專利名稱：Cry1F和Cry1Ac轉(zhuǎn)基因棉花株系及其事件特異性鑒定的制作方法
背景技術(shù)：
棉花是重要的纖維農(nóng)作物。已經(jīng)將育種和生物技術(shù)應(yīng)用于棉花來提高其農(nóng)學性狀和產(chǎn)物質(zhì)量。此類農(nóng)學性狀之一抗蟲性，抗蟲性的優(yōu)點是顯而易見的。已經(jīng)將編碼殺蟲蛋白質(zhì)的基因引入棉花植物。為了減少如下?lián)?，即某種類型昆蟲對單一類型殺蟲蛋白質(zhì)產(chǎn)生抗性，經(jīng)常將植物培育成能產(chǎn)生兩種不同類型殺蟲蛋白質(zhì)。因此，昆蟲能夠?qū)煞N不同殺蟲蛋白質(zhì)產(chǎn)生抗性的可能性極其低。
Cry1Ac殺蟲蛋白質(zhì)和基因是本領(lǐng)域已知的。見例如美國專利號6,114,138、5,710,020、6,251,656和6,229,004。Cry1F殺蟲蛋白質(zhì)和基因也是本領(lǐng)域已知的。見例如美國專利號5,188,960、5,691,308、6,096,708和6,573,240。
外來基因在植物中的表達受到該外來基因所插入的染色體位置的影響。這可能源自染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(例如異染色質(zhì))或者整合位點附近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(例如增強子)的接近(Weising等人，Ann.Rev.Genet 22421-477，1988)。例如，相同基因在相同類型的轉(zhuǎn)基因植物(或其它生物)中表現(xiàn)出，隨不同的事件而表達水平廣泛變化。在表達的空間或時間模式上也可能存在差異。例如，轉(zhuǎn)基因在多種植物組織中相對表達上的差異可能與從存在于所導入基因構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件所預期的模式不符。
因此，需要產(chǎn)生和篩選大量事件來鑒定任選地表達所導入目的基因的事件。為了商業(yè)目的，通常產(chǎn)生數(shù)百乃至數(shù)千的不同事件并在那些事件中篩選出具有預期轉(zhuǎn)基因表達水平和模式的單一事件。具有預期轉(zhuǎn)基因表達水平和/或模式的事件可用于使用常規(guī)育種方法通過兩性異型雜交使轉(zhuǎn)基因滲入不同遺傳背景中。該雜交的后代保持著最初轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達特性。這個策略用來確保在大量的、良好適應(yīng)當?shù)厣L條件的變種中的可靠基因表達。
可方便地檢測特定事件的存在，以便確定兩性雜交的后代是否包含目的轉(zhuǎn)基因。此外，檢測特定事件的方法將有助于例如遵守上市前批準規(guī)程和將來自重組農(nóng)作物植物的食品標記的規(guī)程?？梢酝ㄟ^眾所周知的任何核酸檢測方法檢測轉(zhuǎn)基因的存在，核酸檢測方法如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或利用核酸探針的DNA雜交。這些檢測方法通常集中于頻繁使用的遺傳元件，例如啟動子、終止子、標記基因等。結(jié)果，除非已知臨近所插入DNA的染色體DNA序列(“側(cè)翼DNA”)，否則此類方法可能對區(qū)別不同的轉(zhuǎn)基因事件、尤其是用同一DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的那些事件是無效的。例如，Windels等人(Med.Fac.Landbouww，Univ.Gent 64/5b459462，1999)討論了事件特異性的PCR檢測法。這涉及使用跨越插入序列與側(cè)翼DNA間接頭的一套引物通過PCR對草甘膦耐受大豆事件40-3-2的鑒定。更加具體而言，一條引物包含來自所插入序列的序列，而第二條引物包含來自側(cè)翼DNA的序列。
美國專利申請20020120964A1和20040009504A1涉及棉花事件PV-GHGT07(1445)和組合物及其檢測方法。WO 02/100163涉及棉花事件MONI5985和組合物及其檢測方法。WO 2004/011601涉及玉米事件MON863植物和組合物及其檢測方法。WO 2004/072235涉及棉花事件MON 88913和組合物及其檢測方法。
然而，迄今為止，還不知道能用來特異性鑒定如下文所述積累Cry1F和/或Cry1Ac的棉花的此類方法和材料。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及植物育種和植物的防蟲保護。更加具體而言，本發(fā)明包括包含一種或多種如本文所述的、已插入到棉花細胞基因組特異性位點的多核苷酸序列的棉花植物的新型轉(zhuǎn)化事件。在高度優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸序列編碼“積累的”鱗翅類昆蟲抑制蛋白質(zhì)Cry1F和Cry1Ac。然而，如本文所述，本發(fā)明包括具有單一Cry1F事件或Cry1Ac事件的植物。
此外，本發(fā)明提供了檢測一個或多個本發(fā)明事件在樣品中存在的測定法。本發(fā)明提供了檢測棉花中某種抗蟲事件存在的DNA及相關(guān)測定法。測定法基于插入棉花基因組的重組構(gòu)建體的DNA序列和插入位點側(cè)翼的基因組DNA序列。本發(fā)明還提供了測定時有用的試劑盒和條件。
因此，本發(fā)明部分涉及完整的cry1F插入序列、完整的cry1Ac插入序列及其邊界區(qū)域(在轉(zhuǎn)基因棉花株系中)的DNA序列的克隆和分析。這些序列是獨特的?；谶@些插入序列和邊界序列，產(chǎn)生事件特異性引物。PCR分析表明，這些事件可以通過對使用這些事件特異性引物所產(chǎn)生的PCR擴增子進行分析來鑒定。因此，這些方法以及其它相關(guān)方法可以用來獨特地鑒定包含一種或多種本發(fā)明事件的棉花株系。
附圖簡述


圖1描述了棉花事件281-24-236插入的cry1F轉(zhuǎn)基因和側(cè)翼序列。該圖還顯示了本文所述的擴增子和引物。
圖2描述了棉花事件3006-210-23插入的cry1AC轉(zhuǎn)基因和側(cè)翼序列。該圖還顯示了本文所述的擴增子和引物。
序列簡述SEQ ID NO1為cry1F事件281-24-236插入序列及其邊界序列的DNA序列。
SEQ ID NO2為cry1Ac事件3006-210-23插入序列及其邊界序列的DNA序列。
SEQ ID NO3為和反向引物“281-15”一起用來擴增跨越cry1F事件281-24-236的側(cè)翼區(qū)域和插入?yún)^(qū)域之間5’連接處的603bp擴增子的正向引物“281-14”的序列。
SEQ ID NO4為和正向引物“281-14”一起用來擴增跨越cry1F事件281-24-236的側(cè)翼區(qū)域和插入?yún)^(qū)域之間5’連接處的603bp擴增子的反向引物“281-15”的序列。
SEQ ID NO5為使用引物SEQ ID NO3和4產(chǎn)生的擴增子的603 bp序列。
SEQ ID NO6為和反向引物“281-10”一起用來擴增跨越cry1F事件281-24-236的插入?yún)^(qū)域和側(cè)翼區(qū)域之間3’連接處的562 bp擴增子的正向引物“281-9”的序列。
SEQ ID NO7為和正向引物“281-9”一起用來擴增跨越cry1F事件281-24-236的側(cè)翼區(qū)域和插入?yún)^(qū)域之間3’連接處的562 bp擴增子的反向引物“281-10”的序列。
SEQ ID NO8為使用引物SEQ ID NO6和7產(chǎn)生的擴增子的562 bp序列。
SEQ ID NO9為和反向引物“3006-22”一起用來擴增跨越cry1Ac事件3006-210-23的側(cè)翼區(qū)域和插入?yún)^(qū)域之間5’連接處的614 bp擴增子的正向引物“3006-20”的序列。
SEQ ID NO10為和正向引物“3006-20”一起用來擴增跨越cry1Ac事件3006-210-23的側(cè)翼區(qū)域和插入?yún)^(qū)域之間5’連接處的614 bp擴增子的反向引物“3006-22”的序列。
SEQ ID NO11為使用引物SEQ ID NO9和10產(chǎn)生的擴增子的614 bp序列。
SEQ ID NO12為和反向引物“3006-12”一起用來擴增跨越cry1Ac事件3006-210-23的插入?yún)^(qū)域和側(cè)翼區(qū)域之間3’連接處的662 bp擴增子的正向引物“3006-9”的序列。
SEQ ID NO13為和正向引物“3006-9”一起用來擴增跨越cry1Ac事件3006-210-23的側(cè)翼區(qū)域和插入?yún)^(qū)域之間3’連接處的662 bp擴增子的反向引物“3006-12”的序列。
SEQ ID NO14為使用引物SEQ ID NO12和13產(chǎn)生的擴增子的662bp序列。
SEQ ID NO15為事件281-24-236的棉花基因組DNA片段(缺失53個堿基)。
SEQ ID NO16為事件3006-210-23的棉花基因組DNA片段(缺失16個堿基)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及植物育種和植物的防蟲保護。更加具體而言，本發(fā)明包括包含一種或多種如本文所述的、已插入到棉花細胞基因組特異性位點的多核苷酸序列的棉花植物(例如陸地棉(Gossypium hirsutum)和海島棉(Gossypium barbadense))的新型轉(zhuǎn)化事件。在高度優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸序列編碼“積累的”鱗翅類昆蟲抑制蛋白質(zhì)Cry1F和Cry1Ac。然而，如本文所述，本發(fā)明包括具有單一Cry1F事件或Cry1Ac事件的植物。
此外，本發(fā)明提供了檢測樣品中一個或多個本發(fā)明事件存在的測定法。本發(fā)明方面包括設(shè)計和/或產(chǎn)生本文舉例說明或建議的任何辨別性核酸分子、尤其是那些完全或部分基于本發(fā)明側(cè)翼序列的辨別性核酸分子的方法。
更加具體而言，本發(fā)明部分涉及兩個轉(zhuǎn)基因棉花事件(cry1F281-24-236和cry1Ac 3006-210-23)、包含這些事件的植物株系以及對這個cry1F插入序列、這些cry1Ac插入序列和/或其邊界區(qū)域的DNA序列的克隆和分析。本發(fā)明的植物株系可以用本文公開和建議的序列進行檢測。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生兩種“積累的”、已知為Cry1F和Cry1Ac的殺蟲蛋白質(zhì)的抗蟲性棉花株系及其鑒定。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的植物株系包含cry1F事件281-24-236和cry1Ac事件3006-210-23。然而，本發(fā)明的植物可以包含任意一個或者優(yōu)選地兩個本文所討論的事件。
如上文背景部分暗示，轉(zhuǎn)基因?qū)爰罢线M入植物基因組涉及一些隨機事件(因此特定插入用名稱“事件”表示)。即使用多種轉(zhuǎn)化技術(shù)，如農(nóng)桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化、“基因槍”和WHISKERS時，無法預知轉(zhuǎn)基因?qū)⒉迦氲交蚪M的哪個地方。因此，鑒定插入序列兩側(cè)的側(cè)翼植物基因組DNA對于鑒定具有特定插入事件的植物是重要的。例如，可以設(shè)計PCR引物來產(chǎn)生跨越插入序列和宿主基因組接頭區(qū)域的PCR擴增子。該PCR擴增子可以用來鑒定獨特或不同類型的插入事件。
由于“事件”是隨機事件并且通常不能重復，所以作為本公開的一部分，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.20852)保藏了包含cry1F事件281-24-236和cry1Ac事件3006-210-23的棉花株系的至少2500顆種子，公眾可無任何限制地(但受限于專利權(quán))獲得。給定保藏號為ATCC保藏號PTA-6233。保藏物將無限制地在ATCC儲藏所(公共儲藏所)存放30年或最近請求后五年或本專利的有效使用期(取更長者)，并且如果保藏物在該期間變成無非存活性的，則需替換。
所保藏的種子是本發(fā)明的部分。顯然，這些種子可以生長成為棉花植物，而該植物為本發(fā)明的部分。本發(fā)明還涉及包含在這些棉花植物中、對檢測這些植物及其后代有用的DNA序列。本發(fā)明的檢測方法和試劑盒可以直接鑒定這些事件中的任意一種、兩種或者甚至所有三種事件，這取決于檢測的最終目的。
本文提供了幫助描述本發(fā)明和指導本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用本發(fā)明的定義和實例。除非另外說明，相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將按照常規(guī)用途理解這些術(shù)語。使用在37CFR§1.822中所述的DNA堿基命名法。
轉(zhuǎn)基因“事件”通過下述步驟產(chǎn)生，即用異源DNA(即包含目的轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化植物細胞、源自轉(zhuǎn)基因插入到植物基因組的植物群體的再生、以及選擇表征為在特定基因組位置具有插入序列的特定植物。術(shù)語“事件”指包含異源DNA的最初轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)化體的后代。術(shù)語“事件”也指通過轉(zhuǎn)化體和包含基因組/轉(zhuǎn)基因DNA的另一變種間的有性異型雜交產(chǎn)生的后代。即使在對回歸親本進行重復回交之后，插入的轉(zhuǎn)基因DNA和來自所轉(zhuǎn)化親本的側(cè)翼基因組DNA(基因組/轉(zhuǎn)基因DNA)在雜交后代中也存在于相同的染色體位置。術(shù)語“事件”也指來自最初轉(zhuǎn)化體及其后代的DNA，該DNA包含插入的DNA和緊鄰插入DNA的側(cè)翼基因組序列，由于包含所插入DNA的親本株系(例如最初轉(zhuǎn)化體和自交后代)和不含所插入DNA的親本株系間的有性雜交，可以預期該DNA會轉(zhuǎn)移到接受包括目的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)的插入DNA的后代中。
“連接序列”跨越了插入到基因組的DNA與插入點側(cè)翼的棉花自身基因組DNA相連的接點，在植物遺傳物質(zhì)中鑒定出或檢測出不管哪一條連接序列則足以判斷發(fā)生該事件。所包括的是跨越本文所述棉花事件中的插入序列和相似長度側(cè)翼DNA的DNA序列。本文提供了此類鑒別性序列的具體實例；但是，跨越插入序列間連接序列或跨越插入序列和基因組序列間連接序列的其它序列也是鑒別性的，并且可以根據(jù)本發(fā)明使用。
本發(fā)明涉及此類側(cè)翼序列、連接序列和插入序列的鑒定。本發(fā)明包括相關(guān)的PCR引物和擴增子。根據(jù)本發(fā)明，使用跨越插入DNA及其(Cry1F281-24-236和/或Cry1Ac 3006-210-23的)邊界的擴增子的PCR分析方法可用來檢測和鑒定從本專利轉(zhuǎn)基因棉花株系衍生的商品化轉(zhuǎn)基因棉花變種或株系。
這些插入序列中的每一片段的全長序列以及各自的側(cè)翼序列在本文中以SEQ ID NO1(Cry1F 281-24-236)和SEQ ID NO2(Cry1Ac 3006-210-23)提供。表1提供了這些事件中插入序列和側(cè)翼序列的坐標。
表1
圖1和2進一步闡述了這些插入事件及其更多組分。這些序列(尤其是側(cè)翼序列)是獨特的?；谶@些插入序列和邊界序列，產(chǎn)生事件特異性引物。PCR分析表明，通過對用這些事件特異性引物對產(chǎn)生的PCR擴增子進行分析可以鑒定這些棉花株系的不同棉花基因型。因此，這些方法以及其它相關(guān)方法可以用來獨特地鑒定這些棉花株系。本文鑒定的序列是獨特的。例如，對GENBANK數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索顯示，所克隆的邊界序列與數(shù)據(jù)庫中的序列沒有任何顯著同源性。
本發(fā)明的檢測技術(shù)與植物育種相聯(lián)合可特別用確定在包含目的事件的親本植物與賦予后代一種或多種額外的目的性狀的另一植物株系雜交之后，哪些后代植物包含特定事件。這些PCR分析方法利于棉花育種程序和質(zhì)量控制，特別是對于商品化的轉(zhuǎn)基因棉籽?，F(xiàn)在也可以生產(chǎn)和使用用于這些轉(zhuǎn)基因棉花株系的PCR檢測試劑盒。這也利于產(chǎn)品注冊和產(chǎn)品管理。
此外，側(cè)翼的棉花序列可以用來特異地鑒定每個插入序列的基因組位置。該信息可以用來制備對每個事件特異的分子標記系統(tǒng)。這些可以用于加速育種策略和建立連鎖資料。
此外，側(cè)翼序列信息還可以用于研究和描述轉(zhuǎn)基因整合過程、基因組整合位點特征、事件分類、轉(zhuǎn)基因及其側(cè)翼序列的穩(wěn)定性和基因表達(尤其是涉及基因沉默、轉(zhuǎn)基因甲基化模式、位置效應(yīng)和潛在的表達相關(guān)性元件例如MARS[基質(zhì)附著區(qū)]等)的特征。
根據(jù)全部的本發(fā)明公開，顯而易見本發(fā)明包括ATCC保藏號PTA-6233的種子。本發(fā)明也包括從ATCC保藏(保藏號PTA-6233)的種子生長出的抗蟲性棉花植物。本發(fā)明還包括所述植物的部分，例如葉、組織樣品、由所述植物產(chǎn)生的種子、花粉等。
此外，本發(fā)明還包括從所保藏種子生長出的植物、優(yōu)選抗蟲性棉花植物的子代和/或后代植物，其中所述植物基因組包含如本文所述的可檢測的野生型基因組DNA/插入DNA連接序列。如本文所用，術(shù)語“棉花”指陸地棉(Gossypium hirsutum)并且包括所有能用棉花繁殖的植物變種，其中包括海島棉(Gossypium barbadense)。
本發(fā)明進一步包括使用本發(fā)明的植物作為至少一個親本進行雜交的方法。例如，本發(fā)明包括具有本文例舉的任意植物作為一個或兩個親本的F1雜種植物。由本發(fā)明的此類F1雜種產(chǎn)生的種子也處于本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明包括通過將例證的植物與不同(例如近交親本)植物雜交、隨后收獲雜交種子而產(chǎn)生F1雜種種子的方法。本發(fā)明包括所例證的或為母本或為父本的植物?？梢酝ㄟ^仔細考察親本植物來改良所得植物的性狀。
抗蟲性棉花植物可以如下繁殖，即先將由本文所提到的任意一個株系的種子生長出的棉花植物組成的第一個親本棉花植物與第二個親本棉花植物進行有性雜交，由此產(chǎn)生許多第一代后代植物；然后選擇抗蟲的第一代后代植物(或者具有至少一種本發(fā)明事件的后代植物)；接著使第一代后代植物自交，由此產(chǎn)生許多第二代后代植物；然后從第二代后代植物中選擇抗蟲性植物(或者具有至少一種本發(fā)明事件的植物)。這些步驟可以進一步包括第一代后代植物或第二代后代植物與第二個親本棉花植物或第三個親本棉花植物進行回交。此后，就可以種植包含本發(fā)明棉花種子的棉花農(nóng)作物或其后代。
還應(yīng)該理解，兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物也可以雜交以產(chǎn)生包含兩種獨立地分離的所加入外來基因的后代。將適當后代自交可以產(chǎn)生對所加入的兩個外來基因而言均為純合的植物。因為是營養(yǎng)體繁殖，所以也可以考慮對親本植物進行回交以及與非轉(zhuǎn)基因植物進行異型雜交。本領(lǐng)域已知其它常用于不同性狀和農(nóng)作物的育種方法?；亟挥N已經(jīng)用于將簡單遺傳的、高度可遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移進入目的純合栽培種或近交系(其為回歸親本)。待轉(zhuǎn)移性狀的來源稱為供體親體。預期所得到的植物具有回歸親本(例如栽培種)的特征和從供體親體轉(zhuǎn)移的期望性狀。初次雜交后，選擇具有供體親體表型的個體并與回歸親本重復雜交(回交)。預期所得親本具有回歸親本(例如栽培種)的特征和從供體親本轉(zhuǎn)移的期望性狀。
本發(fā)明的DNA分子可以用作標記輔助性育種(MAB)方法中的分子標記。本發(fā)明的DNA分子可以用于本領(lǐng)域已知的鑒定遺傳上連鎖的農(nóng)學上經(jīng)濟、有用性狀的方法(例如AFLP標記、RFLP標記、RAPD標記、SNPs和SSRs)?？梢允褂肕AB法，在與本發(fā)明棉花植物(或其后代和任意其它棉花栽培種或變種)雜交的后代中追蹤抗蟲性狀。DNA分子是該性狀的標記，而本領(lǐng)域熟知的MAB法可以用來在至少一種本發(fā)明的棉花株系或其后代為親本或祖先的棉花植物中追蹤抗蟲性狀。本發(fā)明的方法可以用來鑒定具有來自棉花株系281-24-236(cry1F)和/或3006-210-23(cry1Ac)的抗蟲事件的任何棉花變種。
本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)抗蟲性棉花植物的方法，其中所述方法包括用本發(fā)明的植物進行育種。更加具體而言，所述方法可以包括將本發(fā)明的兩種植物、或者本發(fā)明的一種植物和任意一種其它植物雜交。優(yōu)選的方法還包括通過分析根據(jù)本發(fā)明可檢測事件的所述后代來選擇所述雜交的后代。
本發(fā)明優(yōu)選的植物或種子在其基因組中包含至少一種如表I所標識的插入序列，以及如表I所標識的在插入序列兩邊的至少20-500個或更多臨近側(cè)翼核苷酸。除非另外說明，“cry1F棉花事件281-24-236”指SEQ IDNO1，其包括插入到最初轉(zhuǎn)化體中的異源DNA(SEQ ID NO1的核苷酸2075-12,748)和緊鄰插入DNA的全部或部分兩側(cè)側(cè)翼基因組序列(SEQ IDNO1的核苷酸殘基1-2074和12,749-15,490)，可以預計插入DNA可因包括該事件的親本株系的有性雜交而傳遞到接受該插入DNA的后代中。類似地，除非另外說明，“cry1Ac棉花事件3006-210-23”指SEQ ID NO2，其包括插入到最初轉(zhuǎn)化體中的異源DNA(SEQ ID NO2的核苷酸528-8900)和緊鄰插入DNA的全部或部分兩側(cè)側(cè)翼基因組序列(SEQ ID NO2的核苷酸殘基1-527和8901-9382)，可以預計插入DNA可因包括該事件的親本株系的有性雜交而傳遞到接受該插入DNA的后代中。
本發(fā)明包括本發(fā)明植物的可再生細胞的組織培養(yǎng)物。也包括從該組織培養(yǎng)物再生出的植物，特異是當所述植物能夠表達所例證變種所有的形態(tài)學和生理學特性時。本發(fā)明的優(yōu)選植物具有從所保藏種子生長出的植物的所有生理學或形態(tài)學特征。本發(fā)明還包含此類種子的后代和具有目的品質(zhì)性狀的種子。
對植物或種子或其部分的操作(例如突變、進一步轉(zhuǎn)染以及進一步育種)可以產(chǎn)生稱為“基本衍生的”變種。植物新品種保護國際聯(lián)盟(theInternational Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV)已經(jīng)提供了下列測定變種是否從受保護變種基本衍生的指導方針。
當存在如下情況時，則認為變種基本衍生自另一變種(“最初變種”)(i)它主要從最初變種衍生或從其自身主要從最初變種衍生的變種衍生，并且保留了源自最初變種基因型或基因型組合的基本特征的表達；(ii)它可以清楚地與最初變種區(qū)別；以及(iii)除了由于衍生行為引起的差別以外，其在源自最初變種的基因型或基因型組合的基本特性表達上與最初變種一致。
UPOV國際組織第六次會議，Geneva，1992年10月30日；文件由聯(lián)盟辦公室制備。
如本文所用，“株系”為一組在至少一個性狀上個體之間顯示很少或沒有遺傳變異的植物。此類株系可以通過幾個世代的自花傳粉和選擇、或者使用組織或細胞培養(yǎng)技術(shù)從單一親本進行營養(yǎng)繁殖來產(chǎn)生。
如本文所用，術(shù)語“栽培種”和“變種”同義，并且指用于商業(yè)生產(chǎn)的株系。
“穩(wěn)定性”或“穩(wěn)定的”意指對于特定組分而言，該組分在世代之間、并且優(yōu)選地在至少三個世代間以基本相同的水平維持，例如優(yōu)選±15％、更優(yōu)選±10％、最優(yōu)選±5％。穩(wěn)定性可能受到溫度、位置、壓力和種植時間的影響。在田間條件下對連續(xù)世代的比較應(yīng)當以相似方式產(chǎn)生組分。
“商業(yè)可用性”定義為具有良好的植物活力和高繁殖力，以便農(nóng)作物能夠由農(nóng)民使用常規(guī)耕作設(shè)備進行生產(chǎn)，并且具有所述組分的油能夠用常規(guī)破碎和提取設(shè)備從種子中提取。為了在商業(yè)上有用，按每英畝生產(chǎn)的種子重量、油含量和總油量測定的產(chǎn)量在相同區(qū)域生長的沒有優(yōu)質(zhì)價值性狀的其它可比較的商業(yè)化蕓苔變種平均產(chǎn)量的15％之內(nèi)。
“農(nóng)學原種”意指具有期望的農(nóng)學特征例如產(chǎn)量、成熟度、抗病性等以及本發(fā)明事件的抗蟲性的株系。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，根據(jù)本公開，檢測試劑盒優(yōu)選的實施方案可以包括定位于和/或包含“連接序列”或“過渡序列”(在此處棉花側(cè)翼基因組序列與插入序列接觸)的探針和/或引物。例如，這包括包含如表1所示的SEQ ID NO1的殘基2074-2075或12,748-12,749或者SEQ ID NO2的殘基527-528或8,900-8,901的序列的多核苷酸探針、引物或擴增子。為了鑒別這些特定事件，優(yōu)選的“接頭引物”應(yīng)當包括至少～15個相鄰側(cè)翼序列的殘基和至少～15個相鄰插入序列的殘基。通過這種排列，在側(cè)翼或插入?yún)^(qū)域中的另一個引物可以用來產(chǎn)生表明本發(fā)明事件存在的可檢測擴增子。然而，在優(yōu)選的實施方案中，一條引物結(jié)合在側(cè)翼區(qū)域，一條引物結(jié)合在插入?yún)^(qū)域，而且這些引物能夠用來產(chǎn)生跨越(及包括)如上所述連接序列的擴增子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也將認識到，引物和探針可以設(shè)計用來在標準的雜交和/或PCR條件范圍下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2及其互補序列的片段雜交，其中引物或探針與所例證的序列不完全互補。即可以耐受一定程度的錯配。例如，對于大約20個核苷酸的引物，如果錯配堿基在與擴增子相反的引物的中間或末端，那么一般一個或兩個核苷酸不需要與相反鏈結(jié)合。下文提供了多種合適的雜交條件。合成的核苷酸類似物例如肌苷也可以在探針中使用。除了DNA和RNA探針外，也可以使用核酸肽(PNA)探針。重要的是該探針和引物對于本發(fā)明事件的存在是鑒別性的(能夠獨特地鑒定和區(qū)分)。
還需要注意的是PCR擴增中可能發(fā)生錯誤，從而可能導致例如少量的測序錯誤。即除非另外說明，本文列出的序列如下測定，先從棉花基因組DNA產(chǎn)生長擴增子，然后將該擴增子克隆和測序。如果必需多個擴增循環(huán)來從基因組DNA產(chǎn)生足夠測序的擴增子，那么在用這種方式產(chǎn)生和測定的序列中發(fā)現(xiàn)細微差別和少量不一致是常見的。例如，標出了在所測定事件-側(cè)翼DNA序列和相應(yīng)的已知/野生型/基因組DNA之間的下列差別。在本發(fā)明cry1F事件的5’側(cè)翼，SEQ ID NO1的2037位殘基測定為/例為“G”，而已知的基因組序列的281-24-236基因座相應(yīng)的殘基為“A”(根據(jù)標準的IUPAC-IUB國際公約，R可以在共有序列中使用)。在這個事件的3’側(cè)翼，SEQ ID NO1的12,781位殘基在本文中列為T，而在公開的基因組序列中的相應(yīng)位置提供的是C(Y為共有代碼)。SEQ ID NO1的12,811位點為C，而基因組提供的是T(Y為一致代碼)。SEQ ID NO1的12,866位點為C，而基因組中出現(xiàn)的是T(Y為一致代碼)。SEQ ID NO1的12,882位點為G，而基因組出現(xiàn)的是A(R為一致代碼)。SEQ ID NO1的12,918位點為A，而基因組中出現(xiàn)的是G(R為一致代碼)。SEQ ID NO1的13,129位點為G，而基因組中出現(xiàn)的是A(R為一致代碼)。SEQ ID NO1的13,222位點為C，而基因組中出現(xiàn)的是T(Y為一致代碼)。在SEQ ID NO1的13,441位點為T，而基因組列表中沒有相應(yīng)殘基。因此，與基因組序列相比，這個明顯的插入將使SEQ ID NO1下游相應(yīng)編號移位。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當認識并注意到，任何由于這種類型的常見測序錯誤或不一致而需要的調(diào)整都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
類似的差別也在本發(fā)明cry1Ac事件的5’側(cè)翼出現(xiàn)。在SEQ ID NO2的149、153、159、165和244位點，分別列出下列殘基C、G、C、C和C。在基因座3006-210-23的基因組序列中分別在相應(yīng)位置出現(xiàn)下列殘基A、A、A、A和A。這些替代的一致代碼分別是M、R、M、M和M?？梢韵鄳?yīng)地對探針和引物進行調(diào)整，而且在跨越或包括任意上述殘基的擴增子中可以注意到相應(yīng)差別。
還應(yīng)當注意的是，當在事件產(chǎn)生期間插入序列時一些基因組序列被刪除，這是不常見的。這是本發(fā)明兩個事件的情況。即，SEQ ID NO1提供了對于事件281-24-236在插入期間被刪除的棉花基因組DNA的53堿基片段。這個“內(nèi)部片段”出現(xiàn)在非轉(zhuǎn)化棉花基因組中SEQ ID NO1的殘基2074和殘基12,749之間。類似地，SEQ ID NO2提供了對于事件3006-210-23在插入期間被刪除的棉花基因組DNA的16堿基片段。這個“內(nèi)部片段”出現(xiàn)在非轉(zhuǎn)化棉花基因組中SEQ ID NO2的殘基527和殘基8,901之間。
如
圖1和2所示，每個“插入片段”的組分如下。本發(fā)明事件Cry1F281-24-236中包含的轉(zhuǎn)基因遺傳元件DNA分子由與產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)(其與ORF25多腺苷酸化序列(Baker等人，Plant Molecular Biology 2335-350，1983)有效連接)有效連接的玉米泛素1啟動子、包含部分刪除的并帶有四個章魚堿合成酶啟動子的增強子元件的甘露堿合成酶啟動子的、與蘇云金芽孢桿菌鲇澤變種(Bacillus thuringiensisvar var.aizawai)的Cry1F(synpro)(其與ORF25多腺苷酸化序列(Baker等人，Plant Molecular Biology2335-350，1983)有效連接)有效連接的嵌合體啟動子[(4OCS)δMAS]和與部分pat序列非有效連接的玉米泛素1啟動子組成。這些組分的DNA多核苷酸序列或片段可以用作本發(fā)明方法中的DNA引物或探針。
事件Cry1Ac 3006-210-23包含的轉(zhuǎn)基因遺傳元件DNA分子由與PAT(如上所述)(其與ORP25有效連接)有效連接的(4OCS)δMAS啟動子和與蘇云金芽孢桿菌庫斯塔變種(Bacillus thuringiensisvar var.kurstaki)的Cry1Ac(synpro)(其與ORP25多腺苷酸化序列有效連接)有效連接的玉米泛素1啟動子組成。這些組分的DNA多核苷酸序列或其片段可以用作本發(fā)明方法中的DNA引物或探針。
在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了在植物和種子等中鑒定來自命名為WIDESTRIKE(包含Cry1F事件281-24-236和Cry1Ac事件3006-210-23)的棉花植物的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域存在的組合物和方法。所提供的DNA序列包含在本文SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、其片段以及所例證序列及其任意片段的互補序列中提供的至少一種轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域連接序列。插入?yún)^(qū)域連接序列跨越插入基因組中的異源DNA和棉花細胞中插入位點側(cè)翼的DNA之間的連接。該序列對一種或多種特定事件是鑒別性的。
基于這些插入片段和邊界序列，產(chǎn)生事件特異性引物。PCR分析表明，可以通過對用這些事件特異性引物對產(chǎn)生的PCR擴增子進行分析來鑒定這些棉花株系(Cry1F 281-24-236和Cry1Ac 3006-210-23)的不同棉花基因型。這些方法以及其它相關(guān)方法可以用來獨特地鑒定這些棉花株系。因此，從此類引物對衍生的PCR擴增子是獨特的，并且能夠用來鑒定這些棉花株系。
在一些實施方案中，包含至少一種新的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域的DNA序列為這個發(fā)明的一個方面。所包括的是包含足夠長度的轉(zhuǎn)基因插入序列多核苷酸和足夠長度的來自一種或多種上述三種棉花植物的棉花基因組序列多核苷酸的DNA序列，和/或用作產(chǎn)生擴增子產(chǎn)物(其對這些棉花植物中的一種或多種具有鑒別性)的引物序列的序列。
相關(guān)的實施方案涉及如下DNA序列，其包含選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2或其互補序列的轉(zhuǎn)基因部分DNA序列中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多連續(xù)核苷酸以及來自這些序列或其互補序列的相似長度的棉花側(cè)翼DNA序列。該序列可用作DNA擴增方法中的DNA引物。用這些引物產(chǎn)生的擴增子對于本文提到的任何棉花事件都是鑒別性的。因此，本發(fā)明也包括通過此類DNA引物和同源引物產(chǎn)生的擴增子。
下表2總結(jié)了本發(fā)明的特定實施方案。
表2.在事件特異性PCR擴增中使用的引物及其序列列表
本發(fā)明也包括在對應(yīng)至少一種本文提到的棉花事件的樣品中檢測DNA存在的方法。此方法包括(a)當引物對用來從至少一種這些棉花事件的DNA進行核酸擴增反應(yīng)時，將引物對與包含DNA的樣品接觸，從而產(chǎn)生對所述事件為鑒別性的擴增子；(b)進行核酸擴增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴增子；以及(c)檢測擴增子。
本發(fā)明更多的檢測方法包括在對應(yīng)至少一種所述事件的樣品中檢測DNA存在的方法，其中所述方法包括(a)將包含DNA的樣品與在嚴格雜交條件下與來自至少一種所述棉花事件的DNA雜交但在嚴格雜交條件下不與對照棉花植物(非目的事件DNA)雜交的探針接觸；(b)將樣品和探針置于嚴格的雜交條件下；以及(c)檢測探針和DNA的雜交。
在更多的實施方案中，本發(fā)明還包括產(chǎn)生包含本發(fā)明cry1F和/或cry1Ac事件的棉花植物的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)將第一個親本棉花株系(包含本發(fā)明的表達盒，其賦予所述株系植物所述抗蟲性狀)和第二個親本棉花株系(缺少該抗蟲性狀)有性雜交，從而產(chǎn)生許多子代植物；以及(b)通過使用分子標志篩選子代植物。此方法可以任選地包括另一個步驟將子代植物和第二個親本棉花株系回交以產(chǎn)生包含所述抗蟲性狀的純種棉花植物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了確定與所述三種事件中任意一種(或多種)事件植物雜交的后代的接合性的方法。所述方法可以包括將包含棉花DNA的樣品與本發(fā)明的引物對接觸。當所述引物用來與至少一種所述棉花事件的基因組DNA進行核酸擴增反應(yīng)時，其產(chǎn)生對至少一種所述棉花事件為鑒別性的第一個擴增子。該方法還包括進行核酸擴增反應(yīng)，從而產(chǎn)生第一個擴增子；檢測第一個擴增子；將包含棉花DNA的樣品與所述引物對(當所述引物對用來自與棉花植物基因組DNA進行核酸擴增反應(yīng)時，其產(chǎn)生第二個擴增子，其中該第二個擴增子包含與所述棉花事件之一所標識轉(zhuǎn)基因插入序列的棉花基因組區(qū)域同源的天然棉花基因組DNA)接觸；以及進行核酸擴增反應(yīng)，從而產(chǎn)生第二個擴增子。該方法還包括檢測第二個擴增子，以及比較樣品中的第一個和第二個擴增子，其中兩個擴增子都存在則表明樣品對于轉(zhuǎn)基因插入是雜合的。
可以使用本文公開的組合物和DNA檢測領(lǐng)域眾所周知的方法研發(fā)DNA檢測試劑盒。試劑盒用于鑒定樣品中本發(fā)明棉花事件DNA，并且可以應(yīng)用于培育包含該DNA的棉花植物的方法。試劑盒包含與例如本文所公開擴增子同源或互補的DNA序列或者與本發(fā)明事件轉(zhuǎn)基因遺傳元件所包含的DNA同源或互補的DNA序列。這些DNA序列可以用于DNA擴增反應(yīng)或者用作DNA雜交方法中的探針。試劑盒還包含開展檢測方法所必需的試劑和材料。
“探針”是帶有常規(guī)可檢測標簽或報告分子(例如放射性同位素、配體、化學發(fā)光劑或酶)的分離的核酸分子。該探針與靶核酸鏈互補，在本發(fā)明中探針與來自所述棉花事件之一的基因組DNA的一條鏈(不管是來自棉花植物還是來自包括源自事件的DNA的樣品)互補。根據(jù)本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，還包括特異結(jié)合靶DNA序列并且能夠用來檢測靶DNA序列存在的聚酰胺和其它探針材料。
“引物”為通過核酸雜交與互補靶DNA鏈退火以便在引物和靶DNA鏈之間形成雜交體，然后通過聚合酶如DNA聚合酶沿著靶DNA鏈被延伸的分離的核酸。本發(fā)明的引物對涉及其通過例如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或其它常規(guī)核酸擴增方法擴增靶核酸序列的用途。
探針和引物的長度通常為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500個多核苷酸或更多。此類探針和引物在高嚴格雜交條件下與靶序列特異性雜交。盡管可以通過常規(guī)方法設(shè)計不同于靶序列但保持與靶序列雜交能力的探針，但優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的探針和引物具有類似于靶序列的完整序列。
制備和使用探針和引物的方法描述于例如Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，第1-3卷，Sambrook等人編輯，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。PCR引物對可以通過例如使用旨在用于該目的的計算機程序從已知序列衍生。
基于本文所公開側(cè)翼DNA和插入序列的引物和探針可以用來通過常規(guī)方法(如通過對該序列進行再克隆和測序)證實(和糾正(如果需要))所公開序列。
本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴格條件下與靶DNA序列雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴增方法都可以用來鑒定樣品中源自轉(zhuǎn)基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能夠在某些情況下特異地與其它核酸分子雜交。如本文所用，如果兩個分子能夠形成反向平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則它們就被表述為能夠彼此特異性雜交。如果核酸分子和另一核酸分子呈現(xiàn)完全的互補性，則該核酸分子就被表述為是另一核酸分子“互補序列”。如本文所用，當兩個分子至一的每個核苷酸均與另一分子的核苷酸互補時，則兩個分子被表述為呈現(xiàn)“完全互補性”。如果兩個分子能夠以足夠的穩(wěn)定性彼此雜交從而允許它們至少在常規(guī)的“低嚴格性”條件下保持彼此退火，則兩個分子被表述為是“最低程度互補的”。類似地，如果分子能以足夠的穩(wěn)定性彼此雜交從而允許它們在常規(guī)的“高嚴格性”條件下保持彼此退火，則它們就被表述為是“互補的”。常規(guī)的嚴格條件描述于Sambrook等人，1989。因此，偏離完全互補性是允許的，只要這種偏離不影響分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力即可。為了使核酸分子用作引物或探針，僅需要其在序列上具有足夠的互補性以便能夠在所采用的特定溶劑和鹽條件下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
如本文所用，基本同源的序列為在高嚴格性條件下與所比較核酸序列的互補序列特異性雜交的核酸序列。關(guān)于核酸探針與靶核酸雜交(即與特定的目的核酸序列雜交)的術(shù)語“嚴格條件”由在Sambrook等人，1989，9.52-9.55中所述特定雜交方法進行功能性定義。還參見Sambrook等人，1989，9.47-9.52。因此，可以利用本發(fā)明核苷酸序列的、能與DNA片段的互補序列形成雙鏈體分子的能力。
取決于預期應(yīng)用，可以使用不同的雜交條件來實現(xiàn)探針對靶序列的不同程度的選擇性。對于需要高選擇性的應(yīng)用，一般采用相對嚴格的條件來形成雜交體，例如選擇相對低的鹽和/或高的溫度條件，如由大約50℃至大約70℃溫度下大約0.02M至大約0.15M NaCl所提供的條件。嚴格條件例如可以包括用高嚴格性洗滌緩沖液(0.2×SSC，0.1％SDS，65℃)洗滌雜交濾器至少兩次。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知促進DNA雜交的近似嚴格條件，例如大約45℃、6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，然后用在50℃用2.0×SSC洗滌，6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從50℃、大約2.0×SSC的低嚴格性至50℃、大約0.2×SSC的高嚴格性中選擇。此外，洗滌步驟的溫度可以從低嚴格條件的室溫大約22℃升高至高嚴格條件的大約65℃。溫度和鹽都可以改變，或者溫度或鹽濃度保持恒定而改變另外的變量。此類選擇性條件耐受探針和模板或靶鏈之間少量的(如果存在的話)錯配。通過雜交作用檢測DNA序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且美國專利號4,965,188和5,176,995的教導為雜交分析方法的范例。
在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸在高嚴格性條件下與一種或多種本文所例證或建議的引物(或擴增子或其它序列)，包括互補序列或片段特異性雜交。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的標記核酸分子具有SEQ IDNO3-14中所述核酸序列或其互補序列和/或片段。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的標記核酸分子與該核酸序列具有80％-100％或90％-100％的序列同一性。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的標記核酸分子與該序列具有95％-100％的序列同一性。該序列可以用作植物育種方法中的標記以鑒定遺傳雜交的后代。探針與靶DNA分子的雜交可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法檢測，這些方法可以包括但不局限于熒光標簽、放射性標簽、基于抗體的標簽和化學發(fā)光標簽。
對于使用特定的擴增引物對對靶核酸序列擴增(例如通過PCR)，“嚴格條件”為允許引物對只與靶核酸序列雜交的條件，其中具有相應(yīng)野生型序列(或其互補序列)的引物將優(yōu)選結(jié)合以產(chǎn)生獨特的擴增產(chǎn)物-擴增子。
術(shù)語“(靶序列)特異性的”表示探針或引物在嚴格雜交條件下只與包含靶序列的樣品中的靶序列雜交。
如本文所用，“擴增的DNA”或“擴增子”指靶核酸序列(為部分核酸模板)的核酸擴增產(chǎn)物。例如，為了測定源自有性雜交的棉花植物是否包含來自本發(fā)明棉花植物的轉(zhuǎn)基因事件的基因組DNA，可以從棉花植物組織樣品中提取DNA進行核酸擴增方法，以便產(chǎn)生鑒別事件DNA存在的擴增子，其中使用的引物對包括從植物基因組中鄰近所插入異源DNA的插入位點的側(cè)翼序列衍生的引物和從所插入異源DNA衍生的第二個引物。該擴增子的長度和序列對于事件而言也是鑒別性的。擴增子長度可以在引物對長度加上一個核苷酸堿基對的組合長度和/或引物對加上大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500、750、1000、1250、1500、1750、2000或更多核苷酸堿基對的組合長度內(nèi)變化(加上或減去上文列出的任意增量)。備選地，引物對可以衍生自所插入的DNA兩側(cè)的側(cè)翼序列以便產(chǎn)生包括整個插入片段核苷酸序列的擴增子。許多衍生自植物基因組序列的引物對可以距所插入DNA序列一段距離。該距離可以在從一個核苷酸堿基對至大約兩萬個核苷酸堿基對內(nèi)變化。特別地，所使用的術(shù)語“擴增子”不包括在DNA熱擴增反應(yīng)中形成的引物二聚體。
核酸擴增可以通過本領(lǐng)域已知的多種核酸擴增方法(包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR))來實現(xiàn)。多種擴增方法是本領(lǐng)域已知的并且尤其描述于美國專利號4,683,195和4,683,202中。已經(jīng)開發(fā)出能擴增高達22kb基因組DNA的PCR擴增方法。這些方法以及DNA擴增領(lǐng)域已知的其它方法可以用于本發(fā)明的實踐。來自本發(fā)明棉花事件的異源轉(zhuǎn)基因DNA插入序列或側(cè)翼基因組序列可以如下證實(和糾正(如果需要))，即通過使用從本文所提供序列衍生的引物擴增從事件中擴增此類序列，隨后對PCR擴增子或所克隆DNA進行標準的DNA測序。
通過這些方法產(chǎn)生的擴增子可以通過許多技術(shù)檢測。瓊脂糖凝膠電泳和用溴化乙錠染色是檢測DNA擴增子的眾所周知的常用方法。另一種此類方法是Genetic Bit Analysis，其中DNA寡核苷酸設(shè)計為與鄰近側(cè)翼基因組DNA序列和插入的DNA序列均重疊。將寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在對目的區(qū)域進行PCR(使用位于插入序列中的一個引物和位于鄰近側(cè)翼基因組序列中的另一個引物)之后，單鏈PCR產(chǎn)物可以與固定的寡核苷酸雜交，并可以作為模板用于使用DNA聚合酶和所預期的下一個堿基特異性的標記ddNTP進行單堿基延伸反應(yīng)。所讀出信號可以是熒光信號或基于ELISA的信號。由于成功擴增、雜交和單堿基延伸，所以信號的存在表明插入/側(cè)翼序列的存在。
另一方法是Winge(Innov.Pharma.Tech.0018-24，2000)描述的焦磷酸測序技術(shù)。在這個方法中，寡核苷酸設(shè)計為與鄰近基因組DNA和插入DNA連接處重疊。寡核苷酸與來自目的區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(使用位于插入序列中的一個引物和位于側(cè)翼基因組序列中的一個引物)雜交，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和熒光素存在下孵育。單獨加入DNTP，摻入后產(chǎn)生待檢測的光信號。由于成功擴增、雜交和單或多堿基延伸，所以光信號的存在表明轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。
熒光偏振是另外一種可以用來檢測本發(fā)明擴增子的方法。按照該方法，寡核苷酸被設(shè)計為與基因組側(cè)翼和插入DNA連接處重疊。寡核苷酸與來自目的區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(使用位于插入序列中的一個引物和位于側(cè)翼基因組序列中的一個引物)雜交，并在DNA聚合酶和熒光標記ddNTP存在下孵育。單堿基延伸導致ddNTP的摻入。摻入可以用熒光計測定為偏振的改變。由于成功擴增、雜交和單堿基延伸，所以偏振的改變表明轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。
TAQMAN(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，Calif.)是檢測和定量DNA序列存在的一種方法。簡言之，F(xiàn)RET寡核苷酸探針被設(shè)計成與基因組側(cè)翼和插入DAN連接處重疊。使用FRET探針和PCR引物(一個引物位于插入DNA序列中，一個位于側(cè)翼基因組序列中)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP存在下進行循環(huán)。FRET探針的雜交導致熒光部分斷裂和釋放而離開FRET探針上的淬滅部分。由于成功擴增和雜交，所以熒光信號的存在表明側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。
已經(jīng)描述了分子燈塔(Molecular Beacons)在序列檢測中的應(yīng)用。簡言之，F(xiàn)RET寡核苷酸探針被設(shè)計成與側(cè)翼基因組DNA和插入DAN連接處重疊。FRET探針的獨特結(jié)構(gòu)使其包含保持熒光和淬滅部分緊密靠近的二級結(jié)構(gòu)。使用FRET探針和PCR引物(一個引物位于插入DNA序列中，一個位于側(cè)翼基因組序列中)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP存在下進行循環(huán)。隨著成功PCR擴增，F(xiàn)RET探針與靶序列的雜交導致探針二級結(jié)構(gòu)的去除，并導致熒光部分和淬滅部分在空間上分離。從而產(chǎn)生熒光信號。由于成功擴增和雜交，所以熒光信號的存在表明側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。
已經(jīng)公開了棉花基因組中對插入而言優(yōu)良的兩個大體位置，本發(fā)明還包括在這一個或兩個位置附近包含至少一種非cry1F和非cry1Ac插入序列的棉花種子和/或棉花植物。一種選擇是用不同的插入序列替代本文例證的cry1F和/或cry1Ac插入序列。出于這種一般考慮，例如根據(jù)本發(fā)明可以使用靶向同源重組。該類型技術(shù)為例如WO03/080809A2和相應(yīng)公布的美國申請(USPA 20030232410)的主題。
本文提及或引用的全部專利、專利申請、臨時申請和公布在此處整體引入作為參考，直到它們與本說明書清楚的教導不一致的程度。
下列實施例用來說明實踐本發(fā)明的方法和闡述本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案。這些實例不應(yīng)解釋為限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當意識到，下列實施例中公開的技術(shù)代表用來闡述其優(yōu)選實施方式的特殊方法。但是，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當意識到，可以對這些具體實施方案在不脫離本發(fā)明的主旨和范圍下進行任何改動而仍然能得到相似或類似結(jié)果。除非另外說明，所有的百分比都是重量百分比；除非另外注明，所有溶劑混合物比例都是體積比。
實施例1-保藏種子的產(chǎn)生棉花的WideStrikeTM類型抗蟲性是Dow AgroSciences研發(fā)轉(zhuǎn)基因性狀，其提供針對鱗翅目昆蟲植物內(nèi)抗性。其包含兩個分別衍生自蘇云金芽胞桿菌庫斯塔亞種和蘇云金芽胞桿菌鲇澤亞種的昆蟲耐受基因，cry1Ac和cry1F。蘇云金芽胞桿菌(B.t.)為常見的革蘭氏陽性土壤細菌。在其孢子形成階段，其產(chǎn)生幾種殺蟲蛋白質(zhì)晶體(已知為δ-內(nèi)毒素)，其中包括Cry1Ac和Cry1F。這些蛋白質(zhì)對于某些鱗翅目昆蟲是有毒的。在敏感性昆蟲中，它們與存在于中腸上皮細胞的特異受體結(jié)合，形成破環(huán)滲透平衡的孔洞，并最終導致細胞溶解和死亡。已經(jīng)表明，Cry1Ac和Cry1F對沒有δ-內(nèi)毒素結(jié)合位點的人、家畜和有益昆蟲是無毒的。由于兩種Cry蛋白質(zhì)比單獨一種提供更廣譜的控制范圍，以及對它們所有效對抗的鱗翅目害蟲具有不同活性，所以使用兩種δ-內(nèi)毒素而非一種δ-內(nèi)毒素將提供改進的抗蟲性。更加重要地，其可以延緩抗性昆蟲的抗性產(chǎn)生。
WideStrike中的cry1Ac和cry1F基因通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化在兩個單獨的轉(zhuǎn)化事件3006-210-23和281-24-236中引入GC-510棉花(陸地棉)植物。雜交后進入原種棉花變種，這些事件可通過常規(guī)育種來組合以產(chǎn)生具WideStrike抗蟲性狀的棉花。WideStrike還包含來自常見需氧土壤細菌綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的pat基因。pat基因編碼膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)，該酶通過乙?；饔檬共蒌@膦解毒成為無效化合物。之所以包含pat基因是為了對已轉(zhuǎn)化的棉花植物進行篩選。
實施例2-Cry1F棉花事件281-24-236的鑒別性檢測使用QIAGEN的Plant DNeasy試劑盒(目錄號69181，Qiagen，Valencia，CA，USA)從棉花葉子中提取Cry1F事件281-24-236和Cry1Ac事件3006-210-23以及非轉(zhuǎn)基因棉花PCS355的DNA。按照制造商建議的方法進行。簡言之，使用碳化鎢珠(直徑0.125mm)和Retsch MM3000 Mixer Mill在補加RNA酶的預熱緩沖液中將葉片破碎。在室溫下將混合物離心，隨后通過流經(jīng)DNeasy96孔板得到上清。用洗脫緩沖液洗脫DNA，并凍存直至使用。
從棉花葉子組織中提取的DNA用于Cry1F事件281-24-236中5’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列和3’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列DNAPCR擴增，在5’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列的擴增中使用引物281-14(SEQ ID NO3，5’TGTCGGCTGAAGGTAGGGAGG3′)和引物281-15(SEQ ID NO4，5′CCGGACATGAAGCCATTTAC3′)，在3’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列中使用引物281-9(SEQ ID NO6，5’TCTCTAGAGAGGGGCACGACC3′)和引物281-10(SEQ ID NO7，5′CGAGCTGGAGAGACCGGTGAC3’)。用從棉花事件Cry1F 281-24-236和非轉(zhuǎn)基因棉花株系PCS355中提取的基因組DNA進行PCR DNA擴增分析。對于5’側(cè)翼基因組序列的擴增反應(yīng)用QIAGEN HotStarTaq PCR試劑盒(目錄號203203或203205，QIAGEN，Valencia，CA，USA)進行，其中在50μl反應(yīng)體積中引物281-14和引物281-15的終濃度為0.4μM。反應(yīng)使用GenAmp PCR System 9600(Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA)進行，循環(huán)條件如下95℃15分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒、57℃30秒、72℃60秒，35個循環(huán)；72℃10分鐘，1個循環(huán)。針對3’側(cè)翼基因組序列的PCR使用Takara ExTaq PCR試劑盒(目錄號RR001A，Panvera，Madison，WI)進行，其中在50μl反應(yīng)體積中含有0.4μM終濃度的引物281-9和引物281-10。反應(yīng)使用GenAmp PCR System 9600(Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA)進行，循環(huán)條件如下95℃5分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒、60℃30秒、72℃60秒，35個循環(huán)；72℃10分鐘，1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳(100V，大約1小時)分離，并通過溴化乙錠染色顯色。
經(jīng)測序，5’PCR產(chǎn)物的DNA序列為603個核苷酸堿基對，其代表著棉花Cry1F事件281-24-236的5’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列并標識為SEQ ID NO5。經(jīng)測序，3’PCR產(chǎn)物的DNA序列為562個核苷酸堿基對，其代表著棉花Cry1F事件281-24-236的3’側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列并標識為SEQ ID NO8。
基因組/轉(zhuǎn)基因連接序列SEQ ID NO5和SEQ ID NO8為Cry1F事件281-24-236中的新的DNA序列，其可以鑒別棉花植物Cry1F事件281-24-236及其后代。
實施例3-Cry1Ac棉花事件3006-210-23的鑒別性檢測從棉花葉子組織中提取的DNA用于Cry1Ac事件3006-210-23中5’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列和3’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列DNAPCR擴增，在5’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列的擴增中使用引物3006-20(SEQ ID NO9，5’TTCCAACCTTTAACTATTATCCTGC3′)和引物3006-22(SEQ ID NO10，5′GCTGCGGACATCTACATTTT3′)。在3’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列中使用引物3006-9(SEQ ID NO12，5′GACATGCAATGCTCATTATCTCTA3′)和引物3006-12(SEQ ID NO13，5’AAGTCTCTGCCTTCTACCCTGG3′)。用從棉花事件Cry1Ac3006-210-23和非轉(zhuǎn)基因棉花株系PCS355中提取的基因組DNA進行PCRDNA擴增分析。對于5’側(cè)翼基因組序列的擴增反應(yīng)用QIAGENHotStarTaq PCR試劑盒(目錄號203203或203205，QIAGEN，Valencia，CA，USA)進行，其中在50μl反應(yīng)體積中引物3006-20和引物3006-22的終濃度為0.4μM。反應(yīng)使用GenAmp PCR System9600(Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA)進行，循環(huán)條件如下95℃15分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒、53℃30秒、72℃60秒，35個循環(huán)；72℃10分鐘，1個循環(huán)。對于3’側(cè)翼基因組序列的擴增反應(yīng)用QIAGEN HotStarTaq PCR試劑盒(目錄號203203或203205，QIAGEN，Valencia，CA，USA)進行，其中在50μl反應(yīng)體積中含有0.4μM終濃度的引物3006-9和引物3006-12。反應(yīng)使用GenAmp PCR System 9600(Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA)進行，循環(huán)條件如下95℃5分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒、56℃30秒、72℃60秒，30個循環(huán)；72℃10分鐘，1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳(100V，大約1小時)分離，并通過溴化乙錠染色顯色。
經(jīng)測序，5’PCR產(chǎn)物的DNA序列為614個核苷酸堿基對， 其代表著棉花Cry1Ac事件3006-210-23的5’側(cè)翼基因組序列/轉(zhuǎn)基因插入序列(在此標識為SEQ ID NO11)。經(jīng)測序，3’PCR產(chǎn)物的DNA序列為662個核苷酸堿基對，其代表著棉花Cry1Ac事件3006-210-23的3’側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列(在此標識為SEQ ID NO14)。
基因組/轉(zhuǎn)基因連接序列SEQ ID NO11和SEQ ID NO14為Cry1Ac事件3006-210-23中的新的DNA序列，其可以鑒別棉花植物Cry1Ac事件3006-210-23及其后代。
實施例4-更多鑒別性檢測DNA事件引物對用來產(chǎn)生對于Cry1F事件281-24-23和Cry1Ac事件3006-210-23而言為鑒別性的擴增子。這些事件引物對包括但不局限于SEQID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13。當在DNA擴增方法(PCR)中使用時，這些引物產(chǎn)生對于Cry1F事件281-24-236和/或Cry1Ac事件3006-210-23及其后代而言為鑒別性的擴增子。除了這些引物對以外，本發(fā)明的更多方面包括從擴增子產(chǎn)物SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、SEQID NO11和/或SEQ ID NO14衍生的任何引物對，其中所述引物對在DNA的擴增反應(yīng)中會產(chǎn)生對于Cry1F事件281-24-236、Cry1Ac事件3006-210-23及其后代為鑒別性的擴增子?？紤]到本公開的利益，涉及使用DNA引物以產(chǎn)生對于Cry1F事件281-24-236、Cry1Ac事件3006-210-23及其后代而言為鑒別性的擴增子的任何修改都屬本領(lǐng)域普通技術(shù)。對來自Cry1F事件281-24-236、Cry1Ac事件3006-210-23及其后代的植物組織樣品的分析應(yīng)當包括來自這些事件的陽性組織對照、來自不是這些事件中任意事件的棉花植物的陰性對照、以及不包含模板棉花DNA的陰性對照。另外的引物序列可以由DNA擴增方法領(lǐng)域的技術(shù)人員從SEQ ID NO1和/或SEQ IDNO2中衍生。產(chǎn)生擴增子的優(yōu)化條件可以與上述實施例中描述的方法不同。這些DNA引物序列在用于實施例中所述方法的修改方法中的用途屬于本發(fā)明的范疇。衍生自SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2、對于Cry1F事件281-24-236和/或Cry1Ac事件3006-210-23及其后代為鑒別性的擴增子和引物為本發(fā)明的幾個方面。對Cry1F事件281-24-236、Cry1Ac事件3006-210-23及其后代的擴增子的檢測可以通過使用Stratagene Robocycler，MJ，Engine或Eppendorf Mastercycler梯度熱循環(huán)儀或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和裝置進行。
已經(jīng)闡明和描述了本發(fā)明的原理，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，可以在安排和細節(jié)上對本發(fā)明進行修改而不脫離該原理。我們要求對在后附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的所有修改進行專利保護。
序列表<110>美國陶氏益農(nóng)公司(Dow AgroSciences LLC)<120>Cry1F和Cry1Ac轉(zhuǎn)基因棉花株系及其事件特異性鑒定<130>DAS-117CXC1<150>US 60/556,586<151>2004-03-26<150>US 60/613,851<151>2004-09-27<160>16<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>15490<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cry1F事件281-24-236的插入片段及其邊界序列<400> 1aagcttgctt aaaagtatca caagccatga tccttataaa aatgatatct gacactatgc 60ttctttgcac attcttcact atgctttctc atttgagcaa tggtgggatt tgctctcaaa120tttggtggcc ctatgtcagt attcaaaaat tttcataggt caaaggcttg aagataagcc180ttcattttta ccacccatat gtagtaaatt tcaccgatga atacaagagg tggaggtggt240gagaaactag atgaatacat tcttgcagaa aacgtccctc aaagatcaaa atggctctca300ataccaattc ttggtgtttt cagactaaga gagaaagcaa aacgagacaa tgaacccaca360agatgaatta atttcaatac atttttttaa atttcatttc aaacggttac aatatatacc420ttttgttttc caaacaactc aactgatcca actaacatct tggaaatagg aaaacttaac480ttgtacacaa actgattgtg aaatcaacac ctaaacacat caagtcatta ccaacttagt540ttattcctag ctaagtatct taacataagg attgaacaaa aggttaaacc aaaactttga600tttttttgct ctaggaagac agcttgcact tcatcataca gttcgcctta ttgttaatca660actcacactt tggctgtccg ttgatatgct ggcagttaaa atgttcacca atgtgcttag720acaatccgcc aagcctatcg tgtaaaaact ctttgcatga cagttcacct attgacagtc780cgccagtctt ttaatgctca gactgtctac catgtgactt agagacggaa ttgtttgcca840tatgtgttcg ccaactagat tgttcaccat ttgtgttgtt taccatgtgt gttcgctaat900
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<223>Cry1Ac事件3006-210-23的插入片段及其邊界序列<220>
<221>misc feature<222>(556)..(556)<223>n是a、c、g或t<400>2accaattatt atcgtctttt ttaattattc caacctttaa ctattatcct gccttaaaat 60tcgaatacat ttattatcta taaactatcc gaatattatt atctaaatcc taattaaata 120ctatttttta tcgagtattc gtatccgcca aggaaatcca tctccaaatt ttcaattatt 180tttcagatat ctaaatctgt aaaatttcaa attcaagtac gttacaattc tttataaata 240atccaaatta taaatatttt ataactatta attcataaat taaaatttat tattcaaata 300ttcgaataat ctatttttaa gacgtaaagt attacatcga agggttactt tcaaagggta 360gtgtatttcc atttcaatta ttcagaacgt tgtcgttttg ttccggtcat agaaaagggc 420tctggaagag aagaaaatga cttgactttt caatttcatg ctcatccact cgtttcaatt 480actgtttact aaaaaaataa taaaataaaa tattaacaat gcattgagta tgatgtccgg 540
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<223>正向引物281-14<400>3tgtcggctga aggtagggag g 21<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物281-15<400>4ccggacatga agccatttac20<210>5<211>603<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>使用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4產(chǎn)生的擴增子的603bp的序列<400>5tgtcggctga aggtagggag gaattaatca atcacagttg cttgtttctg agtctataga 60atcatgaatt ttaaatttat ggaatgcatt ttttcgaaga tattgtatgc attaagtgta 120attttagttt caatatgaaa tttgagattt atatatatac ttacataaaa ccctccttta 180ctgaattagt gccatggata aaagaccaat taagcaatcc ttccaacacg tgcatgcact 240ggattttcat cgcctcgtcc attgttaaat tgataggtta ataagaacaa ttagttggct 300actgattata tggattctgg gttaaaagta tttaggttta ctgttacata catggaggat 360ctacatctat tttcactttt gtttaattaa tttaagttag ttttgatgag tttaaggatt 420gtactagcca atagtagtac ataaaggaga tagagtacca aaacaaagaa aaagccgaaa 480
ggtgttaatg ctaaattgta aaagaaagtt aaaataagag actcgaatta taatatgatt 540ctctggcgca ctaattaagc tactatatat tgtcaatagt attgtaaatg gcttcatgtc 600cgg 603<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物281-9<400>6tctctagaga ggggcacgac c 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物281-10<400>7cgagctggag agaccggtga c 21<210>8<211>562<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>使用引物SEQID NO6和SEQID NO7產(chǎn)生的擴增子的562bp的序列<400>8tctctagaga ggggcacgac cgggtcacgc tgcactgcag ccaagtggcc cccatttgga 60cgtgaatgta gacacgtcga aataaagatt tccgaattag aataatttgc ttattgcttt 120cgcctataaa tacgacggat cgtaatttgt cgctttatca gaatgtactt tcattttata 180ataacgctgc ggacatctac atttttgaat tgaaaaaaaa ttggtaatta ctctttcttt 240ttctccatat tgaccatcat actcattgct gatccatgta gatttccctt acttgtctcc 300ctctaatctg actttattaa cccaaagcaa ttgcttattt gttccccacg cccacaaagc 360ccagcattgt ccctaaggta ttaatttgtt gttcgattct tgttcttgaa cccatttgga 420gaatgcaaca agggttttca tgtcagcacg gtaatggttc tgtgtaaatt ccagtagtgc 480tgcccaagta aagtctgggt atttcctcga atttgcggca ttaactaagc tagctgctgg 540
tgtcaccggt ctctccagct cg 562<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物3006-20<400>9ttccaacctt taactattat cctgc 25<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物3006-22<400>10gctgcggaca tctacatttt 20<210>11<211>614<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>使用引物SEQ ID NO9和SEQ ID NO10產(chǎn)生的擴增子的614bp的序列<400>11ttccaacctt taactattat cctgccttaa aattcgaata catttattat ctataaacta 60tccgaatatt attatctaaa tcctaattaa atactatttt ttatcgagta ttcgtatccg120ccaaggaaat ccatctccaa attttcaatt atttttcaga tatctaaatc tgtaaaattt180caaattcaag tacgttacaa ttctttataa ataatccaaa ttataaatat tttataacta240ttaattcata aattaaaatt tattattcaa atattcgaat aatctatttt taagacgtaa300agtattacat cgaagggtta ctttcaaagg gtagtgtatt tccatttcaa ttattcagaa360cgttgtcgtt ttgttccggt catagaaaag ggctctggaa gagaagaaaa tgacttgact420tttcaatttc atgctcatcc actcgtttca attactgttt actaaaaaaa taataaaata480aaatattaac aatgcattga gtatgatgtc cgggaaatct acatggatca gcaatgagta540tgatggtcaa tatggagaaa aagaaagagt aattaccaat tttttttcaa ttcaaaaatg600tagatgtccg cagc 614
<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物3006-9<400>12gacatgcaat gctcattatc tcta24<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物3600-12<400>13aagtctctgc cttctaccct gg 22<210>14<211>662<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>使用引物SEQ ID NO12和SEQ ID NO13產(chǎn)生的擴增子的662bp的序列<400>14gacatgcaat gctcattatc tctagagagg ggcacgaccg ggtcacgctg cactgcaggc 60atgcgcgcct taattaagga attcctcgag tttaaacgga tccctgaaag cgacgttgga120tgttaacatc tacaaattgc cttttcttat cgaccatgta cgtaagcgct tacgtttttg180gtggaccctt gaggaaactg gtagctgttg tgggcctgtg gtctcaagat ggatcattaa240tttccacctt cacctacgat ggggggcatc gcaccggtga gtaatattgt acggctaaga300gcgaatttgg cctgtagacc tcaattgcga gctttctaat ttcaaactat tcgggcctaa360cttttggtgt gatgatgctg actggcttac gtgtggaaaa aatttgcaat ctatgtagtc420tttaactaat gtttttttct ttaaaaaaaa agtcattatt tttggtttga ttaatatatt480tggtttaaat taaataaaat attaaaaagt ttagttaaat catctattta aacgatttgt540actgatttgt gatctattaa ttttttaact taatctagac cagggtacta gttggtccga600tcccatcttg aaaacactat ctttagcttg ctggtaggtt ccagggtaga aggcagagac660tt 662
<210>15<211>53<212>DNA<213>陸地棉(Gossypium hirsutum)<220>
<223>在棉花中基因座281-24-236上的基因組DNA片段<400>15ataacttctg tagctctatt ccttagaccc accatgaacg agcagataaa tgc53<210>16<211>16<212>DNA<213>陸地棉<220>
<223>在棉花中基因座3006-210-23上的基因組DNA片段<400>16cttggttatt ctatga 1權(quán)利要求
1.一種在其基因組中包含cry1F棉花事件281-24-236和cry1Ac棉花事件3006-210-23、并具有以保藏號PTA-6233保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的代表性種子的棉花種子。
2.一種在其基因組中包含cry1F棉花事件281-24-236的棉花種子。
3.一種在其基因組中包含cry1Ac棉花事件3006-210-23的棉花種子。
4.通過種植權(quán)利要求1的種子產(chǎn)生的棉花植物。
5.權(quán)利要求4的植物的后代棉花植物。
6.權(quán)利要求4的植物的抗蟲性后代棉花植物。
7.權(quán)利要求4的植物，其中所述棉花植物包含含有選自SEQ ID NO1的殘基2055-12,768和SEQ ID NO2的殘基508-8920的DNA序列的基因組。
8.權(quán)利要求4的植物，其中所述棉花植物包含SEQ ID NO1的殘基2055-12,768和SEQ ID NO2的殘基508-8920。
9.權(quán)利要求4的棉花植物的部分，其中所述部分選自花粉、胚珠、花、棉蒴、棉絨、枝、根和葉。
10.包含插入序列的轉(zhuǎn)基因棉花植物，其中所述插入序列破壞選自下列的基因組序列a.第一個DNA序列，其包含含有SEQ ID NO1的核苷酸1-2074的5’末端、含有SEQ ID NO15的第一個內(nèi)部片段、和含有SEQ ID NO1的核苷酸12,749-15,490的3’末端，和b.第二個DNA序列，其包含含有SEQ ID NO2的核苷酸1-527的5’末端、含有SEQ ID NO16的第二個內(nèi)部片段、和含有SEQ ID NO2的核苷酸8,901-9,382的3’末端。
11.分離的多核苷酸分子，其中所述分子包含至少15個核苷酸，并且保持在嚴格洗滌條件下與選自SEQ ID NO1的殘基1-2074、SEQ ID NO1的殘基12,749-15,490、SEQ ID NO2的殘基1-527、SEQ ID NO2的殘基8,901-9,382及其互補序列的核酸序列雜交。
12.權(quán)利要求11的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自SEQ IDNO3、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO13的核苷酸序列。
13.分離的多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO1的殘基2060-2090、SEQID NO1的殘基12,733-12,765、SEQ ID NO2的殘基512-543和SEQ IDNO2的殘基8,885-8,916的核苷酸序列。
14.權(quán)利要求13的多核苷酸，其中所述多核苷酸為通過聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)生的擴增子，并且所述擴增子包含選自SEQ ID NO5、SEQ ID NO8、SEQ ID NO11和SEQ ID NO14的序列。
15.在包含棉花DNA的樣品中檢測棉花事件存在的方法，其中所述方法包括將所述樣品與至少一種對于選自cry1F棉花事件281-24-236和cry1Ac棉花事件3006-210-23的棉花事件為鑒別性的多核苷酸接觸，其中所述棉花事件如存在于以保藏號PTA-6233保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的種子中。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述方法包括將所述樣品與下列引物接觸a.第一條引物，其與選自SEQ ID NO1的殘基1-2074、SEQ IDNO1的殘基12,749-15,490及其互補序列的側(cè)翼序列結(jié)合；和b.第二條引物，其與選自SEQ ID NO1的殘基2075-12,748及其互補序列的插入序列結(jié)合；并將所述樣品進行聚合酶鏈式反應(yīng)；以及分析所述引物間產(chǎn)生的擴增子。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述方法包括將所述樣品與下列引物接觸a.第一條引物，其與選自SEQ ID NO2的殘基1-527、SEQ ID NO2的殘基8,901-9,382及其互補序列的側(cè)翼序列結(jié)合；和b.第二條引物，其與選自SEQ ID NO2的殘基528-8,900及其互補序列的插入序列結(jié)合；并將所述樣品進行聚合酶鏈式反應(yīng)；以及分析所述引物間產(chǎn)生的擴增子。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述的第二條引物選自SEQ ID NO4和SEQ ID NO6。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述的第二條引物選自SEQ ID NO10和SEQ ID NO12。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述多核苷酸包含至少30個核苷酸，并且在嚴格雜件下與選自SEQ ID NO1的殘基2060-2090、SEQ ID NO1的殘基12,733-12,765、SEQ ID NO2的殘基512-543、SEQ ID NO2的殘基8,885-8,916及其互補序列的序列雜交；并且其中所述方法還包括將所述樣品和所述多核苷酸于嚴格雜交條件雜交下；以及分析所述樣品中所述多核苷酸與所述DNA的雜交。
21.包含第一條引物和第二條引物的DNA檢測試劑盒，其中所述引物如權(quán)利要求16所定義。
22.包含第一條引物和第二條引物的DNA檢測試劑盒，其中所述引物如權(quán)利要求17所定義。
23.包含如權(quán)利要求20所定義多核苷酸的DNA檢測試劑盒。
24.包含選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列的多核苷酸。
25.包含含有根據(jù)權(quán)利要求24所述多核苷酸的基因組序列的植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物育種和植物抗蟲保護。更加具體而言，本發(fā)明包括一種新的棉花植物轉(zhuǎn)化事件，該事件包含如本文所述的一種或多種、已插入到棉花細胞基因組特異性位點的多核苷酸序列。在高度優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸序列編碼“積累的”Cry1F和Cry1Ac鱗翅類昆蟲抑制蛋白質(zhì)。然而，如本文所述，本發(fā)明包括具有單一cry1F事件或cry1Ac事件的植物。此外，本發(fā)明涉及衍生自上述轉(zhuǎn)化事件的棉花植物以及檢測樣品中事件存在的測定法。更加具體而言，本發(fā)明提供了在棉花中檢測某些抗蟲事件存在的DNA和相關(guān)測定法。測定法基于插入棉花基因組中的重組構(gòu)建體的DNA序列和插入位點側(cè)翼的基因組DNA序列。這些序列是獨特的。這些序列是獨特的。基于這些插入序列和邊界序列，產(chǎn)生事件特異性引物。PCR分析表明，可以通過對使用這些事件特異性引物對所產(chǎn)生的PCR擴增子進行分析來鑒定這些棉花株系的不同棉花基因型。因此，這些方法以及其它相關(guān)方法可以用來獨特地鑒定這些棉花株系。本發(fā)明還提供了可用于測定的試劑盒和條件。這些材料和方法也可以輔助育種以進一步發(fā)展棉花中的形狀。
文檔編號A01H1/00GK101027396SQ200480042571
公開日2007年8月29日 申請日期2004年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者P·宋, L·塔利亞尼, J·W·佩洛 申請人:美國陶氏益農(nóng)公司