專利名稱：小溝結(jié)合劑(MGB)-寡核苷酸miRNA拮抗劑的制作方法
小溝結(jié)合劑(MGB)-寡核苷酸mi RNA拮抗劑
背景
本申請要求2009年11月25日提交的名稱為“Minor Groove Binder (MGB) -Oligonucleotide miRNAAntagonists”的序列號為 61/264，380 的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過弓I用并入本文。
本發(fā)明涉及用于抑制非編碼RNA(例如，miRNA和piRNA)之作用的組合物和方法。
RNA干擾(“RNAi，RNA interference”)是參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)的近乎普遍存在的途徑。RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子是微RNA(microRNA) ( “miRNA”或“miR”)。這些小的非編碼的 RNA是作為初級miRNA(“pr1-miRNA”)被轉(zhuǎn)錄的(見

圖1)，并且在胞核中被Drosha(III型核糖核酸酶)加工而生成被稱為“pre-miRNA”的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些分子隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，并被第二種核酸酶(Dicer)加工而生成成熟的雙鏈體形式的miRNA，其隨后能夠被并入 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA Induced Silencing Complex, “RISC”)。成熟的 miRNA-RISC 復(fù)合物與靶信使RNA(“mRNA”)之間的相互作用(部分地)由miRNA引導(dǎo)鏈(第2 7位核苷酸)的種子區(qū)(seed region)所介導(dǎo)，并且通過轉(zhuǎn)錄物切割和/或翻譯弱化(translation attenuation)而導(dǎo)致基因敲低(knockdown)。
能夠使研究者理解miRNA和miRNA祀標(biāo)在疾病、細(xì)胞分化和穩(wěn)態(tài)(homeostasis) 中所發(fā)揮作用的工具是很有價值的。這樣的工具包括但不限于miRNA抑制劑。先前已經(jīng)描述miRNA抑制劑的種類(參見Meister2004和Hutvagner 2004)。這些分子是單鏈的，大小范圍為21 31個核苷酸(“nt”)長度，并且在核糖環(huán)的2'位包含O-甲基取代。自從首次發(fā)現(xiàn)miRNA抑制劑以來，已鑒定和并入了多種設(shè)計要素以 增強(qiáng)這些分子在生物環(huán)境 (biological setting)中的效能。例如，已證明具有較長長度或并入二級結(jié)構(gòu)(例如,雙鏈抑制劑)的抑制劑表現(xiàn)出優(yōu)于較短的21 31個單鏈核苷酸設(shè)計(Vermeulen et al. 2007) 的性能。另一些設(shè)計包括并入鎖核酸(locked nucleic acid,“LNA”)(Orom et al. 2006)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于抑制非編碼RNA(例如，miRNA和piRNA)之作用的組合物和方法。 所述組合物包含與小溝結(jié)合劑(Minor Groove Binder, “MGB”)綴合的單鏈或雙鏈寡核苷酸。所述組合物之寡核苷酸部分的長度可有顯著不同。此外，所述寡核苷酸可包含二級結(jié)構(gòu)，其包括但不限于源自發(fā)夾、凸起和/或錯配的二級結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，所述寡核苷酸包含與內(nèi)源性成熟的miRNA或piRNA序列(至少)基本上互補(bǔ)(約70% )的序列。
不意在受理論的約束，提高的miRNA抑制劑的性能很可能由抑制劑與靶分子之間結(jié)合親和力的提高所導(dǎo)致。因此，增強(qiáng)雙鏈體穩(wěn)定性或?qū)⒁种苿?miRNA-RISC復(fù)合物鎖定于更理想構(gòu)象的替代策略可進(jìn)一步增強(qiáng)現(xiàn)有miRNA抑制劑設(shè)計的功能。
與小溝結(jié)合劑(“MGB”)綴合的寡核苷酸可與互補(bǔ)序列形成穩(wěn)定的雙鏈體 (Kutyavin,1. V.，et al 2000)。盡管還不完全理解MGB之作用背后的機(jī)制，但已表明MGB 誘導(dǎo)增強(qiáng)雙鏈體穩(wěn)定性的構(gòu)象改變。類似地，與類似大小的非MGB抑制劑相比，預(yù)期MGB與短抑制劑分子的綴合顯著地提高它們的效力。
小溝結(jié)合劑組分還可有顯著不同，并且包括任何數(shù)目的結(jié)構(gòu)。MGB結(jié)構(gòu)的非限制性實(shí)例可見于美國專利No. 5，801, 155和美國專利No. 7，582，739，其通過引用并入本文。這些 MGB可與一個或更多個寡核苷酸的5'和/或3'末端綴合，或者可與寡核苷酸內(nèi)部的一個或更多個核苷酸締合。
本文中公開的組合物可用于抑制miRNA之作用的多種體內(nèi)或體外方法中。例如， 通過施用最佳量的本發(fā)明的抗此類miRNA的MGB拮抗劑，所述組合物可用于治療以過量表達(dá)所述miRNA為特征的疾病或病癥。
附圖簡述
圖1顯示RNAi途徑的一般示意圖。
圖2 (a)顯示與寡核苷酸綴合的兩種MGB構(gòu)型(DPI3和⑶PI3部分)的示意圖。圖 2(b)顯示可取代MGB的示例性位置的示意圖。
圖3顯示雙螢光素酶測定的示意圖。
圖4a顯示多種miRNA抑制劑設(shè)計對let_7c雙螢光素酶報道基因構(gòu)建體的性能。 圖4b顯示多種miRNA抑制劑設(shè)計對miR-21雙螢光素酶報道基因構(gòu)建體的性能。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述
1.概述
本發(fā)明涉及用于抑制RNA干擾(包括siRNA、piRNA和miRNA誘導(dǎo)的基因沉默)的組合物和方法。
本發(fā)明提供用于抑制非編碼RNA(例如，miRNA和piRNA)之作用的組合物和方法。 所述組合物包含通過接頭(linker)與小溝結(jié)合劑(“MGB”)綴合的單鏈或雙鏈寡核苷酸。 該分子的寡核苷酸部分可由RNA、DNA或RNA-DNA雜交體構(gòu)成，其中上述任何核苷酸是經(jīng)修飾或 未修飾的。所述組合物之寡核苷酸部分的長度可具有顯著不同，且范圍從短至6個核苷酸或堿基對(例如，種子區(qū)的最小長度)到長至100個核苷酸或堿基對。此外，所述寡核苷酸可包含二級結(jié)構(gòu)，包括但不限于源自發(fā)夾、凸起和/或錯配的二級結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，所述寡核苷酸包含與內(nèi)源性成熟的miRNA或piRNA序列(至少)基本上互補(bǔ)(約70% )的序列。
圖1是描述RNAi途徑之最基本細(xì)節(jié)的示意圖。內(nèi)源性miRNA首先作為 pr1-miRNA(其最少由具有5'和3'側(cè)翼區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成)而轉(zhuǎn)錄。pri_miRNA經(jīng)Drosha 加工產(chǎn)生pre-miRNA,其由簡單的發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成。pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)出胞核進(jìn)入胞衆(zhòng)中，在此進(jìn)一步地被Dicer加工成為成熟的雙鏈體miRNA，其能夠進(jìn)入RISC，并且通過切割mRNA 或翻譯弱化而使基因表達(dá)沉默。
I1.定義
除非另外說明，以下術(shù)語和短語具有下文中所提供的含義
術(shù)語“報道基因(reporter或reporter gene) ”是指其表達(dá)可被監(jiān)控的基因。例如，可評估報道基因的表達(dá)水平以通過RNAi途徑的底物來評價基因沉默是否成功。
術(shù)語“RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物”及其首字母縮略詞“RISC”是指這樣的一組蛋白質(zhì)，其與單鏈的多核苷酸(例如，成熟的miRNA或siRNA)相復(fù)合以靶向核酸分子(例如， mRNA)而使其發(fā)生切割、翻譯弱化、甲基化和/或其他改變。RISC的已知的非限制性組分包括Dicer、R2D2和Argonaute家族蛋白質(zhì)，以及siRNA和miRNA鏈。
術(shù)語“RNA干擾”和術(shù)語“RNAi”是同義的，是指包含至少一個多核糖核苷酸單位的多核苷酸(miRNA或siRNA)對生物過程發(fā)揮作用的過程。所述過程包括但不限于通過以下方式使基因沉默降解mRNA，弱化翻譯，與tRNA、rRNA、hnRNA、cDNA和基因組DNA相互作用，以及以輔助蛋白質(zhì)使DNA甲基化。
術(shù)語“基因沉默”是指特定基因產(chǎn)物的表達(dá)通過RNA干擾而被降低或弱化的過程。 可通過多種方法測量基因沉默的水平(有時還稱為“敲低”的程度)，包括但不限于通過 Northern印跡分析、B-DNA技術(shù)、轉(zhuǎn)錄敏感的報道基因構(gòu)建體、表達(dá)譜(例如，DNA芯片)、 qRT-PCR和相關(guān)技術(shù)測量轉(zhuǎn)錄物的水平?；蛘?，可通過評估特定基因所編碼蛋白質(zhì)的水平來測量沉默的水平。這·可通過進(jìn)行多項研究而完成，所述研究包括Western分析(其測量具有例如熒光特性(例如，GFP)或酶活性(例如，堿性磷酸酶)之報道基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平)，或者多種其他方法。
術(shù)語“微RNA”、“miRNA”或“miR”都是指能夠進(jìn)入RNAi途徑并且調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA (并且按照上下文的指示，還指編碼這些RNA的DNA序列)?！俺跫塵iRNA”或 “pr1-miRNA”表示Drosha加工之前的非編碼轉(zhuǎn)錄物，并且包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及側(cè)翼的5'和 3'序列?！扒绑wmiRNA”或“pre-miRNA”表示Drosha加工pr1-miRNA之后的非編碼轉(zhuǎn)錄物。 術(shù)語“成熟的miRNA”可以指Dicer加工pre-miRNA所產(chǎn)生的雙鏈產(chǎn)物或者在Dicer加工之后被引入RISC的單鏈產(chǎn)物。在一些情況中，僅單鏈miRNA進(jìn)入RNAi途徑。在另一些情況中，雙鏈miRNA能夠進(jìn)入RNAi途徑。
術(shù)語“成熟鏈”是指內(nèi)源性miRNA中這樣的序列，所述miRNA是目的靶RNA的完全或部分反向互補(bǔ)物(reverse complement)(即，與所述祀RNA完全或部分互補(bǔ))。術(shù)語“成熟的序列”或“靶向鏈”和“靶向序列”是與術(shù)語“成熟鏈”同義的，并且在本文中經(jīng)?；Q使用。
術(shù)語“MGB抑制劑”、“MGB miRNA抑制劑”、“MGB拮抗劑”和“MGB-寡核苷酸miRNA 拮抗劑”可互換使用，并且其是指具有與小溝結(jié)合劑(“MGB”)綴合的寡核苷酸組分并且能夠抑制miRNA或piRNA之作用的分子。
術(shù)語“靶序列”是指與成熟鏈部分地或完全地互補(bǔ)的靶RNA或DNA中的序列?？墒褂肈NA的四種堿基(A、T、G和C)或RNA的四種堿基(A、U、G和C)來描述所述靶序列。
術(shù)語“靶RNA”是指被RNAi途徑(其導(dǎo)致RNA的功能活性降低)所靶向的特定 RNA。在一些情況中，RNA靶標(biāo)是這樣的mRNA，其功能活性是其能夠被翻譯。在這樣的情況中，RNAi途徑會通過翻譯弱化或通過切割來降低mRNA的功能活性。在本公開內(nèi)容中，靶RNA 是這樣的miRNA、piRNA或相關(guān)分子，其功能可通過結(jié)合而被抑制。術(shù)語“靶”還可指DNA。
術(shù)語“互補(bǔ)”是指多核苷酸彼此形成堿基對的能力。堿基對通常是通過反平行的多核苷酸鏈中核苷酸單位之間的氫鍵形成的?；パa(bǔ)的多核苷酸鏈可以以Watson-Crick方式 (例如，A與T、A與U、C與G)或者以允許形成雙鏈體的任何其他方式(包括U與G之間形成的擺動堿基配對)進(jìn)行堿基配對。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，當(dāng)使用與DNA相對應(yīng)的RNA時， 尿嘧啶(而非胸腺嘧啶)被認(rèn)為是與腺苷互補(bǔ)的堿基。然而，除非另外說明，當(dāng)在本發(fā)明的上下文中標(biāo)示為U時，隱含了其可被替換為T。
術(shù)語“雙鏈體”是指彼此形成堿基對的兩個互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的多核苷酸所形成的雙鏈結(jié)構(gòu)，所述堿基對包括允許在至少部分互補(bǔ)的多核苷酸鏈之間形成穩(wěn)定化雙鏈結(jié)構(gòu)的Watson-Crick堿基對和U-G擺動對。雙鏈體形成無需雙鏈體之鏈的完美互補(bǔ)，即雙鏈體可包含一個或更多個堿基錯配。此外，單鏈內(nèi)的兩個互補(bǔ)區(qū)之間可形成雙鏈體(例如，發(fā)夾)。
術(shù)語“核苷酸”是指核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其修飾形式，及其類似物。核苷酸包括包含嘌呤(例如，腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤及其衍生物和類似物)和嘧啶(例如， 胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和類似物)的種類。核苷酸類似物包括在堿基、糖和 /或磷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有修飾的核苷酸，所述修飾包括但不限于5-位嘧啶修飾、8-位嘌呤修飾、胞嘧啶環(huán)外胺處的修飾和5-溴-尿嘧啶的替換；以及2'-位糖修飾，包括但不限于這樣糖修飾的核糖核苷酸，其中2’ -OH被例如以下基團(tuán)所取代H、OR、R、鹵素、SH、SR、 NH2 (NH. sub. 2)、NHR、NR2 (NR. sub. 2)或CN，其中R是烷基部分。核苷酸類似物還意在包括具有堿基(例如，肌苷、辮苷(queuosine)、黃嘌呤)、糖(例如,2'-甲基核糖)、非天然磷酸二酯連接(例如，乙基膦酸酯(ethylphosphonate)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)和肽中的連接)的核苷酸。
經(jīng)修飾堿基是指這樣的核苷酸堿基，例如通過取代或添加一個或更多個原子或基團(tuán)而被修飾的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤、肌苷和辮苷?？砂瑢A基部分進(jìn)行修飾之核苷酸的修飾類型的一些實(shí)例包括但不限于單獨(dú)或組合的烷基化、鹵化、硫醇化(thiolated)、胺化、酰胺化或乙?；膲A基。更多的具體實(shí)例包括例如5-丙炔基尿苷(5-propynyIuridine)、5-丙炔基胞苷(5-propynylcytidine)、6_ 甲基腺嘌呤(6_methyladenine)、6_ 甲基鳥嘌呤(6-methyiguanine)、N, N, - 二甲基腺嘌呤(N, N, -dimethyladenine)、2_ 丙基腺嘌呤(2-propyIadenine)、2-丙基鳥嘌呤(2-pro pylguanine)、2_ 氨基腺嘌呤 (2-aminoadenine)、1-甲基肌苷(1-methylinosine)、3-甲基尿苷(3-methyluridine) >5-甲基胞苷(5-methylcytidine)、5_甲基尿苷(5-methyluridine)以及在5位具有經(jīng)修飾的另一些核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷(5-(2-amino)propyl uridine)、5_鹵代胞苷 (5-halocytidine)、5_ 齒代尿苷(5_halouridine)、4_ 乙酸基胞苷(4-acetylcytidine)、1-甲基腺苷(l-methyladenosine)、2_甲基腺苷(2_methyladenosine)、3_ 甲基胞苷(3-methylcytidine)、6_ 甲基尿苷(6-methyl uridine)>2-甲基鳥苷 (2-methylguanosine)、7_ 甲基鳥苷(7-methylguanosine)、2，2- 二甲基鳥苷(2,2-dimethylguanosine)、5_甲基氨基乙基尿苷(5-methylaminoethyluridine) >5-甲基氧基尿苷(5-methyloxyuridine)、去氮雜核苷酸(deazanucleotide)(例如,7-去氮雜-腺苷(7-deaza-adenosine))、6_ 偶氮尿苷(6_azouridine)、6_ 偶氮胞苷(6-azocytidine)、6-偶氮胸苷(6-azothymidine)、5_甲基-2-硫尿苷(5-methyl-2-thiouridine)、其他含硫堿基(thio base)(例如，2_ 硫尿苷(2_thiouridine)和 4_ 硫尿苷(4_thiouridine)和 2-硫胞苷(2-thiocytidine))、二氫尿苷(dihydrouridine)、假尿苷(pseudouridine)、辯苷(queuosine)、古嘌苷(archaeosine)、萘基(naphthyl)和經(jīng)取代的萘基、任何O-和N-燒基化的嘌呤和嘧啶(例如，N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine)、5-甲基羰基甲基尿苷( 5-methylcarbonylmethyluridine))、尿苷 5_ 輕基乙酸(uridine 5-oxyacetic acid)、批 P定-4-酮(pyridine-4-one)、卩比唳-2-酮(pyridine-2-one)、苯基(phenyl)和經(jīng)修飾的苯基(例如，氨基酌· (aminophenol)或 2,4,6-三甲氧基苯(2,4,6-trimethoxy benzene))、充當(dāng)G-形鉗(G-clamp)核苷酸的經(jīng)修飾胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-取代的尿嘧唳和胸腺卩密唳、氮雜卩密唳(azapyrimidine)、羧基輕基燒基核苷酸(carboxyhydroxyalkyl nucleotide)、羧基燒基氨基核苷酸(carboxyalkylaminoai nleotide)以及燒基擬基燒基化的核苷酸(alkylcarbonylalkylated nucleotide)。經(jīng)修飾的核苷酸還包括對糖部分進(jìn)行修飾的那些核苷酸，例如通過包含W -o、f -C亞甲基橋修飾的修飾核苷酸，以及具有非核糖基之糖或其類似物的核苷酸。例如，所述糖部分可以是或者基于甘露糖、阿拉伯糖、 吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4'-硫代核糖以及其他糖、雜環(huán)或碳環(huán)。
術(shù)語核苷酸還意在包括本領(lǐng)域中稱為通用堿基(universal base)的核苷酸。舉例來說，通用堿基包括但不限于3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素(nebularine)。術(shù)語 “核苷酸”還意在包括N3'至P5'氨基磷酸酯(phosphoramidate),其來自用胺基團(tuán)替換核糖基3'-氧。此外，術(shù)語核苷酸還包括具有與核苷酸相連的可檢測標(biāo)記(例如，放射性或熒光部分)或質(zhì)量標(biāo)記(mass label)的那些種類。
II1.實(shí)施方案的描述
在一個實(shí)施方案中，MGB miRNA抑制劑包含寡核苷酸組分和MGB-接頭組合，所述接頭具有約3至100個選自C、O、N、S、P和Si的主鏈原子。所述接頭可以是三價接頭、支鏈的脂肪族鏈、雜烷基鏈、一個或更多個經(jīng)取代的環(huán)結(jié)構(gòu)，或其組合。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抑制劑包含單鏈寡核苷酸，其(I)長度可在6 100個核苷酸之間，(2)具有與一個或更多個成熟miRNA或piRNA或者成熟miRNA或piRNA之部分基本上互補(bǔ)的區(qū)域，并且(3)通過接頭與一個或更多個小溝結(jié)合劑(MGB)綴合。優(yōu)選地，該分子包含MGB (其為DPI3 或 CDPI3)。
另一個實(shí)施方案涉及用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法；所述方法包括以一定的濃度向細(xì)胞(體外或體內(nèi))中引 入MGB miRNA抑制劑，所述濃度使靶核酸(優(yōu)選miRNA或piRNA)的功能被抑制。
另一個實(shí)施方案涉及治療源自基因之錯誤表達(dá)或者具有不期望功能之基因表達(dá)的疾病或病癥的方法。所述方法包括使用或不使用合適的藥物載劑向懷疑患有所述疾病或病癥的患者施用足夠量的一種或更多種本文中公開的MGB-miRNA抑制劑。
優(yōu)選地，修飾MGB抑制劑之寡核苷酸部分的一個或更多個核苷酸。優(yōu)選的修飾是核苷酸的一些或全部核糖環(huán)之2,碳的O-烷基修飾。這樣的修飾大幅增強(qiáng)該分子與靶核酸的親和力。這就是說，與等長度的簡單的經(jīng)修飾單鏈抑制劑相比，本發(fā)明的MGB抑制劑表現(xiàn)出多種改進(jìn)。最重要的是，MGB抑制劑表現(xiàn)出提高的沉默效力。
當(dāng)開發(fā)本文中所描述的高功能MGB抑制劑時，考慮多種設(shè)計要素。這些包括(I) 單鏈對多鏈的設(shè)計，⑵寡核苷酸長度，⑶寡核苷酸含量(在寡核苷酸的靶向部分和/或非靶向部分中)，⑷寡核苷酸的化學(xué)修飾，(5)MGB綴合物的類型，(6)寡核苷酸上MGB綴合物的位置，以及(7)用于使MGB部分與寡核苷酸相締合的接頭類型。以下描述更加詳細(xì)地說明這些要素的每一個。
A.抑制劑設(shè)計
與MGB增強(qiáng)相容的抑制劑設(shè)計包括單鏈和多鏈設(shè)計。例如，所述抑制劑的寡核苷酸部分可以是單鏈的、完全雙鏈的或者單鏈與雙鏈區(qū)的組合(例如，包含發(fā)夾環(huán))?？膳cMGB 相容之抑制劑設(shè)計的另一些細(xì)節(jié)可見于W02007/095387。
B.寡核苷酸長度
與MGB相締合之寡核苷酸的長度可根據(jù)多種因素而改變，所述因素包括被分子所靶向的內(nèi)源性RNA的長度和抑制劑的所需設(shè)計特性。成熟miRNA的長度可在約18bp至28bp 之間。因此，在一個實(shí)施方案中，與MGB綴合的寡核苷酸長度與被靶向之miRNA成熟鏈反向互補(bǔ)?？筛鶕?jù)miRNA成熟鏈序列確定所有已知miRNA的反向互補(bǔ)物，所述序列可見于桑格研究所(Sanger Institute)維護(hù)的 miRBase (http://microrna· sanger. ac. uk/)。應(yīng)當(dāng)注意的是，預(yù)計miRBase中可獲得的序列列表隨著在所有物種中miRNA序列數(shù)目的擴(kuò)充而增長。因此，MGB抑制劑可靶向之潛在序列的數(shù)目預(yù)計會增長。
在另一些實(shí)例中，研究已證明非MGB抑制劑的性能隨長度增長而提高(參見 Vermeulen et al 2007)。因此，在另一個實(shí)施方案中，MGB抑制劑可包含被靶向之miRNA的反向互補(bǔ)物序列的側(cè)翼序列。這些序列的長度具有顯著不同(在5'和/或3'端的5 100個核苷酸)并且可包含(l)pre-miRNA或pr1-miRNA中成熟序列之側(cè)翼序列的反向互補(bǔ)物，或者(2)與pre-miRNA或pr1-miRNA的反向互補(bǔ)物部分相關(guān)或不相關(guān)的序列。
C. MGB miRNA 抑制劑的 MGB 組分
可將多個MGB并入MGB抑制劑設(shè)計中。在一個非限制性的實(shí)例中，DPI3和⑶PI3 小溝結(jié)合劑配體可使用本領(lǐng)域中已知的范圍廣泛的接頭化學(xué)作用以任何數(shù)目的取向與寡核苷酸相連。優(yōu)選地，小溝結(jié)合劑與抑制劑鏈的3'或5'端綴合，所述抑制劑鏈?zhǔn)抢绨?miRNA之靶向鏈的反向互補(bǔ)物。
圖2(a)是與寡核苷酸綴合之兩種MGB構(gòu)型(DPI3和⑶PI3部分)的示意圖。圖 2(b)是顯示MGB可被取代之位置的示意圖。在圖2(b)中，W是具有約3至100個選自C、O、 N、S、P和Si之主鏈原子的接頭。一般來說，W表示三價接頭、支鏈的脂肪族鏈、雜烷基鏈、 一個或更多個取代的環(huán)結(jié)構(gòu)，或其組合。[A_B]n表示核酸寡聚物(例如，DNA、RNA、PNA或其任何組合，包括具有經(jīng)修飾堿基和糖的那些)，其中A表示用于制備核酸的糖磷酸骨架、 經(jīng)修飾的糖磷酸骨架、鎖核酸骨架、肽骨架或其變體；而B表示核酸堿基、經(jīng)修飾堿基或堿基類似物，下文中更詳細(xì)地描述。下標(biāo)η是約3至約1 00 (優(yōu)選6至約50，且更優(yōu)選8至約 20)的整數(shù)。符號^1 。、1^、1^和1^表示選自11、鹵素、((1-(8)烷基、(《^0^)2、礦0^)3、 SRg, CORg, CO2Rg, CON(Rg)2, (CH2)mSO3' (CH2)mCO2' (CH2) m0P03_2 和 NHC (O) (CH2)mC02_ 及其酯和鹽的取代基，其中Rg各自獨(dú)立地是H或(C1-C8)烷基，且下標(biāo)m是O至6的整數(shù)。符號Rh和 Rw表示H或具有I 30個選自C、N、0、P和S之原子的基團(tuán)(通常是用于固相合成中的連接基團(tuán)的殘余部分(vestige))，所述基團(tuán)是環(huán)狀的、無環(huán)的或其組合，并且具有額外的氫原子以填充可用的化合價。取代基的另一些實(shí)例可見于美國專利申請公開No. 2005/0118623。
如上文所述，取代基A可包含脫氧呋喃核糖磷酸骨架或呋喃核糖磷酸骨架。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，如以下所示取代所述呋喃核糖
權(quán)利要求
1.用于抑制非編碼RNA的抑制劑組合物，其包含寡核苷酸；以及小溝結(jié)合劑(MGB)。
2.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其還包含接頭，所述MGB通過所述接頭與所述寡核苷酸相連接。
3.權(quán)利要求2的抑制劑組合物，其中所述接頭在鏈中包含約3至約100個選自C、0、N、 S、P和Si的原子。
4.權(quán)利要求2的抑制劑組合物，其中所述接頭包含三價結(jié)構(gòu)、支鏈的脂肪族鏈、雜烷基鏈、一個或更多個經(jīng)取代的環(huán)結(jié)構(gòu)或其組合。
5.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸是單鏈的、雙鏈的或其組合。
6.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸包含RNA、DNA或其組合。
7.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸包含約6至約100個核苷酸。
8.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸包含一個或更多個二級結(jié)構(gòu)。
9.權(quán)利要求8的抑制劑組合物，其中所述二級結(jié)構(gòu)包括發(fā)夾、凸起、錯配或其組合。
10.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸與內(nèi)源性成熟的miRNA或piRNA序列基本上互補(bǔ)。
11.權(quán)利要求10的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸與內(nèi)源性成熟的miRNA或PiRNA 序列至少約70%互補(bǔ)。
12.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸包含一個或更多個經(jīng)修飾堿基。
13.權(quán)利要求12的抑制劑組合物，其中所述一個或更多個經(jīng)修飾堿基包括5_丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N，N，-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、 2_丙基鳥嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷以及在 5位具有修飾的其他核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-齒代胞苷、5-齒代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2，2_ 二甲基鳥苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、7-去氮雜-腺苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6_偶氮胸苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、2-硫胞苷、二氫尿苷、假尿苷、 辮苷、古嘌苷、萘基、N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-羥基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、氨基酚、2，4，6-三甲氧基苯、經(jīng)修飾的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基氨基核苷酸、烷基羰基烷基化的核苷酸及其組合。
14.權(quán)利要求12的抑制劑組合物，其中所述一個或更多個經(jīng)修飾堿基包含一個或更多個具有核糖環(huán)2/碳之O-烷基修飾的堿基。
15.權(quán)利要求12的抑制劑組合物，其中所述一個或更多個經(jīng)修飾堿基包含一個或更多個具有2'鹵素修飾的堿基。
16.權(quán)利要求12的抑制劑組合物，其中所述一個或更多個經(jīng)修飾堿基包含一個或更多個具有Y膽固醇修飾的堿基。
17.權(quán)利要求12的抑制劑組合物，其中所述一個或更多個經(jīng)修飾堿基包含一個或更多個具有以下結(jié)構(gòu)的堿基
18.權(quán)利要求1的抑制劑組合物,其中所述寡核苷酸包含一個或更多個通用堿基。
19.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸包含一個或更多個具有可檢測標(biāo)記的核苷酸。
20.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸包含一個或更多個包含脫氧呋喃核糖或呋喃核糖的核苷酸。
21.權(quán)利要求20的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸包含一個或更多個包含具有以下 結(jié)構(gòu)之呋喃核糖的核苷酸
22.權(quán)利耍求1的抑制劑組合物，其中所述寡核苷酸包含一個或更多個硫代磷酸酯、甲 基膦酸酯或氨基磷酸酯。
23.權(quán)利要求1的抑制劑組合物,其中所述寡核苷酸包含靶序列成熟鏈之反向互補(bǔ)物 的序列。
24.權(quán)利要求23的抑制劑組合物,其還包含側(cè)翼序列。
25.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述MGB與所述寡核苷酸的5'端綴合。
26.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述MGB與所述寡核苷酸的3'端綴合。
27.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述MGB是DPI3或CDPI3O
28.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述MGB包含選自以下的結(jié)構(gòu)
29.權(quán)利要求28的抑制劑組合物，其中所述結(jié)構(gòu)中的環(huán)包含一個或更多個選自以下的取代H、鹵素、(C「C8)烷基、0Rg、N(Rg) 2、N+(Rg) 3、SRg、C0Rg、CO2Rg'CON(Rg)2、(CH2)mSO3' (CH2) mC02_、(CH2)m0P03_2和NHC (O) (CH2)mC02_及其酯和鹽，其中Rg各自獨(dú)立地是H或(C「C8)烷基， 并且下標(biāo)m是O至6的整數(shù)。
30.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述MGB選自CC1065、來紡菌素類、偏端霉素、 紡錘菌素、三氮脒、倍癌霉素、戊烷脒、4，6- 二氨基-2-苯基吲哚、司替巴脒、4，4' - 二乙酰基二苯基脲雙(脒基腙)(DDUG)和吡咯并[2，l-c] [1,4]苯并二氮罩及其任何類似物。
31.權(quán)利要求1的抑制劑組合物，其中所述抑制劑組合物包含以下結(jié)構(gòu)之一
32.體外或體內(nèi)抑制miRNA活性的方法，其包括將權(quán)利要求1的抑制劑組合物引入存在 miRNA活性的體外或體內(nèi)位置。
33.治療以過量表達(dá)miRNA為特征之病癥的方法，其包括以足以抑制所述miRNA之作用的濃度向?qū)ο笫┯脵?quán)利要求1的抑制劑組合物。On
全文摘要
本發(fā)明提供了用于抑制非編碼RNA(例如，miRNA)之作用的組合物和方法。所述組合物包含與小溝結(jié)合劑(“MGB”)綴合的單鏈或雙鏈寡核苷酸。所述寡核苷酸可具有不同長度，可包含具有一個或更多個修飾的核苷酸，并且具有與一個或更多個成熟的miRNA或piRNA基本上互補(bǔ)的區(qū)域。
文檔編號C12N15/113GK103025872SQ201080059311
公開日2013年4月3日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者阿納斯塔西婭·赫沃羅娃, 安納倫·韋爾默朗, 羅布·凱澤爾, 約恩·凱皮洛, 尼古拉斯·韋爾默朗, 沃爾特·馬奧尼 申請人:艾泰控股有限公司, 達(dá)瑪空股份有限公司