本發(fā)明涉及一種用于藍(lán)舌病毒檢測(cè)的試劑盒，特別涉及一種用于藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒，還涉及其在藍(lán)舌病毒檢測(cè)中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

藍(lán)舌病(bluetongue，bt)是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬藍(lán)舌病病毒(btv)引起的經(jīng)媒介昆蟲(庫庫蠓、伊蚊等)傳播的動(dòng)物傳染病。易感動(dòng)物主要為牛、綿羊、山羊、鹿、駱駝等。世界衛(wèi)生組織(oie)規(guī)定其為必須呈報(bào)疫病，中國規(guī)定其為一類傳染病。btv最早發(fā)現(xiàn)于1876年，呈世界性分布。目前已從非洲、歐洲、亞洲、北美、南美和大洋洲的多個(gè)熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)國家分離到btv，并且其分布范圍不斷擴(kuò)大。

藍(lán)舌病病毒(bluetonguevirus，btv)是雙鏈rna病毒，其基因組由10個(gè)線性雙鏈rna片段組成，共編碼10種蛋白，包括7種結(jié)構(gòu)蛋白(vp1-vp7)和4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(ns1、ns2、ns3/ns3a、ns4)。vp2蛋白是btv是btv血清型的主要決定因素。不同血型間vp2的氨基酸序列差異從22.4％到73％不等。

隨著藍(lán)舌病病毒的不斷變異目前已發(fā)現(xiàn)27種藍(lán)舌病病毒血清型，不同血清型之間交叉保護(hù)力較差。目前國內(nèi)外沒有能對(duì)bt進(jìn)行有效防治的疫苗，因此防控bt的重要措施是建立針對(duì)不同血清型的鑒別診斷方法。藍(lán)舌病有多種檢測(cè)方法，但每種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，例如：免疫熒光試驗(yàn)和病毒中和試驗(yàn)需對(duì)病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)，操作過程繁瑣費(fèi)時(shí)，并且存在容易散毒等生物安全問題，熒光定量pcr方法成本較高，對(duì)檢測(cè)設(shè)備和人員能力均有較高要求，瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)特異性較低。而目前以單克隆抗體為基礎(chǔ)的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)方法(c-elisa)為oie推薦的最佳檢測(cè)方法。

本發(fā)明采用兩株針對(duì)8型btvvp2蛋白的單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)性抗體與待檢測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)，從而建立了用于藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)的c-elisa檢測(cè)方法，并通過抑制率大小來判斷待檢測(cè)抗體的數(shù)量，同時(shí)驗(yàn)證該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性。本發(fā)明建立了一套靈敏、特異、高通量的檢測(cè)方法，為我國藍(lán)舌病的快速檢測(cè)提供技術(shù)支持，以確保我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種藍(lán)舌病病毒型特異性競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒及其在btv型特異性檢測(cè)中的應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明的一種藍(lán)舌病病毒型特異性競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒，包括以下兩組組分：

組分i中包括包被藍(lán)舌病病毒抗原i的酶標(biāo)板和用于藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)的單克隆抗體i，所述的單克隆抗體i由雜交瘤細(xì)胞株8b3g11分泌產(chǎn)生，所述的雜交瘤細(xì)胞株8b3g11保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，其微生物保藏號(hào)為：cctccno.c201770；所述的藍(lán)舌病病毒抗原i為藍(lán)舌病病毒8型vp2蛋白或是含有seqidno.1所示抗原表位的vp2蛋白的片段；

組分ii中包括包被藍(lán)舌病病毒抗原ii的酶標(biāo)板和用于藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)的單克隆抗體ii，所述的單克隆抗體ii由雜交瘤細(xì)胞株8b5d4分泌產(chǎn)生，所述的雜交瘤細(xì)胞株8b5d4保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，其微生物保藏號(hào)為：cctccno.c201769；所述的藍(lán)舌病病毒抗原ii為藍(lán)舌病病毒8型vp2蛋白或是含有seqidno.2所示抗原表位的vp2蛋白的片段。

在本發(fā)明所述的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括抗鼠的酶標(biāo)二抗、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、稀釋液、tmb顯色液、洗滌液和終止液。

在本發(fā)明所述的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒中，優(yōu)選的，所述的抗鼠的酶標(biāo)二抗為hrp標(biāo)記的山羊抗鼠igg。

在本發(fā)明所述的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒中，優(yōu)選的，所述陰性對(duì)照為藍(lán)舌病病毒陰性血清；所述陽性對(duì)照為藍(lán)舌病病毒8型陽性血清；所述稀釋液為含有5w/v％脫脂乳的pbs緩沖液；所述洗滌液為pbs緩沖液。

在本發(fā)明所述的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒中，優(yōu)選的，所述的pbs緩沖液中包括nacl8g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，溶解后ph值調(diào)為7.4，用去離子水定容至1000ml。

在本發(fā)明所述的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒中，優(yōu)選的，所述的含有seqidno.1所示抗原表位的vp2蛋白的片段由genbank登錄號(hào)為195972621的8型btv的l2基因的1021-2091bp的核苷酸序列編碼；所述的有seqidno.2所示抗原表位的vp2蛋白的片段由genbank登錄號(hào)為195972621的8型btv的l2基因的1021-2091bp的核苷酸序列編碼。

使用本發(fā)明所述的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒用于藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)時(shí)，分別采用組分i和組分ii進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷：如果兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，則待檢樣品為btv-2、btv-3、btv-5、btv-9、btv-11、btv-12、btv-13、btv-15、btv-16、btv-17、btv-20、btv-24感染的血清或陰性血清；如果兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為陽性，則待檢樣品為btv-7或btv-8感染的血清；如果采用組分i進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)的結(jié)果為陽性而采用組分ii進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)的結(jié)果為陰性，則待檢樣品為btv-10感染的血清；如果采用組分i進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)的結(jié)果為陰性而采用組分ii進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)的結(jié)果為陽性，待檢樣品可能為btv-1、btv-4、btv-6、btv-14、btv-18、btv-19、btv-21、btv-23感染的血清。

其中，優(yōu)選的，采用組分i或組分ii進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)時(shí)，按照以下方法進(jìn)行：

(1)取出包被藍(lán)舌病病毒抗原i或包被藍(lán)舌病病毒抗原ii的酶標(biāo)板，以洗滌液洗板；

(2)加入稀釋液稀釋的待測(cè)血清和用于藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)的單克隆抗體i或用于藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)的單克隆抗體ii，37℃孵育；同時(shí)以分別加入稀釋液稀釋的陰性或陽性血清的孔作為對(duì)照；

(3)以洗滌液洗板，加入抗鼠的酶標(biāo)二抗；

(4)以洗滌液洗板，加入tmb顯色液，37℃顯色，最后加終止液終止反應(yīng)，測(cè)定od值。

其中，優(yōu)選的，所述酶標(biāo)板上包被的藍(lán)舌病病毒抗原i或藍(lán)舌病病毒抗原ii的濃度為5μg/孔，37℃孵育1h；所述的待測(cè)血清的稀釋倍數(shù)為20倍，組分i中用于藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)的單克隆抗體i以及抗鼠的酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為1000倍，組分ii中用于藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)的單克隆抗體ii以及抗鼠的酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為2000倍，孵育溫度為37℃，時(shí)間為2h；tmb顯色反應(yīng)時(shí)間為10min。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒在制備藍(lán)舌病病毒型特異性檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明首次提出了一種可用于btv的型特異性檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)elisa方法及試劑盒。目前，國內(nèi)主要研究了btv群特異性檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)elisa方法，未見有對(duì)btv的型特異性檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)elisa方法建立。在本發(fā)明實(shí)施例中，分別采用8型btvvp2-b蛋白為包被抗原，分別用抗btv-8vp2單克隆抗體8b5d4、8b3g11為競(jìng)爭(zhēng)抗體，建立了聯(lián)合競(jìng)爭(zhēng)elisa方法；

2、特異性強(qiáng)和敏感性高是elisa檢測(cè)方法的最大優(yōu)點(diǎn)，微量的樣品就能引起高效的抗原抗體反應(yīng)，因此，準(zhǔn)確選擇抗原的包被濃度和血清樣品的稀釋度是elisa實(shí)驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)之一。本發(fā)明通過方陣滴定進(jìn)一步調(diào)整一抗與二抗的稀釋度，充分優(yōu)化反應(yīng)條件，提高了檢測(cè)靈敏度。分析表明采用單克隆抗體8b5d4、8b3g11進(jìn)行的c-elisa檢測(cè)具有良好的特異性和敏感性。分別對(duì)兩種c-elisa方法的靈敏度進(jìn)行了檢測(cè)，確定該兩種c-elisa方法檢測(cè)的靈敏度分別為1:160，1:80。本實(shí)驗(yàn)中建立的競(jìng)爭(zhēng)elisa方法的敏感性、特異性和重復(fù)性均符合《哺乳動(dòng)物、禽類和蜜蜂a和b類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》中的相關(guān)規(guī)定。

3、特異性實(shí)驗(yàn)中8b3g11c-elisa能檢測(cè)出btv-7、btv-8、btv-10三種陽性血清。8b5d4c-elisa能檢測(cè)出btv-1、btv-4、btv-6、btv-7、btv-8、btv-14、btv-18、btv-19、btv-21、btv-23十種陽性血清。8b5d4c-elisa和8b3g11c-elisa方法聯(lián)合應(yīng)用可以區(qū)分btv不同血清型。

4、本發(fā)明采用針對(duì)8型btvvp2型特異性單克隆抗體8b5d4和8b3g11建立聯(lián)合c-elisa檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法短時(shí)間內(nèi)可以用于初步區(qū)分不同型藍(lán)舌病感染的動(dòng)物血清，并且實(shí)驗(yàn)條件要求低，具有型特異性，易用于大規(guī)模的血清抗體普查，并且本研究為下一步建立btv型特異性檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為his-8a、his-8b的sds-page分析結(jié)果；

1.pet-28a-8a/bl21誘導(dǎo)前；2.pet-28a-8a/bl21誘導(dǎo)后；3.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；4.pet-28a-8b/bl21誘導(dǎo)前；5.pet-28a-8b/bl21誘導(dǎo)后；

圖2為his-4c的sds-page分析結(jié)果；

1.pet-28a-8c/bl21誘導(dǎo)后；2.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；3.pet-28a-8c/bl21誘導(dǎo)前；

圖3為重組mbp-8a、mbp-8b蛋白的sds-page分析結(jié)果；

1.pmal-c5x-8a/bl21誘導(dǎo)前；2.pmal-c5x-8a/bl21誘導(dǎo)后；3.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；4.pmal-c5x-8b/bl21誘導(dǎo)前；5.pmal-c5x-8b/bl21誘導(dǎo)后；

圖4為重組mbp-8c蛋白的sds-page分析結(jié)果；

1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.pmal-c5x-8c/bl21誘導(dǎo)前；3.pmal-c5x-8c/bl21誘導(dǎo)后；

圖5為8b3g11單抗上清westernblot鑒定結(jié)果；

1.蛋白marker；2.his-8a蛋白；3.his-8b蛋白；4.his-8c化蛋白；

圖6為8b5d4單抗上清westernblot鑒定結(jié)果；

1.蛋白marker；2.his-8a蛋白；3.his-8b蛋白；4.his-8c化蛋白；

圖7為8b3g11間接免疫熒光鑒定結(jié)果；

a.8b3g11間接免疫熒光鑒定結(jié)果；b.陽性對(duì)照；c.sp2/0上清與接種btv8的bhk-21細(xì)胞間接免疫熒光鑒定結(jié)果；

圖8為8b5d4間接免疫熒光鑒定結(jié)果；

a.8b5d4間接免疫熒光鑒定結(jié)果；b.陽性對(duì)照；c.sp2/0上清與接種btv8的bhk-21細(xì)胞間接免疫熒光鑒定結(jié)果；

圖9為8b3g11c-elisa檢測(cè)方法對(duì)陰性血清抑制率及對(duì)應(yīng)血清份數(shù)分布圖；

圖10為8b5d4c-elisa檢測(cè)方法對(duì)陰性血清抑制率及對(duì)應(yīng)血清份數(shù)分布圖。

生物材料的保藏信息：

一株穩(wěn)定分泌抗btv8-vp2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為雜交瘤細(xì)胞株8b3g11，分類命名是雜交瘤細(xì)胞株8b3g11；保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在中國.武漢.武漢大學(xué)，其微生物保藏號(hào)為：cctccno.c201770，保藏時(shí)間為2017年5月8日。

一株穩(wěn)定分泌抗btv8-vp2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為雜交瘤細(xì)胞株8b5d4，分類命名是雜交瘤細(xì)胞株8b5d4；保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在中國.武漢.武漢大學(xué)，其微生物保藏號(hào)為：cctccno.c201769，保藏時(shí)間為2017年5月8日。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例18型btvvp2單克隆抗體8b5d4以及8b3g11的制備

1、主要試劑和藥品

各種限制性內(nèi)切酶、t4連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、taq酶、dnamarker均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購axyge公司；膠回收小量試劑盒購自中科瑞泰有限公司；辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記羊抗鼠igg購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鄰苯二胺(opd)購自sigma公司；胎牛血清均購自gibco公司；特級(jí)胎牛血清購自天津?yàn)柟荆?640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、二甲基亞砜(dmso)、胰蛋白酶、peg3350、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、hat(50×)培養(yǎng)基、ht(l00×)培養(yǎng)基、二氨基聯(lián)苯胺(dab)、鄰苯二胺(opd)、抗體亞類鑒定試劑盒購自sigma公司。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4-6周齡balb/c小鼠由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供。

3、btv8-vp2基因的原核表達(dá)與純化

3.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)genbank中已登錄的8型btv的l2基因序列(登錄號(hào)為195972621)。利用蛋白分析軟件等對(duì)l2基因進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)，將8型的l2基因分為a(1-1230bp)、b(1021-2091bp)、c(1831-2886bp)3個(gè)節(jié)段；設(shè)計(jì)pcr擴(kuò)增引物，針對(duì)pet-28a-c載體設(shè)計(jì)的引物分別為：8a(p1-p2)、8b(p3-p4)、8c(p5-p6)的pcr擴(kuò)增引物序列如下表1所示，表2為針對(duì)pmal-c5x載體的引物序列，8a(p7-p8)、8b(p9-p10)、8c(p11-p12)。

表1pet-28a-c(+)載體引物序列

表2pmal-c5x載體引物序列

3.2基因擴(kuò)增

以合成的btv8l2基因?yàn)槟０澹锰禺愋陨?、下游引物?duì)其進(jìn)行pcr擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min后進(jìn)入pcr循環(huán)，94℃變性40s，54℃退火40s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取1μl產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，分析結(jié)果。

3.3btv8-vp2蛋白原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建

將pcr產(chǎn)物與l0×loadingbuffer混勻，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈照射下切取含有目的片段的凝膠，將其置于已稱重的ep管中，計(jì)算出凝膠的重量，按照小量dna膠回收試劑盒方法操作：每l00mg核酸膠中加入300μlbuffers1，置于56℃水浴鍋中溶解，過程中每隔2-3min震蕩顛倒混勻一次，當(dāng)其完全融化時(shí)，按照150μl異丙醇/l00mg凝膠體積加入異丙醇并混勻，將所得液體加入吸附柱中，12000rpm離心1min，棄去濾液。加入700μl漂洗液于吸附柱中，12000rpm離心1min，棄去濾液。再加入600μl漂洗液重復(fù)洗滌一次，12000rpm離心1min棄去濾液。重復(fù)上述規(guī)程，空離心2min。在吸附膜中央加入40μl預(yù)熱的去離子水，靜止吸附2min，12000rpm離心2min，收集洗脫液于新的離心管中。將純化后的pcr產(chǎn)物與pmd18-tsimple載體連接，并將其轉(zhuǎn)入tg1中。

將純化后的目的基因8a、8b、8c分別與載體pet-28a-c(+)、pmal-c5x進(jìn)行連接。

連接反應(yīng)總體系為10μl：solutionⅰ5μl，pmd18-tsimple載體0.3μl，純化回收的pcr產(chǎn)物4.7μl?；靹蚝蠓湃脒B接儀中，16℃連接4h。

3.4轉(zhuǎn)化與挑菌

將連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞tg1中：從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化3min，將連接后產(chǎn)物10μl加入到tg1100μl中，混勻，冰上靜置20min。42℃熱擊100s，冰浴5min。向其中加入lb液體恢復(fù)培養(yǎng)基700μl，37℃搖床振蕩培養(yǎng)40min。取出200μl培養(yǎng)后菌液均勻涂布于含有amp+的lb平板上，待菌液全部被培養(yǎng)基吸收后放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)12h。

3.5重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定與測(cè)序

用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒。取1ml培養(yǎng)后的菌液于ep管中，12000rpm離心1min，將上清棄去，加入250μlbufferp1并充分震蕩混勻使菌體沉淀懸浮充分；再加入250μlbufferp2，溫和的上下顛倒混勻6-8次；加入350μlbufferp3，溫和的上下顛倒混勻5-6次，12000rpm離心10min；將所得上清液加入到吸附柱中，12000rpm離心1min，棄去濾液。加入700μl漂洗液于吸附柱中，12000rpm離心1min，棄去濾液。再加入500μl漂洗液重復(fù)洗滌一次，12000rpm離心1min，棄去濾液，空離心2min。將吸附柱放入一個(gè)新的ep管中，在吸附膜中央加入60μl預(yù)熱的去離子水，靜止吸附2min，12000rpm離心1min，收集質(zhì)粒dna洗脫液于新的離心管中。

單酶切體系(10μl)：

雙酶切體系(10μl)：

提取的質(zhì)粒進(jìn)行單雙酶切鑒定，37℃水浴作用30min。單雙酶切后產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將酶切鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒送往蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)目的基因序列完全正確。

3.6btv8-vp2基因的原核表達(dá)與純化

按照3.4所述轉(zhuǎn)化方法將陽性重組質(zhì)粒pet-28a-c(+)、pmal-c5x轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)用bl21感受態(tài)細(xì)胞，然后取出100μl菌液涂布于含有氨節(jié)青霉素(100μg/ml)的lb平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取lb平板培養(yǎng)基上的白色孤立菌落，接種于含有氨節(jié)青霉素(100μg/ml)的lb液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。表達(dá)誘導(dǎo)具體操作如下以1100擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)至測(cè)定od600＝0.4～0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑iptg使其終濃度為1.0mmol/l進(jìn)行誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)后4h后，處理蛋白樣。取1ml誘導(dǎo)后菌液置于ep管中，12000r/min離心2min，棄上清，按每毫升od600＝1加入pbs50μl和sds-page2×上樣緩沖液(含dtt)50μl，100℃煮沸10min，用12％的分離膠進(jìn)行sds-page鑒定。

表達(dá)載體pet-28a與目的基因8a、8b以及8c構(gòu)建的重組菌經(jīng)sds-page鑒定，結(jié)果如圖1和2所示，誘導(dǎo)后的重組菌pet-28a(+)-vp2-8b/bl21在47kd處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小相符，且其表達(dá)形式為包涵體表達(dá)；表達(dá)載體pmal-c5x與目的基因8a、8b以及8c構(gòu)建的重組菌經(jīng)sds-page鑒定，結(jié)果如圖3和4所示，誘導(dǎo)后的重組菌pmal-c5x-vp2-8b/bl21在82kd處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小相符，且主要為可溶性表達(dá)。

將重組菌pet-28a(+)-vp2-8b/bl21進(jìn)行大量誘導(dǎo)，提取包涵體。通過切膠、電洗脫的方式對(duì)蛋白進(jìn)行純化。純化后的蛋白，測(cè)定蛋白的濃度后分裝放置于-80℃低溫凍存。

重組菌pgex-6p-1-8b/bl21大量誘導(dǎo)后，利用gst標(biāo)簽蛋白的親和層析柱進(jìn)行純化。純化后的蛋白使用微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，分裝后-80℃低溫凍存。

4、單克隆抗體的制備

4.1小鼠免疫

小鼠免疫以切膠純化的原核表達(dá)的重組btv8-vp2-b蛋白作為免疫抗原，劑量為100μg/只。按1：1比例與弗氏完全佐劑混合，充分乳化后腹腔注射4-6周齡balb/c小鼠；在一免后第14天將免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，免疫部位和劑量同前，進(jìn)行第二次免疫；二免后第7天，小鼠尾部采血檢測(cè)血清抗體效價(jià)；在二免后第14天重復(fù)二免過程，免疫部位和劑量同前，為第三次免疫；7天后尾部采血測(cè)定效價(jià)，最后加強(qiáng)免疫，由腹腔直接注射2倍劑量免疫原，不使用佐劑，劑量同前，3天后進(jìn)行細(xì)胞融合。

4.2細(xì)胞融合

融合前1天制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，將balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中待用。眼球采血，脫頸處死小鼠，取脾臟并分離脾細(xì)胞，按脾細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞8：1的比例用peg進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞鋪于準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞之上。

4.3陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆

利用純化后的原核表達(dá)的帶有mbp標(biāo)簽的btv8-vp2蛋白建立間接elisa檢測(cè)方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，采用有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，亞克隆3次后，檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性。將亞克隆好的陽性雜交瘤細(xì)胞及時(shí)凍存。最終獲得兩株可以穩(wěn)定分泌抗btv8-vp2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為雜交瘤細(xì)胞株8b3g11以及雜交瘤細(xì)胞株8b5d4，所述的雜交瘤細(xì)胞株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，其微生物保藏號(hào)分別為：cctccno.c201770以及cctccno.c201769。

5、單克隆抗體的鑒定

5.1單克隆抗體的亞類及抗原表位鑒定

經(jīng)抗體亞類鑒定試劑盒鑒定，抗btv8vp2蛋白的單克隆抗體中，8b3g11以及8b5d4的亞類分別為igg2b以及igg2a?？?型btvvp2的單克隆抗體8b3g11的抗原表位為²⁸³ll²⁸⁴(seqidno.1所示)，8b5d4的抗原表位為¹⁹²lkp¹⁹⁴(seqidno.2所示)、

5.2westernblot試驗(yàn)

通過westernblot試驗(yàn)對(duì)單克隆抗體的反應(yīng)特異性進(jìn)行鑒定。將原核表達(dá)的重組btv8-vp2-a、btv8-vp2-b以及btv8-vp2-c蛋白轉(zhuǎn)印至nc膜上，8b3g11培養(yǎng)上清液或8b5d4培養(yǎng)上清作為一抗，進(jìn)行一抗孵育，細(xì)胞上清液不稀釋，4℃封閉過夜。取出nc膜用pbst洗滌三次，10min/次，然后放入用經(jīng)5％脫脂乳按1:2000稀釋的hrp標(biāo)記山羊抗鼠igg中，進(jìn)行二抗孵育，室溫作用2.5h，取出nc膜用pbst洗滌三次，10min/次，ecl顯色顯色，觀察結(jié)果。

試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明所制備的單克隆抗體8b3g11以及8b5d4能夠與btv8-vp2-b蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與btv8-vp2-a、btv8-vp2-c不發(fā)生反應(yīng)(如圖5、圖6)。

5.3間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單克隆抗體8b3g11以及8b5d4與btv-8病毒的反應(yīng)

將bhk21細(xì)胞傳至放置爬片的12孔板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后接種8型btv，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔。置于飽和濕度、37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)靜置培養(yǎng)24h；取出爬片用pbs輕輕洗滌3次，5min/次。3％多聚甲醛固定液室溫30min進(jìn)行固定；pbs洗滌三次，5min/次；每孔加入3％的bsa37℃封閉1h進(jìn)行封閉；棄去封閉液用pbs洗滌三次，5min/次；以保存的8b3g11或8b5d4細(xì)胞上清液為一抗，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組，37℃孵育1h；用pbs洗滌三次，5min/次；加入1:2000稀釋的fitc標(biāo)記山羊抗鼠igg，200μl/孔，避光條件下37℃作用1h；避光條件下用pbs洗滌三次，5min/次；在倒置熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7以及圖8所示。

試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，單克隆抗體8b3g11以及8b5d4與btv-8型病毒有陽性反應(yīng)。

實(shí)施例2藍(lán)舌病病毒型特異性競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)方法的建立

1材料與方法

1.1細(xì)胞

抗8型btvvp2蛋白mab8b3g11、8b5d4由實(shí)施例1制備。

1.2主要試劑

8型btvvp2-b蛋白按照實(shí)施例1方法制備；1-24型btv標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清購自藍(lán)舌病參考實(shí)驗(yàn)室pirbrightinstitute；70份綿羊、山羊和牛血清樣品分別來自于內(nèi)蒙古和黑龍江的某養(yǎng)殖場(chǎng)；hrp標(biāo)記的山羊抗鼠igg購自中杉金橋有限公司；tmb顯色液購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；藍(lán)舌病抗體elisa試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。pbs緩沖液：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，溶解后ph值調(diào)為7.4，用去離子水定容至1000ml；稀釋液：脫脂乳5g，pbs緩沖液100ml。

1.3優(yōu)化c-elisa反應(yīng)條件

以8型btvvp2-b蛋白為抗原，分別以1μg/孔、2μg/孔、5μg/孔、10μg/孔包被酶標(biāo)板，包被時(shí)間分別為1h、2h、3h；再將純化后的腹水以及hrp標(biāo)記的山羊抗鼠igg用稀釋液稀釋1:500、1:1000、1:2000、1:4000倍；8型btv標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用pbs稀釋液進(jìn)行1:10、1:20、1:50、1:100、1:200倍，確定最佳稀釋倍數(shù)，將腹水稀釋液和血清樣品混合加入酶標(biāo)板中；反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為1h、2h、3h，確定各步驟最佳反應(yīng)時(shí)間。tmb顯色反應(yīng)時(shí)間分別為7min、10min、15min，確定最佳顯色時(shí)間。根據(jù)優(yōu)化反應(yīng)劑量和時(shí)間的結(jié)果，確定該檢測(cè)方法的最佳工作濃度及反應(yīng)時(shí)間。

1.4血清樣品的鑒定

按照藍(lán)舌病抗體elisa試劑盒說明書，對(duì)70份綿羊、山羊和牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，確定樣品血清的來源動(dòng)物是否感染btv。

1.4判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

利用1.3建立的檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)50份陰性綿羊、山羊和牛陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得血清od450，計(jì)算阻斷率，計(jì)算公式為pi(阻斷率)＝{1-(odx-odmin)/(odmax-odmin)}*100％(odmax:為不加樣品時(shí)的吸光值，odx為樣品的吸光值，odmin為空白對(duì)照孔的吸光值。)。計(jì)算50份血清樣本pi值的平均值()和標(biāo)準(zhǔn)方差(sd),根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則,將+2sd設(shè)定為樣本的陰、陽性血清的臨界值。樣本的pi值>+2sd時(shí),可以在99.9％的水平上判為陽性。

1.5敏感性評(píng)價(jià)

將8型btv標(biāo)準(zhǔn)陽性稀釋1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160和1:320倍作為檢測(cè)抗體,以1.3中建立的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6特異性評(píng)價(jià)

利用兩種c-elisa分別檢測(cè)1-24型btv標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性樣品各10份，按照1:20稀釋倍數(shù)，每孔100μl。分別對(duì)8b3g11、8b5d4c-elisa兩種檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行鑒定。

1.7重復(fù)性試驗(yàn)

利用同一批次的重組vp2蛋白及1.3中所用到的試劑，以建立的競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)方法，分別對(duì)10份血清進(jìn)行三次重復(fù)檢測(cè)，比較它們的結(jié)果差異計(jì)算其變異系數(shù)，評(píng)價(jià)重復(fù)性。

1.8臨床樣品檢測(cè)

以1.3種所建立的檢測(cè)方法,對(duì)btv標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)出的20份陽性血清進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1優(yōu)化反應(yīng)條件

根據(jù)方陣滴定法確定反應(yīng)最佳的稀釋濃度及反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果如表3、表4所示。以mab8b3g11、8b5d4為基礎(chǔ)建立的檢測(cè)方法最佳的包被條件為5μg/孔，37℃孵育1h；樣品的稀釋比例為1：20，腹水(一抗)的稀釋比例為1：1000和1：2000，37℃孵育2h，山羊抗鼠igg(二抗)的稀釋比例為1：1000和1：2000，37℃孵育2h；每孔加入100μltmb顯色液，37℃避光顯色10min。

表38b3g11c-elisa檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

表48b5d4c-elisa檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2血清樣品的鑒定

使用藍(lán)舌病群特異性elisa試劑盒對(duì)70份血清樣本檢測(cè)，其中50份樣品血清表現(xiàn)為陰性，20份血清表現(xiàn)為陽性。

2.3判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

采用優(yōu)化后的mab8b3g11c-elisa檢測(cè)方法對(duì)50份羊和牛btv陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，不同抑制率的血清份數(shù)分布見圖9。測(cè)定od450nm值，檢測(cè)的阻斷率平均值為20％，標(biāo)準(zhǔn)差為12％，根據(jù)公式：平均值+2s計(jì)算，陽性和陰性結(jié)果判定的臨界值為44％。即阻斷率44％及以上則判為btv陽性血清。

使用優(yōu)化后的mab8b5d4c-elisa檢測(cè)方法對(duì)50份羊和牛btv陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，不同抑制率的血清份數(shù)分布見圖10。測(cè)定od450nm值，檢測(cè)的阻斷率平均值為27％，標(biāo)準(zhǔn)差為11％，根據(jù)公式：平均值+2s計(jì)算，陽性和陰性結(jié)果判定的臨界值為49％。即阻斷率49％及以上則判為btv陽性血清。

2.4敏感性分析

采用優(yōu)化后的mab8b3g11c-elisa、mab8b5d4c-elisa兩種檢測(cè)方法檢測(cè)不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)btv-8陽性血清，mab8b3g11c-elisa檢測(cè)結(jié)果表明稀釋度1：80時(shí)，pi>48％；mab8b5d4c-elisa檢測(cè)結(jié)果表明稀釋度1：160時(shí)，pi>54％。

2.5特異性分析

采用mab8b3g11c-elisa、mab8b5d4c-elisa兩種檢測(cè)方法檢測(cè)1-24型btv標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，結(jié)果如表5。兩種檢測(cè)方法均可以檢測(cè)到8型btv標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，但是兩種方法均能檢測(cè)出其他血清為陽性，可能與非特異性結(jié)合有關(guān)。將兩種方法共同使用時(shí)可大量排除非特異性反應(yīng)。兩種方法聯(lián)合使用時(shí)能檢測(cè)出btv-7、btv-8。

表5btv競(jìng)爭(zhēng)elisa特異性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

利用3批次制備的兩種方法的檢測(cè)試劑對(duì)10份血清分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，利用不同批次試劑檢測(cè)同一樣品的變異系數(shù)在4％-10％之間，無明顯差異。

2.7臨床樣品檢測(cè)

將經(jīng)藍(lán)舌病群特異性elisa試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陽性的20份btv血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。用基于8b3g11的c-elisa檢測(cè)方法檢測(cè)出的陽性樣品有1個(gè)，因此該檢測(cè)樣品可能為btv-7、btv-8和btv-10感染的動(dòng)物血清；用基于8b5d4的c-elisa檢測(cè)方法檢測(cè)出的陽性樣品有4個(gè)，因此該檢測(cè)樣品可能為btv-1、btv-4、btv-6、btv-7、btv-8、btv-14、btv-18、btv-19、btv-21和btv-23感染的動(dòng)物血清。兩種方法檢測(cè)均為陽性的有1個(gè)樣品，該陽性樣品可能為感染btv-7或btv-8型的藍(lán)舌病血清，與進(jìn)口群特異性藍(lán)舌病抗體elisa試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。

序列表

<110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>藍(lán)舌病病毒型特異性競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

<130>klpi170260

<160>2

<170>patentin3.5

<210>1

<211>2

<212>prt

<213>bluetonguediseasevirus

<400>1

leuleu

<210>2

<211>3

<212>prt

<213>bluetonguediseasevirus

<400>2

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