本發(fā)明涉及生物、醫(yī)學領域中的自身免疫性疾病及臨床自身免疫igg抗體檢測分析領域，具體涉及一種基于細胞的間接免疫熒光檢測(cell-basedassays，cba)試劑盒制備與臨床血樣、腦脊液樣品中mog自身免疫性抗體的cba快速檢測技術，是一種快速完成mog自身免疫抗體檢測的有效方法，即本發(fā)明具體涉及一種用于臨床樣品mog自身免疫igg抗體檢測的cba檢測試劑盒用的細胞爬片組件的制備、cba檢測試劑盒及應用。

背景技術：

髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(myelinoligodendrocyteglycoprotein，mog)由218個氨基酸組成，是免疫球蛋白超家族中的一員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性的表達，僅存在于少突膠質細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘表面。mog在神經(jīng)發(fā)育過程中表達相對較晚，提示其是一個重要的少突膠質細胞成熟的表面標志物，參與髓鞘的完整性、黏附、細胞表面交互作用等。以往研究表明，mog作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的靶抗原同時參與了體液免疫和細胞介導的免疫反應。

現(xiàn)有檢測抗原抗體的方法都是利用抗原抗體免疫結合原理為基礎開展的，最為人熟知的兩種免疫學經(jīng)典實驗方法：酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)和蛋白印跡法(westernblots)。elisa指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。westernblot法是一種將電泳與免疫結合起來的技術，可分為電泳、轉印、酶免疫測定3個階段。westernblot法結合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣本組分的免疫學測定方法。

現(xiàn)有技術的缺點：現(xiàn)有的研究已發(fā)現(xiàn)mog具有不同的表位，包括線性肽段表位、構象表位及糖基化表位。只有識別mog的天然的(完整形態(tài)的)非連續(xù)構象表位抗體才具有誘發(fā)脫髓鞘的潛力，而識別變性的線性肽段表位的mog-igg抗體并不具備致病的能力。在進行elisa或westernblots檢測時，抗原需要先抽提純化(elisa)或變性(westernblots)后才能進行下游實驗。其很可能導致檢測到的mog-igg其實只是識別mog蛋白線性肽段表位的mog抗體。并不適合用于檢測識別天然mog蛋白的非連續(xù)構象表位的mog-igg抗體。因此elisa與westernblot檢測方法無法做臨床樣品檢測所需的高靈敏度與特異性。這也導致實驗結果重復性差，甚至互相矛盾。雖然眾所公認mog抗體與人類脫髓鞘性疾病關系密切，但其機制研究一直沒有重大進展。所以，正確選擇抗mog抗體的檢測方法非常重要。

近年來，用cba方法檢測mog-igg抗體的方法已經(jīng)越來越得到各方重視，國外也已有公司把目光投向了這個領域。但不管國內(nèi)國外，幾乎所有的嘗試都僅限于以基礎科研為目的的探索，并未進行進一步臨床驗證實驗。且在國內(nèi)并沒有相關檢測產(chǎn)品的生產(chǎn)與銷售。該試劑的研發(fā)成功將有利于臨床樣品的mog-igg檢測及對應疾病的診斷、治療。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種用于臨床樣品mog自身免疫igg抗體檢測的cba檢測試劑盒及其制備與應用方法，以解決了現(xiàn)有技術中的不足。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)：

一種檢測mog-igg的cba試劑盒用的細胞爬片組件的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

s1：mog質粒構建：從人的體細胞中抽提總mrna，并反轉錄成cdna，設計mog特異性pcr引物，擴充出全長mogcdna，并將該mogcdna連接到質粒載體上進行轉化，擴增抽提，得到mog質粒；

s2：過表達mog基因的慢病毒包裝：將mog質粒和作為對照的空載體質粒分別與病毒包裝體系質粒共轉染進細胞中；轉染后，獲得病毒感染細胞，即得到過表達mog的病毒顆粒和由空載體質粒轉染所得到的不表達mog的對照病毒顆粒；

s3：過表達mog基因的細胞株(mog-293t細胞株)構建：接種細胞，用上述所得的過表達mog的病毒顆粒和不表達mog的對照病毒顆粒分別感染所接種的細胞；感染后，篩選過表達mog-293t細胞株與vector-293t細胞株，將其進行凍存保種；

s4：mog-iggcba檢測用細胞爬片組件的制備

①接種步驟s3中所得到的過表達mog-293t細胞株與vector-293t細胞，并保證二者接種的細胞量相近；②待細胞融合度達到80-100％，除去培養(yǎng)vector-293t細胞和過表達mog-293t細胞株的培養(yǎng)基，加入多聚甲醛，0～10℃固定過夜；③pbs洗滌細胞，風干，則mog-iggcba檢測用細胞爬片組件制備完成。

進一步地，步驟s1中，所述的mog特異性pcr引物的正向引物序列為：atggcaagcttatcaagaccc，反向引物序列為：gaagggatttcgtagctcttc。

進一步地，步驟s1中，所述mog質粒構建的具體過程為：(1)以人神經(jīng)少突膠質細胞為材料，抽提總mrna，并利用反轉錄試劑盒將mrna反轉錄成cdna；(2)設計mog特異性pcr引物，擴充出全長mogcdna，并將所得mogcdna進行克隆，然后連接到質粒載體上，所述質粒載體為plvx-ires-mcherry慢病毒質粒載體；(3)將質粒進行轉化、搖菌，擴增抽提，得到mog質粒；

進一步地，在步驟s2中，所述過表達mog基因的慢病毒包裝的過程為：接種hek293t細胞，待細胞融合度達到80-90％，借助轉染試劑，將所得的mog質粒和作為對照的空載體質粒plvx-ires-mcherry分別與病毒包裝體系質粒pspax2和pmd2.g均按照質量比2:2:1的比例一起共轉染至hek293t細胞；轉染40～55小時后，收取含病毒顆粒的細胞培養(yǎng)基上清；上清經(jīng)超濾法濃縮，獲得濃縮后高滴度的病毒顆粒，即病毒感染細胞；然后進行病毒滴度驗證，確保病毒滴度合格，則得到過表達mog的病毒顆粒和不表達mog的對照病毒顆粒。

進一步地，在步驟s3中，所述過表達mog基因的細胞株(mog-293t細胞株)構建過程為：接種hek293t細胞，待細胞融合度達到40-50％，借助感染試劑，用步驟s2中所得的過表達mog的病毒顆粒和不表達mog的對照病毒顆粒分別感染hek293t細胞；感染48～72小時后，進行抗生素篩選，并采用未進行病毒轉染的hek293t細胞做為抗生素篩選對照組，當對照組的hek293t細胞被殺死后，完成篩選，則篩選好的細胞即為過表達mog-293t細胞株與vector-293t細胞株。

進一步地，在步驟s3中，所述的轉染試劑為陽離子聚合物polybrene(聚凝胺，即溴化己二甲銨)，其能夠加強病毒的感染效率；感染48～72小時后，進行抗生素嘌呤霉素篩選；接種hek293t細胞的培養(yǎng)基為成分以及各種成分的加量為：dmem培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1000u青霉素+1000mg/l鏈霉素。

進一步地，在步驟s4中，培養(yǎng)vector-293t細胞和過表達mog-293t細胞株的培養(yǎng)基均為：dmem培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1000u青霉素+1000mg/l鏈霉素。

進一步地，在步驟s4中，將過表達mog-293t細胞株與vector-293t細胞株分別接種于可拆卸的12小室載玻片中，其中，6室接種過表達mog-293t細胞株，6室接種vector-293t細胞株，并保證每個小室所接種的細胞量相近；除去培養(yǎng)vector-293t細胞和過表達mog-293t細胞株的培養(yǎng)基，用pbs洗滌細胞2次，加入200ul4％多聚甲醛，4℃固定過夜。

一種用于臨床樣品mog-igg檢測的cba檢測試劑盒，所述試劑盒包括mog-iggcba檢測用細胞爬片組件、抗人igg-fitc二抗、封閉液、10×pbs和封片劑；所述mog-iggcba檢測用細胞爬片組件由含有小室的載玻片或爬片、vector-293t細胞和mog-293t細胞制備而成，具體地，含有小室的載玻片為含有多個小室的可拆卸載玻片，其中，多個小室含mog-293t細胞，多個小室含vector-293t細胞。

進一步地，所述封片劑為抗熒光漂白封片劑；所述封閉液為10％山羊血清。

一種cba檢測試劑盒的應用方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將以上步驟s4中所制備的kit室溫平衡10min，加入10％山羊血清，37℃封閉40分鐘；

(2)將臨床血清或腦脊液樣品用pbs1:100稀釋，37℃孵育1小時；

(3)pbs洗滌細胞兩次，加入稀釋好的抗人igg-fitc二抗，37℃避光孵育30分鐘；

(4)pbs洗滌細胞兩次；

(5)滴加封片劑封片，熒光顯微鏡鏡檢、拍照。

本發(fā)明至少具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種檢測mog-igg的cba試劑盒用的細胞爬片組件制備、cba檢測試劑盒及其應用，其通過本申請?zhí)囟ǖ姆椒ㄖ苽涫沟媚軌虿捎迷噭┖衼頇z測mog-igg抗體，而且檢測的特異性強，靈敏度高，實驗結果重復性好，能夠進行推廣應用，這在臨床上具有極其重要的意義。

此外，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，依據(jù)抗體特異性識別抗原蛋白特定表位。相對于elisa和wb檢測方法，cba檢測法中的mog抗原可以完全呈現(xiàn)出體內(nèi)mog的特點，進行抗體陽性檢測更能客觀的反應臨床mog-igg抗體與疾病的關系。

在試劑盒的優(yōu)化方面，相比傳統(tǒng)利用96孔板接種細胞或用蓋玻片制作細胞爬片進行試驗，將兩種不同細胞分別接種于特殊的可拆卸的12小室載玻片上，十分方便后續(xù)的實驗操作。過表達與對照細胞在一個板中左右排布，也方便了后續(xù)實驗結果的對比，可顯著提高實驗判斷的準確性。經(jīng)實驗驗證，制成的試劑盒可輕松保存、運輸且不影響檢測效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例所述的mog-血清對vector-293t細胞染色示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例所述的mog-血清對mog-293t細胞染色示意圖；

圖3是本發(fā)明實施例所述的mog+血清對vector-293t細胞染色示意圖；

圖4是本發(fā)明實施例所述的mog+血清對mog-293t細胞染色示意圖；

圖5是本發(fā)明實施例所述的elisa檢測法的結果示意圖；

圖6是本發(fā)明實施例所述的cba檢測試劑盒的結果示意圖；

圖7是本發(fā)明實施例所述的過表達mog基因的慢病毒包裝的制備流程圖；

圖8是本發(fā)明實施例所述的做復孔和不做復孔的臨床樣品稀釋示意圖；

圖9是本發(fā)明實施例所述的試劑盒制備與檢測運用步驟流程圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。以下提供的本發(fā)明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通方法人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

一種用于臨床樣品mog自身免疫igg抗體檢測的cba檢測試劑盒的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

s1：mog質粒構建

(1)以人神經(jīng)少突膠質細胞為材料，抽提總mrna；

(2)利用反轉錄試劑盒將mrna反轉錄成cdna；

(3)設計mog特異性pcr引物，擴充出全長mogcdna；所述的mog特異性pcr引物的正向引物序列為：atggcaagcttatcaagaccc，反向引物序列為：gaagggatttcgtagctcttc；

(4)將擴增所得mogcdna進行克隆，連接到plvx-ires-mcherry慢病毒質粒載體上；

(5)然后將plvx-ires-mcherry慢病毒質粒進行轉化、搖菌，進行擴增抽提，得到mog質粒；

s2：過表達mog基因的慢病毒包裝，參見圖7所示的流程概括圖。

(1)將hek293t細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10⁶左右細胞；

(2)待細胞融合度達到80-90％，借助轉染試劑，將步驟s1中所得到的mog質粒和作為對照的空載體質粒plvx-ires-mcherry分別與病毒包裝體系質粒pspax2和pmd2.g，均按照質量比2:2:1比例一起共轉染進hek293t細胞，即mog質粒:pspax2:pmd2.g＝2:2:1，空載體質粒plvx-ires-mcherry:pspax2:pmd2.g＝2:2:1；所述轉染試劑可為life公司的lipofectemin3000轉染試劑。

(3)轉染48小時后，收取含病毒顆粒的細胞培養(yǎng)基上清；上清經(jīng)超濾法濃縮，獲得濃縮后高滴度的病毒顆粒，即病毒感染細胞，即過表達mog基因的慢病毒包裝。

(4)病毒滴度驗證，確保病毒滴度合格，得到過表達mog的病毒顆粒和由空載體質粒轉染所得到的不表達mog的對照病毒顆粒。

s3：過表達mog基因的細胞株(mog-293t細胞株)構建

(1)將hek293t細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10⁶左右細胞；

(2)待細胞融合度達到40-50％，借助感染試劑，用步驟s2中所得的過表達mog的病毒顆粒和不表達mog的對照病毒顆粒分別感染所接種的hek293t細胞；此處的轉染試劑優(yōu)選為polybrene(聚凝胺，即溴化己二甲銨)，一種陽離子聚合物，其能夠加強病毒的感染效率。

(3)感染50小時后，進行抗生素puromycin(嘌呤霉素)篩選，并用未進行病毒轉染的hek293t細胞作為抗生素篩選的對照組，大約4-6天，當對照組的hek293t細胞全部被安全殺死后，完成篩選；

(4)篩選好的細胞即為過表達mog-293t穩(wěn)定細胞株(即過表達mog基因的細胞株)與vector-293t細胞株，該vector-293t細胞株即為不表達mog的對照病毒顆粒感染hek293t細胞得到的，將其均進行凍存保種；

s4：mog-iggcba檢測用細胞爬片組件的制備

(1)同時復蘇步驟s3中凍存的過表達mog-293t細胞株與vector-293t細胞株。

(2)待細胞數(shù)量足量后接種于可拆卸的12小室載玻片中，接種方法為12小室載玻片的一排(共6室)接種過表達mog-293t細胞株，另外一排(共6室)接種vector-293t細胞株，且保證每個小室的細胞量相近，接種布局如下表所示；接種過表達mog-293t細胞株的培養(yǎng)基成分以及各種成分的加量為：dmem培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1000u青霉素+1000mg/l鏈霉素，接種vector-293t細胞的培養(yǎng)基成分以及各種成分的加量為：dmem培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1000u青霉素+1000mg/l鏈霉素；

(3)待細胞融合度達到80-100％，去掉上述兩種細胞的培養(yǎng)基，用pbs洗滌細胞2次，加入200ul4％多聚甲醛，4℃固定過夜。

(4)pbs洗滌細胞兩次，倒置自然風干，mog-iggcba檢測用細胞爬片組件制備完成，即完成檢測mog-igg的cba試劑盒用的細胞爬片組件的制備；制備好的mog-iggcba檢測用細胞爬片組件可-80℃凍存保存12月以上，-20℃保存1個月以上。

該實施例可同時準備抗人igg-fitc二抗、封閉液、10×pbs和抗熒光漂白封片劑，得到cba檢測試劑盒，便可直接檢測臨床樣本中的mog-igg。

實施例2

一種用于臨床樣品mog自身免疫igg抗體檢測的cba檢測試劑盒，所述試劑盒包括抗人igg-fitc二抗、封閉液、10×pbs、抗熒光漂白封片劑以及mog-iggcba檢測用細胞爬片組件；封閉液優(yōu)選為10％山羊血清。

優(yōu)選地，mog-iggcba檢測用細胞爬片組件由含有小室的載玻片或爬片、vector-293t細胞和mog-293t細胞制備而成，具體地，含有小室的載玻片為含有12個小室的可拆卸載玻片，其中，6室含mog-293t細胞，6室含vector-293t細胞，具體的制備方法參見實施例1的步驟s4。

實施例3

一種cba試劑盒的應用方法，即采用試劑盒的檢測方法包括以下步驟：

step1：實施例1所制備完成的mog-iggcba檢測用細胞爬片組件或實施例2所述的mog-iggcba檢測用細胞爬片組件(簡稱細胞爬片組件)可-80℃凍存保存12月以上，-20℃保存1個月以上。

step2：取臨床血清或腦脊液樣品，如不能馬上使用應立即分離后-80℃保存，以最大限度保證樣品中蛋白自然活性；

step3：根據(jù)待測樣品數(shù)量，決定所需細胞爬片組件數(shù)量，如不做復孔，一個細胞爬片組件可檢測6個樣品；如做復孔，一個細胞爬片組件可檢測3個樣品，。

step4：將凍存保存的細胞爬片組件室溫平衡10min，加入10％山羊血清，37℃封閉40分鐘；

step5：將臨床血清或腦脊液樣品用10×pbs按1:100稀釋，按圖8所示，每個小室100ul，37℃孵育1小時；

step6：10×pbs洗滌細胞兩次，加入稀釋好的抗人igg-fitc二抗(購買廠家：abcam，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司)，37℃避光孵育30分鐘；

step7：10×pbs洗滌細胞兩次，去除載玻片上小室的四周；

step8：滴加抗熒光漂白封片劑封片，熒光顯微鏡鏡檢、拍照。

cba試劑盒的制備與檢測運用大體步驟流程概括如圖9所示。

實施例4

為了進一步驗證cba檢測試劑盒，取mog-血清(mog陰性血清)和mog+血清(mog陽性血清)按照實施例3中的方法進行驗證，通過最后熒光拍照，kit(即試劑盒)可非常直觀判斷出樣品中mog-igg是陰性還是陽性。

結果顯示，mog-血清在vector-293t細胞及mog-293t細胞兩組染色都為陰性，分別如圖1和圖2所示；而mog+血清對ector-293t細胞染色為陰性，如圖3所示，然而，mog+血清能夠特異性識別mog-293t組，顯出綠色熒光，如圖4所示，需要說明的是，將圖4改為無色彩圖片后降低了實際的顯色效果。

實施例5

選取臨床nmo/nmosd(視神經(jīng)脊髓炎/視神經(jīng)脊髓炎譜系病)患者血清40例，其中20例aqp4+，20例aqp4-。另外，選取對照正常人血清(nc)20例，一共60例樣品進行elisa法和cba發(fā)檢測mog-igg檢測。

elisa檢測顯示mog-igg濃度≥200pg的，aqp4+2例，aqp4-6例，nc2例，如圖5所示。而cba檢測試劑盒檢測結果顯示只有2個mog-igg陽性，且只存在于aqp4-中，如圖6所示。cba檢測結果與臨床癥狀相符，則相對于elisa檢測法，本發(fā)明所述的cba檢測試劑盒的檢測方法準確性更高，其明顯高于elisa法。

在本發(fā)明中，基于細胞的間接免疫熒光檢測(cell-basedassays，cba)是近年來興起的一種細胞檢測方法，在該方法中，通過體外轉染的方式將表達人類mog蛋白的基因轉染到哺乳細胞hek293t中，轉染后的細胞在細胞膜表面表達mog蛋白。在細胞表面mog蛋白能保持人體體內(nèi)一樣的天然跨膜折疊結構。檢測時，樣品中的mog-igg抗體可特異性的識別mog膜外結構域，借助帶特定熒光基團標簽的抗人igg抗體與樣品中mog-igg結合，使用顯微鏡觀測或流式細胞儀進行定量定性分析。

本發(fā)明所使用的最原始的hek293t細胞的購置廠家為atcc(americantypeculturecollection，美國模式培養(yǎng)物集存庫)，可留種保存。

在本發(fā)明中，多個小室的可拆卸載玻片可為在載玻片上設置多個能夠接種細胞的小室，具體如圖9所示；帶小室的載玻片可用其他同類設備代替，只要能夠實現(xiàn)本發(fā)明的功能便可。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域技術人員而言，本發(fā)明可以有各種改動和變化。凡在本發(fā)明的精神和原理之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。