專利名稱：肌肉增強(qiáng)子序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種來自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因的肌肉增強(qiáng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因轉(zhuǎn)殖是現(xiàn)今生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的技術(shù)，其是經(jīng)由遺傳工程技術(shù)將可表達(dá)特定基因產(chǎn)物的核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞，以修飾其基因表達(dá)、給予新的表現(xiàn)性狀或作為大量生產(chǎn)特定基因產(chǎn)物的工具。例如，針對牛、羊、豬、魚、蝦等經(jīng)濟(jì)動物，可用以改良品種、改良肉質(zhì)、增加生長率、提高抗病能力及適應(yīng)力、或提升觀賞價值等。以魚而言，水族產(chǎn)業(yè)消費(fèi)型態(tài) 由傳統(tǒng)蓄養(yǎng)觀賞，漸漸提升趨向藝術(shù)化、精致化與生活化。而生物科技的發(fā)展與創(chuàng)新運(yùn)用促成了“熒光魚”的誕生，熒光魚產(chǎn)業(yè)具有技術(shù)密集、高附加價值等特性，因此具有龐大的發(fā)展?jié)摿εc商機(jī)。一般而言，欲使導(dǎo)入細(xì)胞的核酸分子在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出所欲的基因產(chǎn)物需要適當(dāng)?shù)膯幼有蛄姓{(diào)控，以達(dá)所欲效果，例如，組織專一性表達(dá)、誘導(dǎo)性表達(dá)、或提升的蛋白質(zhì)表達(dá)量，而增強(qiáng)子序列可再進(jìn)一步增強(qiáng)啟動子活性。以魚類而言，目前常用于基因轉(zhuǎn)殖熒光觀賞魚的啟動子包括來自斑馬魚肌凝蛋白輕煉2 (myosin light chain 2,mylz2)的2. 2kb啟動子。然而，斑馬魚mylz2啟動子在斑馬魚種外的其它魚種和物種的活性仍有改善加強(qiáng)的空間。因此，在此領(lǐng)域中，仍有需要一種可提升啟動子活性的增強(qiáng)子序列，以應(yīng)用于動物，特別是魚類的轉(zhuǎn)殖基因技術(shù)，。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是從斑馬魚肌肉型肌酸激酶b (ckmb)基因分離出一段肌肉增強(qiáng)子序列，其具有明顯提高啟動子活性的效果，并進(jìn)一步利用該增強(qiáng)子序列結(jié)合啟動子制備轉(zhuǎn)殖基因動物(如熒光魚)，不僅可于不同目(Order)魚種中應(yīng)用，亦有應(yīng)用到其它脊椎動物如哺乳類的肌肉細(xì)胞中的潛力，有利于在生物反應(yīng)器中的應(yīng)用。因此，在一方面，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，其是由SEQ ID NO 1的核苷酸序列所組成，其具有增強(qiáng)子的活性。在另一方面，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)框，其包括(a)第一核苷酸片段，其包括一含啟動子的核苷酸序列及SEQ ID NO :1的核苷酸序列；及(b)第二核苷酸片段，其編碼外源蛋白且操作地與第一核酸片段連接，使得該外源蛋白在第一核苷酸片段的調(diào)控下表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，該含啟動子的核苷酸序列是衍生自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因。在一具體實(shí)例中，該含啟動子的核苷酸序列是選自SEQ ID NOS :2至11所組成的群的任一序列。在另一具體實(shí)例中，該第一核苷酸片段是選自SEQ ID N0:2、3、12及13所組成的群的任一序列。在一具體實(shí)例中，其中該外源蛋白是熒光蛋白。在又一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，其包括上述重組表達(dá)框。本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，其包括上述表達(dá)載體。本發(fā)明亦提供一種制備轉(zhuǎn)殖基因動物的方法，其包括將前述表達(dá)載體導(dǎo)入動物的配子、受精卵、胚胎或體細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，使該表達(dá)載體所含的核苷酸片段在胚胎或細(xì)胞中繼續(xù)復(fù)制，進(jìn)而在個體及其后代細(xì)胞中表達(dá)；其中該動物不包含人類。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，本發(fā)明的方法可用于制備轉(zhuǎn)殖基因魚，特別是熒光魚。其是使用顯微注射技術(shù)將該表達(dá)載體導(dǎo)入魚的受精卵中。其中該魚是斑馬魚或神仙魚。本發(fā)明亦提供一種分離的核酸分子，其具有選自SEQ ID NOS 2至13所組成的群 的任一核苷酸序列。


上述發(fā)明內(nèi)容及以下具體實(shí)施方式
與所附圖式一并閱讀將更增了解。為達(dá)闡明本發(fā)明的目的，圖式中所示具體實(shí)例為目前最佳實(shí)施方式。然而，應(yīng)了解本發(fā)明并不限于所示的特定排列及結(jié)構(gòu)。圖I 為 pT2-mylz2_P2· O-AmCyanl 載體結(jié)構(gòu)不意圖；圖2 為 pT2-mylz2-P2. O-TcFP-Il 載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖3 為 pT2-mylz2-P2. O-TcFP-13 載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為根據(jù)本發(fā)明的ckmb-P2363片段(-1202/+1161);由ATG(+1162)轉(zhuǎn)譯起始點(diǎn)往前進(jìn)行選殖2363bp片段，序列中標(biāo)示重要肌肉生長相關(guān)轉(zhuǎn)譯因子結(jié)合位置；+1為轉(zhuǎn)譯起始位置，*為第二個轉(zhuǎn)譯起始位置，丨和丨代表I. 2kb啟動子是列刪減位置。下半部陰影部位表示335bp增強(qiáng)子片段；圖5 為根據(jù)本發(fā)明以載體(a)pT2-ckmb-P2363-TcFP_13 及(b)pT2-ckmb-P1271-TcFP-13利用顯微注射至斑馬魚單一細(xì)胞階段(one-cell stage)受精卵，以熒光顯微鏡觀察2天大的斑馬魚胚胎的瞬時表達(dá)，其中左圖是經(jīng)HcRedl濾鏡觀察，右圖是亮視野合并圖。曝光時間1000msec,比例尺為Imm;圖6 為根據(jù)本發(fā)明以載體(a)pT2-ckmb-P2363-TcFP_13 及(b)pT2-ckmb-P1271-TcFP-13利用顯微注射至斑馬魚單一細(xì)胞階段受精卵，以熒光顯微鏡觀察3天大的斑馬魚胚胎的瞬時表達(dá)，其中左圖是經(jīng)AmCYANl濾鏡觀察，右圖是亮視野合并圖；曝光時間500msec,比例尺為Imm ；圖7為片段系列刪減的啟動子構(gòu)建示意圖及活性分析結(jié)果；虛線部分為未選殖區(qū)段，實(shí)線部分為實(shí)際選殖區(qū)段，各形狀區(qū)塊表示轉(zhuǎn)譯因子結(jié)合位置，位于實(shí)線上方代表順向，位于實(shí)線下方代表反向；啟動子活性及專一性依照強(qiáng)度劃分為五個等級，以正號表示，+/_代表與其它組別相比趨近于不表達(dá)，但仍具有微弱表達(dá)。I表示MyoD家族，*表示MEF2，
I表示E-盒子,I表示TATA盒子,ι表示TREX/SIX4, 表示MAZ,—表示外顯子1，D表示外顯子2 (在ATG之前)；圖8為pT2-ckmb-P1343-TcFP-13載體構(gòu)建示意圖；|表示MyoD家族，表示MEF2，
I表示E-盒子，ι表示SIX4/MEF3,表示MAZ, |表示TATA盒子，表示外顯子I,-表示外顯子2 (在ATG的前)；圖9 為根據(jù)本發(fā)明以載體 pT2-ckmb-P1271-TcFP-13 及 pT2-ckmb-P1343-TcFP_13利用顯微注射至斑馬魚單一細(xì)胞階段受精卵，以熒光顯微鏡觀察3天大的斑馬魚胚胎的瞬時表達(dá)；曝光時間500msec,比例尺為Imm ；圖10為以各種載體利用顯微注射至斑馬魚單一細(xì)胞階段受精卵，使用商業(yè)套組進(jìn)行冷光活性分析的結(jié)果；圖11為根據(jù)本發(fā)明制備的基因轉(zhuǎn)殖熒光觀賞魚Tg(ckmb-P2363 TcFP-13)Fl子代；圖12為根據(jù)本發(fā)明以斑馬魚ckmb調(diào)節(jié)序列表達(dá)臺灣珊瑚紅色熒光蛋白(TcFP-Il)的親代神仙魚(F0，二個月)，其肌肉可見鑲嵌性表達(dá)紅色熒光；圖13為根據(jù)本發(fā)明以pT2-EnInl-ckmb-P2363-TcFP-ll載體導(dǎo)入小鼠C2C12肌母 細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)分化成肌管細(xì)胞后，觀察到強(qiáng)烈的熒光蛋白表達(dá)，其中(a)是可見光圖，(b)是熒光圖以及(C)是合并圖；圖14為本發(fā)明的335bp核苷酸片段(SEQ ID NO 1)；圖15為本發(fā)明的ckmb-P1343核苷酸片段(SEQ ID NO 2)；圖16為本發(fā)明的ckmb_P2363片段核苷酸片段(SEQ ID NO 3)；圖17為本發(fā)明的ckmb-P69片段核苷酸片段(SEQ ID NO 4)、ckmb_P183片段(SEQID NO 5)、ckmb-P227 片段(SEQ ID NO 6)及 ckmb_P251 片段(SEQID NO 7)；圖18為本發(fā)明的ckmb-P371片段核苷酸片段(SEQ ID NO 8)及ckmb_P511片段(SEQ ID NO 9)；圖19為本發(fā)明的ckmb_P1079片段核苷酸片段(SEQ ID NO 10)；圖20為本發(fā)明的ckmb_P1271片段核苷酸片段(SEQ ID NO 11)；圖21為本發(fā)明的EnInl-ckmb-P371片段核苷酸片段(SEQ ID NO 12)；圖22為本發(fā)明的EnInl-ckmb-P2363片段片段核苷酸片段(SEQ ID NO 13)；圖23為斑馬魚肌球蛋白輕鏈2啟動子(對照組)核苷酸片段(SEQ ID NO 14)。本發(fā)明的各個具體實(shí)例的細(xì)節(jié)說明如后。本發(fā)明的其它特征將會經(jīng)由以下各個具體實(shí)例中的詳細(xì)說明及申請專利范圍而清楚呈現(xiàn)。無須進(jìn)一步的闡述，相信本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員基于前述說明即可利用本發(fā)明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明，而非以任何方式限制本發(fā)明范圍。
具體實(shí)施例方式除非另有指明，所有在此處使用的技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語具有如同本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員一般所了解的意義。本文所使用的“一”的表述方式，如未特別指明，是指至少一個(一個或一個以上)
的數(shù)量。本文所使用的“核酸分子”或“核酸”一詞是指核苷酸單體的聚合體，其可以是單股或雙股、直線型或環(huán)狀、脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。一核苷酸單體包括磷酸基部分、糖基部分及堿基部分。常見的核苷酸的堿基部分包括鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)，其中腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶配對，以及鳥嘌呤與胞嘧啶配對。本文所使用的“分離的核酸分子”是指從天然生物體來源純化而來的核酸，或以化學(xué)合成法或PCR擴(kuò)增技術(shù)所制得的核酸。核酸的純化方法、化學(xué)合成法及PCR擴(kuò)增技術(shù)可參見 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Sambrook J 等人編著，1989,以及 Current Protocols in Molecular Biology,Frederick M. A.等人編著，2001, John Wiley & Sons, Inc.。此一領(lǐng)域的技術(shù)人員可依據(jù)慣知的技術(shù)獲得本發(fā)明的核酸分子，詳細(xì)方法描述于以下實(shí)例中。本文所使用的“可操作性地連 接”或類似用語是指調(diào)節(jié)序列與另一編碼特定基因產(chǎn)物的核苷酸序列的連接方式，使得該核苷酸序列接受調(diào)節(jié)序列的控制或調(diào)節(jié)，而在適當(dāng)條件下表達(dá)出該基因產(chǎn)物。本文所使用的“重組”是用以描述核酸分子含有非天然連接的序列。重組核酸分子可為載體形式，其可包括一或多個編碼基因的結(jié)構(gòu)序列及用于表達(dá)該基因的調(diào)節(jié)序列，例如，啟動子序列。載體的種類包括但不限于質(zhì)體、黏質(zhì)體、噬菌體、YAC或PAC等。重組載體可用于表達(dá)或復(fù)制所導(dǎo)入的基因序列。典型地，在重組載體中，編碼基因的結(jié)構(gòu)序列是操作性地連結(jié)于調(diào)節(jié)序列，使得重組載體導(dǎo)入適當(dāng)宿主中時，編碼基因的結(jié)構(gòu)序列在該調(diào)節(jié)序列的調(diào)控下表達(dá)。調(diào)節(jié)序列可包括但不限于啟動子序列、起始密碼子、復(fù)制起始點(diǎn)、增強(qiáng)子序列或分泌訊息序列等。本文所使用的“核酸分子編碼...”或其類似用語是指，該核酸分子帶有一或多個編碼特定基因產(chǎn)物的核苷酸序列，而可在適當(dāng)條件下作為模板表達(dá)出該基因產(chǎn)物。應(yīng)了解的是，由于基因密碼(由三個核苷酸所組成)的簡并性，故不同的基因密碼可編碼相同的氨基酸殘基，例如，GAU與GAC，兩者在核苷酸序列上不同，但均編碼相同氨基酸殘基，S卩天門冬酸(Asp)。針對相同的多肽產(chǎn)物，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可運(yùn)用例行技術(shù)及已知的基因密碼偏好性(codon usage)，獲得對應(yīng)的核苷酸序列及其簡并序列。因此，本文所述編碼特定基因產(chǎn)物的核苷酸序列尚包括其簡并序列(可編碼相同基因產(chǎn)物)。本文所使用的“重組表達(dá)框”一詞是指一通過重組技術(shù)或合成產(chǎn)生的核苷酸序列，得以在宿主細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)。表達(dá)框可嵌入質(zhì)體或染色體中。典型地，一重組表達(dá)框包含欲轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列及調(diào)節(jié)序列。在一方面，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，其是由SEQ ID NO :1的核苷酸序列所組成，其具有增強(qiáng)子的活性。具體而言，本發(fā)明的分離的核酸分子是分離自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b (ckmb)基因的下游序列，長度為335bp，具有強(qiáng)烈提升啟動子活性的效果。在另一方面，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)框，其包括(a)第一核苷酸片段，其包括一含啟動子的核苷酸序列及SEQ ID NO :1的核苷酸序列；及(b)第二核苷酸片段，其編碼外源蛋白且操作地與第一核酸片段連接，使得該外源蛋白在第一核苷酸片段的調(diào)控下表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，SEQ ID NO 1的核苷酸序列可與任何適當(dāng)?shù)暮瑔幼拥暮塑账嵝蛄薪M合形成第一核苷酸片段，以調(diào)節(jié)第二核苷酸片段編碼的外源蛋白的表達(dá)。在一具體實(shí)例中，該含啟動子的核苷酸序列是衍生自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因。在一特定實(shí)例中，該含啟動子的核苷酸序列是選自SEQ ID NOS :2至11所組成的群的任一者。在另一特定實(shí)例中，SEQ ID N01的核苷酸序列與該含啟動子的核苷酸序列所形成的第一核苷酸片段是選自SEQ ID NO :2、3、12及13所組成的群的任一者。表I列出SEQ ID NOS 1至11對應(yīng)于ckmb基因的位置。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其由SEQ ID NO :1的核苷酸序列所組成，具有增強(qiáng)子的活性。
2.—種重組表達(dá)框,其包括 (a)第一核苷酸片段，其包括一含啟動子的核苷酸序列及SEQID NO 1的核苷酸序列；及 (b)第二核苷酸片段，其編碼外源蛋白且操作地與第一核酸片段連接，使得該外源蛋白在第一核苷酸片段的調(diào)控下表達(dá)。
3.如權(quán)利要求2的重組表達(dá)框，其中該含啟動子的核苷酸序列是衍生自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b (ckmb)基因。
4.如權(quán)利要求2的重組表達(dá)框，其中該含啟動子的核苷酸序列是選自SEQIDNOS :2至11所組成的群的任一序列。
5.如權(quán)利要求2的重組表達(dá)框，其中該第一核苷酸片段是選自SEQID N0:2、3、12及13所組成的群的任一序列。
6.如權(quán)利要求2的重組表達(dá)框，其中該外源蛋白是熒光蛋白。
7.—種表達(dá)載體,其包括如權(quán)利要求2至6項(xiàng)中任一項(xiàng)的重組表達(dá)框。
8.—種宿主細(xì)胞，其包括如權(quán)利要求7的表達(dá)載體。
9.一種制備轉(zhuǎn)殖基因動物的方法，其包括將如權(quán)利要求7的表達(dá)載體導(dǎo)入動物的配子、受精卵、胚胎或體細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，使該表達(dá)載體所含的核苷酸片段在胚胎或細(xì)胞中繼續(xù)復(fù)制，進(jìn)而在個體及其后代細(xì)胞上表達(dá)所編碼的外源蛋白；其中該動物不包含人類。
10.如權(quán)利要求9的方法，其是用于制備轉(zhuǎn)殖基因魚。
11.如權(quán)利要求10的方法，其是使用顯微注射技術(shù)將該表達(dá)載體導(dǎo)入魚的受精卵中。
12.如權(quán)利要求10的方法，其中該魚是斑馬魚或神仙魚。
13.一種分離的核酸分子，其具有選自SEQ ID NOS :2至13所組成的群的任一核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種來自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因的肌肉增強(qiáng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明的增強(qiáng)子可提升啟動子活性，可用于制備轉(zhuǎn)殖基因動物及應(yīng)用于生物反應(yīng)器中。
文檔編號A01K67/033GK102911937SQ201110221498
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月3日
發(fā)明者龔纮毅, 陳鳴泉, 吳金洌, 黃士晉 申請人:龔纮毅