專利名稱：一種提高間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的預(yù)處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的預(yù)處理方法，可提高細(xì)胞移植后 修復(fù)損傷組織的能力。
背景技術(shù)：
目前充血性心力衰竭發(fā)病率逐年升高，是65歲以上人群的首要住院原因，也是 心血管疾病死亡的主要原因。細(xì)胞移植療法可促進(jìn)梗死局部血管新生和心肌再生，進(jìn)而 改善心肌梗死后的心功能，已成為目前心血管領(lǐng)域的研究熱點。然而可供移植的細(xì)胞中 胚胎心肌細(xì)胞增殖能力有限、取材不便，骨骼肌成肌細(xì)胞不能與心肌細(xì)胞形成縫隙連接 且有致心律失常作用，導(dǎo)致該治療手段止步不前。因此，以干細(xì)胞為種子資源的細(xì)胞治 療成為進(jìn)行損傷組織修復(fù)和替代的重要手段。成功建立干細(xì)胞治療需要以下幾大要素具備自我更新，多向分化潛能以及免 疫調(diào)節(jié)等特性的干細(xì)胞群體；來源廣泛；移植后不發(fā)生并發(fā)癥和腫瘤形成。間充質(zhì)干 細(xì)胞(MSC)是一類最早從成體骨髓中分離獲得的多能性干細(xì)胞，具有分化為成骨細(xì)胞， 軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞的潛能以及免疫調(diào)節(jié)作用。由于其特有的生物學(xué)性狀， 它能作為細(xì)胞治療的種子資源，參與治療骨骼肌肉損傷，改善心血管疾病引發(fā)的心肌功 能衰退，緩解移植物與宿主之間的免疫排斥現(xiàn)象。除了骨髓能作為MSC來源外，研究 證實其還存在于如脂肪，子宮內(nèi)膜，羊膜液，骨膜，臍帶血等成體或胚胎組織中。然而 目前所有用于臨床試驗的人骨髓MSC均在含動物源性的血清如胎牛血清或血清替代物 的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)擴(kuò)增，使用這類種子資源進(jìn)行細(xì)胞治療可能會導(dǎo)致各種異源污染(如 蛋白酶傳染性因子，病毒和病原微生物)，也有可能引發(fā)異種抗原(如非人源唾液酸 N-glycolylneuraminic acid和牛載脂蛋白B-100)導(dǎo)致的免疫反應(yīng)。雖然已有研究試圖采 用自體或異體的血清或血漿代替胎牛血清來培養(yǎng)人骨髓MSC，但存在一定的局限性，首 先供體能提供的自體血清或血漿有限，無法滿足MSC擴(kuò)增的需要；其次異體血清或血漿 可能會導(dǎo)致MSC生長停滯或極速衰老。因此，優(yōu)化干細(xì)胞培養(yǎng)體系將有助于提高其未來 的臨床應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是優(yōu)化干細(xì)胞培養(yǎng)體系，提供一種提高間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的預(yù) 處理方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種提高間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的預(yù)處理方法，所述方法包括將傳代穩(wěn)定的 間充質(zhì)干細(xì)胞于無血清預(yù)處理培養(yǎng)基中，常規(guī)條件下培養(yǎng)4 5天，獲得處理后的間充質(zhì) 干細(xì)胞；處理后的細(xì)胞可直接用于細(xì)胞移植；所述無血清預(yù)處理培養(yǎng)基組成如下N2添加劑 終濃度為1 X
B27添加劑 終濃度為1 XIGF5 20ng/ml PDGF 或 bFGF 5 20ng/ml溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基或高糖DMEM培養(yǎng)基。其中N2，B27添加劑為市購商品，其成分確定且唯一，其終濃度為IX，意思 是其中各組分在預(yù)處理培養(yǎng)基的終濃度與1XN2和1XB27中相同。N2，B27是美國 Invitrogen公司生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)基添加成分，用于作為神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的添加成分， 2006美國PNAS雜志報道在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1XN2和1XB27，并輔助添加 bFGF能長期維持人胚胎干細(xì)胞的自我更新和定向分化潛能，但尚未有文獻(xiàn)證實這類添加 成分能維持組織來源的MSC的增殖和保持細(xì)胞形態(tài)。市購商品多為50X或100X母 液，按比例(1/50體積或1/100體積)添加使其終濃度為IX即可。50XN2母液主要包 含ImM人源轉(zhuǎn)鐵蛋白，8.61 μ M重組人胰島素，ImM孕酮，ImM四甲烯二胺和ImM亞 硒酸。Β27主要包含D-生物素，牛血清白蛋白(BSA fraction V，無脂肪酸)，過氧化氫 酶，L-肉堿鹽酸，皮質(zhì)酮，乙醇胺鹽酸，D-半乳糖，谷胱甘肽，人重組胰島素，亞麻 酸，孕酮，亞硒酸鈉，過氧化物歧化酶，白蛋白，維生素E和人源轉(zhuǎn)鐵蛋白。本發(fā)明的要點在于利用N2，B27完全代替常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基中的FBS，并輔助添 加不同組合的細(xì)胞因子(IGF/PDGF或IGF/bFGF組合)，培養(yǎng)后能增加MSC基質(zhì)金屬蛋 白酶-2(MMP_2)的表達(dá)和分泌，一定程度提高細(xì)胞的運動能力。所述培養(yǎng)在常規(guī)條件下進(jìn)行，具體于37°C下、在(02體積濃度5%、空氣體積濃 度95%的混合氣體中進(jìn)行。具體的，所述方法如下將繼代第8 11代的間充質(zhì)干細(xì)胞于無血清預(yù)處理培 養(yǎng)基中，于37°C下、在(02體積濃度5%、空氣體積濃度95%的混合氣體中培養(yǎng)4 5 天，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞；所述無血清預(yù)處理培養(yǎng)基組成如下N2添加劑終濃度為IXB27添加劑終濃度為IXIGF 10ng/mlPDGF 或 bFGF 10ng/ml溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明通過該無血清預(yù)處理培養(yǎng)基培養(yǎng)，能保 持MSC細(xì)胞學(xué)特征，并有效提高其體內(nèi)移植后的遷移能力，進(jìn)而提高M(jìn)SC移植治療各種 損傷疾病的能力。


圖1為經(jīng)血來源的MSC分別經(jīng)兩種無血清培養(yǎng)基(N2B27+10ng/mlIGF+10ng/ ml PDGF, N2B27+10ng/ml IGF+lOng/ml bFGF)培養(yǎng)5天后的形態(tài)學(xué)特征，標(biāo)尺為 IOOym ；圖2為經(jīng)血來源的MSC分別經(jīng)兩種無血清培養(yǎng)基(N2B27+10ng/mlIGF+10ng/ml PDGF, N2B27+10ng/ml IGF+10ng/ml bFGF)培養(yǎng)5天后的表面抗原表達(dá)情況；圖3為利用transwell技術(shù)比較不同培養(yǎng)體系下培養(yǎng)4天的經(jīng)血MSC的體外遷移能力，標(biāo)尺為IOOym;圖4為利用流式細(xì)胞技術(shù)比較不同培養(yǎng)體系下培養(yǎng)5天的經(jīng)血MSC移植入大鼠 心梗模型后的遷移情況。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限 于此實施例1 1、第10代經(jīng)血來源的MSC (杭州易文賽生物技術(shù)有限公司)常規(guī)培養(yǎng)于含20% FBS (ν/ν)(杭州四季青生物工程材料有限公司)的低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen公 司)中，一旦匯集，采用0.25%胰酶(w/v)-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA) (w/v)(吉諾生 物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)消化傳代。2、待經(jīng)血MSC生長至50%匯合度，去除常規(guī)的含20% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基，采 用無血清低糖DMEM洗滌3次以上，隨后分別添加含10ng/mlIGF，10ng/ml PDGF (英 國PeproTech公司)的無血清N2BW培養(yǎng)基(N2，B27,美國Invitrogen公司)(N2，B27 終濃度為1 X，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基)，或含10ng/ml IGF, 10ng/ml bFGF (英國 PeproTech公司)的無血清N2B27培養(yǎng)基(N2，B27終濃度為1 X，溶劑為低糖DMEM 培養(yǎng)基)，置于37°C，含5% CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma 3111，美國Thermo Fisher公司)內(nèi)培養(yǎng)4 5天，隔日更換培養(yǎng)基。3、5天后，對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)和表面抗原表達(dá)的鑒定分別獲得不同培養(yǎng)體 系下培養(yǎng)的人經(jīng)血MSC，經(jīng)磷酸緩沖液(PBS)常溫洗滌2次，采用0.25%胰酶-0.02% EDTA室溫消化2 3分鐘，添加含血清培養(yǎng)基終止消化，收集，于室溫1200rpm離心5 分鐘，棄去上清，并添加PBS離心洗滌2次，最后重懸于PBS中，制備成5X107100 μ 1 細(xì)胞懸液，各添加 20 μ 1 Human Fc Receptor Binding Inhibitor Purified (美國 eBioscience 公 司)，4°C孵育20分鐘，隨后依次添加抗人CD29，CD166抗體及其同型對照抗體(美國 eBioscience公司)，避光4°C孵育45分鐘，1500rpm離心5分鐘去除抗體，添加PBS離心 洗滌2次，最后添加500 μ 1 PBS重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞儀(美國BD公司)計數(shù)，對于每個 樣本至少計數(shù)1Χ104，數(shù)據(jù)采用流式細(xì)胞儀自帶軟件(美國BD公司)分析。經(jīng)血來源的MSC分別經(jīng)兩種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后的形態(tài)學(xué)特征見圖1，與 常規(guī)的DMEM+20%FBS培養(yǎng)相比，按照本發(fā)明方法預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞狀態(tài)更佳，保持典 型的成纖維細(xì)胞形態(tài)；經(jīng)血來源的MSC分別經(jīng)兩種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后的表面抗原表達(dá)情況見 圖2，與常規(guī)的DMEM+20% FBS培養(yǎng)相比，兩者在MSC特異性表面抗原標(biāo)志CD29， CD166方面表達(dá)情況相似。4、利用Tnmswell評價人經(jīng)血MSC的體外遷移能力分別獲得不同培養(yǎng)體系下 培養(yǎng)4天的人經(jīng)血MSC，消化收集后，各采用200 μ 1含1 % FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基 重懸，制備成4 X IO4細(xì)胞懸液，接種于Transwell小室(美國Costar公司，孔徑為8 μ m) 中，小室外添加500μ1含20% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37°C，含5% CO2和飽 和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20-24小時。隨后，取出Tnmswell小室，用棉簽擦去小室膜上層細(xì)胞，PBS輕柔洗滌2次后，置于4%多聚甲醛(美國Sigma公司)內(nèi)，37°C固定30 分鐘，PBS洗滌2-3次后，采用1 μ g/ml Hoechst 33258 (美國Invitrogen公司)室溫避光 染色15分鐘，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)拍照記錄。結(jié)果見圖3。與常規(guī)含血 清培養(yǎng)基相比，采用本發(fā)明方法預(yù)處理后的細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)。5、利用大鼠急性心梗模型的體內(nèi)移植來評價人經(jīng)血MSC的體內(nèi)遷移能力 Sprague Dawley(SD)大鼠(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)經(jīng)水合氯醛麻醉后，氣管插管， 小動物呼吸機(jī)支持，開胸，用6-0絲線在左心耳下方結(jié)扎左前降支冠脈，根據(jù)心電圖變 化和局部組織顏色變化確定心梗模型制成，關(guān)胸。分別獲得不同培養(yǎng)體系下培養(yǎng)5天的 人經(jīng)血MSC，PBS輕柔洗滌2 3次后，添加5μ IDiI(美國MolecularProbes公司)/Iml 低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37°C，含5% CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20分鐘，隨 后采用PBS輕柔洗滌3次，徹底去除Dil，消化收集細(xì)胞，分別采用300 μ 1低糖DMEM 重懸，通過尾靜脈注射入SD大鼠心梗模型中，20 24小時后，引頸處死大鼠，分別取 出心臟左室，骨髓，肺，脾臟，勻漿或lmg/mll型膠原酶(美國Sigma公司)消化后獲得 細(xì)胞懸液，離心洗滌后，采用紅細(xì)胞裂解液，冰上處理4 10分鐘，2000-3000rpm離心 10分鐘后采用適量PBS重懸，流式細(xì)胞儀計數(shù)，對于每個樣本至少計數(shù)2 X 105，數(shù)據(jù)流 式細(xì)胞儀自帶軟件分析。結(jié)果見圖4，與常規(guī)含血清培養(yǎng)基相比，采用本發(fā)明方法預(yù)處理后的細(xì)胞體內(nèi)遷 移能力更強(qiáng)。結(jié)論無血清培養(yǎng)基(N2B27+10ng/mlIGF+10ng/ml PDGF，N2B27+10ng/ml IGF+10ng/ml bFGF)預(yù)處理后能維持MSC典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)和表面抗原標(biāo)志的表 達(dá)，同時也能提高其體內(nèi)體外的運動遷移能力，進(jìn)一步提高M(jìn)SC移植治療各種損傷疾病 的效果。
權(quán)利要求
1.一種提高間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的預(yù)處理方法，所述方法包括將傳代穩(wěn)定的間 充質(zhì)干細(xì)胞于無血清預(yù)處理培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 5天，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞；所述無血清預(yù)處理培養(yǎng)基組成如下N2添加劑終濃度為1 XB27添加劑終濃度為1 XIGF 5 20ng/mlPDGF 或 bFGF 5 20ng/ml溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基或高糖DMEM培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)于37°C下、在(02體積濃度5%、 空氣體積濃度95%的混合氣體中進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下將繼代第8 11代的間 充質(zhì)干細(xì)胞于無血清預(yù)處理培養(yǎng)基中，于37°C下、在(02體積濃度5%、空氣體積濃度 95%的混合氣體中培養(yǎng)4 5天，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞；所述無血清預(yù)處理培養(yǎng)基 組成如下N2添加劑終濃度為1 X B27添加劑終濃度為1 X IGF 10ng/ml PDGF 或 bFGF 10ng/ml 溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的預(yù)處理方法，所述方法包括將傳代穩(wěn)定的間充質(zhì)干細(xì)胞于無血清預(yù)處理培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4～5天，獲得處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞用于細(xì)胞移植；所述無血清預(yù)處理培養(yǎng)基組成如下1×N2添加劑，1×B27添加劑，5～20ng/mlIGF，5～20ng/ml PDGF或bFGF，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基或高糖DMEM培養(yǎng)基；本發(fā)明通過該無血清預(yù)處理培養(yǎng)基培養(yǎng)，能保持MSC細(xì)胞學(xué)特征，并有效提高其體內(nèi)移植后的遷移能力，進(jìn)而提高M(jìn)SC移植治療各種損傷疾病的能力。
文檔編號C12N5/0775GK102021143SQ20101055749
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者吳蓉蓉, 王建安 申請人:浙江大學(xué)