專利名稱：：來(lái)自破囊壺菌屬(Thraustochytrid)的△6去飽和酶及其用途的制作方法來(lái)自破嚢壺菌屬(77zmMstoc/^加v0的a6去飽和酶及其用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及從裂殖壺菌(5b/n'zoc/^n'Mm)分離的A-6去飽和酶基因。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在酵母中克隆來(lái)源于裂殖壺菌的A-6去飽和酶。揭示了A-6去飽和酶的核酸序列和氨基酸序列。進(jìn)一步揭示了構(gòu)建體、包含與異源調(diào)節(jié)序列功能性組合的編碼A-6去飽和酶這種酶的基因的載體。所述新型a-6去飽和酶可用于將亞油酸轉(zhuǎn)化為y亞麻酸的代謝途徑(co-6途徑)。本發(fā)明提供來(lái)自裂殖壺菌的這些編碼上述蛋白質(zhì)的新型核酸的鑒定、分離。本發(fā)明具體列舉了帶有包含該A-6去飽和酶基因的載體的重組酵母細(xì)胞，其依靠所產(chǎn)生的酶將能夠產(chǎn)生？亞麻酸。可將使用該酶生產(chǎn)的多不飽和脂肪酸加入到藥物組合物、營(yíng)養(yǎng)組合物、動(dòng)物祠料以及其它制品例如化妝品中。發(fā)明背景△-6去飽和酶是合成高度不飽和脂肪酸例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸所需的關(guān)鍵酶。n-6途徑的主要代謝產(chǎn)物是花生四烯酸(20:4n-6)，而n-3途徑的主要終產(chǎn)物是二十碳五烯酸(EPA)(20:5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA)(22:6n-3)。20碳和22碳(n-6)和(n-3)多烯脂肪酸的可得性(availability)主要取決于A-6去飽和酶使18:2(n-6)和18:3(n-3)去飽和的速率。A-6去飽和酶是孩t粒體酶，^皮認(rèn)為是包括NADH-細(xì)胞色素b5還原酶、細(xì)胞色素b5和A-6去飽和酶的三酶系統(tǒng)中的組分。A-6去飽和酶催化PUFA合成的第一步、也是限速步驟。它對(duì)于通過(guò)去飽和延長(zhǎng)途徑的脂肪酸流起閘門的作用。盡管其可作用于任何長(zhǎng)鏈脂肪酸，但底物結(jié)合親合力隨著業(yè)已存在的雙鍵數(shù)目而大大增加。最近鑒定的人缺乏A-6去飽和酶的病例強(qiáng)調(diào)了該途徑的重要性(Nakamura等，2003)。不飽和脂肪酸例如亞油酸和a-亞油酸為不能由脊推動(dòng)物合成的必需飲食成分，因?yàn)榧雇苿?dòng)物細(xì)胞能在脂肪酸的A-9位引入雙鍵，但不能在脂肪酸的A-9和曱基末端之間引入另外的雙鍵。因此很顯然，動(dòng)物不能在△-9位以外的地方去飽和，因此不能將油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸，同樣地，哺乳動(dòng)物不能合成y-亞麻酸。因?yàn)閬営退岷蚢-亞油酸為其它產(chǎn)物的前體，所以它們是必需脂肪酸(不能由機(jī)體合成并因此需要構(gòu)成飲食的部分)，并且通常由植物來(lái)源獲得。哺乳動(dòng)物可將亞油酸轉(zhuǎn)化為Y-亞麻酸，后者可進(jìn)而轉(zhuǎn)化為花生四烯酸(20:4),花生四烯酸是一種極為重要的脂肪酸，因?yàn)槠錇榇蟛糠智傲邢偎氐谋匦枨绑w。此外，由亞油酸、a-亞麻酸和油酸轉(zhuǎn)化為高度多不飽和脂肪酸的動(dòng)物生物轉(zhuǎn)化，主要由A6和A5去飽和酶經(jīng)由飲食和激素刺激機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)。(ProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids68(2):151-62.)。由于前述原因，對(duì)A-6去飽和酶這種酶、編碼該酶的相應(yīng)基因、包括生產(chǎn)該酶的重組方法存在明確的需求。通過(guò)飲食攝入富含這樣的PUFA的植物來(lái)源，目前業(yè)已滿足對(duì)這些必需脂肪酸的需求。^f旦存在不足之處，因?yàn)檫@些天然來(lái)源在可得性上總是遭遇無(wú)法控制的波動(dòng)。而且，植物油具高異質(zhì)性組成，需要大量的純化程序來(lái)分離特定的目標(biāo)多不飽和脂肪酸(US20060035351)。然而，為滿足日益增長(zhǎng)的全球人口的需求，不得不探索成本有效的替代物。本發(fā)明涉及將編碼分離自海洋生物裂殖壺菌的A-6去飽和酶的基因?qū)氲浇湍?，以生產(chǎn)脂肪酸，例如Y-亞麻酸、十八碳四烯酸和在co-3/co-6脂肪酸生物合成途徑中由各自底物生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的其它脂肪酸。酵母作為在合適的培養(yǎng)基中表達(dá)脂肪酸的良好系統(tǒng)，提供了大量?jī)?yōu)勢(shì)。很久以來(lái)酵母就被公認(rèn)為蛋白質(zhì)表達(dá)宿主，并用作蛋白質(zhì)表達(dá)宿主，因?yàn)槠淇商峁┘庸は到y(tǒng)連同方便使用的微生物系統(tǒng)。作為宿主，其擁有許多優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠浼瓤捎糜谏a(chǎn)分泌型蛋白，又可用于生產(chǎn)可能需要翻譯后修飾的胞質(zhì)蛋白，其生物合成途徑在很多方面象高等真核細(xì)胞。而且，與其它真核系統(tǒng)相比，對(duì)其遺傳學(xué)的了解要深入得多，且其與大腸桿菌(E.co/t)相似，易于操作。表達(dá)水平也在每升培養(yǎng)物幾個(gè)毫克的范圍內(nèi)。業(yè)已鑒定了很多A-6去飽和酶。在植物例如牧草琉璃苣(Boragoofficianalis)中，業(yè)已鑒定出A-6去飽和酶(Sayanova等，1997)。在人類(Hyekyung等，l"9)、動(dòng)物例如線蟲秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)(Michaelson等，1998和Napier等，1998)和真核微生物例如真菌高山被孢霉(Mortierellaalpina)(Hunag等，1999和Knutzon等，1998)中，同樣業(yè)已鑒定A-6去飽和酶。按照本發(fā)明所述方面，提供包含編碼分離自海洋生物裂殖壺菌的A-6去飽和酶的DNA序列的分離的核酸分子。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及分離的編碼具有去飽和酶活性的多肽分子的核酸序列或其片段，其核酸序列示于SEQID.No.1中，其氨基酸序列示于SEQID.No.2中。本發(fā)明包括分離的核S吏序列或其片段，其包含與SEQID.No.l所示核苷酸序列具有至少70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%核苷酸序列同一性的核酸序列，或與所述核酸序列互補(bǔ)。本發(fā)明還包括分離的編碼具有去飽和酶活性的多肽的核酸序列或其片段，其中所述多肽包含與SEQID.No.2所示的氨基酸序列具有至少70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。上述核苦酸序列編碼用單不飽和或多不飽和脂肪酸作為底物的功能活性的A-6-去飽和酶。該核苷酸序列分離自裂殖壺菌SC-1。另外，本發(fā)明包括鑒定、分離和克隆編碼A-6去飽和酶的核酸序列和氨基S吏序列的方法，該方法包括如下步驟(1)用部分S-4去飽和酶基因進(jìn)行cDNA文庫(kù)篩選，導(dǎo)致鑒定出部分cDNA克隆；(2)用該部分cDNA克隆篩選裂殖壺菌SC-1的BAC文庫(kù)，以^使鑒定陽(yáng)性BAC克?。?3)對(duì)陽(yáng)性BAC克隆進(jìn)行鑒定和測(cè)序，進(jìn)一步鑒定全長(zhǎng)序列內(nèi)的A-6去飽和酶ORF;(4)構(gòu)建包含與SEQID1所示序列有至少90%序列同一性的載體；(5)通過(guò)轉(zhuǎn)化，在足以表達(dá)所述去飽和酶的條件和時(shí)間下，將所構(gòu)建的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。宿主細(xì)胞可為例如真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。原核細(xì)胞可為例如大腸桿菌，原核細(xì)胞可為例如真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或才直物細(xì)月包，{旦優(yōu)選酵母細(xì)月包，例如酉良酒酵母(Sacc/^row少cescerev/w'ae)。其它合適的宿主細(xì)胞可包括解脂耶氏酵母(7amnv/a印o/,'ca)、假絲酵母(Ca"(i油w)、漢遜酵母(/7a"化"w/"s//)等等。本發(fā)明具體實(shí)施方案闡述了包含編碼具有A-6去飽和酶活性的多肽的核香酸序列或其片段的載體的構(gòu)建，其中所述多肽包含與SEQID.NO.2所示序列具有至少70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其在最佳條件下操作性連接到調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子和終止子)，以便表達(dá)酶△-6去々包和酶。另外，本發(fā)明包括包含以上載體的酵母細(xì)胞，其中A-6去飽和酶的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生？亞麻酸。本發(fā)明的再一方面涉及對(duì)表達(dá)A-12和A-6去飽和酶的酵母克隆的誘導(dǎo)，顯示出形成亞油酸和y亞麻酸。由芥菜CBra^/cay，cae)A-12去飽和酶在體內(nèi)將油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸。隨后由克隆的SC-1A-6去飽和酶催化，使亞油酸去飽和為y亞麻酸。在所述發(fā)明范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)證明了SC-1A-6去飽和酶在酵母中的功能表達(dá)。附圖和序列的詳細(xì)說(shuō)明圖1:SC-1的A-6去^L和酶與其它已知A-6去^l和酶的聚類。(注意在所有物種中組氨酸基序的存在對(duì)去飽和酶的功能必不可少)。圖2:SC-1的A-6去飽和酶中存在脂肪酸去飽和酶基序和細(xì)胞色素(Cytocrome)B-5結(jié)構(gòu)域。圖3:A-6去飽和酶(全長(zhǎng))與用EcoRI(E)和PstI(P)消化的SC1基因組DNA的DNA印跡雜交；M-lkb序列梯。(雜交結(jié)果清楚地表明，SC-1中存在單拷貝的A-6去飽和酶。)圖4:構(gòu)建體PET-SC-1-D6的圖譜。圖5:用Gall引物擴(kuò)增所述克隆。圖6:含有MCSI中的A-6去飽和酶和MCSII中的A-12去飽和酶的pESC-Trp構(gòu)建體的圖譜。該構(gòu)建體稱為PET-D6SCl-D12BJ-CO。圖7:從PET-D12-D6構(gòu)建體擴(kuò)增A-12和A-6去飽和酶(泳道M:1KB序列梯；1:A-12去飽和酶的擴(kuò)增，和2:A-6去飽和酶的擴(kuò)增。)SEQID.No.1:分離自裂殖壺菌SC1的△-6-去飽和酶的核酸序列。SEQID.No.2:分離自裂殖壺菌SCI的A-6-去飽和酶的氨基酸序列。發(fā)明詳述通過(guò)A-6去飽和酶將亞油酸轉(zhuǎn)化為亞麻酸。本發(fā)明涉及分離的編碼A-6去飽和酶的核酸序列。本發(fā)明更具體地涉及來(lái)源于海洋生物裂殖壺菌的A-6去飽和酶基因的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列，其中所述基因通過(guò)篩選裂殖壺菌的BAC文庫(kù)而得到。本發(fā)明進(jìn)一步涉及將包含本發(fā)明核酸片段或其編碼功能酶的部分連同指導(dǎo)其mRNA轉(zhuǎn)錄的合適的調(diào)節(jié)序列的載體轉(zhuǎn)移到活細(xì)胞，藉此引起特定的A-6去飽和酶的產(chǎn)生，導(dǎo)致將亞油酸轉(zhuǎn)化為Y-亞麻酸，在本發(fā)明上下文中所述活細(xì)胞為酵母細(xì)胞。在本發(fā)明上下文中將使用大量術(shù)語(yǔ)。提供以下定義以便更好地限定本發(fā)明并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除非另外指出，否則術(shù)語(yǔ)應(yīng)該按相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)使用來(lái)理解。去飽和酶去飽和酶是促進(jìn)烴分子中形成碳-碳雙鍵的酶。脂肪酸去飽和酶本文所用術(shù)語(yǔ)"脂肪酸去飽和酶"指催化碳-氫4建斷裂并將碳-碳雙鍵引入到脂肪酸分子的酶。脂肪酸可為游離的，或酯化到另一分子，所述另一分子包括但不限于?；d體蛋白、輔酶A、固醇類和甘油脂的甘油部分。"A-6去飽和酶"指催化在12和13位碳(從曱基端開始編號(hào))之間形成雙鍵的脂肪酸去飽和酶，所述12和13位碳即對(duì)應(yīng)于長(zhǎng)18碳的脂肪?；湹?和7位石友(從羰基碳開始編號(hào))的位置。如本文所述，在本發(fā)明上下文中，A-6去飽和酶催化從亞油酸到Y(jié)-亞麻酸的轉(zhuǎn)化。"分離的核酸片段或序列"為單鏈或雙鏈RNA聚合物，其可任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段組成。重組核酸并非天然存在的序列，或具有由人工序列制備的序列的序列，該人工序列通過(guò)人工組合兩個(gè)在其他情況下為分開的序列區(qū)段來(lái)制備。該人工組合通常通過(guò)化學(xué)合成來(lái)實(shí)現(xiàn)，或更通常通過(guò)人工操作分離的核酸區(qū)段來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)基因工程技術(shù)，例如闡述于Sambrook等MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratorypress,NY,1989中的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。"基因"指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括在前(5，非編碼序歹'J)和在后(3，非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。"啟動(dòng)子"指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達(dá)的DNA序列。"編碼序列"指編碼特定蛋白質(zhì)的DNA序列，其不包括非編碼序列。其可組成"非間斷編碼序列"，即缺乏內(nèi)含子，或其可包括一個(gè)或多個(gè)由合適的剪接界限定的內(nèi)含子。"起始密碼子"和"終止密碼子，，指編碼序列中三個(gè)相鄰核苦酸的單位，其分別限定蛋白質(zhì)合成(mRNA翻譯)的起始和鏈終止。"可讀框，，(ORF)指在起始密碼子和終止密碼子之間不被內(nèi)含子間斷的編碼氨基S復(fù)序列的編碼序列。"操作性連接(operablylinked)"指核酸片段連接以便一個(gè)片段的功能由另一個(gè)片段來(lái)調(diào)節(jié)。"同系物"指享有共同的祖先序列并當(dāng)攜帶該祖先序列的物種分裂為兩個(gè)物種時(shí)趨異的兩種核苷S^f列或氨基酸序列。同系物經(jīng)常表現(xiàn)相當(dāng)大程度的序列同一性。本文的"轉(zhuǎn)化"指將外源基因轉(zhuǎn)移到宿主生物的基因組中并且其在遺傳上穩(wěn)定遺傳。本文所用"表達(dá)，，指來(lái)源于本發(fā)明核酸片段的有義RNA(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達(dá)還指將mRNA翻譯成多肽。術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"、"載體"和"盒"指染色體外元件，其通常攜帶不構(gòu)成細(xì)胞主要新陳代謝部分的基因，所述基因通常呈環(huán)狀雙鏈DNA片段形式。這樣的元件可為起源于任何來(lái)源的自主復(fù)制型序列、基因組整合型序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA,其中很多核苷酸序列已被連接或重組為能夠?qū)?dòng)子片段和所選基因產(chǎn)物的DNA序列連同合適的3'非翻譯序列導(dǎo)入到細(xì)胞中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。"表達(dá)盒"指這樣的特定載體，其含有外源基因且除外源基因外還具有允許該基因在外源宿主中表達(dá)增強(qiáng)的元件。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，用部分A-4去飽和酶基因篩選了裂殖壺菌(SC1)(下文稱為"SCI")cDNA文庫(kù)。這導(dǎo)致鑒定了與各種其它生物體的△-6去飽和酶基因同源的長(zhǎng)617個(gè)堿基對(duì)的克隆。該鑒定的克隆為部分cDNA克隆。根據(jù)本發(fā)明另一方面，將該鑒定的部分克隆用于篩選SCIBAC文庫(kù)。篩選BAC文庫(kù)導(dǎo)致鑒定出包含A-6去飽和酶基因全長(zhǎng)序列的陽(yáng)性克隆。對(duì)該克隆進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序，鑒定出該序列內(nèi)的A-6去飽和酶ORF(可讀框)。A-6去飽和酶的核酸序列業(yè)已示于SEQID1中。該核酸序列翻譯為472個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。來(lái)自SC-1的A-6去飽和酶的氨基酸序列業(yè)已示于SEQID2。本發(fā)明包括來(lái)自其它生物體例如SC-1的其它"可得到的"A-6去飽和酶。"可得到的"指與本文提供的編碼生物活性蛋白質(zhì)的序列具有充分相似序列的那些去飽和酶。在本發(fā)明的再一方面，比較所分離的A-6去飽和酶與不同物種的A-6去飽和酶的同源性程度。分離的A-6去飽和酶的核酸序列與編碼來(lái)自其它生物體的A-6去飽和酶的DNA序列比較為"同源"或"相關(guān)"。"同源'，或"相關(guān)"包括與例示性的生物體例如琉璃苣、五c/2&m取""a"o/iiay、高山被孢霉和畸雌腐霉CfyA/MW/庁egwAare)比較時(shí)為相同或保守取代的那些核酸序列。兩種核酸或兩種氨基酸序列之間的相似性用序列同一性百分比來(lái)表示。兩個(gè)序列之間的序列同一性百分比越高，這兩個(gè)序列就越相似。對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，且在比對(duì)中允許引入空位，用計(jì)算機(jī)算法來(lái)定量同一性區(qū)域。通常用計(jì)算機(jī)程序的默認(rèn)參數(shù)來(lái)設(shè)置允許空位和其它變量。序列比對(duì)的方法為本領(lǐng)域所熟知。各種程序和比對(duì)算法由Pearson等，MethodsinMolecularBiology24:307-331，1994和Altschul等，NatureGenetics.6:119-129,1994闡述。Altschul等對(duì)序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算提出了詳細(xì)的考慮。NCBIBasic局部序列比對(duì)搜索工具(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol,215:403-410，1990)可從幾個(gè)來(lái)源4尋至U,包4舌theNationalCenterofBiotechnologicalInformation(NCBI，Bethesda,Md.)和在互聯(lián)網(wǎng)上，或與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx等聯(lián)合使用。另外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該了解，多肽可具有某些以使多肽功能不改變或受損的方式保守取代的氨基酸。從如圖l所示所進(jìn)行的比較同源性來(lái)看，很顯然在所比較的生物體中組氨Stt序是保守的。在本發(fā)明另一方面，對(duì)A-6去飽和酶序列進(jìn)行基序搜索以確證去飽和酶結(jié)構(gòu)域的存在。基序搜索結(jié)果示于圖No:2中。由此確證該基因具有完整的去飽和酶結(jié)構(gòu)域和功能性去飽和酶特征性的細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。含有所有或部分所揭示核酸的重組核酸，例如SEQID:1中所述的，例如作為計(jì)劃表達(dá)蛋白質(zhì)的克隆的部分，操作性連接到另一核酸元件例如啟動(dòng)子。用于這樣的目的的克隆和表達(dá)系統(tǒng)可市購(gòu)。本發(fā)明也提供含有編碼A-6去飽和酶的DNA的載體。多種宿主細(xì)胞可用于表達(dá)蛋白質(zhì)。例如各種酵母菌抹和酵母來(lái)源的載體通常用于表達(dá)和純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明用釀酒酵母作為表達(dá)所克隆基因的宿主。但也可設(shè)想用其它表達(dá)系統(tǒng)，例如巴斯德畢赤酵母f/c/z/a/a加n^J表達(dá)系統(tǒng)。用于轉(zhuǎn)化合適宿主細(xì)胞的載體或DNA盒為本領(lǐng)域所熟知。然而，通?？蓪⒑兄笇?dǎo)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列的載體或盒、選擇標(biāo)記表達(dá)載體例如pET系統(tǒng)用于表達(dá)目標(biāo)基因。載體可為質(zhì)粒、粘粒或噬菌體，為本發(fā)明目的優(yōu)選質(zhì)粒，所述載體可包含在宿主細(xì)胞中有功能并能引發(fā)由核苷酸序列編碼的去飽和酶的表達(dá)的核苷酸序列(例如啟動(dòng)子)。(啟動(dòng)子與編碼序列"操作性連接")。某些合適的啟動(dòng)子包括編碼T7、TPI、乳糖酶、金屬硫蛋白的基因或在半乳糖存在下被激活的啟動(dòng)子例如GAL1和GALIO。用于表達(dá)的啟動(dòng)子種類應(yīng)該取決于所需表達(dá)產(chǎn)物的種類，還有宿主細(xì)胞的性質(zhì)。例如在本發(fā)明中，GAL1或GAL10啟動(dòng)子用于控制A-6去飽和酶基因序列的表達(dá)?？墒褂枚喾N調(diào)節(jié)序列中的任一種，其取決于所需要的是組成型轉(zhuǎn)錄還是誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄、表達(dá)目標(biāo)ORF的啟動(dòng)子的效率、構(gòu)建的便利性等等。業(yè)已發(fā)現(xiàn)在酵母細(xì)胞中，翻譯起始密碼子'ATG，周圍的核苷酸序列影響表達(dá)，為了達(dá)到所需的表達(dá)水平，可修飾外源基因的某些核苷酸序列。為了在酵母中表達(dá)，這可通過(guò)將低效表達(dá)基因符合讀框地融合到內(nèi)源酵母基因(優(yōu)選高表達(dá)的基因)進(jìn)行定點(diǎn)誘變來(lái)實(shí)施。在轉(zhuǎn)化后，可用有用的選擇標(biāo)記來(lái)選擇成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用于選擇的選擇標(biāo)記不限于鏈霉素(streptomycin)、氨芐青霉素(Ampicillin)等。然后通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的方法，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔或轉(zhuǎn)化，可將構(gòu)建的載體導(dǎo)入所選擇的宿主細(xì)胞。這樣的導(dǎo)入技術(shù)業(yè)已充分闡述于MolecularCloning:AlaboratoryManual.Vol1-3Sambrook等，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中。業(yè)已吸收表達(dá)盒(其已通過(guò)任何吸收DNA序列的方法操作)的宿主細(xì)胞在本文中將^皮稱為"轉(zhuǎn)化的"或"重組的"。本發(fā)明進(jìn)一步用以下實(shí)施例來(lái)闡明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例盡管指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅以舉例方式給出。從上述討論和這些實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可明確本發(fā)明的基本特點(diǎn)，在不偏離其精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修改，以使其適合多種用法和情形。實(shí)施例實(shí)施例1:用部分A-4-去飽和酶基因篩選SC1的cDNA文庫(kù)用通過(guò)對(duì)SC-1cDNA文庫(kù)測(cè)序而得到的部分A-4-去飽和酶基因來(lái)篩選SC1cDNA文庫(kù)，導(dǎo)致鑒定出多個(gè)克隆。發(fā)現(xiàn)617bp的這些克隆之一與幾種生物體的A6去飽和酶同源。所述序列具有直貫穿到273個(gè)堿基的ORJF。3，UTR為401個(gè)堿基。觀察到朝著序列的3，末端的聚腺苷酸化信號(hào)"AATAA"。當(dāng)在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索時(shí)，表明該序列與車前葉藍(lán)薊(五c/n'wmp/awtag/"a)、刺阿干初于^4ragam-as/^Vc^(3)和五c/z/ww^toraKv的A-6去々包和酶的同源性。涉及的方案為-(A)cDNA文庫(kù)接種和轉(zhuǎn)移到膜的方案系列稀釋將1^1cDNA文庫(kù)克隆混合物和9^1SOC放入eppendorf管(稀釋系數(shù)IO-1)，將該管標(biāo)記為A。從A管取出lpl克隆混合物，和加入的9^1Soc—起放于另一新管，標(biāo)記為B(稀釋系數(shù)10-2)。從B管取出1^1克隆混合物，和加入的9j^lSoc—起放于另一新管，標(biāo)記為C。從A、B和C管各取出1微升，加入99^1SOC。接種1.將來(lái)自各管的lOOpl最終克隆混合物接種到分開的LBamp平板。2.讓平板在37。C培養(yǎng)過(guò)夜。3.將具有104細(xì)胞/平板或更多細(xì)胞的平板取出用于轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移到膜上1.為了使克隆正確定位，用墨汁在四個(gè)地方標(biāo)記平板。2.將尼龍膜倒置在平板上，使其浸泡1-2分鐘。3.用無(wú)菌鑷子從一邊夾起膜，然后風(fēng)干，進(jìn)一步吸收用于雜交。(B)通過(guò)隨機(jī)引發(fā)而制備標(biāo)記探針的方案1.將用于標(biāo)記的DNA;容于無(wú)菌水或10mMTrisHC1(pH-8.0)、lmMEDTA到10pg/ml的濃度。2.在95。C讓DNA變性2分鐘(通過(guò)讓含有DNA的小管保持在沸水浴中)，立即在冰上冷卻。3.用以下次序?qū)⒃噭┘尤氲奖３衷谒系男ppendorff管中，以標(biāo)記50ng的DNA:將5pi變性的DNA置于小管中；向其中加入5pl隨機(jī)引物緩沖液，然后加入5)li1隨機(jī)引物溶液，再加入12|ildNTP混合物、2plklenow酶(lU/(il)、18^1無(wú)菌水。4.蓋上管蓋，通過(guò)慢慢拍打底部或通過(guò)在離心機(jī)中'輕拍旋轉(zhuǎn)(tapspin)，來(lái)溫和混合。5.將管置于丙烯酸保護(hù)屏后面，將3pl(3(^Ci)P32標(biāo)記的核苷酸加入到上述混合物中。6.在37。C恒溫將管置于PCR模塊(block)中。7.然后讓管在PCR儀中的在95。C保持15分鐘，立即在冰上冷卻。8.用作探測(cè)的隨機(jī)標(biāo)記片段準(zhǔn)備好了。(C)雜交方案1.將25.0ml預(yù)雜交緩沖液置于雜交瓶中，將膜浸入其中。2.然后將瓶置于設(shè)為65。C的分子雜交儀(hybridizationoven)中2小時(shí)。3.棄掉預(yù)雜交緩沖液，加入25.0ml新鮮預(yù)雜交緩沖液。4.將50|lU隨機(jī)標(biāo)記探針加入到置于丙烯酸保護(hù)屏后面的瓶中。5.將瓶放回到設(shè)為65。C的分子雜交儀上過(guò)夜。6.將含有溶液的探針傾入標(biāo)記的放射性廢棄罐中以便處理。7.用2XSSC于室溫漂洗膜以除去任何未結(jié)合的揮:針。8.進(jìn)一步用2XSSC+0.1。/。SDS于65。C將膜在分子雜交儀的旋轉(zhuǎn)盤上漂洗15分鐘。實(shí)施例2:用SC-1的A-6去飽和酶部分cDNA克隆來(lái)構(gòu)建和篩選BAC文庫(kù)用部分克隆中的一種篩選SC-1的BAC文庫(kù)，導(dǎo)致鑒定出陽(yáng)性BAC克隆。對(duì)BAC克隆進(jìn)行測(cè)序，鑒定出所述序列內(nèi)的A-6去飽和酶ORF。BAC文庫(kù)構(gòu)建的方案用1單位EcoRI限制酶消化通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳純化的DNA，其中最大化地獲得75-200kb的片段。將經(jīng)大小選擇的DNA連接(_/^卓在葛^產(chǎn)WWD7Vv4遂凝齊fW0w/〃/,'A^B&o/afe」以7.^:..#A#.我'##農(nóng)^)到經(jīng)消化的BAC載體(pIndigoBAC536)，在大腸桿菌電感受態(tài)細(xì)胞中通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化，接種在合適的培養(yǎng)基上。挑出重組克隆，在96孔板中接種于SOB,并將該文庫(kù)以甘油貯液儲(chǔ)存于-70。C。篩選BAC文庫(kù)的方案與實(shí)施例1中闡述的一樣。該序列顯示出與不同物種的A-6去飽和酶序列有高度同源性。當(dāng)進(jìn)行基序搜索時(shí)，所述A-6去飽和酶序列顯示出該基因具有完整的去飽和酶結(jié)構(gòu)域和功能性去飽和酶特有的細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例3:基因拷貝數(shù)的測(cè)定用EcoRI或PstI消化分離自SC-1的lO(ig基因組DNA,上樣到0.8%瓊脂糖凝膠，在30伏電壓下電泳過(guò)夜，將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍N+膜(milipore)。將通過(guò)隨機(jī)引發(fā)用32PdCTP標(biāo)記的SC-1A-6去飽和酶基因在65。C與所述印跡過(guò)夜雜交。然后用中等嚴(yán)格性(2xSSC-15分鐘，2xSSC+0.1%SDS_15分鐘，0.5xSSC+0.1%SDS-15分鐘，65")洗滌所述印跡，對(duì)X光膠片曝光。雜交結(jié)果示于圖3中，雜交結(jié)果清楚表明SC-1中存在單拷貝的△-6去飽和酶。在SC-1基因組中沒有出現(xiàn)交叉雜交同源序列。實(shí)施例4:載體的構(gòu)建將A-6去飽和酶基因克隆到pESC-Trp的位于BamHI和Sail位點(diǎn)之間的MCSII位點(diǎn)，置于GAL1啟動(dòng)子之下(PET-SC1-D6)。用于擴(kuò)增的引物如下。D6pESFCGGGATCCTATGATCTGGCGGGAGG表1:用于擴(kuò)增來(lái)自SC1的A-6去飽和酶并將其克隆到pESC的BamHI和Sall位點(diǎn)之間的MCSII的合成引物。引物中的限制位點(diǎn)用紅色給出。用于20ul反應(yīng)物的PCR組分Milli-Q水補(bǔ)充到IOX反應(yīng)緩沖液dNTP混合物(10mM)正向引物(5.0皮摩爾/u1)/反向引物(5.0皮摩爾/ul)/Sc-1的基因組DNA(1OOng)Taq聚合酶(3U/ul)20|Lil2.010.211.011.011.010.1l(約0.3U)循環(huán)條件如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>用以上引物擴(kuò)增A-6去飽和酶的ORF，用BamHI和Sail限制并定向克隆到pESC-Trp的相應(yīng)位點(diǎn)。將構(gòu)建體命名為PET-SC-1-D6，示于圖4中。實(shí)施例5:酵母的轉(zhuǎn)化將如圖4所示的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母YPH500菌抹，通過(guò)PCR確證轉(zhuǎn)化抹。PCR結(jié)果示于圖5。用Gall引物擴(kuò)增(所用的試劑盒來(lái)自Stmtagene，酵母表位標(biāo)記載體)擴(kuò)增，顯示有A-6-去飽和酶基因。制備酵母感受態(tài)細(xì)胞的方案所有步驟皆在無(wú)菌條件下實(shí)施。將單個(gè)菌落接種到Y(jié)PD，在30。C過(guò)夜生長(zhǎng)。用5%接種物使50ml培養(yǎng)物在30。C生長(zhǎng)到O.D達(dá)到1.0。將細(xì)胞留置水上10分鐘，以5000rpm在4。C離心IO分鐘，棄掉培養(yǎng)基。將沉淀重懸浮于同等體積的水(50ml)，在4。C以5000rpm離心10分鐘。用同等體積的1M山梨醇將沉淀洗滌2次，以5000rpm在4°C離心IO分鐘。最后將沉淀重懸于150jil的1M山梨醇，貯存在4"C。該感受態(tài)細(xì)胞可貯存1周。通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化酵母將6(Vl感受態(tài)細(xì)胞和約l叫的DNA置于小瓶中，混合并置于冰上。將其進(jìn)一步放在0.2cm電穿孔池上，給予設(shè)為SC2(1.7kV和5.8ms)的脈沖。立即加入600|il的1M山梨醇，將細(xì)胞重新懸浮，轉(zhuǎn)移到小瓶中，在室溫貯存5分鐘。將200^1細(xì)胞涂布在合適的選擇培養(yǎng)基上，在3(TC培養(yǎng)2天。預(yù)期的菌落lt目為每200(J涂布培養(yǎng)物含100個(gè)。通過(guò)在含色氨酸的SD營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SDDropoutMedia,Sigma)中生長(zhǎng)，選擇轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。實(shí)施例6:體內(nèi)功能證明在用含有A-6去飽和酶和芥菜A-12去飽和酶的pESC-Trp構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的酵母菌抹YPH499中實(shí)施體內(nèi)功能證明實(shí)驗(yàn)。在該培養(yǎng)基中未加入前體脂肪酸的情況下，用該構(gòu)建體可觀察到體內(nèi)A-6去飽和酶活性。在pESC-Trp中MCSI的EcoRI和Spel位點(diǎn)之間克隆的A-6去飽和酶用BamHI和Sail來(lái)限制。用BamHI和Sail消化攜帶A-12去飽和酶的PEH-D12-BJ-CO克隆，分離出由此釋放的A-12去飽和酶。將后者定向克隆到上述構(gòu)建體的相應(yīng)位點(diǎn)MCSII。由此獲得的構(gòu)建體具有MCSI的A-6和MCSII的A-12。將以上構(gòu)建體稱為PET-D6SC1-D12BJ-C0C圖6)。通過(guò)PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，確證某些所選擇的克隆中存在這兩種基因(圖7)。讓重組克隆在不含色氨酸的SD培養(yǎng)基(0.67%酵母N2堿W/O氨基酸；2%葡萄糖；0.13%不含色氨酸的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型粉)中過(guò)夜生長(zhǎng)。以5,000rpm離心10分鐘將細(xì)胞沉淀，用無(wú)菌水洗滌一次，重新懸浮于不含色氨酸的SG培養(yǎng)基(0.67。/。酵母N2堿W/0氨基酸；2%半乳糖；0.13。/。不含色氨酸的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型粉)中。讓培養(yǎng)物在30。C培養(yǎng)l天；沉淀細(xì)胞，凍干。為測(cè)定脂肪酸的分布型，進(jìn)行脂質(zhì)抽提，制備脂肪酸曱酯(FAME)，用GC-MS分析。典型的重組酵母克隆的脂肪酸分布型如下表所示。表表達(dá)A-12和A-6去飽和酶的酵母的脂肪酸分析脂肪酸組成(GC0/。)脂肪酸pESC△-12+A-6去飽和酶14:00,70.316:019.618.316:138.433.616:2-4.418:05.86.418:135.526.418:2-9.718:3*-0.8*y亞麻酸從上表顯然看出，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，表達(dá)A-12和A-6去飽和酶的酵母克隆顯示出形成了亞油酸和y亞麻酸。從油酸到亞油酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)化由芥菜A-12去飽和酶實(shí)施?？寺〉腟C-1A-6去飽和酶隨后催化亞油酸去飽和為y亞麻酸。本實(shí)驗(yàn)證明了sc-1a-6去飽和酶在酵母中進(jìn)行了功能性表達(dá)。權(quán)利要求1.分離的核酸序列或其片段，其包含編碼具有Δ-6-去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，或與所述核苷酸序列互補(bǔ)，其中所述核酸序列分離自裂殖壺菌(Schizochytrium)SC1。2.分離的核酸序列或其片段，其包含與權(quán)利要求1的核酸序列具有至少70%、優(yōu)選80%、最優(yōu)選90%同一性的核苷酸序列，或與所述核苷S菱序列互補(bǔ)，其中權(quán)利要求1的核酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸存列。3.分離的核酉銀列或其片段，其包含權(quán)利要求1的編碼具有A-6-去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，或與所述核香g臾序列互補(bǔ)，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少70%、優(yōu)選80%、最優(yōu)選90%同一性。4.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的分離的核酸序列，其中所述序列編碼功能活性的A-6-去飽和酶，所述酶用多不飽和脂肪酸作為底物。5.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的分離的核^列，所述核酸序列操作性連接到能夠影響所述分離的核酸表達(dá)基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子和終止信號(hào)。6.權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子為Gall啟動(dòng)子。7.表達(dá)載體，其如圖4所示。8.酵母細(xì)胞，其已用權(quán)利要求5或6或7的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。9.用分離的核酸序列轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，所述核酸序列編碼具有將結(jié)合脂質(zhì)的脂肪酸去飽和活性的蛋白質(zhì)，其中由所述核酸序列編碼的A-6-去飽和酶將多不飽和脂肪酸特異性地轉(zhuǎn)化為co-3脂肪酸。10.生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括以下步驟(i)用部分A-4去飽和酶基因進(jìn)行cDNA文庫(kù)篩選，導(dǎo)致鑒定出部分cDNA克??；(ii)用部分cDNA克隆篩選裂殖壺菌SC-1的BAC文庫(kù)，以便鑒定陽(yáng)性BAC克隆；(iii)對(duì)所述陽(yáng)性BAC克隆進(jìn)行鑒定和測(cè)序，并進(jìn)一步鑒定全長(zhǎng)序列內(nèi)的△-6去^^和酶ORF;(iv)構(gòu)建包含操作性連接到調(diào)節(jié)序列的所述分離的核酸序列的載體；(v)在足以表達(dá)所述去飽和酶的條件和時(shí)間下，用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞特別是酵母細(xì)胞，更特別是。11.包含至少一種多不飽和脂肪酸的組合物，所述多不飽和脂肪酸選自按照權(quán)利要求10的方法生產(chǎn)的多不飽和脂肪酸產(chǎn)物。12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述組合物選自嬰兒配方奶粉、膳食補(bǔ)充品和膳食替代品。13.權(quán)利要求11的組合物，其中所述組合物給予人或動(dòng)物。14.權(quán)利要求ll的組合物，其中所述組合物經(jīng)腸道給予或胃腸外給予。15.預(yù)防或治療由多不飽和脂肪酸攝取不足引起的病癥的方法，該方法包括將權(quán)利要求11的組合物以足以實(shí)現(xiàn)所述預(yù)防或治療的量給予所述患者。全文摘要本發(fā)明涉及從裂殖壺菌屬(Schizochytrium)分離的△-6去飽和酶基因。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在酵母中克隆來(lái)源于裂殖壺菌屬的△-6去飽和酶。揭示了△-6去飽和酶的核酸序列和氨基酸序列。進(jìn)一步揭示了構(gòu)建體、包含與異源調(diào)節(jié)序列功能性組合的編碼△-6去飽和酶這種酶的基因的載體。所述新型△-6去飽和酶可用于將亞油酸轉(zhuǎn)化為γ亞麻酸的代謝途徑(ω-6途徑)。本發(fā)明提供來(lái)自裂殖壺菌屬的這些編碼上述蛋白質(zhì)的新型核酸的鑒定、分離。本發(fā)明具體列舉了帶有包含△-6去飽和酶基因的載體的重組酵母細(xì)胞，其依靠所產(chǎn)生的酶將能夠產(chǎn)生γ-亞麻酸。文檔編號(hào)C12N15/53GK101268190SQ200680034136公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2006年7月20日優(yōu)先權(quán)日2005年7月20日發(fā)明者V·M·帕特爾申請(qǐng)人:阿維斯塔金格蘭技術(shù)有限公司