáng)的表達(dá)或PTEN和TMP3的下調(diào)后，TRAIL敏感性NSCLC和HCC細(xì)胞變得抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，雖然PTEN的下調(diào)比TMP3的下調(diào)略微更有效。本發(fā)明提供了影響miR-221和miR222表達(dá)的方法，因?yàn)楝F(xiàn)已證明miR-221和miR-222表達(dá)是TRAIL抗性的NSCLC和HCC細(xì)胞的“前提”。重要地，基于miR-221/222表達(dá)水平的腫瘤分層(tumor stratification)可在NSCLC和HCC的治療中用作預(yù)測(cè)TRAIL敏感性或TRAIL抗性的診斷工具。本發(fā)明還公開了 miR-221和miR-222阻斷PTEN表達(dá)，從而導(dǎo)致AKT途徑的激活，這顯示miR-221和miR-222通過靶向PTEN/AKT途徑在細(xì)胞生長和侵襲中起著重要作用。在這一點(diǎn)上，細(xì)胞周期分析證明細(xì)胞生長的增加與Gl至S的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，這與PTEN以及還 有p27kipl (G1/S細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的已知調(diào)節(jié)劑和PTEN的下游效應(yīng)物)的調(diào)節(jié)一致。過表達(dá)miR-221和miR-222的NSCLC和HCC細(xì)胞不僅抗TRAIL而且它們與表達(dá)較低水平的miR-221和miR-222的細(xì)胞相比還顯示較遷移和侵襲能力的增強(qiáng)。此外，本文中還顯示miR-221和miR-222通過直接抑制PTEN和TMP3表達(dá)和抑制牽涉AKT和ERK磷酸化的下游途徑以及激活MMP-3和MMP-9來促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲和生長。此外，H460腫瘤異種移植物中PTEN和TMP3的丟失在體內(nèi)不僅賦予超過對(duì)照腫瘤的腫瘤生長有利方面而且還賦予超過對(duì)照腫瘤的對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抗性。有趣地，TMP3敲低腫瘤比對(duì)照腫瘤形成更多的血管，突顯了其在血管生成和腫瘤形成中的作用。miR-221和miR-222在體外和體內(nèi)作為NSCLC和HCC的腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的重要調(diào)節(jié)劑的鑒定為這些miRNA在肝癌和肺癌發(fā)生以及腫瘤行為中的作用提供了見解。檢查了 miR-221和miR-222及其靶對(duì)細(xì)胞存活和TRAIL抗性的作用。有趣地，在miR-221/222增強(qiáng)的表達(dá)或PTEN和TMP3下調(diào)后，TRAIL-敏感性NSCLC和HCC細(xì)胞變得對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抗性，雖然PTEN的下調(diào)比TMP3的下調(diào)略微更有效。這表明miR-221及222的過表達(dá)是TRAIL抗性的NSCLC和HCC細(xì)胞的“前提”。重要地，基于miR-221/222表達(dá)水平的腫瘤分層可以在NSCLC和HCC的治療中用作預(yù)測(cè)TRAIL-敏感性或TRAIL抗性的預(yù)后工具。DNA 脫氧核糖核酸HCC 肝細(xì)胞癌IL 白細(xì)胞介素ISH原位雜交miR MicroRNAmiRNA MicroRNAmRNA 信使 RNAPCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pre-miRNA 前體 microRNA
qRT-PCR定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RNA 核糖核酸siRNA 小干擾 RNAsnRNA 小核 RNASVM 支持向量機(jī)(Support vector machine)術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解，上述一般描述和下列詳細(xì)描述都僅僅是示例性的和解釋性的，并且無意限定本教導(dǎo)的范圍。在本申請(qǐng)中，除非另外明確地指出，否則單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。權(quán)利要求和/或說明書中單詞“一個(gè)/種(a) ”或“一個(gè)/種(an) ”與術(shù)語“包含” 結(jié)合的使用可表示“一個(gè)”，但其還與“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或超過一個(gè)”的含
意一致。同樣地，“包含”、“含有”和“包括”以及這些根詞的修飾例如但不限于“包括”、“包含的”和“包括”的使用無意是限定的。術(shù)語“和/或”意指之前和之后的術(shù)語可合在一起或分開。為了舉例說明的目的，但非作為限定，“X和/或V，可表示“X”或“Y”或“X和Y”。應(yīng)理解，miRNA來源于基因組序列或基因。在這方面，術(shù)語“基因”用于簡單地指編碼給定的miRNA的前體miRNA的基因組序列。然而，本發(fā)明的實(shí)施方案可包括參與其表達(dá)的miRNA的基因組序列，例如啟動(dòng)子或其它調(diào)控序列。術(shù)語“miRNA”通常是指單鏈分子，但在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的分子還可包括這樣的區(qū)域或另外的鏈，所述區(qū)域或另外的鏈與相同單鏈分子的另一個(gè)區(qū)域或另一個(gè)核酸部分地(整個(gè)鏈長度的10至50%的互補(bǔ))、大體上(超過整個(gè)鏈長度的50%但低于100%的互補(bǔ))或完全互補(bǔ)。因此，核酸可包括分子，所述分子包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)或自身互補(bǔ)鏈或包含分子的特定序列的“互補(bǔ)物”。例如，前體miRNA可具有自身互補(bǔ)區(qū)，其為至多100%互補(bǔ)的miRNA，本發(fā)明的探針可與其靶具有至少60、65、70、75、80、85、90、95或100%的互補(bǔ)性。如本文中所用，術(shù)語“其組合”是指在該術(shù)語前所列的項(xiàng)目的所有排列和組合。例如，“A、B、C或其組合”意指包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC的至少一個(gè)，并且如果順序在特定上下文中是重要的話，還包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。除非另外指出，否則按照常規(guī)使用使用技術(shù)術(shù)語。分子生物學(xué)中的常用術(shù)語的定義可以見于 Benjamin Lewin, Genes V,由 Oxford University Press 出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew 等人(eds. ), The Encyclopedia of MolecularBiology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和 RobertA. Meyers(ed. ), Molecular Biology and Biotechnologya Comprehensive DeskReference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)。為了幫助綜述本公開內(nèi)容的各個(gè)實(shí)施方案，提供特定術(shù)語的下列解釋輔助治療(Adjunctive therapy):與主要治療一起使用以改善主要治療的效果的治療。例如，經(jīng)診斷患有HCC的患者可經(jīng)歷肝切除術(shù)(作為主要治療)以及反義miR-221和miR-222治療(作為輔助治療)。候選者如本文中所用，治療的“候選者”是具有TRAIL抗性的TRAIL表達(dá)模式的患者。
臨床結(jié)果是指在疾病或障礙例如HCC的治療后或在治療不存在的情況下患者的健康狀態(tài)。臨床結(jié)果包括但不限于直至死亡的時(shí)間長度的增加、直至死亡的時(shí)間長度的減少、存活機(jī)會(huì)的增加、死亡、存活、無疾病存活、慢性疾病、轉(zhuǎn)移、晚期或侵襲性疾病、疾病復(fù)發(fā)、死亡的風(fēng)險(xiǎn)的增加以及對(duì)治療的有利或不良反應(yīng)。對(duì)照“對(duì)照”是指用于與實(shí)驗(yàn)樣品例如獲自患有TRAIL抗性的癌癥的患者的腫瘤樣品比較的樣品或標(biāo)準(zhǔn)物。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是獲自健康患者的肝樣品或獲自經(jīng)診斷患有HCC的患者的非癌細(xì)胞組織樣品。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是病歷對(duì)照(historicalcontrol)或標(biāo)準(zhǔn)值(即，先前測(cè)試的對(duì)照樣品或代表基線或正常值的組，例如非癌性組織中的Trail表達(dá)模式水平)。細(xì)胞因子由許多影響其它細(xì)胞的行為的造血和非造血細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子對(duì)于先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答都是非常重要的。存活的減少如本文中所用，“存活的減少”是指在患者死亡之前時(shí)間長度的減少，或患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加。 檢測(cè)表達(dá)的水平例如，“檢測(cè)miR-221和miR-222表達(dá)的水平”是指定量存在于樣品中的miR-221和miR-222的量。檢測(cè)miR-221和miR-222或任何microRNA的表達(dá)可使用本領(lǐng)域中已知的或本文中描述的任何方法例如利用qRT-PCR來實(shí)現(xiàn)。檢測(cè)miR-221和miR-222的表達(dá)包括檢測(cè)miR-221和miR-222的成熟形式或與miR-221和miR-222表達(dá)相關(guān)聯(lián)的前體形式的表達(dá)。通常，miRNA檢測(cè)法包括例如利用RT-PCR的序列特異性檢測(cè)。miR-221和miR-222特異性引物和探針可使用前體以及成熟miR-221和miR-222核酸序列來設(shè)計(jì)，所述序列在本領(lǐng)域是公知的并且包括不改變序列的功能的修飾。肝細(xì)胞癌(HCC) =HCC是通常在具有因病毒性肝炎、肝毒素或肝硬化(通常由酒精中毒引起的)導(dǎo)致的炎癥性肝的患者中發(fā)生的肝的原發(fā)性惡性腫瘤。MicroRNA (miRNA, miR):調(diào)節(jié)基因表達(dá)的單鏈RNA分子。MicroRNA在長度上通常為21-23個(gè)核苷酸。McroRNA從被稱為pri-miRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工成稱為前體(pre) -miRNA的短莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，最終被加工成功能性成熟microRNA。成熟microRNA分子與一個(gè)或多個(gè)信使RNA分子部分互補(bǔ)，并且其主要功能是下調(diào)基因表達(dá)。MicroRNA通過RNAi途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miR-221和miR-222表達(dá):如本文中所用，“低miR-221和miR-222表達(dá)”和“高miR-miR-221和miR-222表達(dá)”是指在樣品例如健康或HCC肝樣品中發(fā)現(xiàn)的miR-221和miR-222的水平的相對(duì)術(shù)語。在一些實(shí)施方案中，低和高miR-221和miR-222表達(dá)通過比較一組非癌性肝樣品和HCC肝樣品的miR-221和miR-222水平來確定。隨后可基于樣品的miR-221和miR-222的表達(dá)是高于(高)還是低于(低)平均值或中位miR-221和miR-222表達(dá)水平來將低和高表達(dá)賦予每一個(gè)樣品。對(duì)于單個(gè)樣品，可通過將樣品與已知具有高或低表達(dá)的對(duì)照或參照樣品比較，或通過與標(biāo)準(zhǔn)值比較來確定高或低miR-221和miR-222表達(dá)。低和高miR-221和miR-222表達(dá)可包括miR-221和miR-222的前體或成熟形式或這兩種形式的表達(dá)?；颊呷绫疚闹兴茫g(shù)語“患者”包括人和非人動(dòng)物。進(jìn)行治療的優(yōu)選患者是人。“患者”或“受試者”在本文中可互換使用。藥學(xué)上可接受的媒介物本公開內(nèi)容中使用的藥學(xué)上可接受的載體(媒介物)是常規(guī)的° Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack PublishingCo. , Easton, PA,第15版(1975)，描述了適用于一種或多種治療性化合物、分子或試劑的藥物遞送的組合物和制劑。通常，載體的性質(zhì)將取決于將應(yīng)用的具體施用模式。例如，胃腸外制劑通常包含可注射液體，所述液體包含藥學(xué)上和生理上可接受的液體例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、含水葡萄糖、甘油等作為媒介物。對(duì)于固體組合物(例如，粉劑、丸劑、片劑或膠囊形式)，常規(guī)非毒性固體載體可包括例如藥物級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除生物學(xué)中性載體外，待施用的藥物組合物可包含少量非毒性輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑和PH緩沖劑等，例如醋酸鹽或山梨醇酐單月桂酸酯(sorbitan monolaurate)。預(yù)防、治療或緩解疾病“預(yù)防”疾病(例如HCC)是指抑制疾病的完全發(fā)生?！爸委煛笔侵冈诩膊』虿±頎顩r已開始發(fā)生后緩解其體征或癥狀的治療性干預(yù)?！熬徑狻笔侵讣膊〉捏w征或癥狀的數(shù)目或嚴(yán)重度的減輕。
篩選如本文中所用，“篩選”是指用于評(píng)估和鑒定影響TRAIL表達(dá)模式的候選試劑的方法。在一些情況下，篩選包括將候選試劑(例如抗體、小分子或細(xì)胞因子)與TRAIL抗性癌細(xì)胞接觸和測(cè)試所述試劑對(duì)TRAIL表達(dá)模式的影響。microRNA的表達(dá)可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的和本文中描述的許多技術(shù)中的任一種,例如通過微陣列分析或通過qRT-PCR來進(jìn)
行定量。小分子這樣的分子，通常具有小于約1000道爾頓，或在一些實(shí)施方案中，小于約500道爾頓的分子量，其中所述分子能夠調(diào)節(jié)靶分子的活性至一定可測(cè)量的程度。治療性的包括診斷和治療的通用詞。治療劑當(dāng)適當(dāng)?shù)亟o受試者施用時(shí)能夠誘導(dǎo)期望的治療或預(yù)防效果的化合物、小分子或其它組合物，例如反義化合物、抗體、蛋白酶抑制劑、激素、趨化因子或細(xì)胞因子。例如，TRAIL抗性癌細(xì)胞的治療劑包括阻止或抑制TRAIL抗性癌細(xì)胞的發(fā)展或轉(zhuǎn)移的試劑。如本文中所用，“候選試劑”是被選擇用以篩選以確定其是否可用作TRAIL抗性的癌細(xì)胞的治療劑的化合物。在一些實(shí)施方案中，如果所述試劑可轉(zhuǎn)化來自TRAIL抗性癌細(xì)胞的細(xì)胞，所述候選試劑被鑒定為治療劑?！皽赜卑ㄓ糜谠噭┡c細(xì)胞或組織接觸的充足量的時(shí)間?！敖佑|”包括將以固體或液體形式存在的試劑與細(xì)胞或組織一起溫育。利用試劑“處理”細(xì)胞或組織包括將所述試劑與細(xì)胞或組織接觸或一起溫育。治療有效量足以在用試劑處理的受試者或細(xì)胞中獲得期望的效果的指定的藥物或治療劑的量。例如，這可以是減少miR-221和miR-222以及c-Jun的表達(dá)或減少miR-221和miR-222的表達(dá)并增加PTEN和/或TMP3，從而預(yù)防、治療或緩解患者的TRAIL抗性的癌細(xì)胞的治療劑的量。所述試劑的有效量將取決于幾個(gè)因素，包括但不限于被治療的受試者或細(xì)胞以及治療性組合物的施用方式。TRAIL表達(dá)模式細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織樣品中的4個(gè)基因、包括c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN和HMP3的相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平。TRAIL抗性的TRAIL表達(dá)模式為其中與對(duì)照相比較，c-Jun以及miR-221和miR-222的表達(dá)高并且PTEN和TMP3的表達(dá)低的TRAIL表達(dá)模式。TRAIL抗性癌細(xì)胞、TRAIL抗性癌癥、TRAIL抗性腫瘤細(xì)胞或腫瘤等當(dāng)用TRAIL攻擊時(shí)，與對(duì)照相比較未觀察到或幾乎未觀察到響應(yīng)于TRAIL的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞(體外、原位、體內(nèi))。該定義不需要每一個(gè)假定的TRAIL抗性細(xì)胞的TRAIL攻擊測(cè)試滿足所述定義；相反地，取樣、染色、表型或遺傳標(biāo)志鑒定、已知的TRAIL狀態(tài)或TRAIL抗性的任何其它暗示在本定義的含義之內(nèi)。TRAIL敏感性TRAIL表達(dá)模式為其中與對(duì)照相比較，c-Jun以及miR-221和miR-222的表達(dá)低并且PTEN和TMP3的表達(dá)高的TRAIL表達(dá)模式。腫瘤、贅生物(neoplasia)、惡性腫瘤或癌癥細(xì)胞的異常和不受控制的生長的結(jié)果。贅生物、惡性腫瘤、癌癥和腫瘤通?？苫Q使用并且是指因過度細(xì)胞分裂導(dǎo)致的組織或細(xì)胞的異常生長。個(gè)體的腫瘤的量為可測(cè)量為腫瘤的數(shù)目、體積或重量的“腫瘤負(fù)荷”。不轉(zhuǎn)移的腫瘤被稱為“良性的”。侵襲周圍組織和/或可轉(zhuǎn)移的腫瘤被稱為“惡性的”。腫瘤-結(jié)節(jié)-轉(zhuǎn)移(Tumor-Node-Metastasis) (TNM)惡性腫瘤的TNM分類是用于描述患者身體的癌癥的程度的癌癥分期系統(tǒng)。T描述原發(fā)性腫瘤的大小以及其是否已侵入附近組織#描述了被牽涉的任何淋巴節(jié)；以及M描述轉(zhuǎn)移。ITM由國際抗癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer)發(fā)展和維持以在用于分類癌癥的擴(kuò)散程度的 一個(gè)全球公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)上達(dá)成一致。 M分類也由美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American JointCommittee on Cancer)和國際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)盟(International Federation of Gynecologyand Obstetrics)使用。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是獲自相同患者的非癌性組織樣品。在其它實(shí)施方案中，對(duì)照是獲自健康受試者例如健康肝供體的肝樣品。在另一個(gè)實(shí)例中，對(duì)照是從歷史值計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的任何方法獲得腫瘤樣品和非癌性組織樣品。例如，可從已經(jīng)歷肝切除術(shù)的HCC患者獲自腫瘤和非癌性樣品，或它們可通過使用皮下針頭提取，通過顯微解剖或通過激光捕獲獲得。對(duì)照(非癌性)樣品可以例如從尸體器官供體或從健康肝供體獲得。在一些實(shí)施方案中，篩選包括將候選試劑與細(xì)胞接觸。細(xì)胞可以是獲自患者的原代細(xì)胞，或細(xì)胞可以是永生化或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。候選試劑可以是任何類型的試劑例如蛋白質(zhì)、肽、小分子、抗體或核酸。在一些實(shí)施方案中，候選試劑是細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，候選試劑是小分子。篩選包括高通量篩選和篩選單一或小組候選試劑。檢測(cè)RNA表汰的方法前體microRNA (pre-miRNA)和成熟miRNA的序列是例如通過miRBase數(shù)據(jù)庫公共可獲得的，可通過Sanger研究所(參見Griffiths-Jones等人，NucleicAcids Res. 36:D154-D158, 2008 ；Griffiths-Jones 等人，Nucleic AcidsRes. 34:D140-D144,2006 ;和 Griffiths-Jones, Nucleic Acids Res. 32 D109-D111,2004)
在線獲得。RNA表達(dá)的檢測(cè)和定量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見，例如，美國專利申請(qǐng)公開案No. 2006/0211000和2007/0299030，通過引用并入本文)和下列描述的許多方法的任一方法來實(shí)現(xiàn)。通過使用RNA家族成員的已知序列，適當(dāng)時(shí)，可設(shè)計(jì)用于下述檢測(cè)方法的特異性探針和引物。在一些情況下，RNA檢測(cè)法要求從樣品例如細(xì)胞或組織樣品分離核酸。核酸，包括RNA，具體地miRNA，可使用本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)來分離，例如，基于酚的提取是用于RNA分離的常用方法?；诜拥脑噭┌糜诩?xì)胞和組織破壞以及隨后將RNA與污染物分離的變性劑和RNA酶抑制劑的組合?；诜拥姆蛛x法可回收10至200個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的RNA種類(例如，前體和成熟miRNA、5S和5. 8S核糖體RNA (rRNA)和Ul小核RNA (snRNA))。此外，提取方法例如使用TRIZOLTM或TRI REAGENTTM的提取法可純化所有RNA(大的和小的)，并且是用于從生物樣品分離總RNA的高效方法，所述總RNA包含miRNA和小干擾RNA(siRNA)。微陣列
微陣列是核酸、蛋白質(zhì)、小分子、細(xì)胞或其它物質(zhì)的微型有序的陣列，其使得能夠平行分析復(fù)雜的生物化學(xué)樣品。DNA微陣列由稱為捕獲探針的不同核酸探針組成，所述探針被化學(xué)連接至固體基質(zhì)，所述固體基質(zhì)可以是微芯片、載玻片或微球體大小的珠子?？梢詫⑽㈥嚵欣缬糜谕瑫r(shí)測(cè)量大量信使RNA (mRNA)和/或miRNA的表達(dá)水平。可使用多種技術(shù),包括利用尖細(xì)的針(fine-pointed pin)打印至載玻片上,使用預(yù)制的遮蔽物進(jìn)行光刻、使用動(dòng)態(tài)微鏡裝置(dynamic micromirror device)進(jìn)行光刻、噴墨打印或在微電極陣列上進(jìn)行電化學(xué)來制作微陣列。miRNA的微陣列分析，例如(雖然這些方法可以以改進(jìn)的形式用于任何RNA分析)可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法來實(shí)現(xiàn)(參見，例如，PCT公開案WO 2008/054828 ;Ye等人,Nat. Med. 9 (4) :416-423, 2003 ；Calin 等人，N. Engl. J. Med. 353(17) :1793-1801, 2005，將所述每一個(gè)公開案和文獻(xiàn)通過引用并入本文)。在一個(gè)實(shí)例中，從細(xì)胞或組織樣品提取RNA,使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳從總RNA按大小選擇小RNA (18-26個(gè)核苷酸的RNA)。將寡核苷酸接頭連接至小RNA的5’和3’末端，將所得的連接產(chǎn)物用作RT-PCR反應(yīng)的模板，使用10個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。有義PCR引物具有連接至其5’末端的熒光基團(tuán)，從而熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物的有義鏈。將PCR產(chǎn)物變性，隨后將其與微陣列雜交。PCR產(chǎn)物，稱為靶核酸(其與陣列上的相應(yīng)miRNA捕獲探針序列互補(bǔ))將通過堿基配對(duì)與其上固定有捕獲探針的點(diǎn)雜交。當(dāng)使用微陣列激光掃描儀激發(fā)時(shí)，所述點(diǎn)將發(fā)熒光。隨后使用許多陽性和陰性對(duì)照以及陣列數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化法，就特定miRNA的拷貝數(shù)估計(jì)每一個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，這可產(chǎn)生特定miRNA的表達(dá)水平的評(píng)估。在備選方法中，直接使用從細(xì)胞或組織樣品提取的包含小RNA級(jí)分(包括miRNA)的總RNA而無需小RNA的大小選擇，以及標(biāo)記的3’末端，使用T4RNA連接酶和熒光標(biāo)記的短RNA接頭。通過在30° C溫育2小時(shí)，然后在80° C下進(jìn)行5分鐘熱滅活T4 RNA連接酶來標(biāo)記RNA樣品。與陣列上的相應(yīng)的miRNA捕獲探針序列互補(bǔ)的熒光標(biāo)記的miRNA通過堿基配對(duì)與其上固定有捕獲探針的點(diǎn)雜交。如上所述進(jìn)行微陣列掃描和數(shù)據(jù)處理?？梢岳脦追N類型所使用的微陣列，包括斑點(diǎn)寡核苷酸微陣列(spottedoligonucleotide microarray)、預(yù)制寡核苷酸微陣列(pre-fabricated oligonucleotidemicroarray)和斑點(diǎn)長寡核苷酸陣列(spotted long oligonucleotide array)。在斑點(diǎn)寡核苷酸微陣列中，捕獲探針為與miRNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸。通常將該類型的陣列與用兩種不同熒光團(tuán)標(biāo)記的來自待比較的兩個(gè)樣品(例如非癌性組織和HCC肝組織)的經(jīng)大小選擇的小RNA的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物雜交?；蛘?，從兩個(gè)樣品提取包含小RNA級(jí)分(包括miRNA)的總RNA，直接使用所述總RNA而無需小RNA的大小選擇，以及標(biāo)記的3’末端，使用T4RNA連接酶和利用兩種不同熒光團(tuán)標(biāo)記的短RNA接頭?？苫旌蠘悠?，將其與一個(gè)單一微陣列雜交，隨后掃描微陣列，從而在一個(gè)測(cè)定中使上調(diào)和下調(diào)的miRNA基因可視化。在預(yù)制寡核苷酸微陣列或單通道微陣列中，設(shè)計(jì)探針以匹配已知或預(yù)測(cè)的miRNA的序列。存在商購可得的覆蓋完整基因組的設(shè)計(jì)(例如，來自AfTymetrix或Agilent)。此類微陣列評(píng)估基因表達(dá)的絕對(duì)值，從而兩種狀況的比較需要使用兩個(gè)獨(dú)立的微陣列。斑點(diǎn)長寡核苷酸陣列由50至70聚體的寡核苷酸捕獲探針組成，通過噴墨或自動(dòng)化打印產(chǎn)生。短寡核苷酸陣列由20-25聚體寡核苷酸探針組成，通過光刻合成(Affymetrix)或通過自動(dòng)化打印產(chǎn)生。定量RT-PCR定量RT-PCR(qRT-PCR)是用于快速測(cè)量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物的量的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的改進(jìn)。qRT-PCR通常用于確定基因序列例如miR是否存在于樣品中，以及樣品中的拷貝數(shù)(如果其存在的話)的目的?？蓽y(cè)定核酸分子、包括miRNA的表達(dá)的PCR的任何方法落在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。存在本領(lǐng)域已知的qRT-PCR法的幾個(gè)變型，下面描述其中的 3個(gè)。用于定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法包括但不限于通過瓊脂糖凝膠電泳，SYBR綠(雙鏈DNA染料)的使用和熒光報(bào)道分子探針的使用。后兩者可進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，利用已知濃度的相似大小片段的靶DNA制備未知樣品和已知樣品以用于擴(kuò)增。在相同條件下(優(yōu)選使用相同引物，或至少具有相似退火溫度的引物)運(yùn)行兩個(gè)反應(yīng)，進(jìn)行相同的時(shí)間長度。將瓊脂糖凝膠電泳用于將反應(yīng)產(chǎn)物與其原始DNA和剩余引物分離。測(cè)量已知和未知樣品的相對(duì)量以測(cè)定未知的量。SYBR綠染料的使用比瓊脂糖凝膠法更精確，并且可產(chǎn)生實(shí)時(shí)結(jié)果。DNA結(jié)合染料結(jié)合所有新合成的雙鏈DNA，測(cè)量熒光強(qiáng)度的增加，從而使得能夠測(cè)定初始濃度。然而，SYBR綠將標(biāo)記所有雙鏈DNA，包括任何不希望的PCR產(chǎn)物以及引物二聚體，從而導(dǎo)致潛在的復(fù)雜性和人工假像。常規(guī)地制備反應(yīng)物，加入熒光雙鏈DNA染料。運(yùn)行反應(yīng)，監(jiān)測(cè)熒光的水平(染料僅當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)才發(fā)熒光)。通過參考標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線，可測(cè)定PCR中的雙鏈DNA濃度。熒光報(bào)道分子探針法使用基于序列特異性核酸的探針，以僅定量所述探針序列而非所有雙鏈DNA。其通常利用在相鄰位置上具有熒光報(bào)道分子和猝滅劑的基于DNA探針(所謂的雙標(biāo)記探針)來進(jìn)行。報(bào)道分子與猝滅劑的緊密相鄰阻止其熒光；只有在探針斷裂的情況下才可檢測(cè)到熒光。該方法依賴于參與的聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性。通過添加雙標(biāo)記探針制備實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)物。當(dāng)雙鏈DNA模板變性時(shí)，探針能夠結(jié)合模板DNA的目標(biāo)區(qū)域中的其互補(bǔ)序列。當(dāng)將PCR反應(yīng)混合物加熱以激活聚合酶時(shí)，聚合酶開始合成引發(fā)的單鏈模板DNA的互補(bǔ)鏈。隨著聚合繼續(xù)，其到達(dá)與其互補(bǔ)序列結(jié)合的探針，隨后因聚合酶的5’ -3’外切核酸酶活性而被水解，從而將熒光報(bào)道分子與猝滅分子分開。這導(dǎo)致熒光的增加，其被檢測(cè)。在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的熱循環(huán)過程中，監(jiān)測(cè)熒光(如從每一個(gè)PCR水解的雜交的雙標(biāo)記探針釋放的)的增加，這使得能夠精確地測(cè)定終DNA的量，從而使得能夠測(cè)定初始DNA的量。原位雜交原位雜交(ISH)將核酸雜交的技術(shù)應(yīng)用和擴(kuò)展至單細(xì)胞水平，并且與細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)的領(lǐng)域組合，允許維持形態(tài)學(xué)和鑒定待維持和鑒定的細(xì)胞標(biāo)記，以及使得能夠?qū)⑿蛄卸ㄎ恢寥后w例如組織和血液樣品中的特定細(xì)胞。ISH是一種類型的雜交，其使用互補(bǔ)核酸來將一種或多種特定核酸序列定位在一部分組織或組織切片中(原位)，或者，如果組織足夠小，定位在整個(gè)組織中(整裝ISH (whole mount ISH))。RNA ISH可用于測(cè)定組織的表達(dá)模式，例如miRNA的表達(dá)。處理樣品細(xì)胞或組織以增加它們的通透性以允許探針例如miRNA-特異性探針進(jìn)入細(xì)胞。將探針添加至處理的細(xì)胞，從而使得在適當(dāng)?shù)臏?度下雜交，洗去過量的探針。用放射性、熒光或抗原性標(biāo)簽標(biāo)記互補(bǔ)探針以便可使用放射自顯影 術(shù)、熒光顯微鏡檢查或免疫測(cè)定來測(cè)定組織中探針的定位和量。樣品可以是本文中描述的任何樣品，例如非癌性或HCC肝樣品。因?yàn)閙iR-26家族成員的序列是已知的，因此可相應(yīng)地設(shè)計(jì)miR-26探針以便探針特異性結(jié)合miR-26。原位PCR原位PCR是在ISH之前靶核酸序列的基于PCR的擴(kuò)增。為了檢測(cè)RNA，引入細(xì)胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄步驟以在原位PCR之前從RNA模板產(chǎn)生互補(bǔ)DNA。這使得能夠檢測(cè)低拷貝的RNA序列。在原位PCR之前，固定細(xì)胞或組織樣品，對(duì)其進(jìn)行透化以保持形態(tài)學(xué)并且允許PCR試劑與待擴(kuò)增的細(xì)胞內(nèi)序列接觸。接著在懸浮液中保持的完整細(xì)胞中或直接在細(xì)胞尚心制劑(cytocentrifuge preparation)中或載玻片上的組織切片中進(jìn)行祀序列的PCR擴(kuò)增。在前一個(gè)方法中，使用常規(guī)熱循環(huán)儀對(duì)懸浮在PCR反應(yīng)混合物中的固定細(xì)胞進(jìn)行熱循環(huán)。在PCR后，將細(xì)胞離心分離至載玻片上，通過ISH或免疫組織化學(xué)使細(xì)胞內(nèi)PCR產(chǎn)物可視。通過在蓋玻片下用PCR混合物覆蓋樣品而在載玻片上進(jìn)行原位PCR，隨后密封蓋玻片以防止反應(yīng)混合物的蒸發(fā)。通過將載玻片直接放置于常規(guī)或?qū)ｉT設(shè)計(jì)的熱循環(huán)儀的加熱塊的頂部或通過使用熱循環(huán)爐實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)。通常利用兩個(gè)不同技術(shù)間接原位PCR(利用PCR產(chǎn)物特異性探針通過ISH進(jìn)行的)或直接原位PCR(通過直接檢測(cè)標(biāo)記核苷酸(例如地高辛-11-dUTP、熒光素-dUTP、3H-CTP或生物素-16-dUTP，所述標(biāo)記核苷酸在熱循環(huán)過程中已被摻入PCR產(chǎn)物)而不用ISH進(jìn)行的)之一實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。miR-221和miR-222以及c_Jun、PTEN和HMP3用作預(yù)后的預(yù)測(cè)標(biāo)志和用于鑒定用于治療TRAIL抗性癌細(xì)胞的治療劑的用途。本文中公開了 miR-221和miR-222、c_Jun、PTEN和TMP3的表達(dá)模式是TRAIL抗性患者的存活預(yù)后的預(yù)測(cè)物。具有與來自相同受試者或來自健康受試者的非癌性組織相比較的高miR-221和miR-222以及c-Jun表達(dá)連同低PTEN和HMP3表達(dá)的TRAIL抗性癌細(xì)胞樣品(例如，組織活檢樣品)預(yù)測(cè)存活的減少。因此，腫瘤的TRAIL抗性表達(dá)模式狀態(tài)可用作TRAIL抗性癌癥患者的預(yù)后的臨床工具。在一些實(shí)施方案中，直接將本文中的標(biāo)志物在TRAIL抗性腫瘤樣品中的表達(dá)水平與來自相同患者的周圍非癌性組織的TRAIL抗性表達(dá)模式相比較。在其它實(shí)施方案中，將腫瘤樣品的TRAIL抗性表達(dá)模式與獲自健康受試者例如肝供體的肝樣品的TRAIL抗性表達(dá)模式相比較。在一些情況下，用作對(duì)照樣品的非癌性組織獲自尸體。在其它實(shí)施方案中，將腫瘤樣品的TRAIL抗性表達(dá)模式與基于病歷值的標(biāo)準(zhǔn)水平相比較。例如，可基于獲自受試者組群的非癌性肝組織樣品的平均TRAIL抗性表達(dá)模式設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)。例如，受試者的組群可以是臨床試驗(yàn)招募的一組HCC患者。受試者的組群還可以是一組尸體器官供體。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照的HCC腫瘤樣品中的TRAIL抗性表達(dá)模式的發(fā)現(xiàn)表示患者的不良預(yù)后和將患者鑒定為?？漂煼?specialized therapy)的良好候選者。如本文中所用，“不良預(yù)后”通常是指存活的減少或換句話說，死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加或直至死亡的時(shí)間的減少。不良預(yù)后還可指疾病的嚴(yán)重度的增加，例如癌癥至其它器官的擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)的增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)各個(gè)標(biāo)志物顯示相對(duì)于對(duì)照表達(dá)增加I. 5倍或減少2/3時(shí)，發(fā)現(xiàn)TRAIL抗性表達(dá)模式。在其它實(shí)施方案中，TRAIL抗性表達(dá)模式通過與對(duì)照相比較TRAIL抗性表達(dá)模式的標(biāo)志物增加至少2倍、至少2. 5倍、至少3倍、至少3. 5倍或至少4倍或減少1/2、2/5、1/3、2/7或1/4來表示。具有擁有TRAIL敏感性表達(dá)模式的TRAIL抗性腫瘤的患者具有更好的存活概率的發(fā)現(xiàn)表明減少c-Jun、miR-221和miR-222表達(dá)并且增加PTEN和HMP3表達(dá)的化合物可用作用于治療TRAIL抗性腫瘤的治療劑。
因此，本文中提供了鑒定用于治療TRAIL抗性癌細(xì)胞的治療劑的方法，包括體外篩選候選試劑以選擇促進(jìn)從TRAIL抗性的TRAIL表達(dá)模式至TRAIL敏感性TRAIL表達(dá)模式的轉(zhuǎn)化的試劑。在一些實(shí)施方案中，篩選包括將候選試劑與TRAIL抗性癌細(xì)胞接觸和檢測(cè)TRAIL表達(dá)模式的任何改變。TRAIL抗性癌細(xì)胞可以是獲自患者的原代細(xì)胞，獲自患者的永生化或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或細(xì)胞可以是商購可得的永生化細(xì)胞系，例如但不限于MHCC97、IfepG2、Hep3B 或 SNU-423 細(xì)胞。在用候選試劑治療后向TRAIL敏感性表達(dá)模式的轉(zhuǎn)化將所述試劑鑒定為用于治療TRAIL抗性癌癥的治療劑。篩選候選試劑以鑒定用于治療疾病的候選試劑的方法在本領(lǐng)域是公知的。檢測(cè)RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的方法在本領(lǐng)域中是公知的并且描述于本文中，例如，但不限于微陣列分析、RT-PCR(包括qRT-PCR)、原位雜交、原位PCR和Northern印跡分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，篩選包括高通量篩選。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)地篩選候選試劑。候選試劑可以是任何類型的分子，例如但不限于核酸分子、蛋白質(zhì)、肽、抗體、月旨質(zhì)、小分子、化學(xué)品、細(xì)胞因子、趨化因子、激素或可直接或間接改變TRAIL表達(dá)模式的任何其它類型的分子。在一些實(shí)施方案中，候選試劑可以是在NFk B/IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用的分子。在其它實(shí)施方案中，候選試劑是在IL-10、STAT3或干擾素可誘導(dǎo)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中起作用的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，候選試劑是細(xì)胞因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，候選試劑是小分子。本文中還描述了用于表征TRAIL抗性癌癥的方法，其中TRAIL抗性癌癥的至少一個(gè)特征選自下列一項(xiàng)或多項(xiàng)=TRAIL抗性癌癥的存在或不存在；TRAIL抗性癌癥的診斷；TRAIL抗性癌癥的預(yù)后；治療結(jié)果預(yù)測(cè)；治療結(jié)果監(jiān)測(cè)；TRAIL抗性癌癥對(duì)治療的適合性，例如TRAIL抗性癌癥對(duì)化學(xué)療法治療和/或放射療法治療的適合性；TRAIL抗性癌癥對(duì)激素治療的適合性；TRAIL抗性癌癥對(duì)通過侵入性手術(shù)去除的適合性；TRAIL抗性癌癥對(duì)組合輔助治療的適合性。本文中還描述了用于檢測(cè)TRAIL抗性癌癥的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種包含 c-Jun 和 miR-221 和 miR-222 或 miR-221 和 miR-222 和 PTEN 和 / 或 HMP3 的檢測(cè)探針。試劑盒可以以寡核苷酸陣列的形式存在或包括寡核苷酸陣列。本文中還描述了用于確定TRAIL抗性癌癥患者對(duì)治療的適合性的方法，包括i)從患有TRAIL抗性癌癥的患者分離至少一個(gè)組織樣品；和ii)進(jìn)行至少一個(gè)組織樣品的表征和/或利用檢測(cè)探針以鑒定TRAIL表達(dá)模式；iii)基于步驟ii)中鑒定的至少一個(gè)特征，診斷患者的生理狀態(tài)；iv)基于步驟iii)中獲得的診斷，確定患者是否從TRAIL抗性癌癥的治療獲益。在某些實(shí)施方案中，癌癥的至少一個(gè)特征選自下列一項(xiàng)或多項(xiàng)癌癥的存在或不存在；癌癥的類型；癌癥的來源；癌癥的診斷；癌癥的預(yù)后；治療結(jié)果預(yù)測(cè)；治療結(jié)果監(jiān)測(cè)；癌癥對(duì)治療的適合性，例如癌癥對(duì)化學(xué)療法治療和/或放射療法治療的適合性；癌癥對(duì)激素治療的適合性；癌癥對(duì)通過侵入性手術(shù)去除的適合性；癌癥對(duì)組合輔助治療的適合性。本文中還描述了用于確定癌癥對(duì)于治療的適合性的方法，其中癌癥的至少一個(gè)特 征是癌癥對(duì)治療的適合性，例如癌癥對(duì)化學(xué)療法治療和/或放射療法治療的適合性；癌癥對(duì)激素治療的適合性；癌癥對(duì)通過侵入性手術(shù)去除的適合性；癌癥對(duì)組合輔助治療的適合性。本文中還描述了用于確定癌癥患者的可能預(yù)后的方法，包括i)從患有癌癥的患者分離至少一個(gè)組織樣品；和ii)表征至少一個(gè)組織樣品以鑒定TRAIL表達(dá)模式；其中所述特征允許確定癌癥患者的可能預(yù)后。提供下列實(shí)施例以舉例說明某些特定的特征和/或?qū)嵤┓桨?。這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋為將公開內(nèi)容限定于所述的特定特征或?qū)嵤┓桨浮?br> 實(shí)施例
實(shí)施例I :miR-221 和 miR-222 直接靶向 PTEN 和 ΜΡ33’ UTR。為了鑒定假定的miR-221和miR-222祀，進(jìn)行了生物信息學(xué)研究(Targetscan, Pictar, RNhybrid)。在候選靶中，人 PTEN 的 3，-UTR(核苷酸 200-207，NM_000314)和人 ΜΡ3 的 3，-UTR(核苷酸 2443-2449，NM_000362)包含與 hsa-miR-221和miR-222的種子序列匹配的區(qū)域(圖1A)。為了確定PTEN和 ΜΡ3是否是miR-221和miR-222的直接靶，將包含miR-221/222結(jié)合位點(diǎn)的PTEN和 ΜΡ33’ UTR克隆在熒光素酶開放閱讀框的下游。將此類報(bào)道分子構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)染MEGOl細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)極低水平的miR-221和miR-222 (圖1B)并且是可高度轉(zhuǎn)染的(Freson等人，2005)。通過qRT-PCR確認(rèn)的轉(zhuǎn)染后此類miR的增加的表達(dá)(圖1B)顯著影響熒光素酶的表達(dá)，測(cè)量為相對(duì)熒光活性(圖1C)。相反地，當(dāng)通過使用具有PTEN和HMP3mRNA的3’ UTR的質(zhì)粒(其中miR-221和miR-222的結(jié)合位點(diǎn)被定點(diǎn)誘變失活)進(jìn)行熒光素酶測(cè)定時(shí)，觀察到miR-221和miR-222抑制效應(yīng)的一致降低(圖1C)。為了確定這些microRNA是否影響PTEN和 ΜΡ3在H460細(xì)胞環(huán)境中的表達(dá)，分析了 miR-221和miR-222在H460細(xì)胞中的異位表達(dá)的后果。利用qRT-PCR (圖1D)確認(rèn)轉(zhuǎn)染后這些miR的增加的表達(dá)，隨后利用Western印跡(圖1E)分析對(duì)PTEN和 ΜΡ3的內(nèi)源水平的作用；與用無規(guī)preniR轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞相比較，miR-221和miR-222的過表達(dá)顯著降低PTEN和TIMP3的內(nèi)源水平。相反地，具有高水平內(nèi)源miR-221和 miR-222 的 Calu-I-肺衍生的細(xì)胞中 2’-0_me-抗-miR-221 和 2’-0_me-抗-miR-222 對(duì)miR-221和miR-222的敲低(利用qRT-PCR(圖1F)驗(yàn)證)升高了 PTEN和TIMP3的蛋白質(zhì)水平(圖1G)。吸引人地，通過定量RT - PCR,發(fā)現(xiàn)PTEN但非HMP3mRNA水平在miR-221和miR-222轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中被強(qiáng)烈降低(圖1H)，從而表明miR-221和miR-222誘導(dǎo)PTENmRNA的降解，然而 ΜΡ3僅在翻譯水平上受此類microRNA調(diào)節(jié)。因此PTEN和 ΜΡ33’ UTR是miR-221和miR-222的直接靶。實(shí)施例II =NSCLC和HCC中miR-221和miR-222與PTEN和 ΜΡ3的表達(dá)反相關(guān)通過一大組的原發(fā)性NSCLC和HCC的Northern印跡評(píng)估與正常對(duì)應(yīng)物相比較的miR-221和miR-222的內(nèi)源水平。miR-221和miR-222表達(dá)在正常肺和肝細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到，但在大部分腫瘤細(xì)胞系中高度表達(dá)(圖2A)。此外,如通過Western印跡所評(píng)估的，在大多數(shù)分析的細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)miR-221和miR-222RNA表達(dá)與PTEN和TIMP3蛋白質(zhì)表達(dá)之間的反相關(guān)，這也被qRT-PCR確認(rèn)(圖2B)。未測(cè)試HMP3mRNA表達(dá)水平，因?yàn)樵谠鰪?qiáng)的 miR-221和miR-222表達(dá)后未觀察到TIMP3mRNA的下調(diào)(圖1H)。這些結(jié)果表明miR-221和miR-222的高表達(dá)是用于負(fù)調(diào)節(jié)NSCLC和HCC中的PTEN和 ΜΡ3的機(jī)制之一。為了驗(yàn)證這些microRNA是否也在HCC中影響PTEN和 ΜΡ3的內(nèi)源水平，進(jìn)行了表達(dá)低水平的miR-221和miR-222的Sk-Hepl細(xì)胞系的miR-221和miR-222的異位表達(dá)的作用的分析。如圖3A中所示，PTEN和TIMP3蛋白在miR-221和miR-222過表達(dá)后在Sk-Hepl細(xì)胞中降低。相反地，表達(dá)高水平的內(nèi)源miR-221和miR-222的Snu_387細(xì)胞中2，-Ο-me-抗-miR-221 和 2，-Oie-抗-miR-222 對(duì) miR-221 和 miR-222 的敲低升高 PTEN和TIMP3的蛋白質(zhì)水平(圖3A)。 由于已注意到miR-221和miR-222下調(diào)NSCLC和HCC衍生的細(xì)胞培養(yǎng)物中的PTEN和TIMP3表達(dá)，因此研究了體內(nèi)調(diào)節(jié)。為了回答該問題，通過qRT-PCR研究了與正常人肺組織樣品相比較，原代肺腫瘤樣品的PTEN mRNA和miR-221&222表達(dá)。miR-221和miR-222在正常人肺樣品幾乎檢測(cè)不到，并且在所有分析的腫瘤樣品中高度表達(dá)。在檢查的22個(gè)原發(fā)性肺腫瘤中，事實(shí)上全部都展示PTEN的下調(diào)以及miR-221和miR-222的過表達(dá)(圖3B)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持PTEN在體內(nèi)也是miR-221和miR-222的直接靶。為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，通過使用5’ -地高辛-標(biāo)記的LNA探針在肝癌和正常肝組織上進(jìn)行了原位雜交分析，然后對(duì)PTEN和 ΜΡ3進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析(圖3C)。miR-221/222與PTEN/TIMP3表達(dá)在肝癌和相鄰正常/硬變肝組織中反相關(guān)。肝癌細(xì)胞顯示miR-221/222的高表達(dá)和極低表達(dá)的PTEN或TIMP3(圖3CG-H-K-L)，而相鄰非惡性肝表達(dá)豐富的PTEN和 ΜΡ3并且極少顯示可檢測(cè)的miR-221/222信號(hào)(圖3CA-B-E-F)。miR-221/222與ΡΤΕΝ/ ΜΡ3表達(dá)在肺癌和相鄰正常肺組織也呈反相關(guān)(圖9)。大部分癌細(xì)胞對(duì)于miR-221和miR-222呈陽性并且對(duì)于PTEN(圖9F-9G)和TIMP3 (圖91-9J)呈陰性。在圖9I-9J中，miRNA表達(dá)在癌細(xì)胞中是明顯的并且 ΜΡ3表達(dá)在周圍細(xì)胞中是明顯的。在正在浸潤相鄰纖維變性的肺組織的腫瘤細(xì)胞巢中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)miR-222信號(hào)(大箭頭)(圖9K-9L)。實(shí)施例III. miR-221 和 miR-222 通過靶向 PTEN 和 TIMP3 誘導(dǎo) NSCLC 和 HCC 的TRAIL抗性研究了 miR-221和miR-222和/或ΡΤΕΝ- ΜΡ3沉默對(duì)NSCLC和HCC的細(xì)胞存活和TRAIL抗性的作用。首先對(duì)5個(gè)HCC衍生的細(xì)胞系進(jìn)行增殖測(cè)定，其中有3個(gè)(HepG2、Sk-Hepl 和 Huh 7)具有低 miR-221-222 表達(dá)；2 個(gè)(PLC/PRF-5 和 Snu-387)具有高miR-221-222表達(dá)水平(圖4A)。將細(xì)胞暴露于TRAIL 24小時(shí)，隨后使用MTT測(cè)定評(píng)估細(xì)胞增殖。有趣地，表達(dá)低水平的miR-221和miR-222的細(xì)胞經(jīng)歷TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，顯示了極低的增殖率，然而過表達(dá)miR-221和miR-222的細(xì)胞當(dāng)暴露于可溶性TRAIL時(shí)未顯示敏感性(圖4A)。此外，對(duì)TRAIL敏感性細(xì)胞系Sk-H印I細(xì)胞(圖4B-4C)、HepG2和Huh7 (圖IOA-10B)進(jìn)行的Annexin-FITC和胱天蛋白酶3/7測(cè)定顯示在miR-221和miR-222過表達(dá)后以及通過PTEN和HMP3siRNA進(jìn)行PTEN和 ΜΡ3沉默后，TRAIL抗性增加約30_40%。TRAIL敏感性H460細(xì) 胞在PTEN和 ΜΡ3敲低后也變得對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更具抗性，如通過胱天蛋白酶3/7活性(圖4D)和Annexin-FITC測(cè)定(圖4E)所測(cè)定的，雖然PTEN沉默比 ΜΡ3更有效。此外，為了進(jìn)一步評(píng)估這些靶對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的貢獻(xiàn)，將PTEN和 ΜΡ3序列克隆在pCruz-HA質(zhì)粒(Santa Cruz)中并且用于轉(zhuǎn)染Calu-ITRAIL抗性細(xì)胞。Calu-I細(xì)胞在PTEN和 ΜΡ3單獨(dú)或組合地恢復(fù)后變得對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更敏感，如通過胱天蛋白酶3/7活性(圖4D)和Annexin-FITC染色(圖11A-11B)所測(cè)定的。為了進(jìn)一步研究 ΜΡ3在TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，在Calu-I細(xì)胞系中過表達(dá) ΜΡ3后，利用western印跡測(cè)試胱天蛋白酶_3、-8、_9、多聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)和一些參與TRAIL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子的表達(dá)(圖11C)。有趣地，觀察到PARP和胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)的激活，如通過切割的片段的出現(xiàn)所評(píng)估的。此外，Mcl-I表達(dá)被下調(diào)然而細(xì)胞色素c表達(dá)增加(圖11C)。綜合起來，這些結(jié)果表明 ΜΡ3參與外部和內(nèi)部細(xì)胞凋亡途徑并且突顯了其在TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。在于Snu-387細(xì)胞中恢復(fù) ΜΡ3后獲得了相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，在于H460細(xì)胞中增強(qiáng)miR-221和miR-222的表達(dá)后或于Snu-387中進(jìn)行miR-221/222沉默后，實(shí)現(xiàn)了一些參與PI3K/AKT途徑的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或激活達(dá)到。如圖5A中所示，在Snu-387細(xì)胞中，PI3K、AKT及其磷酸化底物磷酸化糖原合酶激酶3的表達(dá)水平被miR-221和miR-222的異位表達(dá)升高，并且，相反地，被miR-221和miR-222的敲低降低,從而表明miR-221和miR-222靶向PTEN/AKT途徑(圖5B)。進(jìn)一步研究了此類蛋白質(zhì)的激活和表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)與用對(duì)照miR轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞相比較，ERK磷酸化和PAKl表達(dá)增加(圖5C)。有趣地，作為 ΜΡ3下調(diào)的可能結(jié)果，還發(fā)現(xiàn)增加的金屬肽酶3和金屬肽酶9的表達(dá)(圖5A-5C)。為了測(cè)試先前蛋白質(zhì)的激活是否是PTEN和/或TIMP3依賴性的，在H460細(xì)胞中沉默PTEN和 ΜΡ3。如圖5D和E中顯示的，ERK和PAKl的激活都是PTEN和 ΜΡ3依賴性的，而AKT磷酸化是PTEN依賴性的并且MMP3和MMP9在 ΜΡ3敲低后被上調(diào)。最后，研究了 AKT的抑制，因?yàn)槠渑c其是否使miR_221&222誘導(dǎo)的細(xì)胞存活和TRAIL抗性無效相關(guān)。用2’ -O-甲基(2’ -Ο-me) -抗-miR-221和miR-222寡核苷酸轉(zhuǎn)染Calu-I和Snu-387。將用2’-One-無規(guī)miR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對(duì)照。阻斷miR-221和miR-222的表達(dá)明顯地使此類細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，如通過胱天蛋白酶3/7測(cè)定估量的(圖5F-5G)。此外，在使用或不使用TRAIL的情況下，用特異性AKT抑制劑API-2/曲西立濱處理Calu-I和Snu-387細(xì)胞。如圖5F和5G中顯示的，API-2消除了 miR 221&222激活的AKT并且顯著地抑制miR-221和miR-222誘導(dǎo)的細(xì)胞存活和TRAIL抗性。然后，為了直接比較具有和不具有PTEN和 ΜΡ3的腫瘤的生長，將被設(shè)計(jì)用以敲低基因表達(dá)的短發(fā)夾RNA(shRNA)構(gòu)建體用于沉默H460細(xì)胞的PTEN和 ΜΡ3。將編碼不導(dǎo)致任何已知細(xì)胞mRNA的特異性降解的無規(guī)shRNA序列的shRNA質(zhì)粒用作對(duì)照。通過將H460PTEN和 ΜΡ3敲低細(xì)胞植入裸小鼠的右背面來體內(nèi)評(píng)估PTEN和 ΜΡ3破壞對(duì)腫瘤生長和TRAIL抗性的作用。在此之后5天，開始TRAIL處理，此時(shí)肺癌已建立。PTEN和 ΜΡ3丟失(圖12A)在體內(nèi)不僅賦予超過對(duì)照腫瘤的顯著腫瘤生長有利方面而且還賦予超過對(duì)照腫瘤的對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抗性(圖124B-12C-12D-2E-12F-12G)?？傊琍TEN和 ΜΡ3是TRAIL抗性中的重要靶并且在NSCLC和HCC細(xì)胞的致瘤性中起著重要作用。實(shí)施例IV. miR-221和miR-222對(duì)PTEN和 ΜΡ3的下調(diào)誘導(dǎo)NSCLC和HCC細(xì)胞的 遷移和侵襲性為了直接測(cè)試miR-221/222在腫瘤發(fā)生中的功能作用，在H460和Sk-H印I細(xì)胞中過表達(dá)這兩個(gè)microRNA，或沉默PTEN和TIMP3。隨后，通過細(xì)胞周期分析，miR-221和miR-222以及PTEN siRNA轉(zhuǎn)染的H460細(xì)胞顯示Gl的減少以及S和G2-M期的相應(yīng)增加(圖6A)。在72小時(shí)的轉(zhuǎn)染后，分析顯示通過miR-221和miR-222或PTEN敲低誘導(dǎo)的DNA合成的更早發(fā)生，同時(shí)伴隨著Gl細(xì)胞的更快速減少，這促成了增殖有利方面(圖6A)。在Sk-Hepl細(xì)胞中觀察到了相同的改變(圖13A)。然后，本發(fā)明人分析了 miR-221和miR-222的過表達(dá)對(duì)NSCLC和HCC細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲的作用。有趣地，觀察到在miR-221和miR-222過表達(dá)后以及PTEN和TIMP3下調(diào)后，H460和Sk-Hepl (圖113B)細(xì)胞的遷移(圖6B-6C)和侵襲(圖6D)能力的顯著增強(qiáng)。相反地，當(dāng)通過利用2’-0-me-抗-miR-221和miR-222的轉(zhuǎn)染下調(diào)miR-221和miR-222時(shí)，觀察到Calu-I和Snu-387細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲的減少(圖14A-14B)。實(shí)施例V. MET通過AP-I轉(zhuǎn)錄因子控制miR-221和miR-222的激活通過在Calu-I和Snu-387細(xì)胞以及在胃細(xì)胞系(GTL16)(先前報(bào)導(dǎo)其因DNA擴(kuò)增而過表達(dá)MET癌基因(Giordano等人，1989))中使用siRNA來沉默MET。首先，利用qRT-PCR評(píng)估m(xù)iR-221&222的表達(dá)水平。在MET敲低后，miR-221和miR-222的表達(dá)在所有分析的細(xì)胞系中被下調(diào)(圖7A-7B-7C)。通過用MET抑制劑SU11274處理CTL16細(xì)胞獲得了相同結(jié)果(圖15A)。其次，通過免疫染色，在MET下調(diào)或抑制后觀察到增加的PTEN和 ΜΡ3表達(dá)水平，這表明 MET 參與 miR-221 和 miR-222 激活(圖 7D-7E-7F)。然后，通過生物信息學(xué)研究(TESS 數(shù)據(jù)庫http://www. cbil. upenn. edu/cgi-bin/tess/tess),發(fā)現(xiàn)經(jīng)預(yù)測(cè)結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活miR-221/222啟動(dòng)子的參與MET途徑的唯一轉(zhuǎn)錄因子為AP-I。AP-I是屬于Jun和Fos亞家族的二聚堿性區(qū)域-亮氨酸拉鏈蛋白。c-Jun是其組中效力最高的轉(zhuǎn)錄激活物。為了鑒定哪個(gè)因子屬于參與miR-221/222的轉(zhuǎn)錄激活的AP_1家族，研究了 4個(gè)不同細(xì)胞系(H460、Calu-l、Huh7 和 Snu-387)中 miR-221 和 miR-222 的表達(dá)與 c-Jun 和 c_Fos蛋白質(zhì)水平之間的關(guān)系(圖S7B)。用MET siRNA,c-Jun siRNA或c_Fos siRNA共轉(zhuǎn)染高度表達(dá)c-Jun和c-Fos的Calu-I。隨后的qRT-PCR擴(kuò)增顯示MET和c-Jun下調(diào)，但非c-Fos敲低，產(chǎn)生miR-221和miR-222表達(dá)水平的約 45-50%的下降，如與陰性對(duì)照相比較的(圖S7C)。為了進(jìn)一步確認(rèn)這些結(jié)果，進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。在先前的工作中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR-221和miR-222被轉(zhuǎn)錄成單一種類的2. Ikb RNA并且轉(zhuǎn)錄受位于離miR-222發(fā)夾結(jié)構(gòu)的5’末端-150bp/50bp的上游序列調(diào)控。為了確定先前鑒定的miR-221和miR-222啟動(dòng)子區(qū)域是否受MET/AP1影響，通過使用包含跨越+3至-150、+3至-600、+3至-1000 (+1位置對(duì)應(yīng)于miR-222發(fā)夾的5’末端)(圖7G)進(jìn)入pGL3basic載體的片段的報(bào)導(dǎo)基因質(zhì)粒進(jìn)行熒光素酶測(cè)定，所述pGL3basic載體具有啟動(dòng)子-較少熒光毒酶基因(Di Leva等人，未發(fā)表的數(shù)據(jù))ο 將 pGL3b、-150、-600 和 _1000pGL3b 與 MET siRNA、c-Jun siRNA 或 c-FossiRNA共轉(zhuǎn)染入Calu-I細(xì)胞(圖15D-15E)。
隨后的熒光素酶測(cè)定顯示MET和c-Jun下調(diào)產(chǎn)生與通過利用pGL3b空載體的轉(zhuǎn)染測(cè)定的基線活性相比較 45%的熒光素酶活性的下降；本發(fā)明人在c-Fos siRNA轉(zhuǎn)染后未觀察到熒光素酶活性的降低(圖15D-15E)。這些數(shù)據(jù)表明c-Jun而非c_Fos是參與MET途徑的轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)NSCLC和HCC細(xì)胞的miR-221和miR-222的激活。由于啟動(dòng)子區(qū)域?qū)-Jun調(diào)節(jié)起反應(yīng)，因此為了驗(yàn)證c-Jun對(duì)miR-221和miR-222啟動(dòng)子的直接結(jié)合，進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)測(cè)定。首先，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)AP-I假定的結(jié)合位點(diǎn)位于premiR-222-5’末端的上游 130bp。通過考慮預(yù)測(cè)的AP-I結(jié)合位點(diǎn)，分析了總共2個(gè)染色質(zhì)區(qū)域(圖7G): —個(gè)跨越AP-I結(jié)合位點(diǎn)，第二個(gè)作為陰性對(duì)照位于pre-miR-222-5’末端的上游 1700nt，其中本發(fā)明人未發(fā)現(xiàn)AP-I的任何預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)。c-Jun陽性Calu-I和Snu-387細(xì)胞的ChIP測(cè)定顯示在與啟動(dòng)子接近的ChIP分析的區(qū)域2上顯著的AP-I結(jié)合(圖7H-7I)。在c-Jun陰性H460細(xì)胞中未觀察到染色質(zhì)被c-Jun ChIP富集，從而驗(yàn)證了 ChIP測(cè)定的特異性。最后，用茴香霉素(能夠激活JNK激酶的抗生素)處理顯示低水平的miR_221&222的Huh7細(xì)胞，從而檢查AP-l、miR-221和miR-222以及ΡΤΕΝ- ΜΡ3表達(dá)水平。在通過茴香霉素激活 c-Jun (圖 7M)后，miR-221 和-222 表達(dá)增加(miR_221=80%，miR_222=40%)，如通過qRT-PCR確認(rèn)的(圖7L)，然而PTEN和 ΜΡ3的表達(dá)水平急劇下降(圖7M)。為了進(jìn)一步證明JNK是c-Met和c-Jun之間的中間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子并且c-Jun敲低導(dǎo)致增加的PTEN和 ΜΡ3表達(dá)，研究了 Calu-I細(xì)胞的c-Met和c_Jun，分別分析JNK1/2磷酸化以及PTEN和TIMP3的表達(dá)。如圖S7F中顯示的，MET的敲低減少JNK1/2的磷酸化，而c-Jun沉默增加PTEN/TIMP3表達(dá)，其為miR-221和miR-222下調(diào)的結(jié)果。為了研究MET與ΡΤΕΝ/ ΜΡ3之間在體內(nèi)是否存在直接關(guān)系，對(duì)肺癌和肝癌以及正常樣品進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。共標(biāo)記MET/PTEN和ΜΕΤ/ ΜΡ3顯示PTEN和 ΜΡ3僅在正常細(xì)胞中大量表達(dá)，其中MET不存在，而c-Met只在癌細(xì)胞中表達(dá)(圖16)。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)了 MET至少部分地通過JNK、AP-I和特別地c-Jun轉(zhuǎn)錄因子參與miR-221和222的調(diào)節(jié)。實(shí)施例VI.實(shí)驗(yàn)方法熒光素酶測(cè)定使用下列引物PCR 擴(kuò)增人 PTEN 和 ΜΡ3 基因的 3’UTR :PTEN Fw 5’-TCT AGA GACTCT GAT CCA GAG AAT GM CC-3’ [SEQ ID No: I]和PTEN Rw 5’-TCT AGA GTT GCC ACA AGTGCA AAG GGG TAG GAT GTG-3’ [SEQ ID No :2] ；TIMP3Fw5> -TCT AGA CTG GGC AAA GAA GGGTCT TTC GCA AAG C_3’ [SEQ ID No :3]和 HMP3Rw 5’TCT AGA TTC CAA TAG GGA GGA GGCTGG AGG AGT CTC-3，[SEQ ID No :4]并且將其克隆在pGL3對(duì)照載體(Promega)的蟲熒光素酶終止密碼子的下游，從而產(chǎn)生p3’ UTR-PTEN和p3’ UTR-TIMP3質(zhì)粒。將這些構(gòu)建體用于通過反轉(zhuǎn)PCR產(chǎn)生p3’ -UTRmut-PTEN質(zhì)粒-引物Fw :5’ -GTTGAA AAA AGG TTG GGG GCG GGT GTC ATG TAT ATA C-3[SEQ ID No:5] ；Rw :5’-GTA TAT ACATGA CAC CCG CCC CCA ACC TTT TTT CM C_3，[SEQ ID No :6] ;p3，-UTRmut-HMP3 質(zhì)粒-引物Fw :5，-GTA TAA TTT AM ATC ATT GGG CGG CGG GAG ACA CTT CTG TAT TTC-3，[SEQ IDNo :7] ；Rw 5' -GAA ATA CAG AAG TGT CTC CCG CCG CCCAAT GAT TTT AAA TTA TAC-3’ [SEQID No:8]o通過使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，利用 I μ g 的 ρ3’ UTR-PTEN 或ρ3’ UTR-TΙΜΡ3以及ρ3’ UTRmut-PTEN或ρ3’ UTR ΤΙΜΡ3質(zhì)粒和I μ g蟲熒光素酶表達(dá)構(gòu)建體PRL-TK(Promega)共轉(zhuǎn)染MeGOl細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收獲細(xì)胞，按照制造商的說明書利用雙重突光素酶測(cè)定法(Dual Luciferase Assay) (Promega)進(jìn)行測(cè)定。以一式三份進(jìn)行 3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。肺癌和肝癌樣品和細(xì)胞系在俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(Columbus, OH)收集總共32個(gè)快速冷凍的正常肺組織和惡性腫瘤肺組織(19個(gè)男性和13個(gè)女性，年齡中位數(shù)70. O,范圍55-82)和60個(gè)快速冷凍的正常肝組織和60個(gè)惡性腫瘤肝組織。其它72個(gè)癌癥和正常(24)肺組織購自USBiomax, Inc0按照由俄亥俄州立大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)的方案獲得所有人組織。體內(nèi)實(shí)駘根據(jù)機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)方針進(jìn)行動(dòng)物研究。通過使用shPTEN和 ΜΡ3質(zhì)粒(Santa Cruz)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染NCI-H460細(xì)胞；用shMET穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Calu-I細(xì)胞。在于嘌呤霉素中選擇10天后，將5x106(H460)或7xl06(Calu-I)個(gè)活細(xì)胞皮下注射入6周齡雄性裸小鼠(CharlesRiverBreeding Laboratories, Wilmington, MA)的右肋。通過每天靜脈內(nèi)注射 TRAIL/Apo2 (10mg/kg/d)或媒介物(PBS)進(jìn)行2個(gè)5天的周期，從腫瘤細(xì)胞接種后5天(H460異種移植物)或10天(Calu-I異種移植物)開始處理。利用數(shù)字測(cè)徑器每5天測(cè)量腫瘤尺寸。通過測(cè)量長度⑴和寬度(《)和計(jì)算體積(V=lw2/2)來測(cè)定腫瘤體積。注射后35天，處死小鼠，通過PTEN、TIMP3和MET表達(dá)的western印跡分析腫瘤樣品。通過使用Studentt檢驗(yàn)評(píng)估對(duì)照與處理的動(dòng)物之間的統(tǒng)計(jì)顯著性。在俄亥俄州立大學(xué)的動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析將Student t檢驗(yàn)和單因素方差分析用于測(cè)定顯著性。所有誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)以測(cè)試正常組相對(duì)于腫瘤組的miR-221/222與PTEN之間的關(guān)聯(lián)性。通過計(jì)算P-值評(píng)估的所有測(cè)試的統(tǒng)計(jì)顯著性都小于O. 05。Western 印跡分析用放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)緩沖液(O.15mM NaCl, O. 05mM Tris-HCl，pH7. 5，l%Triton, 0. 1%SDS, 0. 1% 脫氧膽酸鈉和 l%Nonidet P40)提取 NSCLC 和 HCC 細(xì)胞的總蛋白質(zhì)。使用微型凝膠裝置(mini-gel apparatus) (Bio-Rad Laboratories)將樣品提取物(50 μ g)在7. 5 - 12%SDS -聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上進(jìn)行分離，將其轉(zhuǎn)移至Hybond-Cextra硝酸纖維素。用含有O. 05%Tween 20的Tris緩沖鹽溶液中的5%脫脂奶粉封閉膜I小時(shí)，用一抗溫育過夜，然后洗滌，用二抗溫育，通過化學(xué)發(fā)光使其可視。使用下列一抗抗-PTEN,抗-c-Jun、抗-p-c-Jun、抗-Fosj _p_JNK、抗-MMP3、抗-Mcl-I (Santa Cruz)、抗- ΜΡ3 (Millipore)、抗 _PI3K(BD Biosciences)、抗-ERK、抗-磷酸 ERK、抗-AKT、抗-ρ-ΑΚΤ、抗-GSK3b、抗-p-GSK3b (Ser9)、抗-ΡΑΚΙ、抗-胱天蛋白酶 _8、-3 和-9、抗-PARP、抗-細(xì)胞色素 c (Cell signaling)和抗-MMP9、抗-FADD(Abcam)、抗-肌動(dòng)蛋白抗體(Sigma)。使用第二抗-兔或抗-小鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體過氧化物酶綴合物(Chemicon)。熒光素酶測(cè)定擴(kuò)增在miR-222/-221的上游含有假定的調(diào)控區(qū)(從+1至_150nt，+1至-600,+1至-1000(+1位置對(duì)應(yīng)于miR-222發(fā)夾的5’末端)的DNA片段，將其克隆在pGL3basic (Promega)中。使用I. Ong pGL3basic空載體或含有上述基因組片段的pGL3、200ng 的蟲熒光素酶表達(dá)構(gòu)建體 pRL-TK(Promega)和 MET、c-Jun、c-Fos siRNA, 利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染MegOl細(xì)胞。48小時(shí)后，裂解4種細(xì)胞，按照制造商的說明書使用雙重突光素酶測(cè)定法(Dual Luciferase Assay) (Promega)進(jìn)行測(cè)定。以一式三份進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。用于克隆的引物如下_1000pGL3b Forw 5 gctagccctagccaccttatcgaaaatagcattcc 3 [SEQ ID No:9] ;_600pGL3b Forw 5 gctagcctgacatgctagtgagcacctgc 3 [SEQ ID No:10] ；-150pGL3b Forw :5 gctagcccagaggttgtttaaaattacgta 3 [SEQ ID No:11] ；miR-222pGL3b Rev :5 ctcgagagctgggtgatcctttgccttctg 3'[SEQ ID No:12]。實(shí)時(shí)PCR使用標(biāo)準(zhǔn)TaqMan PCR 試劑盒方案在 Applied Biosystems7900HT SequenceDetection 系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR。10 μ I PCR 反應(yīng)物包括 0· 67 μ I RT 產(chǎn)物、I μ I TaqMan 通用 PCR 標(biāo)準(zhǔn)混合物(Master Mix) (Applied Biosystems)、0· 2mMTaqMan探針、I. 5mM正向引物和0. 7mM反向引物。將反應(yīng)物在95° C于96孔板中溫育10分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)在95° C進(jìn)行15秒和在60° C進(jìn)行I分鐘。以一式三份運(yùn)行所有反應(yīng)。將閾值循環(huán)(CT)確定為熒光通過固定閾值所經(jīng)歷的分?jǐn)?shù)循環(huán)數(shù)(fractionalcycle number)。將用于基因表達(dá)的相對(duì)定量的比較CT法(Applied Biosystems)用于測(cè)定miRNA的表達(dá)水平。Y軸代表2 (-CT)或不同miR的相對(duì)表達(dá)。計(jì)算相對(duì)于U44和U48rRNA的miR表達(dá)，將其乘以104。對(duì)于每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)以一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用軟件(Bio-Rad)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。RNA提耳又矛口 Northern印跡按照制商的說明書利用TRIzol溶液(Invitrogen)提取總RNA,使用AgilentBioAnalizer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA, USA)評(píng)估 RNA 的完整性。如由 Calin 等人，2002所述進(jìn)行Northern印跡。用作探針的寡核苷酸是成熟miRNA(miRNA登記)的互補(bǔ)序列miR-221, 5，-GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3，[SEQ ID No: 13],miR222, 5，GAGACCCAGTAGCCAGATGTAGCT-3’ [SEQ ID No: 14]。miRNA表汰的反義抑制
通過Fidelity 合成 2’-0-甲基(2’-0_me)寡核糖核苷酸。2’-0_me-抗-miR-221和2’ -Ο-me-抗-miR-222的序列如下5' -gaaacccagcagacaauguagcu[SEQ ID No:15]和5，-gagacccagtagccagatgtagct[SEQ ID No:16]。2，-0-me-GFP miR(5' -aaggcaagcugacccugaagu[SEQ ID No: 17])用作對(duì)照。細(xì)胞在 6 孔板(I. 7X IO6/孔)生長 24 小時(shí)，使用 lipofectamine2000,以 100nmoli/L/孔的2’ -Ο-me-寡核糖核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)提取RNA和蛋白質(zhì)。細(xì)胞死亡和細(xì)胞增殖定暈將細(xì)胞以一式三份涂鋪在96孔板中，在37° C于5%C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行溫育。將Super-Killer TRAIL (Alexis Biochemicals)以 400ng/ml 使用 24-48 小時(shí)。按照制造商的方案，利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)-Cell Titer96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)檢查細(xì)胞存活性。通過將20 μ I MTT添加至每一個(gè)孔中來檢測(cè)具有代謝活性的細(xì)胞。在I小時(shí)的溫育后，在Multilabel計(jì)數(shù)器(Bio-Rad Laboratories)中分析板。使用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析和胱天蛋白酶3/7活性來評(píng)估細(xì)胞凋亡。以I. SxlO6個(gè)細(xì)胞/IOOmm培養(yǎng)皿接種細(xì)胞，將其在10%FBS/RPMI中生長過夜，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，隨后用400ng/ml TRAIL處理24小時(shí)。溫育后，用冷PBS洗滌細(xì)胞，通過胰蛋白酶處理從板取出細(xì)胞。用冷PBS洗漆重懸浮的細(xì)胞,按照制劑商的說明書(Roche Applied Science),用綴合有FITC的annexin V抗體進(jìn)行染色。隨后將細(xì)胞(5 X IO5/樣品)經(jīng)歷流式細(xì)胞術(shù)分析。如所描述的(Garofalo等人，2007)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。用TRAIL處理的H460細(xì)胞的級(jí)分被采用為凋亡細(xì)胞群體。針對(duì)在相應(yīng)的未處理的對(duì)照中發(fā)現(xiàn)的本底水平修正指明的細(xì)胞凋亡的百分比。假定方差相同，使用兩樣品t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并且基于雙尾檢驗(yàn)計(jì)算P值。為了檢測(cè)胱天蛋白酶3/7活性，將細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，用400ng/ml TRAIL處理，按照制造商的說明書使用胱天蛋白酶-Glo3/7Assay試劑盒(Promega)進(jìn)行分析。連續(xù)變量表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(s. d.)。染色質(zhì)免疫沉淀 如由de Belle等人，2000所描述的(具有稍許改進(jìn))進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀。將來自H460、Calu-I和Snu-387細(xì)胞系的細(xì)胞(5xl06)于37° C在1%甲醛中固定10分鐘。用冰冷的IPBS洗滌細(xì)胞，于IxPBS+蛋白酶抑制劑中刮取細(xì)胞，通過離心收集細(xì)胞。隨后超聲處理重懸浮于細(xì)胞裂解緩沖液[50mmol/L Tris-HCl (pH 8. O)、10mmol/L EDTA和1%SDS] +蛋白酶抑制劑中的細(xì)胞沉淀。使用5g抗-c-Jun抗體(Santa Cruz)或使用兔多克隆IgG對(duì)照(Zymed)免疫沉淀DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。通過加熱利用蛋白酶K在65° C逆轉(zhuǎn)免疫沉淀的染色質(zhì)的交聯(lián)，過夜進(jìn)行；然后利用MinElute Reaction Cleanup柱(Qiagen)純化DNA,將其重懸浮于水中。將純化的染色質(zhì)經(jīng)歷PCR，使用2%瓊脂糖通過凝膠電泳分析產(chǎn)物。使用下列引物區(qū)域IF :5'GATGTGGAGAATAGATACCTTTGAG 3'[SEQ ID No :18]區(qū)域IR 5'GGCACTGCCTACAAACCAGAGCATA3' [SEQ ID No: 19]區(qū)域2F :5'GTCACTCAGTCAGTATCTGTTGGA 3'[SEQ ID No :20]區(qū)域2R :5'GTGTGTAATTCAAGGTAAAGTTTTC3'[SEQ ID No:21]
抗-PTEN和抗 _HMP3siRNA 轉(zhuǎn)染將細(xì)胞培養(yǎng)至80%的匯合，使用Lipofectamine 2000，利用IOOnM抗-PTEN或利用IOOnM抗-HMP3SMARTpool siRNA或?qū)φ誷iRNA (Dharmacon)、經(jīng)設(shè)計(jì)用以敲低基因表達(dá)的4種靶特異性20 - 25nt siRNA的混合物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片的原位雜交的miRNA鎖核酸。使用先前公開的方案(Nuovo等人，2009)對(duì)脫蠟的人肺和肝組織進(jìn)行原位雜交(ISH)，包括在胃蛋白酶(1.3mg/ml)中消化30分鐘。包含6個(gè)分散的鎖核酸(LNA)修飾堿基的探針的序列(地高辛綴合至5’末端)為 miR-221, 5，-GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT [SEQ ID No: 13],miR222, 5，GAGACCCAGTAGCCAGATGTAGCT [SEQ ID No: 14]。將探針混合物和組織miRNA在60° C共變性5分鐘，然后在37° C雜交過夜，在4° C于0.2X SSC和2%牛血清白蛋白中進(jìn)行低嚴(yán)格度洗滌，進(jìn)行10分鐘。由于堿性磷酸酶對(duì)色原氮藍(lán)四唑和溴-氯-吲哚磷酸(NBT/BCIP)的作用而看見探針-靶復(fù)合物。陰性對(duì)照包括應(yīng)當(dāng)在這樣的組織中產(chǎn)生陰性結(jié)果的探針的使用。不使用復(fù)染色，以幫助ΡΤΕΝ、 ΜΡ3和MET蛋白的共標(biāo)記。在miRNA的原位雜交后，如先前所描述的(Nuovo等人，2009)，使用對(duì)于PTEN(1 800，細(xì)胞條件化30分鐘)、 ΜΡ3 (1:1300,細(xì)胞條件化30分鐘)和MET (1:20，細(xì)胞條件化30分鐘)的最佳條件對(duì)載玻片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。為了進(jìn)行免疫組織化學(xué)，本發(fā)明人使用了來自 Ventana Medical System 的 Ultrasensitive Universal Fast Red系統(tǒng)。本發(fā)明人使用了正常肝和肺組織作為這些蛋白質(zhì)的對(duì)照。隨后分析表達(dá)PTEN、TIMP3以及miR-221和miR-222的腫瘤細(xì)胞的百分比，強(qiáng)調(diào)各個(gè)靶(miR-221或-222以及PTEN或TIMP3)的共定位。材料用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、血清和抗生素來自Life Technologies, Inc. (GrandIsland, NY, USA)。蛋白質(zhì)電泳試劑來自 Bio-Rad Laboratories (Richmond, VA, USA)，western印跡和ECL試劑來自GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)。所有其它化學(xué)品來自Sigma(St Louis, MO, USA)。肺癌和肝癌樣品以及細(xì)胞系將人Calu-I和A549細(xì)胞系生長在含有10%熱滅活的胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺和IOOUml-I青霉素-鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基中。將Hel299、H460、A459、H1975、H1299、H1573、H23、PLCRFl5, SNU-387, Snu-423、Snu-475 細(xì)胞系生長在含有10%熱滅活的FBS和2mM L-谷氨酰胺和IOOUml-I青霉素-鏈霉素的RPMI中。將Sk_h印I、Hep-G2, HepG2C3A, H印3B、Huh7生長在補(bǔ)充有10%熱滅活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和IOOUml-I青霉素-鏈霉素的MEM中。將正常肝細(xì)胞生長在補(bǔ)充有10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1%的肝細(xì)胞生長添加物(HGS)和IOOUml-I青霉素-鏈霉素的肝細(xì)胞生長培養(yǎng)基(Sciencell)中。i千移測(cè)丨定將具有8_ μ m多孔膜(Greiner bio-one)的Transwell插入小室用于測(cè)定。用PBS洗滌細(xì)胞3次，將其添加至頂部小室中的無血清培養(yǎng)基中。底部小室充滿含有10%FBS的培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37° C于5%C02潮濕培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)。為了定量遷移的細(xì)胞，通過使用棉簽除去頂部小室上的細(xì)胞，將遷移的細(xì)胞固定在PBS，25%戊二醛中，然后使用結(jié)晶紫染色進(jìn)行染色，在相差顯微鏡下使其可視，然后進(jìn)行照相。將結(jié)晶紫染色的細(xì)胞再次溶解在醋酸和甲醇(1:1)中，在595nm測(cè)量吸光度。結(jié)果為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土S. D。侵襲性測(cè)定以一式三份將H460和SK-H印-I細(xì)胞置于具有含有8_ μ m孔的膜(BDBiosciences)的BD Falcon HTS FluoroBlok插入物的頂部小室中的300L的無血清達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基中。將插入物置于含有達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基和胎牛血清(10%)(作為化學(xué)引誘物)的24孔板的底部小室孔內(nèi)。用8g/mL的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的鈣黃綠素-AM(Molecular Probes, Eugene, OR)在37°C標(biāo)記通過膜的孔至底部小室的細(xì)胞,進(jìn)行30分鐘。使用熒光計(jì)在485nm和激發(fā)波長和530nm的發(fā)射波長定量遷移的細(xì)胞的熒光，將其表示為任意熒光單位。數(shù)據(jù)表示為4個(gè)獨(dú)立測(cè)定的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。PTEN 和 ΜΡ3 質(zhì)粒
按照制造商的說明書,通過使用一步RT-PCR試劑盒(Invitrogen)從H460細(xì)胞的RNA獲得PTEN和HMP3cDNA。通過使用下列引物擴(kuò)增PCR片段NotI-TIMP3-HA 5'gcggccgcatgaccccttggctcgggctcatcgtgct 3' [SEQ IDNo:22]BglII-TIMP3-HA 5'agatctcagggtctggcgctcaggggtctgt 3'[SEQ ID No:23]NotI-PTEN-HA 5'gcggccgcatgacagccatcatcaaagagatcgttag 3'[SEQ ID No:24]Xbal-PTEN-HA :5'tctagaggtgttttatccctcttgataaaaaaaaattca 3'[SEQ IDNo:25],隨后將其克隆入用NotI-XbaI(PTEN)或NotI-BglII ( ΜΡ3)消化后的pCRUZ-HA(Santa Cruz)。通過測(cè)序控制所有載體。靶分析通過使用這些特定程序Targetscanl、Pictar2和 RNhybrid3. Ihttp://www. targetscan. org/2 http ://pictar.bio.nyu. edu/3http://bibiserv. techfak.uni-bielefeld. de/進(jìn)行生物信息學(xué)分析。實(shí)施例VII :治療在HCC腫瘤樣品中顯示TRAIL敏感性TRAIL表達(dá)模式的患者的HCC的方法本實(shí)施例描述了選擇和治療可能具有有利的對(duì)TRAIL治療的反應(yīng)的HCC患者的方法(作為療法)。對(duì)于一些HCC患者，TRAIL療法可延長存活時(shí)間(Sun等人，J. Cancer Res. Clin.Oncol. 132(7) : 458-465，2006)。然而，有益地是在開始治療之前鑒定最可能從從TRAIL療法受益的患者。本文中現(xiàn)已公開在腫瘤樣品中相對(duì)于對(duì)照(例如獲自相同患者的非癌性肝組織)表達(dá)TRAIL敏感性TRAIL表達(dá)模式的HCC患者的預(yù)后在利用TRAIL治療后得到顯著地改善。相反地，在腫瘤樣品中表達(dá)TRAIL抗性的TRAIL表達(dá)模式的患者在TRAIL治療后不顯示存活的顯著增加，從而不是這樣的輔助治療的良好候選者。經(jīng)診斷患有HCC的患者首先經(jīng)歷肝切除術(shù)以意欲治愈。HCC腫瘤和非癌性組織樣品獲自從患者切除的肝組織的部分。隨后使用本領(lǐng)域公知的用于提取小RNA的任何適當(dāng)?shù)姆椒ɡ缤ㄟ^使用TRIZOLTM從組織樣品分離RNA。隨后使用特異于c-Jun以及miR-221和miR-222 (任選地與PTEN和/或 ΜΡ3結(jié)合)的引物，將純化的RNA經(jīng)歷RT-PCR。還可在不使用c-Jun的情況下，使用miR-221和miR-222以及PTEN和/或 ΜΡ3運(yùn)行所述測(cè)定。運(yùn)行此類測(cè)定以測(cè)定腫瘤和非癌性組織的相關(guān)RNA的表達(dá)水平。如果相對(duì)于非癌性組織在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了 TRAIL敏感性表達(dá)模式，則所述患者為進(jìn)行TRAIL輔助治療的候選者。因此，按照本領(lǐng)域已知的方法利用治療有效量的TRAILa治療患者。取決于許多因素例如患者的健康狀態(tài)和HCC的分期，TRAIL的劑量和給藥方案可變化。通常地，在一段時(shí)間內(nèi)以多劑施用TRAIL。實(shí)施例VIII :用于具有低miR-26表達(dá)的HCC患者的替代治療法本實(shí)施例描述了在不存在肝切除術(shù)的情況下治療經(jīng)診斷患有HCC的患者的方法。為了確定經(jīng)診斷患有HCC的患者是否是進(jìn)行TRAIL治療的良好候選者，從未曾經(jīng)歷肝切除術(shù)的患者獲得HCC腫瘤樣品以及非癌性肝組織樣品?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知的任何方法獲得組 織樣品。例如，可通過使用皮下針頭進(jìn)行活組織檢查法以取出想要的組織來獲得組織樣品。然后使用本領(lǐng)域公知的用于提取小RNA的任何適當(dāng)?shù)姆椒ɡ缤ㄟ^使用TRIZOLTM從組織樣品分離RNA。隨后使用特異于miR-26的引物，將純化的RNA經(jīng)歷RT-PCR，以測(cè)定腫瘤和非癌性組織的miR-26的表達(dá)水平。如果相對(duì)于非癌性組織在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)TRAIL敏感性TRAIL表達(dá)模式，則所述患者是進(jìn)行治療的候選者。因此，按照本領(lǐng)域已知的方法利用治療有效量的治療劑治療患者。取決于許多因素例如患者的健康狀態(tài)和HCC的分期，TRAIL的劑量和給藥方案可變化。通常地，在一段時(shí)間內(nèi)以多劑施用TRAIL。實(shí)施例IV :治療在HCC腫瘤樣品中顯示TRAIL抗性的TRAIL表達(dá)模式的患者的HCC的方法本實(shí)施例描述了如果患者在HCC腫瘤中顯示TRAIL抗性的TRAIL表達(dá)模式，治療經(jīng)診斷患有HCC的患者的方法。經(jīng)診斷患有HCC的患者首先經(jīng)歷肝切除術(shù)以意欲治愈。HCC腫瘤和非癌性組織樣品獲自從患者切除的肝組織的部分。隨后使用本領(lǐng)域公知的用于提取小RNA的任何適當(dāng)?shù)姆椒ɡ缤ㄟ^使用TRIZOLTM從組織樣品分離RNA。隨后使用特異于miR-26的引物，將純化的RNA經(jīng)歷RT-PCR，以測(cè)定腫瘤和非癌性組織的miR-26的表達(dá)水平。如果相對(duì)于非癌性組織在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)TRAIL抗性的TRAIL表達(dá)模式，則所述患者可能不會(huì)有利地響應(yīng)TRAIL輔助治療。因此，患者不接受TRAIL治療，但考慮進(jìn)行其它治療模式以轉(zhuǎn)化成TRAIL敏感性?；蛘?，監(jiān)控患者的疾病復(fù)發(fā)的術(shù)后體征。實(shí)施例IX :診斷HCC患者的方法在一個(gè)特定的方面，在本文中提供了診斷受試者是否患有肝細(xì)胞癌(HCC)或處于發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。所述方法一般包括測(cè)量來自受試者的測(cè)試樣品的TRAIL表達(dá)模式和確定測(cè)試樣品的TRAIL表達(dá)模式相對(duì)于對(duì)照樣品的TRAIL表達(dá)模式的水平是否偏離，偏離則表示受試者患有HCC或處于發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)中。在某些實(shí)施方案中，使用Northern印跡分析測(cè)量至少一種基因產(chǎn)物的水平。同樣地，在某些實(shí)施方案中，測(cè)試樣品的至少一種基因產(chǎn)物的水平低于對(duì)照樣品的相應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平，和/或測(cè)試樣品的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平高于對(duì)照樣品的相應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平。
實(shí)施例X :測(cè)量miR基因產(chǎn)物可通過從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸來測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平；將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供測(cè)試樣品的雜交譜；和將測(cè)試樣品的雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜相比較。至少一種miRNA的信號(hào)的改變表示受試者患有HCC或處于發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)中。實(shí)施例XI :診斷和治療應(yīng)用在另一個(gè)方面，本文中提供了治療受試者的HCC的方法，其中相對(duì)于從對(duì)照樣品 產(chǎn)生的信號(hào)，至少一種miRNA的信號(hào)脫調(diào)控(例如，被下調(diào)和/或被上調(diào))。本文中還提供了通過如下步驟診斷受試者是否患有與受試者的一個(gè)或多個(gè)不利預(yù)后標(biāo)志相關(guān)的HCC或處于發(fā)生其的風(fēng)險(xiǎn)中的方法從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供測(cè)試樣品的雜交譜；和將測(cè)試樣品的雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜相比較。信號(hào)的改變表示受試者患有癌癥或處于發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中。本文中還提供了用于治療受試者的HCC的方法，所述受試者患有其中TRAIL表達(dá)模式基因的至少兩種基因產(chǎn)物在受試者的癌細(xì)胞中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞被下調(diào)或上調(diào)的HCC。當(dāng)至少兩種基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被下調(diào)時(shí)，所述方法包括給受試者施用有效量的至少兩種分離的基因產(chǎn)物，以便抑制受試者的癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)兩種或更多種基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被上調(diào)時(shí)，所述方法包括給受試者施用有效量的至少一種用于抑制至少一種基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，以便抑制受試者的癌細(xì)胞的增殖。本文中還提供了治療受試者的HCC的方法，包括測(cè)定HCC細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞的至少兩種TRAIL表達(dá)基因產(chǎn)物的量；和通過給受試者施用有效量的至少兩種基因產(chǎn)物(如果癌細(xì)胞中表達(dá)的所述基因產(chǎn)物的量少于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的所述基因產(chǎn)物的量的話)；或通過給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少兩種基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物(如果癌細(xì)胞中表達(dá)的基因產(chǎn)物的量高于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的基因產(chǎn)物的量的話)來改變HCC細(xì)胞中表達(dá)的基因產(chǎn)物的量，以便抑制受試者的癌細(xì)胞的增殖。實(shí)施例XII:組合物本文中還提供了用于治療TRAIL抗性癌癥的藥物組合物，其包含至少兩種分離的TRAIL表達(dá)模式基因產(chǎn)物和藥學(xué)上可接受的載體。在具體實(shí)施方案中，藥物組合物包含對(duì)應(yīng)于在HCC細(xì)胞中相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞被下調(diào)的基因產(chǎn)物的基因產(chǎn)物。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種表達(dá)調(diào)節(jié)劑(例如，抑制齊IJ)化合物和藥學(xué)上可接受的載體。本文中還提供了包含至少一種表達(dá)調(diào)節(jié)劑化合物的藥物組合物，所述表達(dá)調(diào)節(jié)劑化合物特異于在HCC細(xì)胞中相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞被上調(diào)或下調(diào)的基因產(chǎn)物。實(shí)施例XII I:試劑盒可將本文中描述的任何組合物包括在試劑盒中。在非限制性實(shí)例中，將用于分離miRNA、標(biāo)記miRNA和/或使用陣列評(píng)估m(xù)iRNA群體的試劑包括在試劑盒中。試劑盒還可包括用于產(chǎn)生或合成miRNA探針的試劑。試劑盒從而可在適當(dāng)?shù)娜萜餮b置中包含用于通過摻入標(biāo)記的核苷酸或未標(biāo)記的核苷酸(隨后被標(biāo)記)而標(biāo)記miRNA的酶。其還可包括一種或多種緩沖液，例如反應(yīng)緩沖液、標(biāo)記緩沖液、洗漆緩沖液或雜交緩沖液、用于制備miRNA探針的化合物和用于分離miRNA的化合物。其它試劑盒可包括用于制備核酸陣列的組分，所述組分包含與miRNA互補(bǔ)的寡核苷酸，從而可包括例如固體支持物。對(duì)于任何試劑盒實(shí)施方案，包括陣列，可存在這樣的核酸分子，所述核酸分子包含與本文中的任何序列的全部或部分具有同一性或與其互補(bǔ)的序列。可以在含水介質(zhì)中或以凍干形式包裝試劑盒的組分。試劑盒的容器裝置通常包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其它容器裝置，可將組分放入，優(yōu)選適當(dāng)?shù)氐确秩胨鋈萜餮b置中。當(dāng)試劑盒中存在超過I種組分時(shí)(可將標(biāo)記試劑和標(biāo)記物包裝在一起)，試劑盒通常還包含第二、第三或其它額外的容器，可將其它組分分別放入所述容器中。然而，可在小瓶中包含組分的不同組合。本發(fā)明的試劑盒通常還包括用于將核酸和任何其它試劑容器包含在密閉物(close confinement)中以用于銷售的裝置。此類容器可包括可 將期望的小瓶保留在其中的注射或吹塑塑料容器。當(dāng)在一種和/或多種液體溶液中提供試劑盒的組分時(shí)，液體溶液是水溶液，無菌水溶液是一種優(yōu)選溶液?？砂ㄔ谠噭┖兄械钠渌芤菏菂⑴c從混合樣品分離和/或富集miRNA的溶液。然而，可以以干燥粉末的形式提供試劑盒的組分。當(dāng)以干燥粉末提供試劑和/或組分時(shí)，可通過添加適當(dāng)?shù)娜軇┲亟ǚ勰?。預(yù)期溶劑還可在另一個(gè)容器裝置中提供。試劑盒還可包括幫助分離標(biāo)記的miRNA的組分。其還可包括保護(hù)或維持miRNA或保護(hù)其免受降解的組分。組分可以是不含RNAse的或保護(hù)免受RNAse分解。同樣地，試劑盒通?？稍谶m當(dāng)?shù)难b置中包括用于每一種單一試劑或溶液的不同容器。試劑盒還可包括使用試劑盒組分以及使用未包括在試劑盒中的任何其它試劑的使用說明書。說明書可包括可執(zhí)行的變型?？紤]到此類試劑是本發(fā)明的試劑盒的實(shí)施方案。同樣地，試劑盒不限于上文中鑒定的特定項(xiàng)目，其可包括用于操作或表征miRNA的任何試劑。還考慮到miRNA陣列的情境中論述的任何實(shí)施方案更一般地可用于本發(fā)明的篩選或表征方法或試劑盒。換句話說，描述什么可包含在特定陣列中的任何實(shí)施方案可更一般地于miRNA表征的情境中實(shí)施并且本身不必包括陣列。還考慮到任何試劑盒、陣列或其它檢測(cè)技術(shù)或工具或任何方法可包括任何此類miRNA表征。同樣地，還考慮到可在本發(fā)明的方法中利用或或不利用陣列形式來執(zhí)行在miRNA陣列的情境中論述的任何實(shí)施方案；換句話說，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，在本發(fā)明的任何方法中篩選或評(píng)估m(xù)iRNA陣列中的任何miRNA。陣列形式不是待執(zhí)行的篩選和診斷方法所必需的。本發(fā)明人還在本文中考慮到了用于使用miRNA陣列進(jìn)行治療、預(yù)后或診斷應(yīng)用易激此類用途的試劑盒。試劑盒可包括miRNA陣列，以及關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)化或規(guī)范化陣列上的miRNA的miRNA特征譜的信息。同樣地，在某些實(shí)施方案中，可在試劑盒中包括對(duì)照RNA或DNA。對(duì)照RNA可以是可用于標(biāo)記和/或陣列分析的陽性對(duì)照的miRNA。已在本文中廣泛地和一般性地描述本教導(dǎo)的方法和試劑盒。落在一般性公開內(nèi)容內(nèi)的每一個(gè)更窄的種類和子類分組也形成本教導(dǎo)的一部分。這包括本教導(dǎo)的一般描述，前提或負(fù)性限制是從屬中除去任何主題，無論去除的材料是否在本文中被明確地引述。實(shí)施例XIV :陣列制備和篩選本文中還提供了 miRNA陣列的制備和用途，所述陣列是核酸分子(探針)的有序大陣列或微陣列，所述核酸分子(探針)與多個(gè)miRNA分子或前體miRNA分子完全或部分互補(bǔ)或與其具有同一性，并且被置于空間上分開的架構(gòu)中的支持物材料上。大陣列通常是成片的硝酸纖 維素或尼龍，其中點(diǎn)染探針。微陣列更密集地排列核酸探針以便至多10，OOO個(gè)核酸分子能合適地安裝在通常I至4平方厘米的區(qū)域?？赏ㄟ^將核酸分子例如基因、寡核苷酸等點(diǎn)在基質(zhì)上或在基質(zhì)上原位構(gòu)建寡核苷酸序列來制作微陣列?？梢砸灾炼嗉s30個(gè)非同一的核酸分子/平方厘米或更高的高密度基質(zhì)模式，例如至多約100或甚至1000/平方厘米的高密度基質(zhì)模式應(yīng)用所點(diǎn)的或所構(gòu)建的核酸分子。微陣列通常使用涂覆的玻璃作為固體支持物，與過濾陣列的基于硝酸纖維素的材料不同。通過具有miRNA互補(bǔ)核酸樣品的有序陣列，可追蹤每一個(gè)樣品的位置并且將其與原始樣品聯(lián)系起來。其中多種不同的核酸探針穩(wěn)定地與固體支持物表面結(jié)合的多種不同的陣列裝置對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。用于陣列的有用基質(zhì)包括尼龍、玻璃和硅。陣列可在許多不同方面，包括平均探針長度、探針的序列或類型、探針與陣列表面之間的鍵的性質(zhì)(例如共價(jià)或非共價(jià)的)等方面不同。除探針檢測(cè)miRNA外，就任何參數(shù)而言，本文中描述的標(biāo)記和篩選方法以及陣列不限于其效用；因此，可將方法和組合物與多種不同類型的miRNA陣列一起使用。鑒于我們的發(fā)明的原理可用于的許多可能的實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)承認(rèn)舉例說明的實(shí)施方案僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例并且不應(yīng)當(dāng)被當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。相反地，本發(fā)明的范圍由下列權(quán)利要求界定。因此我們要求落在這些權(quán)利要求的范圍和精神內(nèi)的所有實(shí)施方案作為我們的發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種改變細(xì)胞中的TRAIL表達(dá)模式的方法，包括抑制能夠表達(dá)C-Jun、miR-221和miR-222、PTEN 和 ΜΡ3 的細(xì)胞中的 c-Jun、miR_221 和 miR-222 以及 PTEN 或 ΜΡ3，和觀察TRAIL表達(dá)模式的改變。
2.一種改變細(xì)胞中的TRAIL表達(dá)模式的方法，包括在能夠表達(dá)c-Jun、miR-221和miR-222、PTEN 和 ΜΡ3 的細(xì)胞中過表達(dá) c-Jun、miR-221 和 miR-222、PTEN 或 ΜΡ3，和觀察TRAIL表達(dá)模式的改變。
3.—種鑒定細(xì)胞樣品中的TRAIL表達(dá)模式的方法，包括鑒定細(xì)胞樣品中的至少兩種核酸的表達(dá)水平，其中所述至少兩種核酸選自miR-221和miR-222和c-Jun ；miR-221和miR-222 和 PTEN ;miR-221、miR_222 和 TIMP3 ；miR-221 和 miR-222、c-Jun 和 PTEN ；miR-221和 miR-222、PTEN 和 TIMP3 ；以及，miR-221 和 miR-222、c-Jun 和 ΜΡ3。
4.一種改變TRAIL抗性細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法，包括抑制也表達(dá)至少一種選自c-Jun、PTEN和 ΜΡ3的核酸的細(xì)胞中的miR-221和miR-222。
5.一種改變TRAIL抗性細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法，包括在也表達(dá)至少一種選自c-Jun、PTEN和 ΜΡ3的核酸的細(xì)胞中過表達(dá)miR-221和miR-222。
6.一種鑒定具有核酸表達(dá)抑制的測(cè)試細(xì)胞的方法，包括將至少一種測(cè)試細(xì)胞與反義miR-221和miR-222接觸，和觀察選自PTEN和TIMP3的核酸的表達(dá)的增加。
7.一種預(yù)測(cè)經(jīng)診斷患有癌癥的患者的臨床結(jié)果的方法，包括檢測(cè)獲自所述患者的癌細(xì)胞樣品中的miR-221和miR-222的表達(dá)水平和至少一種選自c-Jun、PTEN和 ΜΡ3的核酸的表達(dá)水平，其中，相對(duì)于對(duì)照而言，腫瘤樣品中miR-221和miR-222的水平升高至I. 5倍或更高與PTEN或TIMP3的表達(dá)水平下降至2/3或更低的組合預(yù)測(cè)了存活的減少，或其中，相對(duì)于對(duì)照而言，腫瘤樣品中miR-221和miR-222的水平升高至I. 5倍或更高與c-Jun的表達(dá)水平升高至I. 5倍或更高的組合預(yù)測(cè)了存活的減少。
8.一種抑制表達(dá)miR-221和miR-222和PTEN的腫瘤細(xì)胞中的PTEN表達(dá)的下調(diào)的方法，包括抑制表達(dá)miR-221和miR-222和PTEN的腫瘤細(xì)胞中的miR-221和miR-222活性，和觀察PTEN下調(diào)的抑制。
9.權(quán)利要求8的方法，其中通過反義miR-221和miR-222抑制所述miR-221和miR-222的活性。
10.權(quán)利要求8的方法，其中通過TRAIL敏感性觀察PTEN表達(dá)下調(diào)的抑制。
11.權(quán)利要求8的方法，其中通過PTEN轉(zhuǎn)錄分析觀察PTEN表達(dá)下調(diào)的抑制。
12.—種鑒定用于治療TRAIL抗性癌癥的治療劑的方法，包括體外篩選候選試劑以選擇在TRAIL抗性癌細(xì)胞中減少miR-221和miR-222的表達(dá)和增加PTEN的表達(dá)的試劑，從而鑒定用于治療TRAIL抗性癌癥的試劑。
13.一種治療具有TRAIL抗性腫瘤細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用能夠抑制PTEN表達(dá)的下調(diào)的治療劑，所述哺乳動(dòng)物具有TRAIL抗性腫瘤細(xì)胞，如通過miR-221和miR-222的水平升高至I. 5倍或更高與PTEN表達(dá)水平降低至2/3或更低的組合所鑒定的。
14.一種用于鑒定測(cè)試細(xì)胞中的PTEN的miR-221和miR-222上調(diào)的試劑盒，包括miR-221和miR-222的至少一種分子鑒定物和PTEN的至少一種分子鑒定物，其中所述分子鑒定物選自探針、引物、抗體或小分子。
15.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞選自癌細(xì)胞、TRAIL抗性癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和肝細(xì)胞癌細(xì)胞。
16.一種改變能夠表達(dá) ΜΡ3和miR-221和miR-222的細(xì)胞中的 ΜΡ3表達(dá)的調(diào)節(jié)的方法，包括改變表達(dá)TIMP3和表達(dá)miR-221和miR-222的細(xì)胞中的miR-221和miR-222活性，和觀察 ΜΡ3的表達(dá)的改變。
17.一種抑制能夠表達(dá) ΜΡ3的細(xì)胞中的 ΜΡ3表達(dá)的方法，包括在也表達(dá) ΜΡ3的細(xì)胞中過表達(dá)miR-221和miR-222，和觀察TIMP3的表達(dá)的抑制。
18.—種鑒定具有TIMP3表達(dá)的抑制的細(xì)胞的方法，包括將測(cè)試細(xì)胞與反義miR-221和miR-222接觸，和觀察 ΜΡ3表達(dá)的增加。
19.一種鑒定TRAIL抗性細(xì)胞的方法，包括鑒定測(cè)試細(xì)胞樣品是否包含miR-221和miR-222核酸以及 ΜΡ3核酸。
20.一種鑒定用于治療TRAIL抗性癌癥的治療劑的方法，包括體外篩選候選試劑以選擇在TRAIL抗性癌細(xì)胞中減少miR-221和miR-222的表達(dá)和增加 ΜΡ3的表達(dá)的試劑，從而鑒定用于治療TRAIL抗性癌癥的試劑。
21.一種預(yù)測(cè)經(jīng)診斷患有癌癥的患者的臨床結(jié)果的方法，包括檢測(cè)獲自所述患者的癌細(xì)胞樣品中的miR-221、miR-222和TIMP3的表達(dá)水平，其中相對(duì)于對(duì)照而言，腫瘤樣品中miR-221和miR-222的水平升高至I. 5倍或更高與TIMP3表達(dá)水平降至2/3或更低的組合預(yù)測(cè)了存活的減少。
22.—種治療具有TRAIL抗性腫瘤細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用能夠抑制 ΜΡ3表達(dá)的下調(diào)的治療劑，所述哺乳動(dòng)物具有TRAIL抗性腫瘤細(xì)胞，如通過miR-221和miR-222的表達(dá)升高至I. 5倍或更高與TIMP3表達(dá)的水平降低至2/3或更低的組合所鑒定。
23.一種用于鑒定測(cè)試細(xì)胞中的 ΜΡ3的miR-221和miR-222上調(diào)的試劑盒，包括miR-221和miR-222的至少一種分子鑒定物和TIMP3的至少一種分子鑒定物，其中所述分子鑒定物選自探針、引物、抗體或小分子。
24.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞選自癌細(xì)胞、TRAIL抗性癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和肝細(xì)胞癌細(xì)胞。
25.一種抑制表達(dá)miR-221、miR-222和 ΜΡ3的腫瘤細(xì)胞中的 ΜΡ3表達(dá)的下調(diào)的方法，包括抑制表達(dá)miR-221、miR-222和TIMP3的腫瘤細(xì)胞中的miR-221和miR-222活性，和觀察TIMP3的下調(diào)的抑制。
26.權(quán)利要求25的方法，其中通過反義miR-221和miR-222抑制所述miR-221和miR-222 活性。
27.權(quán)利要求25的方法，其中通過TRAIL敏感性觀察 ΜΡ3表達(dá)的下調(diào)的抑制。
28.權(quán)利要求25的方法，其中通過 ΜΡ3翻譯分析觀察 ΜΡ3表達(dá)的下調(diào)的抑制。
全文摘要
本文中公開了miR-221和miR-222下調(diào)PTEN和TIMP3腫瘤阻抑子，從而導(dǎo)致TRAIL抗性。本發(fā)明提供了與該發(fā)現(xiàn)相關(guān)的研究、診斷和治療工具及方法。在本文中具體地描述了用于具有TRAIL抗性的人肝細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌的診斷、預(yù)后和治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102803511SQ201080059339
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者C·M·克羅斯 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)